Kandidat Vaksin Flu Burung H5N1 Bagi Ternak Ayam Isolat Asal Jawa Timur

Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan Vol. 4, No. 1, Februari 2011

Kandidat Vaksin Flu Burung H5N1 Bagi Ternak Ayam Isolat Asal Jawa Timur Avian Influenza H5N1 Vaccine Candidate for Chicken from East Java Isolate virus Rahayu Ernawati1, E. Djoko Putranto2, Maulana Hanief R3 1 Fakultas Kedokteran Hewan Unair Mahasiswa Program DoktorPascasarjana Unair 3 Mahasiswa Program MagisterPascasarjana Unair 2

Kampus C Unair, Jl. Mulyorejo Surabaya-60115 Telp. 031-5992785, Fax. 031-5993015 Email : [email protected]

Abstract Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5N1 virus is an ongoing public health and socio-economic challenge, particularly in Indonesia. Avian Influenza (H5N1) is now endemic in poultry in many countries, and represents a major pandemic threat. Now, the evolution of H5N1 virus in Indonesia has evolved with genetic variations affecting virulence, drug-resistance, and adaptation to new host species. The reassortment events leading to high genetic diversity in the region, and factors responsible for virus spread. Development of H5N1-specific vaccine may be become a good strategy for the prevention or controlling the spread of AI. This study was aimed to find a vaccine candidate for Avian Influenza subtype H5N1 which has a good quality, safe, homolog genetically and antigenically with the virus in East Java. The sample viruses were isolated from village chicken in traditional market at Surabaya, Jombang, Pare, and Kediri. Suspensions in antibiotic solution of cloacal swabs (or organs), taken from village chicken, inoculated into the allantoic cavity of 9 to 11-day-old embryonating chicken eggs. The eggs are incubated at 37°C (range 35–39°C) for 4–7 days. The allantoic fluid of any eggs containing dead or dying embryos during the incubation and all eggs at the end of the incubation period are tested for the presence of haemagglutinating activity by HA and HI test. The presence of Hemagglutinin gene which are common to all influenza A viruses can be confirmed by One Step PCR using 4 pairs of specific primers. Then, the product being purificated and sequenced to get the hemagglutinin nucleotide data. The data were analysed for homology relationship. The antigenic test against confirmed antisera panel was conducted to observed the antigenic potential from the isolate. The study results two isolates, Jombang and Pare isolate. The result of this study show that the isolate have a high homology of hemagglutinin gene with another virus isolate (A/chicken/WestJava/Tasiksol/2006) which have wide covered spatial area. The antigenic test showed the same result, but Pare isolate have much wider covered area because it can react with all of antigenic test panel antisera. Keywords : Vaccine, Avian Influenza (H5N1), Chicken, Hemagglutinin, Homology Pendahuluan Kejadian wabah Flu Burung (Avian Influenza) selain mengakibatkan kerugian ekonomi yang sangat tinggi karena kematian pada ternak unggas juga menimbulkan kepanikan yang luar biasa karena dapat menular dan mematikan pada manusia. Di Indonesia sejak Agustus 2003 hingga 10 September 2008 telah menyebabkan kematian lebih dari 10 juta ayam dengan menimbulkan kerugian lebih dari 4 trilyun rupiah dan hingga bulan Januari 2010 tercatat 163 kasus pada manusia dengan kematian 135 orang (Hasan, 2009; Dharmawan dan Wahyuningsih, 2010). Virus Avian Influenza (AI) mempunyai struktur antigen permukaan antara lain Hemaglutinin (HA) dan Neuroamidase (NA). Penggolongan subtipe AI adalah atas dasar kandungan Hemaglutinin yang terdiri atas 16 subtipe dan atas dasar Neuroamidase yang terdiri atas 9 subtipe. Jenis yang menyerang Indonesia, menurut pemerintah

yang diumumkan oleh Ditjenak adalah subtype H5N1 (Nidom, 2009; Kawaoka, 2009). Virus AI mempunyai 8 segmen gen yang menyandi 10 macam protein, yakni PB-2 (Polymerase Basic-2), PB-1(Polymerase Basic-1), PA (Polymerase acidic), HA (Haemaglutinin), NP(Nucleo Protein), NA (Neuroamidase), M1(Matrix-1), M2 (Matrix-2) , NS1 (Non Struktural1) dan NS2 (Non Struktural-2). Protein HA merupakan target awal dalam pembentukan antibody inang. Pada awal infeksi protein ini akan berikatan dengan reseptor sel inang dan melepaskan ribonukleoprotein. Akibat aktivasi precursor HA (HAO) oleh protease inang, protein akan terbelah menjadi HA1 dan HA2. Protein HA1 akan berikatan dengan reseptor dan merupakan target utama untuk timbulnya respons imun, sedangkan protein HA2 akan memfasilitasi fusi antara amplop virus dengan membrane endosomal inang. Oleh karenanya Protein HA merupakan pertimbangan utama dalam

19

Kandidat Vaksin Flu ......

menentukan bahan dalam pembuatan vaksin flu burung (Suzuki and Nei, 2002). Namun membuat vaksin yang dijamin aman, efektif, stabil secara genetik serta homolog secara antigenik adalah suatu hal yang tidak mudah, karena sebagai virus RNA virus ini mudah mengalami mutasi sehingga virus yang mewabah dari tiap daerah dan tiap waktu sering tidak sama karena telah mengalami mutasi delesi atau insersi bahkan reassortment (Hoffmann dkk., 2005). Sekalipun publikasi tentang genotipe virus Al H5N1 asal Indonesia belum banyak dipublikasi, data yang telah tersedia menunjukkan bahwa virus AI telah berevolusi dan kian menyebar di Indonesia melalui perantara lalu lintas unggas dan produk perunggasan. Reassortment genetik dan peran burung liar belum teridentifikasi dengan jelas namun seperti yang diduga, materi genetika virus Al H5N1 terus mengalami perubahan melalui mutasi (genetic drift) terutama pada segmen ke-4 yang menyandi protein HA. Perkembangan diatas mempunyai implikasi yang besar dalam pemilihan seed vaksin yang hendak digunakan di suatu wilayah. Idealnya, vaksin yang digunakan mestinya mempunyai homologi genetik dan antigenik yang mendekati sempurna dengan virus yang beredar di wilayah yang bersangkutan (Kawaoka,Y.2009., Rantam dkk. 2008). Materi dan Metode Penelitian Sampel Koleksi sampel berasal dari puluhan ayam buras yang didapat dari pasar Wonokromo Keputran, Djombang, Pare dan Kediri. Tehnik pengambilan sampel virus Avian Influenza dilakukan dengan berbagai cara, diantaranya dengan tehnik swab/ usapan dan tehnik gerusan organ. Pada tehnik swab/usapan di lakukan dengan melakukan swab atau usapan pada bagian kloaka unggas dengan menggunakan cotton bud/ batang berkapas kemudian di masukkan dalam media transport yang telah disediakan di dalam tabung-tabung kecil/ ependof, campuran inilah yang nantinya menjadi bahan inokulan pada TAB. Pada tehnik gerusan organ dilakukan dengan mengambil sebagian potongan organ seperti paru-paru, trakea, hepar, usus ataupun otak yang kemudian digerus di dalam cawan gerus dengan sedikit cairan PZ dan dicampur dengan pasir kuarsa dalam proses penggerusan bila dianggap perlu. Selanjutnya, hasil larutan gerusan organ tersebut dimasukkan ke dalam tabung untuk dilakukan sentrifuse, kemudian diambil cairan supernatannya sebagai bahan inokulan pada TAB.

20

Selanjutnya bahan inokulan dari usapan kloaka dan gerusan organ tersebut diinokulasikan pada telur ayam bertunas (TAB) berumur antara 8 – 11 hari. Kemudian diinkubasikan pada inkubator dengan suhu 37 o C selama 5 hari. TAB ini diamati perkembangannya tiap 4 jam untuk dicandling embrionya. Apabila terdapat TAB yang embrionya mati sebelum 5 hari, maka dimasukkan kedalam refrigerator -4oC. Pada hari ke 5 semua telur dimasukkan ke dalam refrigerator. Kemudian cairan alantois dari TAB tersebut dipanen. Setiap sampel ditanam pada TAB sebanyak 2 butir. Cairan alantois tersebut kemudian diuji dengan Hemaglutinin test (Uji HA). Isolat-isolat cairan alantois ini digunakan sebagai sampel penelitian, dan kemudian disimpan di dalam refrigerator -4oC. Uji Hemaglutinasi Mikroteknik Uji hemaglutinasi (HA) dapat digunakan untuk mengidentifikasi virus jenis orthomyxovirus yang mampu menggumpalkan darah serta untuk mengetahui titer awal antigen yang digunakan terutama guna kelanjutan uji hambatan hemaglutinasi (HI). Prosedur pelaksanaan uji ini adalah semua lubang pada mikroplate diisi dengan PZ sebanyak 25μl. Kemudian diisikan antigen sebanyak 25μl ke lubang A1 untuk sampel I dan lubang A2 untuk sampel ke II dan seterusnya, lalu dilakukan pengenceran serial dengan mengambil 25μl dari lubang A1 dicampur ke lubang B1, kemudian diambil lagi dari lubang B1 sebanyak 25μl dicampur lagi ke lubang C1 begitu seterusnya sampai lubang H1. Pengambilan terakhir dari lubang H1 dibuang. Kemudian semua lubang diisi dengan eritrosit ayam 0,5% sebanyak 50μl, lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Setelah itu titer sampel bisa diperiksa. Reaksi hemaglutinasi positif ditandai dengan terjadinya aglutinasi pada eritrosit. Uji Hambatan Hemaglutinasi (HI) Mikroteknik Pelaksanaan uji ini dilakukan dengan mengisikan ke semua lubang mikroplate dengan 0,025 ml PZ/PBS menggunakan mikropipet. Kemudian diisi lubang no.1 dan 12 dengan antiserum sebanyak 0,025 ml dengan menggunakan mikropipet, lalu campurkan dengan mikropipet juga antiserum dan PZ/PBS pada lubang no.1 dengan menghisap dan mengeluarkan kembali lalu ambil 0,025 ml dan pindahkan ke lubang berikutnya, demikian seterusnya sampai lubang no.10. Setelah itu dilakukan pengisisan lubang no.1 sampai no.10 dengan antigen 4HA unit sebanyak 0,025 ml dengan

Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan Vol. 4, No. 1, Februari 2011

menggunakan mikropipet. Inkubasikan pada suhu ruang selama 30 menit, diisi semua lubang dengan 0,05 ml eritrosit ayam 0,5%, kemudian inkubasikan pada suhu kamar selama 30 menit. Uji Antigenitas/Immunogenitas Sesuai dengan Prescreen Haemaglutination Inhibition Testing Protocol, DIC Prescreen Effort to Monitor Virus Variant, 1 November 2010 maka sebelum penelitian antigen harus diinaktifkan lebih dahulu dengan Formaldehide 37% dengan konsentrasi akhir 0,2% dalam larutan Allantois yang berisi virus, kemudian inkubasi 4C semalam. Semua antigen yang dipergunakan adalah 4 HAU antigen (antigen yang masih mampu mengaglutinasi eritrosit pada batas pengenceran 4 kali) dan harus disiapkan 1-2 hari sebelum uji. Antisera yang disiapkan adalah antisera yang dienceran 4 kali sehingga awal penelitian dimulai dengan pengenceran 8 kali hal ini karena syarat minimal untuk seed vaksin adalah positif pada pengenceran >4 kali. Uji ini dilakukan dengan urutan kerja sebagai berikut semua lubang mikroplate diisi dengan 25 ul larutan PBS menggunakan pipet dropper, kemudian lubang no 1 diisi dengan serum Anti-A/chickenWestJava/SMIHamid/2006, no. 2 dengan serum AntiA/chicken/Konawe Selatan/BBVM2040/2007, no. 3 denga serumAnti-A/chicken/WestJava/Tasiksol/2006, n o . 4 d e n g a n s e r u m A n t i A/chicken/Indonesia/Wates1/2005. Menggunakan mikrodiluter 25 ul, dicampur masing-masing antiserum dengan PBS dengan cara memutar-mutar mikrodiluter kemudian encerkan dengan cara memindahkan 25 ul ke lubang baris ke 2. Demikian seterusnya hingga lubang baris ke 8 dan terakhir dibuang, kemudian semua lubang mikroplate (no. 1 hingga 4, baris 1 hingga 8) diisi dengan antigen 4 HAU dari antigen yang diperiksa. Kemudian dikocok dengan shaker selama 10-15 detik dan diinkubasikan 37C selama 30 menit. Ditambah dengan 50 ul 0,5% eritrosit ayam pada semua lubang mikroplate, ditutup dan dikocok dengan shaker selama 10-15 detik, diinkubasi 4C selama 45 – 60 menit. Buffer AW2. Sentrifus 14000 rpm selama 3 menit dan pindahkan ke tube 1,5 ml, tambahkan 60 μl buffer AVE. Kemudian inkubasi pada suhu ruang 1 menit lalu sentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Ekstraksi RNA Ekstraksi RNA virus avian influenza dilakukan dengan menggunakan QIAamp Viral Mini Kit. Langkah-langkah ekstraksi adalah dengan

memasukkan 560 μl buffer AVL (viral lysis buffer) yang mengandung carrier RNA dengan perbandingan : volume buffer AVL 0,56 ml + carrier RNA-AVE 5,6 μl. Kemudian dimasukkan 140 μl sampel dan spin sebentar, tambahkan 560 μl Ethanol absolut, vortex 15 detik, lalu spin sebentar. Masukkan 630 μl ke dalam spin column sentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Buang cairan dibawah, tambahkan 500 μl buffer AW1 (washing buffer). Sentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Kemudian pindahkan ke tabung baru dan tambahkan 500 μl buffer AW2. Sentrifus 14000 rpm selama 3 menit dan pindahkan ke tube 1,5 ml, tambahkan 60 μl buffer AVE. Kemudian inkubasi pada suhu ruang 1 menit lalu sentrifus 8000 rpm selama 1 menit. RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) dan Sequensing Uji Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) dilakukan dengan menggunakan SuperScriptTM III One-Step RT-PCR system with Platinum® Taq High Fidelity DNA Polimerase (Invitrogen). Pelaksanaan PCR terhadap gen HA virus avian influenza ini dilakukan dengan mempertimbangkan kebutuhan panjang nukleotida yang dapat diolah oleh mesin sekuenser nantinya. Sehingga untuk proses PCR gen HA yang memiliki kurang lebih 1779 nukleotida, maka digunakan 4 pasang primer spesifik sebagaimana terlihat dalam tabel 1. Tabel 1. Primer dan Sekuens Primer Primer Sekuens P1_F P1_R P2_F P2_R P3_F P3_R P4_F P4_R

5” GGCCAGTAGCAAAAGCAGGGGT 3” 5” CTTCTCCACTATGTAAGACCATTCCGGTACAT 3” 5” GTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTG 3” 5” AATTGCTGAGTCCCCTTTCTTGACAATTTTGT 3” 5” CCTATATTTCCGTTGGGACATCAACACTAA 3” 5” CATTTTCCATGAGAACCAGAAGTTCAGCA 3” 5” GAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATG 3” 5” CCAGTAGAAACAAGGGTGTT 3”

Pelaksanaan One Step PCR dilakukan dengan cara mencampurkan ke dalam tabung PCR bahan komponen One Step PCR yang terdiri dari 2X Reaction Mix 12,5 µl, template RNA (1 pg–1 µg) 2 µl, sense primer (10 µM) 0,5 µl, anti-sense primer (10 µM) 0,5 µl, SuperScript™ III RT/ Platinum® Taq High Fidelity Enzyme Mix* 1 µl, lalu tambahkan autoclaved distilled water sampai 50 µl. Kemudian tabung PCR tersebut dimasukkan kedalam alat

21

Kandidat Vaksin Flu ......

Thermocycler (GeneAmp PCR System 9700) dengan siklus suhu di program dalam kondisi suhu sintesis cDNA 48oC selama 30 Menit, pre-denaturasi 94 oC selama 2 menit. Suhu amplifikasi PCR sebagai berikut suhu denaturation 94 oC selama 30 detik, annealling 50 oC selama 40 detik, dan extention 68 oC selama 40 detik yang dilakukan sebanyak 40 siklus. Suhu untuk final extention adalah 68 oC selama 5 menit. Elektroforesis Sebanyak 5µl sampel DNA ditambah dengan 2µl blue juice di- loading pada sumuran gel agarose 1%. Plat dijalankan dengan 125 V, 70 mA dalam waktu 30-45 menit. Gel dibaca pada transluminator UV dan didokumentasi.

Isolate Jombang Isolate Pare Gambar 1. Hasil elektroforesis isolat Jombang dan Pare Sekuensing Hasil mesin sekuenser dengan 4 pasang primer (masing–masing terlampir) diolah dengan clone manager dengan hasil pada gambar 2.

Purifikasi Produk PCR Purifikasi produk PCR dilakukan dengan Nucleospin II. Dilakukan dengan mencampurkan 1 volume sampel dengan 2 volume Buffer NT. Kemudian mempersiapkan kolum Nucleospin Extract II, lalu dimasukkan sampel dan sentrifus 11.000 rpm selama 1 menit. Cuci Silica membran dengan menambahkan 600 μl Buffer NT dan sentrifuse 11.000 rpm selama 1 menit. Setelah itu melakukan pengeringan Silica membran dan lakukan s e n t r i f u s e 11 . 0 0 0 s e l a m a 2 m e n i t u n t u k mengeluarkan NT. Purifikasi hasil cycle sekuensing dengan Big Dye X Terminator Purification Kit Tahap ini dilakukan dengan melakukan pencampuran menggunakan vortex terlebih dahulu terhadap Big Dye X terminator sampai homogen, kemudian dimasukkan SAM sol 4,5 x volume cycle sequencing ke dalam well. Dimasukkan Big Dye X Terminator 1 x vulome hasil cycle sequencing, lalu dicampur mengunakan vortex selama 30 menit dan sentrifus 1000 g/rcf selama 2 menit pada suhu ruang. Hasil Dan Pembahasan Elektroforesis M e n g i n g a t t a rg e t RT- P C R a d a l a h sekuensing lengkap RNA dari gen HA virus H5N1 yang terdiri dari sekitar 1700 bps nukleotida maka untuk mendapatkan hasil yang bagus dipergunakan 4 pasang primer.

22

Gambar 2. Hasil sekuensing gen HA Avian Influenza H5N1 asal ayam Buras Pare (=AJP3)

Gambar 3. Hasil sekuensing gen HA Avian Influenza H5N1 asal ayam Buras Djombang (=AJP2)

Jurnal Ilmiah Kedokteran Hewan Vol. 4, No. 1, Februari 2011

Bila dilakukan homologi antara ayam Buras asal Djombang dan Pare, hasilnya sebagai berikut (detail terlampir): Sequences producing significant alignments: Max

Total

Query

E

Max

Description AJP3_Full

score score coverage value

ident

2519

95%

2519

97%

0.0

Tabel.....keterangan tabel ? Kesimpulannya adalah, kesamaan nukleotida gen HA virus H5N1 antara virus asal ayam Buras Djombang dan Pare adalah 95%. Dengan cara yang sama dua gen HA diatas ( Ayam Buras Djombang=AJP2; Ayam Buras Pare=AJP3) bila di homologikan dengan salah satu gen HA virus yang mempunyai cakupan yang luas yakni A/chicken/West Java/TASIKSOL/2006 (detail terlampir) hasilnya adalah sebagai berikut: Sequences producing significant alignments: Max

Total

Query

E

Max

Description score score coverage value

ident

AJP2_Full

2662

2662

92%

0.0

96%

AJP3_Full

2728

2728

91%

0.0

98%

Hal ini menunjukkan bahwa kedua kandidat vaksin diatas secara philogenitik dekat dengan virus yang mempunyai cakupan luas yaitu A/chicken/West Java/TASIKSOL/ 2006 sehingga dapat disimpulkan bahwa kedua kandidat vaksin diatas juga mempunyai ikatan antigen dengan cakupan yang luas yang merupakan salah satu persyaratan kandidat vaksin (Dharmawan, dan Wahyuningsih, 2010). Antigenitas Sesuai dengan hasil carthography antisera (Workshop OFFLU & AAHL,2009) yang kemudian ditetapkan menjadi aturan pemerintah, Seed Vaksin AI harus melalui uji tantang Haemaglutination Inhibition dengan panel antisera yang telah ditetapkan (dengan titer >4): Anti-A/chicken/WestJava/SMI- Hamid / 2006 Anti-A/chicken/KonaweSelatan/ BBVM2004/2007

Anti-A/chicken/WestJava/Tasiksol/ 2006 Anti-A/chicken/Indonesia/Wates1/ 2005 (Positif control hiperimun sera clade 2.1.3) Hasilnya harus positif terhadap antisera hiperimun yaitu no. 4 serta memiliki cakupan cukup luas dengan menilai reaksi uji antisera dengan 3 antisera lainnya (no.1,2,3) . Hasil penelitian sebagai berikut: Kesimpulan Antigen virus H5N1 asal ayam Buras asal Djombang yang diteliti dapat dipergunakan sebagai seed vaksin H5N1 khususnya yang masuk clade 2.1.3 namun antigen virus H5N1 asal ayam Buras Pare yang diteliti lebih baik sebagai seed vaksin H5N1 karena mempunyai cakupan yang lebih luas. Daftar Pustaka Barbara LTK. 2008. Avian Influenza Survellance in Migratory, Resident and Captive Birds in Java. Lokakarya Nasional Penyusunan Strategi dan Pedoman Surveiland Avian Influenza pada Burung Liar, Bogor 14-16 April 2008 Beard CW. 2003. Avian Influenza (Fowl Plaque). Shouthest Poultry Research Laboratory, Athens, GA. Chen H, G. Deng, Z. Li, G. Tiam, Y. Li, P. Jiao, L. Zhang, Z. Liu, R.G. Webster, and K. Yu. 2004. The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in Southern China. Microbiology 101 : 10451-10457. Dharmawan, R. dan Wahyuningsih, S. 2010. Penelusuran Perkembangan Virus Avian Influenza Dengan Metode Antigenic Cartography, Prosiding Rapat Teknis dan Pertemuan Ilmiah Kesehatan Hewan Tahun 2010 di Balai Besar Veteriner Wates. Ernawati, R., A.P.Rahardjo, N.Sianita, j. Rahmahani, F.A. Rantam, san Suwarno,. 2008, Petunjuk Praktikum Pemeriksaan Virologik dan Serologik, Laboratorium Virologi dan Imunologi, Departemen Mikrobiologi Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga. Fouchier, R.A.M., V. Munster, A. Wallenstens, T.M. Bestebroer, S. Hersfst, D. Smith, G.F. Rimmelzwaan, B. Olsen, and A.D.M.E. Osterhaus. 2005. Characterization of novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained black-headed gulls. J Virol 79 (5) : 2814-2822.

23

Kandidat Vaksin Flu ......

Haryanto, A., M.Purwaningrum, R. Ermawati, K. Putri, M.H.Wibowo dan C.R., Tabbu 2009. Studi Penentuan Tipe dan Subtype Virus Avian Influenza dengan Metode Single Step Multiplex Reverse Transcriptase Chain Reaction (RT-PCR). Media Kedokteran Hewan. Vol.25. No. 1. Januari 2009. Hasan, M.Z. 2009. Kebijakan Nasional Pengendalian Penyakit Avian Influenza (Flu Burung) di Indonesia. Surabaya 21 Januari 2009. Horimoto, T, and Y. Kawaoka. 2001. Pandemic threat posed by avian influenza A viruses. Clin Microbiol Rev. 14 : 129-149. Jones, Y.L. and D.E. Swayne, 2003. Comparative Pathobiology of low and High Pathogenecity H7N3 Chilean Avian Influenza Virus in Chicken. Avian Disease. 48;119-128 Kawaoka, Y. 2009. Avian Influenza In Indonesia Control, Prevention and Surveillance. Surabaya, 19 Maret 2009. Lipatov, A. S., E.A. Govorkova, R.J. Webby, H. Ozaki, M. Peiris, Y. Guan, L. Poon, and R.G. Webster. 2004.Influenza : emergence and control. J Virol 78 : 8951-8959. Nidom, C.2009. International Symposium. Avian Influenza In Indonesia Control, Prevention and Surveillance, Surabaya 19 Maret 2009 Moerad, B. 2004. Kebijakan Pemerintah dan Penanggulangan Wabah Avian InfluenzaDi Indonesia. Disampaikan dalam seminar Menyingkapi Dampak Avian Influenza Tanggal 14 Februari 2004. Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga OIE. 2009. Highly pathogenic avian influenza. World Organization for Animal Health. http://www.oie.int/ Poetranto, E. D. 2005, Deteksi Antibodi Avian Influenza subtype H5 Pada Burung Air Liar di Pantai Tempat Persinggahan Burung Migran. Seminar Nasional Dies Natalis Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga, Surabaya 15-16 April 2005 Rantam, F.A., 2009. Tehnik Pemeriksaan Imunologi., Seminar sehari, Surabaya, 11 Juli 2009

24

Rantam, F.A., 2005. Virologi, Airlangga University Press Rantam, F. A., E. D. Poetranto., A.P.Rahardjo, Suwarno., N.Sianita, N. R.Ernawati dan J. Rahmahani. 2007. Kajian Burung Migrasi Sebagai Sumber Penularan Terhadap Pencegahan Penyebaran Wabah Flu Burung. Penelitian Kerjasama Dinas Peternakan Propinsi Jawa Timur dengan Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat Universitas Airlangga. Susanti, R, D.S. Retno, I.G.N. Mahardika, I.W.T. Wibawan dan M.T.Suhartono. 2009. Isolasi dan Indentifikasi Virus Avian Influenza Subtipe H5N1 pada Unggas Air Sehat di Peternakan Skala Rumah Tangga di Jawa Barat, Media Kedokteran Hewan Vol. 24 No.3, September 2009 Suwarno, Karakteristik Protein N1 Virus Avian Influenza A/Ck/Bl/Indonesia/2003 sebagai Antigen Diagnostik pada ELISA Tak Langsung, Media Kedokteran Hewan Vol. 24. No. 3, September 2009 Steven J., O.Blixt, I.A.Paulson and. IA., Wilson. Structure and Receptor Specifty Avian Flu Antigen, ALS News Vol.278, July 25 2007 Ta b b u , C . R . 2 0 0 0 . P e n y a k i t Ay a m d a n Penanggulangannya Penyakit Bakterial, Mikal Dan Viral. Yogyakarta; Kanisius, 238-243 WHO. 2009. Pandemic (H1N1) 2009 – update 59. 28 Juli 2009. World Organization for Animal Health. http://www.who.int/ Wijayanti S. P. M., Karakteristik Molekuler Tapak perlekatan Reseptor (Receptor binding site) Virus Avian Influenza H5N1 Isolat burung Puyuh asal Demak dan Ayam Kampung asal Purworejo, Thesis S2 Pasca Sarjana UGM 2007. You L., C. Kortenweg and W.H.J.Gu. Avian Influenza Receptor Expression in H5N1 Infected and non Infected Human Tissue, the Faseb Journal 22: 733-740. 2008.