KAM KRÁČÍ ANALYTICKÁ CHEMIE? doc. RNDr. Vlastimil Dohnal, Ph.D.
Podpora přednášky kurzu Mezioborové dimenze vědy
KAM KRÁČÍ ANALYTICKÁ CHEMIE? doc. RNDr. Vlastimil Dohnal, Ph.D. | Katedra chemie, PřF UHK
???
Kolik obsahuje mykotoxinů? Kolik má dusíkatých látek? Jaký je poměr amylosa/amylopektin? Jaký je obsah beta-glukanů?
Kolik má v sobě vitamínů? Obsahuje těžké kovy? Je skutečně pouze z pomerančů? Odkud pochází?
Kolik je účinné látky v tabletě? Jak čistá byla účinná látka?
ANALYTICKÁ CHEMIE • Interdisciplinární obor zabývající se složením zkoumaného vzorku • Otázky – CO? • Kvalitativní analýza, důkaz jedné či více složek (prvky, funkční skupiny) ve vzorku.
– KOLIK? • Kvantitativní analýza – stanovení množství látky ve vzorku.
– KDE? • Analytická topografie - rozložení analytu ve vzorku (povrch, jádro, atd.)
– STRUKTURA • Strukturní analýza – prostorové uspořádání atomů v molekule
ANALYTICKÉ METODY Jednoduché testy
Složité instrumentální metody
SCHÉMA ANALYTICKÉHO POSTUPU • Výběr vhodné metody • Odběr vzorku • Příprava vzorku k analýze • Separace
• Měření • Validace metody • Vyhodnocení výsledků
TRENDY VE VÝVOJI METOD • Zvyšování citlivost, přesnosti a selektivity instrumentálních metod • Snižování ekonomické a časové náročnosti • Vývoj nedestruktivních metod • Automatizace, laboratorní roboti
VYBRANÉ SKUPINY LÁTEK
mykotoxiny
PLÍSNĚ (VLÁKNITÉ MIKROMYCETY) • Je známo více jak 100 000 kmenů plísní – Nejčastěji Aspergillus, Penicillium a Fusarium
• Extracelulární trávení – Biodegradace organické hmoty – absorpce
• Produkce více jak 200 000 sekundárních metabolitů
ČLOVĚK A PLÍSNĚ • Benefity – Houby jako potrava – Fermentace • Asijské potraviny, sýry
– Výroba • Enzymy, organické kyseliny, antibiotika, steroidy, léčiva apod.
PRŮMYSLOVÉ VYUŽITÍ PLÍSNÍ • Claviceps purpurea – Ergotové alkaloidy
• Aspergillus niger – Kyselina citronová (>99 %)
• Rhizopus oligosporus – Tempeh
• Aspergillus oryzae – Fermentované sojové omáčky
PLÍSNĚ OHROŽUJÍCÍ • Negativní vliv – Paraziti • Mykózy
– Změny • Vůně, morfologie, barvy, chuti apod.
– Snížení nutriční hodnoty • Aminokyseliny, sacharidy, tuky
– Toxické metabolity • Mykotoxikózy
– Tvorba alergenů
PLÍSNÍM NA STOPĚ
DETEKCE POMOCÍ DNA A KULTIVACÍ • PCR • kultivace
PCR detekce (1996-2006)
ERGOSTEROL JAKO BIOMARKER • 1977 Seitz a kol. – marker přítomnosti plísní – Extrakce, stanovení HPLC
• Dnes – Marker kvality rajčat
– Kvalita odpadních vod – Monitoring plísní • Sklady, domy, města apod.
STANOVENÍ ERGOSTEROLU • Imunochemicky – Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
• Kapalinová chromatografie – UV detekce – Hmotnostní detekce
PŘÍKLAD – ANALÝZA PÍCNIN • Stanovení ergosterolu ve třech pícninách metodou HPLC/UV • Cíle – Vliv druhu – Vliv doby sklizně
Festuca arundinacea x Lolium multiflorum
Dactylis glomerata Arrhenatherum elatius
PŘÍPRAVA VZORKU • zmýdelnění – 250 mg vzorku – 2 ml 10% KOH v methanolu – 90 min @ 80 °C
– 0.5 ml H2O
• Extrakce – 3 x 1 ml hexan
HPLC/UV STANOVENÍ • Chromatograph Agilent HP1100 0,8
• Column Zorbax SB-C18 (4.6 x 30 mm, 1.8 m)
A [mAU] 0,6
ergosterol
• Isocratic elution methanol/H2O (97.5:2.5, v/v)
0,4
0,2
• Flowrate 0.6 ml/min
0 0
3
6
9
12
čas [min]
• Temperature 25 °C • UV detection @ 282 nm • Injected 2 l of sample
Modified method: Varga, M., Bartók, T., Mesterházy, Á. Determination of ergosterol in Fusarium-infected wheat by liquid chromatography–atmospheric pressure photoionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 1103 (2006) 278-283.
• Calibration using standard addition method – Matrix influence elimination
VÝSLEDKY říjen
listopad
prosinec
Festulolium
40,94
10,68
30,29
4,46
212,04
15,92
Dactylis glomerata
52,02
13,01
59,29
7,32
339,63
33,94
Arrhenatherum elatius
39,70
9,04
49,43
4,71
314,05
48,19
VÝSLEDKY pícnina
měsíc
seč červen [mg/kg]
červen + červenec [mg/kg]
Festulolium (Festuca arundinacea x Lolium multiflorum)
říjen
59,90
12,14
21,98
7,97
listopad
38,76
0,75
21,82
5,21
prosinec
210,71
Dactylis glomerata
říjen
72,92
19,93
31,11
3,46
listopad
69,75
4,42
48,82
11,78
prosinec
342,36
říjen
52,53
10,07
26,86
11,93
listopad
44,53
4,65
54,33
8,08
prosinec
216,35
Arrhenatherum elatius
10,22
56,23
27,08
213,36
336,90
411,75
34,07
50,89
36,52
ZÁVĚR • Obsah ergosterolu vzrůstá od října do prosince (až 5x) • Senoseč – Červen + červenec = méně ergosterolu v říjnu a listopadu než pro sklizeň pouze v červnu – V prosinci nepozorovány významné rozdíly
• Pozorovány mezidruhové rozdíly – Festulolium nejodolnější
DETEKCE METABOLITŮ • Více jak 200 000 sekundárních metabolitů • Metabolické markery – Těkavé organické látky – Ergosterol – Chitin a chitosan – Mykotoxiny
TĚKAVÉ ORGANICKÉ LÁTKY • Plynová chromatografie – Kapalné či plynné vzorky – I složité směsi
TĚKAVÉ ORGANICKÉ LÁTKY • Iontová mobilita – Odpaření vzorku – Ionizace v plynné fázi – Detekce
– Měření doby letu trubicí
HMOTNOSTNÍ DETEKTOR
Q-TOF MS
IONTOVÁ MOBILITA Iontově mobilitní spektrometr na mikročipu
DESI (DESORPTION ELECTROSPRAY IONIZATION)
DESI
DART (DIRECT ANALYSIS IN REAL TIME)
DART
ELEKTRONICKÉ NOSY • Zachycení těkavých látek • Detekce • Převod změny vlastnosti na elektrickou veličinu • Zpracování signálu – využití kalibrace pomocí předem změřené databáze
(A) metal-oxide sensor, (B) surface acoustic wave, (C) quartz crystal sensor, (D) sensor array
ELEKTRONICKÉ NOSY
OTISKY PRSTŮ („FINGERPRINTS“) • Hmotnostní spektrometrie • Plynová chromatografie
TRENDY DO BUDOUCNA • Využití hmotnostně spektrometrické detekce • Modelování obsahu ergosterolu v závislosti na počasí • Inkorporace produkce mykotoxinů do tohoto modelu • Předpověď a výběr faktorů ovlivňujících kontaminaci pícnin plísněmi (ergosterol, mykotoxiny) • Využití modelu pro prevenci a minimalizaci kontaminace potravin/krmiv plísněmi
MYKOTOXINY OCHRATOXIN A CITRININ
• Je známo více jak 200 000 sekundárních metabolitů plísní • Některé jsou toxické pro lidi nebo zvířata
ÚSTNÍ DUTINA
ZEARALENON TRICHOTHECENY
– 450 známo
REPRODUKČNÍ ORGÁNY
– 20 000 se odhaduje – 20 se běžně vyskytuje
TRICHOTHECENY
LEDVINY
KREV
STŘEVA JÁTRA
ERGOT. TOXINY KŮŽE
SATRATOXIN AFLATOXINY OCHRATOXIN A TRICHOTHECENY
AFLATOXINY OCHRATOXIN A RUBRATOXIN B
MYKOTOXIKÓZY Mycotoxicosis
Mycotoxin
Producent
Aflatoxicosis
Aflatoxins
Aspergillus flavus
AcuteDON toxicosis
Deoxynivalenol
Fusarium sp.
Acute cardiial beri-beri
Citreoviridin
Penicillium citreoviride
Alimentar toxic aleukia
Trichothecens, (DON, T-2 toxin)
Fusarium sp.
Balcan endemic nephropathy
Ochratoxin A
Aspergillus ochraceus
Ergotism
Ergot alkaloids
Claviceps purpurea
Kvashiokor
Aflatoxins
Aspergillus flavus
Renal tumors
Ochratoxin A
Aspergillus ochraceus
Yellow rice disease
Citrinin, citreoviridin, etc.
Penicillium citreoviride
Red mold disease
Deoxynivalenol
Fusarium sp.
Primar hepatic carcinom
Aflatoxins
Aspergillus flavus
Cancer
Fumonisins
Fusarium moniliforme
Rey syndrome
Aflatoxins
Aspergillus flavus
Stachybotryotoxicosis
Trichothecenes
Fusarium sp.
VÝSKYT • Limity jsou ve více jak 100 zemích • Více jak 25 % cereálií je kontaminováno • Produkce – Na poli (Fusarium, Alternaria, Cladosporium, Diplodia, Giberella etc.) – Ve skladu (Aspergillus, Penicillium etc.) – Na poli i ve skladu (Penicillium)
ANALÝZA MYKOTOXINŮ • Vzorkování • Mletí a homogenizace • Extrakce • Filtrace
• Čištění extraktu • Příprava k analýze • Analýza
• Zpracování dat
ODEBRÁNÍ VZORKU • Přibližně 80 % chyb • Neuniformní výskyt ve vzorku • Vzorkovací plány
FUMONISINY • Objeveny v roce 1988 • Produkovány Fusarium verticillioides • Je známo více jak 28 fumonisinů • Toxicita FB1>FB2>FB3
HO
O
O
HO O
O
OH
CH3
CH3
OH
OH OH
O HO
OH
O
Fumonisin B1
O
O
NH2
O
O
O
O
OH
CH3
OH
CH3
NH2
O
OH
O
O HO
OH
O
Fumonisin B2
ANALÝZA • Příprava vzozrku – C18, imunoafinitní kolonky, SPE, SPME, extrakce kapalinakapalina
• Stanovení – ELISA – Chromatografie
SPE
• Tenkovrstvá • HPLC
Mycosep®
IMMUNOASSAY - ELISA • Princip • Metoda v některých případech není selektivní – Falešné pozitivní/negativní výsledky
TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE • Detekce – UV/VIS – fluorescence
STANDARDNÍ ANALÝZA HPLC-MS • Příprava vzorku – Mixer nebo třepačka
• Stanovení pomocí HPLC-MS – Validace metody – Testování FAPAS
• Aplikace – Porovnání GMO a konvenční kukuřice – Testování kukuřičných výrobků
LC-MS/MS •
FB2
TIC 800
FB1
500
HPLC –
5 l vzorku
–
Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm), guard column Metaguard ODS-2 (30 x 4,6 mm; 5 μm)
–
Mobile phase
200 0
3
6
9
12
15 time [min]
•
Fumonisin identification FB1
FB2
m/z
identification
m/z
identification
744
[FB1+Na+]+
728
[FB2+Na+]+
721
[FB1+H+]+
706
[FB2+H+]+
352
[FB1-2TCA-H2O+H+]+
336
[FB2-2TCA-H2O+H+]+
334
[FB1-2TCA-2H2O+H+]+
318
[FB2-2TCA-2H2O+H+]+
•
5 mM ammonium acetate/acetic acid; pH 3
•
Acetonitril (ACN)
•
Gradient elution 0 min 33% ACN, 8 min 60% ACN
•
Flowrate 0.8 ml/min
MS –
Capillary voltage 6000 V
–
Fragmentor 300 V
–
Nebulizer gas flow 11 l/min
–
Nebulizer pressure 60 psig
47
VÝHLED DO BUDOUCNA
MOLEKULÁRNĚ VTIŠTĚNÉ POLYMERY • Syntetické „receptory“ – „Molekulární paměť“
• Vlastnosti – Afinita – Specifita – Reverzibilita
•
Výhody oproti ELISA – Nízká cena
– Rychlá syntéza – Žádné testy na zvířatech – Stabilita • Tepelná, pH, dlouhodobé skladování
– Opětovné použití • Více jak100x
MOLEKULÁRNĚ VTIŠTĚNÉ POLYMERY • Stacionární fáze pro HPLC • Receptory pro senzory • SPE založená na MIP – Vyšší selektivita než C18 nebo aktivní uhlí – Nižší cena než imunoafinitní kolonky – Recyklovatelné
BUDOUCÍ TRENDY VE STANOVENÍ MYKOTOXINŮ • Kapalinová chromatografie – tandemová hmotnostní spektrometrie – Série mykotoxinů v jedné analýze – Vysoká rychlost – Použití izotopicky značených vnitřních standardů
– Drahé přístroje
• Rychlotesty (lateral flow) – Tři až čtyři mykotoxiny v analýze
– Nízká cena
PROČ VÍCE MYKOTOXINŮ? • Potraviny a krmiva mohou být kontaminovány více mykotoxiny • Různá toxicita mykotoxinů jedné skupiny – Eg. FB1 > FB2 > FB3
• Synergický efekt
• Aditivní efekt v toxicitě • Antagonismus mezi mykotoxiny
LC-MS/MS 19 mykotoxinů
LC-MS/MS 71 mykotoxinů
LC-MS/MS • Současné stanovení 186 metabolitů plísní a bakterií ve vzorcích z bytu pomocí kapalinové chromatografie s detekcí tandemovou hmotnostní spektrometrií • Vinay Vishwanath & Michael Sulyok & Roman Labuda & Wolfgang Bicker & Rudolf Krska • Anal Bioanal Chem (2009) 395:1355–1372
LATERAL FLOW TEST
hydrolýza
• Produkt konjugace a biotransformace mykotoxinů • Mohou být hydrolyzovány během trávicích procesů a ovlivnit zdraví lidí/zvířat v důsledku uvolnění volného mykotoxinu • Nedetekovatelné konvenčními metodami
konjugace
„MASKOVANÉ“ MYKOTOXINY
Deoxynivalenol-3-glukosid 45 % DON v pšenici
ANALYTICKÉ PROBLÉMY • Vyšší polarita než volné mykotoxiny – Problémy s extrakcí
– Ztráty během extrakce
• Standardy nejsou dostupné – Možno syntetizovat
• Křížová reaktivita ELISA – DON a DON-3-Glu – Nadhodnocení výsledků
• Detekovatelné pouze metodou LCMS/MS
DALŠÍ TRENDY V ANALYTICKÉ CHEMII
TĚŽKÉ KOVY X-ray fluorescence • Příprava vzorku – Mletí, lisování, bez úpravy
• Analýza – X-Ray fluorescence
– Laser induced break down spectroscopy (LIBS)
• Výhody – Použití pro prvky N = 11 až 95
– Minimální příprava vzorku – Ruční přístroj
X-RAY FLUORESCENCE Princip
Spektrum
TĚŽKÉ KOVY LIBS
• Příprava vzorku – Lisování
• Analýza – Excitace laserovým pulsem – Všechny prvky – Limitace energií laseru, citlivostí detektoru či spektrografu – Eliminace matrice kalibrací
LIBS Přístrojové uspořádání
Představení přístroje ST-LIBS v Arizonské poušti. Výzkum byl podpořen NATO.
Spektrum
TĚŽKÉ KOVY Detekce mědi
1-(2-pyridylazo)-2-naftol (PAN)
Chromazurol S (CS)
ZÁVĚR • Minimální příprava vzorku • Jednoduché i sofistikované metody • Rychlost analýzy
Děkuji za pozornost.
