KAJIAN MIKROSKOPIS INDUKSI N-METHYL-N-NITROSOUREA PADA KELENJAR MAMMARI KELINCI
SITI SARAH ULIA
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “Kajian Mikroskopis Induksi N-Methyl-N-Nitrosourea Pada Kelenjar Mammari Kelinci” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Juli 2010 Siti Sarah Ulia B04051059
ABSTRACT SITI SARAH ULIA. B04051059. Microscopic Study of Induction of N-Methyl-NNitrosourea on Rabbit’s Mammary Gland. Under direction of DEWI RATIH and GUNANTI The aim of this research is to study the N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU) induction on the rabbit’s mammary gland tumour formation. Six 6-9 month old, female rabbit were induced by N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU) intramammary dose 50 µg/kg Body Weight, every 1 weeks for 4 week. After 4 weeks of induction, mastectomy were done. The mammary glands were processed for histopathological examination stained with HE. One lactating rabbit was act as normal mammary control. The result showed that the N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU) could induced tumorigenesis which characterized as benign and slow growth tumor, as well as the inflammatory reaction. Keywords: Rabbit, Mammary gland, N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU), Tumorigenesis
ABSTRAK SITI SARAH ULIA. B04051059. Kajian Mikroskopis Induksi N-Methyl-NNitrosourea Pada Kelenjar Mammari Kelinci. Dibawah bimbingan DEWI RATIH dan GUNANTI Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek induksi N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU) terhadap pembentukan tumor kelenjar mamari. Sebanyak 6 ekor kelinci betina yang berumur 6-9 bulan diadaptasikan selama tiga minggu lalu diinduksi dengan N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU) intramamari dengan dosis 50 µg/kg BB sebanyak 4x setiap seminggu sekali. Setelah 4 minggu perlakuan induksi, dilakukan mastektomi kemudian jaringan kelenjar mamari dibuat sediaan histopatologi dengan pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE) dan diamati perubahan jaringan secara mikroskopis. Kelenjar mamari dari kelinci yang sedang laktasi digunakan sebagai pembanding. Hasil pengamatan preparat histopatologi kelenjar mamari menunjukkan bahwa induksi N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU) pada kelenjar mamari memicu lesio tumorigenesis yang besifat jinak dan pertumbuhan tumor yang lambat serta menimbulkan reaksi peradangan. Kata kunci : Kelinci, Kelenjar mamari, N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU), lesio tumorigenesis
KAJIAN MIKROSKOPIS INDUKSI N-METHYL-N-NITROSOUREA PADA KELENJAR MAMMARI KELINCI
SITI SARAH ULIA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
RIWAYAT HIDUP Penulis lahir di Jakarta pada tanggal 25 November1987. Penulis adalah anak ketiga dari pasangan suami isteri Lukman Hakim dan Umi Mariani. Penulis mengenyam pendidikan mulai dari SD, SLTP dan SMU pada Yayasan yang sama yaitu
Pembangunan Jaya. Pada tingkat sekolah dasar di tahun 1993, penulis
bersekolah di SD Pembangunan Jaya, kemudian melanjutkan pendidikannya di SLTP Pembangunan Jaya pada tahun 1999. Tahun 2002, penulis melanjutkan bersekolah di SMU Plus pembangunan Jaya. Selanjutnya pada tahun 2005 penulis diterima sebagai mahasiswa di Institut Pertanian Bogor melalui jalur SPMB (Saringan Penerimaan Mahasiswa Baru). Selama menjadi mahasiswi, penulis mengikuti kegiatan Himpunan Profesi SATLI (Satwa Liar), terlibat dalam kegiatan AZWMC (Asian Zoo/Wildlife Medicine and Conservation) dan menjadi Asisten Praktikum Patologi Sistemik.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR LAMPIRAN PENDAHULUAN Latar Belakang …………………………………………………….. Tujuan Penelitian ………………………………………………….. Manfaat Penelitian ……………………………………………….... TINJAUAN PUSTAKA Kelenjar Mammari ............................................................................ Tumor ……………………………………………………………… Tumor Mammari ............................................................................... N-metil-n-nitrosourea ……………………………………………... Respon Tubuh Terhadap Pertumbuhan ............................................. Kelinci ............................................................................................... MATERI DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian …………………………………….. Bahan dan Materi Penelitian ............................................................. Metode Penelitian ............................................................................. Diagram alur penelitian ....................................................... Pengadaptasian dan perlakuan terhadap kelinci ................. Induksi tumor ...................................................................... Mastektomi .......................................................................... Pembuatan sediaan histopatologi tumor ............................. Pengamatan sediaan histopatologi tumor............................. HASIL DAN PEMBAHASAN KESIMPULAN DAN SARAN Simpulan …………………………………………………...……... Saran ………………………………………………………………. DAFTAR PUSTAKA ………………………………..……………..
i ii iii iv 1 2 2 3 5 7 9 13 15 17 17 18 18 18 18 19 20 20 21 36 36 37
i
DAFTAR TABEL
Halaman 1
Penamaan tumor berdasarkan jaringan asalnya ……….…………….
6
2 3
Perbandingan ciri tumor jinak dan tumor ganas ................................ Frekuensi persentase lesio histopatologi pada mamari kelinci yang diinduksi MNU …………………………………………………….. Jumlah lesio yang muncul dari enam lapang pandang pada kelompok I-VI …………………………………………………………………. Persentase hasil pengamatan kelompok I-VI ……………………….
7
4 5
34 45 45
ii
DAFTAR GAMBAR Halaman 1
Anatomi kelenjar mamari kelinci ...................................................
3
2
Gambaran skematik histologi kelenjar mamari ..............................
4
3
Rumus molekul N-metil-N-nitrosourea ..........................................
10
4
Langkah tangga pembentukan tumor ..............................................
12
5
Persembuhan luka ...........................................................................
13
6
Respon imun terhadap tumor ……………………………………..
14
7
Kelinci penelitian ............................................................................
15
8
Gambaran mikroskopis lapisan epidermis kulit kelenjar mamari ..
21
9
Gambaran mikroskopis lapisan epidermis kelinci ..........................
22
10
Gambaran mikroskopis folikel rambut kelinci …………………...
24
11
25
12
Gambaran mikroskopis proliferasi kolagen jaringan interstitial kelinci …………………………………………………………..... Gambaran mikroskopis jaringan interstitial kelinci ......................
13
Gambaran mikroskopis bagian duktus papila kelinci perlakuan ...
27
14
Gambaran mikroskopis proliferasi pembuluh darah jaringan interstitial kelinci perlakuan ……...………………………………
28
15
Gambaran mikroskopis dermal kolagen kelinci ...........................
29
16
Gambaran mikroskopis kelenjar mamari kelinci ………………...
31
17 Gambaran mikroskopis kelenjar mamari kelinci perlakuan yang membentuk Duktus papilloma ……………………………………
33
26
iii
LAMPIRAN Halaman 1
Pembuatan preparat histopatologi …………………………………
2
Tabel 4 Jumlah lesio yang muncul dari enam lapang pandang pada kelompok I-VI ……………………………………………………. Tabel 5 Persentase hasil pengamatan kelompok I-VI …………….
2
42 45 45
iv
© Hak Cipta Milik IPB, tahun 2010 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
HALAMAN PENGESAHAN Judul Tugas Akhir Bentuk Tugas Akhir Nama Mahasiswa NIM
: Kajian Mikroskopis Induksi N-Methyl-NNitrosourea Pada Kelenjar Mammari Kelinci : Penelitian : Siti Sarah Ulia : B04051059
Disetujui,
Drh. Dewi Ratih Agungpriyono, PhD, APVet Pembimbing I
Dr. Drh. Hj. Gunanti, MS Pembimbing II
Diketahui Wakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan
Dr. Nastiti Kusumorini 1962 1205 1987 03 2 001
Tanggal Lulus:
KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas segala berkat dan kemurahan-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi tentang Kajian Mikroskopis Induksi N-Metil-NNitrosourea Pada Kelenjar Mamari Kelinci. Dengan selesainya skripsi ini, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Keluarga Tercinta (Bapak ‘Lukman Hakim’, mama ‘Umi Mariani’, kakak ‘Imron Hakim’, kakak ‘Helmiyanti’, kakak ‘Nuramalia’, kakak ‘Edward Benhard Frese’ adik ‘Oman Rizky Hakim’) atas segala kasih sayang, doa, bantuan serta dukungan yang telah diberikan. 2. Drh. Dewi Ratih Agungpriyono, PhD, APVet selaku dosen pembimbing I atas segala bimbingan, saran dan kesabaran serta segala pembelajaran yang diperoleh penulis selama penelitian dan penulisan skripsi. 3. Dr. Drh. Hj. Gunanti, MS selaku dosen pembimbing II atas segala bimbingan, saran dan kesabaran serta segala pembelajaran yang diperoleh penulis selama penelitian dan penulisan skripsi. 4. Dr. drh Sri Murtini, Msi dan drh Adi Winarto PhD selaku dosen penilai yang telah memberikan banyak masukan. 5. Dr. drh. Upik Kesumawati, MS selaku dosen pembimbing akademik atas segala bimbingan dan motivasi yang telah diberikan selama masa perkuliahan. 6. Seluruh staf dan teknisi di Bagian Patologi, Bagian Bedah, Fakultas Kedokteran Hewan IPB yang membantu penulis selama penelitian. 7. Rekan sepenelitian Betania Suswati, Data Putera dan Eva Devari atas kerjasama, bantuan dan saran dalam penelitian serta penulisan skripsi. 8. Sahabat-sahabatku (Zahrotun Nuri, Faradilla Riza, Nurfajrianti, Ratih Annisa, Pita, Retno Wulandari) atas arti sebuah sahabat. 9. Teman-teman kosan Pondok Rahma (Cilla, Etha, Putri, Nidya, Aida) 10. Kak Chandra, Kak Bayu, Kak Lilis, Jaya dan anak-anak 42 lainnya yang mengikuti proyek di Subang.
11. Wandi Himawan, Destriyanti Sugiarti, Hosiana Sanviani, Nita Natalia Sinaga, Rina Firantiani, Mariani, dan Ahmad Syifa Siddiq, Aura Maulana, Zultinur Muttaqin, Mizwar Amansyah serta angkatan Goblet ‘42 atas kenangan manis selama empat tahun ini. 12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu-persatu. Semoga penulisan ini dapat bermanfaat bagi yang membutuhkan.
Bogor, Juli 2010
Siti Sarah Ulia
PENDAHULUAN Latar belakang Setiap makhluk hidup terdiri dari sel yang merupakan susunan satuan terkecil. Sel akan terus membelah untuk memperbanyak jumlah sehingga makhluk hidup dapat terus tumbuh dan berkembang. Gangguan fisiologis tertentu misalnya tumor dapat menyebabkan pertumbuhan sel yang tidak terkendali. Terutama pada manusia dan hewan dikenal dengan sel onkogenik yaitu sel pemicu pertumbuhan tumor. Tumor dapat terjadi pada manusia maupun hewan. Hewan mamalia terutama anjing dan kucing banyak dijumpai tumor mamari. Ras anjing yang banyak terkena tumor mamari yaitu anjing ras Pointers, Retriever, Poodles, Boston Terrier, Daschund dan English Setter.
Berdasarkan tingkat keganasan tumor, kucing
merupakan hewan yang paling banyak mengidap tumor jenis ganas, misalnya kucing siamese (Ihle 2006). Penyebab tumor mamari hingga kini belum diketahui dengan pasti, adapun beberapa faktor penyebabnya adalah faktor internal dan faktor eksternal.
Faktor
internal meliputi faktor keturunan (kesalahan replikasi DNA), imunologi dan hormon sedangkan faktor eksternal yaitu radiasi, virus yang onkogenik dan zat kimia yang karsinogenik misalnya N-metil-N-nitrosourea (Schottenfeld dan Fraumeni 1996). Diagnosis tumor hingga kini masih berdasarkan tanggapan subjektif ahli patologi anatomik yaitu salah satunya dengan melakukan pemeriksaan histopatologi. Analisis histopatologi dilakukan untuk mendiagnosa dan menetapkan pengobatan yang tepat pada kasus tumor mamari. Analisa histopatologi akan menetapkan tumor tersebut termasuk tumor tipe ganas atau jinak, metastatis atau non metastatis. Histopatologi terhadap penyebaran tumor sangat penting diketahui untuk mencegah terjadinya metastatis (Himawan 1990). Terapi tumor mamari dilakukan untuk mencegah agar tumor tidak menyebar (metastatis).
Operasi pengangkatan tumor mamari (mastektomi) adalah metode
pengobatan yang banyak digunakan untuk menangani tumor mamari yang belum bermetastasis,
sedangkan
Radioterapi,
pengangkatan
limfonodus
axillaris 1
(mastektomi radikal) dan kemoterapi adalah pengobatan untuk tumor yang bermetastatis. Metode pengobatan tersebut mempunyai keunggulan dan kelemahan masing-masing dan tidak dapat seratus persen menghilangkan sel tumor yang telah menyebar di dalam tubuh. Percobaan penelitian obat antitumor, diperlukan hewan model yang memenuhi persyaratan standar dasar hewan coba yaitu mudah diperoleh dan dipelihara serta memberikan respon patofisiologi yang cenderung sama (Smith dan Mangkoewidjojo 1998). Hewan coba yang sering digunakan adalah mencit, tikus dan kelinci. Penelitian ini menggunakan kelinci karena hewan laboratorium ini mudah dipelihara dan didapatkan serta harganya terjangkau. Kelinci memiliki papila mamari yang lebih besar daripada tikus walaupun tidak sebesar kucing, selain itu kelinci lebih mudah ditangani. Hal ini memberikan nilai tambah pada kelinci sebagai hewan model tumor mamari.
Tujuan Mempelajari efek induksi N-metil-N-nitrosourea intramamari terhadap pembentukan tumor kelenjar mamari.
Manfaat Mengetahui jenis tumor yang terjadi akibat induksi karsinogen (N-metil-Nnitrosourea) intramamari.
2
TINJAUAN PUSTAKA Kelenjar Mamari Kelinci termasuk kelas mamalia yang memiliki ciri fisik yang diseliputi rambut, monotermik dan menyusui anaknya dengan adanya kelenjar mamari (Cunningham 2002). Kelenjar mamari kelinci secara anatomi terletak disepanjang regio thorax dan inguinal dan berjumlah delapan buah (Gambar 1) (O’Maley 2005).
Gambar 1 Anatomi kelenjar mamari kelinci. (Sumber:http://bibliodyssey.blogspot.com/2008/12/c omparative-breast-anatomy.html)
Perkembangan kelenjar mamari dimulai dari lapisan ektoderm dan pada lapisan ini terdapat mammary primer cord yang menjadi cikal bakal pembentukan sel alveolar.
Sel alveolar merupakan unit terkecil pada kelenjar mamari.
Puting
merupakan sistem sekresi air susu yang berkembang di permukaan dan merupakan penghubung saluran eksternal dan saluran internal kelenjar mamari. Puting pada hewan jantan jarang berkembang karena mammary primer cord tidak berkembang menjadi jaringan kelenjar (Cunningham 2002).
Gambaran skematik histologi
kelenjar mamari dapat dilihat pada gambar 2 berikut.
3
Gambar 2 Gambaran skematik histologi kelenjar mamari. (Sumber: Cunningham 2002)
Alveolar terdiri dari dua jenis sel yaitu sel epitel dan myoepitel. Sel epitel alveolar merupakan unit pengatur dengan mensekresikan glikoprotein ke lumen glandular. Sel epitel alveolar dikelilingi oleh sel myoepitel yang mengandung protein (Underwood 1992). Perkembangan kelenjar mamari dipengaruhi oleh gen dan kontrol hormon endokrin. Perkembangan kelenjar mamari pada masa neonatal sampai menjadi aktif sekresi juga dipengaruhi oleh faktor eksogenus yaitu hormon dari induk. Hormon yang mempengaruhi proliferasi sistem saluran mamari yaitu estrogen, hormon pertumbuhan, adrenal steroid sedangkan yang mempengaruhi perkembangan alveolar adalah progesteron dan prolaktin (Cunningham 2002). Kelenjar mamari merupakan kelenjar yang terdiri dari epitel kubus sebaris dan termasuk kelenjar tipe apokrin menurut cara pembentukan sekretanya, yaitu bagian dari sel sekresi hilang ketika sekresi berlangsung.
Kelenjar mamari merupakan
kelenjar majemuk/compound gland berdasarkan komponen sekreta yang dihasilkan, pada umumnya mempunyai parenkim dan stroma serta mempunyai banyak ujung kelenjar dan sistem alat penyalur yang bercabang-cabang (Dellmann dan Eurell 1998). Kelenjar mamari terdiri dari dua lapisan yaitu dermis dan epidermis. Epidermis merupakan epitel pipih banyak lapis yang terdiri dari dua tipe sel primer yaitu keratinosit (stratum Corneum, stratum Lucidum, stratum Granulosum, stratum 4
Spinosum dan stratum Basale) dan non keratinosit (Melanosit, Sel Langerhans, Sel Merkel) (Samuelson 2007). Folikel rambut, kelenjar keringat dan kelenjar sebaseus menurut Geneser (1993) ditemukan pada lapisan dermis. Lapisan dermis terbagi menjadi dua lapisan yaitu lapisan papilaris yang terdiri atas jaringan ikat longgar yang berisi serat kolagen dan papil-papil, lalu lapisan retikularis yang berisi serat kolagen yang jauh lebih padat (Macfarlane et al. 2000).
Tumor Tumor adalah sel yang tumbuh dengan ciri-ciri berproliferasi terus-menerus tidak terkontrol; jumlah dan bentuk sel hampir menyerupai sel normal baik fungsi maupun morfologinya; tidak mempunyai pola pertumbuhan yang pasti; tidak berguna bagi host/induk (Jones et al. 2006). Pertumbuhan tumor disebabkan oleh mutasi DNA dalam sel. Mutasi ini secara fisiologis mengaktifkan sel onkogenik, walaupun secara mekanis dapat memperbaiki kerusakan DNA sel. Namun apabila kerusakan DNA sel nya sangat parah maka sel akan melakukan mekanisme penghancuran diri melalui proses apoptosis. Mutasi dalam satu sel onkogenik biasanya tidak cukup menyebabkan terjadinya tumor akan tetapi untuk menyebabkan tumor dibutuhkan sejumlah mutasi DNA (Weinberg 1992). Berdasarkan tingkat keganasannya tumor dibedakan atas dua yaitu, tumor ganas dan tumor jinak. Tumor ganas biasa disebut kanker. Kanker memiliki potensi untuk menyerang dan merusak jaringan disekitarnya dengan melakukan metastasis. Tumor jinak tumbuh secara lokal menjadi besar serta biasanya tidak muncul kembali setelah pengangkatan melalui operasi. Tumor ganas yang berasal dari sel epitel, dikenal dengan karsinoma dan yang berasal dari sel mesenkim dinamakan sarkoma, selain itu ada istilah teratoma untuk tumor yang terdiri dari campuran jaringan dari tiga sel germinal yaitu endoderm, mesoderm dan ektoderm. Tumor teratoma pada hewan biasanya bersifat jinak (Cheville 2006). Berdasarkan pola pertumbuhannya, dikenal tumor yang multipel atau tunggal dan tumor yang metastasis atau non-
5
metastasis. Penamaan tumor berdasarkan jaringan asalnya ditampilkan pada Tabel 1 dibawah ini.
Tabel 1 Penamaan tumor berdasarkan jaringan asalnya JaringanAsal Jaringan ikat Jaringan fibrosa Jaringan embrionik fibrosa Tulang rawan Tulang Jaringan adiposa Histiosit Sel mast Endothelium Pembuluh darah Pembuluh limfe Otot Otot polos Otot lurik Sel darah Eritroblas Mieloblas Jaringan limfatik Limfonodus, limpa, timus Limpoblas Jaringan syaraf Glia Neuron Selubung syaraf Melanosit Epithelium Epitel skuamosa Epitel transisional Epitel kelenjar Tumor dengan multipel sel neoplastik Ovari Ginjal Kelenjar mamari
Kelenjar ludah Kelenjar apokrin
Tumor jinak
Tumor ganas
Fibroma Miksoma Kondroma Osteoma Lipoma Histiositoma Tumor sel mast
Fibrosarkoma Miksosarkoma Kondrosarkoma Osteosarkoma Liposarkoma Histiositoma ganas Tumor sel mast ganas
Hemangioma Limfangioma
Hemangiosarkoma Limfangiosarkoma
Leiomioma Rhabdomioma
Leiomioma Rhabdomiosarkoma
-
Eritroid leukemia Mieloid leukemia
-
Limfosarkoma Limfositik (blastik) leukemia
Glioma Gangloneuroma Neurofibroma (Neurilemmoma) Melanositoma
Glioblastoma Neuroblastoma Neurofibrosarkoma (Neurogeniksarkoma) Melanoma ganas
Papilloma Papilloma Adenoma
Sel skuamosa karsinoma Sel transisional karsinoma Adenokarsinoma
Teratoma Tumor campuran kelenjar mamari jinak Adenoma kompleks Adenoma kompleks Adenoma kompleks
Teratoma ganas Embryonal nefroma Tumor campuran kelenjar mamari ganas Adenokarsinoma kompleks Tumor campuran kelenjar ludah Tumor campuran kelenjar apokrin
(Sumber: Jones et al. 2006)
6
Beberapa kriteria ditetapkan untuk membedakan tumor jinak dan tumor ganas (Tabel 2).
Keganasan tumor penting ditetapkan untuk menentukan terapi dan
prognosisnya.
Tabel 2 Perbandingan ciri tumor jinak dan tumor ganas Karakteristik Kecepatan pertumbuhan Batas pertumbuhan Proses pertumbuhan Diferensiasi Stroma Metastatis Kemungkinan muncul kembali
Tumor jinak Lambat Ada Ekspansif Baik Ada Tidak ada Jarang
Tumor ganas Cepat Tidak terbatas Invasif Anaplastik Sedikit Sering Sering
(Sumber: Jones et al. 2006)
Tumor ganas tumbuhnya infiltratif, yaitu bercabang-cabang masuk diantara jaringan sehat disekitarnya sedangkan tumor jinak tumbuhnya ekspansif, yaitu mendesak jaringan sehat disekitarnya sehingga jaringan yang terdesak membentuk kapsula. Kebanyakan tumor ganas akan muncul kembali setelah dilakukan operasi pengangkatan atau setelah dilakukan pengobatan dengan penyinaran sedangkan tumor jinak tidak. Sering dijumpai inti sel yang bizzare (tidak beraturan) pada tumor ganas sedangkan tumor jinak tidak ada. Semakin ganas suatu tumor maka sifat anaplastik tumor tersebut meningkat (Himawan 1990). Immunitas tumor dikenal dengan dua macam yaitu tumor-specific antigen dan tumor-associated antigen.
Tumor-associated antigen adalah antigen yang
memperlihatkan bahwa sel tumor tersebut adalah sel neoplastik dan ada yang memperlihatkan sel normal, sedangkan tumor-specific antigen adalah antigen yang disebabkan oleh bahan kimia yang karsinogenik atau beberapa virus yang onkogenik (Jones et al. 2006).
Tumor Mamari Setiap sel pada kelenjar mamari normal mempunyai nukleus yang mengandung kromatin yang berisi DNA dan nukleolus yang mengandung RNA. Sel
7
ini mempunyai sifat reproduktif, yaitu kemampuan sel untuk selalu memperbarui diri secara periodik sehingga sel dapat berfungsi optimum.
Namun apabila sel ini
mengalami kelainan misalnya terjadi mutasi, maka dapat menimbulkan tumor (Dellman dan Carthers 1996). Tumor dapat mensintesis komponen matriks maupun menurunkan komponen matriks serta meningkatkan matriks yang berdekatan pada sel mesenkim pada jaringan interstitial. Sel tumor pada jenis tumor karsinoma menghasilkan kolagen IV dan bersama glikoprotein membentuk membran dasar (Cheville 2006). Tumor mamari pada hewan banyak terjadi pada anjing betina, sedangkan pada kucing, tumor mamari menempati urutan ketiga. Tumor mamari pada kucing sering terjadi pada umur lebih dari 8 tahun dan meningkat seiring dengan bertambahnya umur. Biasanya umur 10-12 tahun rawan terhadap timbulnya tumor mamari. Tumor mamari ganas lebih sering terjadi pada kucing daripada anjing (Ihle 2006). Semua tumor mamari berkapsul dan konsistensi padat. Ada berbagai variasi pembentukan tumor kelenjar mamari, antara lain ada yang berbentuk kombinasi papilari karsinoma, komedo karsinoma, kribiform karsinoma yang dikenal dengan tumor campuran.
Bentuk papilari adalah yang paling umum dijumpai dengan
jaringan darah yang dipenuhi dengan sel anaplastik dan adanya penonjolan pada epitel.
Komedo karsinoma adalah massa sel nekrosis pada sentral sedangkan
kribiform karsinoma adalah tumor yang berbentuk bulat atau oval yang solid dan banyak terjadi mitosis.
Pertumbuhan epitel yang menjulur ke dalam lumen
membentuk struktur serupa jari dengan sel epitel yang solid di sekitar stroma dan membran dasar rusak (Liska et al. 2000). Tumor jinak yang sering muncul pada anjing adalah benign mixed mammary tumor, adenoma, fibroadenomas, duktus papiloma serta tumor ganas yaitu tubular adenokarsinoma, papilari adenokarsinoma, solid karsinoma, anaplastik karsinoma, osteosarkoma, fibrosarkoma dan malignant mixed tumor (Foster dan Smith 2010). Pada tumor campuran (mixed tumor), ditemukan proliferasi pertumbuhan sel tumor lebih dari satu jenis sel, antara lain sel epitel alveolar dan jaringan ikat (Akhyar 2009).
8
Faktor pakan dan kegemukan serta agen kimia dan biologis tertentu dapat menjadi pemicu dan penyebab tumor mamari. Kegemukan pada hewan umur satu tahun dan makanan komersial yang mengandung bahan kimia dapat menstimuli pembentukan sel-sel tumor. Agen kimia dan biologis tertentu dapat berperan sebagai senyawa karsinogenik (pemicu kanker). Batu bara dan senyawa-senyawa turunannya dapat menyebabkan tumor pada kulit, ginjal, kelenjar mamari dan beberapa organ lainnya.
Retrovirus, papiloma virus, adenovirus dan herpes virus juga bisa
menyebabkan terjadinya tumor kelenjar mamari (Seolalita 2008). Terapi tumor kelenjar mamari dilakukan secara operasi, radioterapi dan terapi pendukung.
Prognosis tumor kelenjar mamari tergantung pada ukuran tumor,
jaringan yang terkena, ulser pada kulit, tipe histologi tumor, tingkat penyebaran atau metastatis, invasi dan infiltrasi pada pembuluh limfe (Seolalita 2008).
N-metil-N-nitrosourea N-metil-N-nitrosourea (MNU) adalah agen alkilasi yang dapat menyebabkan mutasi pada sel jika komponen sel penuh dengan genotoxin, yaitu toksin yang dapat merusak dan menyebabkan mutasi DNA (Juchimiuk et al. 2006).
Pesatnya
perkembangan industri saat ini menyebabkan banyaknya limbah kimiawi yang diantaranya memiliki sifat sebagai agen alkilasi.
Masih sedikit orang yang
memperhatikan dampak lingkungan akibat perkembangan industri. Adanya polusi udara, air, bahan makanan, minuman serta kosmetik ikut memperparah keadaan. Pengetahuan masyarakat terhadap agen alkilasi masih rendah sehingga produk bahan makanan, minuman maupun kosmetik yang beredar di masyarakat masih menggunakan bahan-bahan
yang dapat
mengalkilasi
DNA.
Agen alkilasi
menyebabkan kesalahan susunan untaian rantai DNA atau yang dikenal dengan mutasi (Lu dan Archer 1992). Berikut adalah gambaran molekul MNU (Gambar 3).
9
Gambar 3 Rumus molekul N-metil-N-nitrosourea. (Sumber: http://en.wikipedia.org/wiki/N-Nitroso-N-methylurea)
MNU mampu menumbuhkan tumor kelenjar mamari, tipe intraduktus pada mencit serta tumor duktus karsinoma pada manusia dan tikus. Selain itu MNU juga menyebabkan karsinoma campuran kelenjar mamari, duktus karsinoma, papilla karsinoma, komedo karsinoma, kribiform karsinoma dan tubular karsinoma (Liska et al. 2000). MNU juga dikenal O6-methylguanin pada DNA yang mewakili protein G pada transisi G-A selama replikasi DNA (Lu dan Archer 1992) dan pada tubuh mamalia terdapat DNA alkylguanine yaitu alkyltransferase (AGT) untuk merespon methylating agent dengan protein (D’ Ambrosio et al. 1990).
MNU tidak
memerlukan aktivasi metabolik dalam menginisiasi tumor, zat ini dapat dihancurkan secara alami menggunakan zat kimiawi. MNU dapat menghasilkan ion methyl diazonium yang bersifat karsinogen (King et al. 1981). MNU masuk ke dalam tubuh dan menyebabkan terjadinya proses biotransformasi. Biotranformasi adalah proses perubahan suatu zat di dalam tubuh menjadi suatu zat lain yang dapat dimanfaatkan tubuh atau tidak bermanfaat. Zat yang tidak bermanfaat bagi tubuh akan dikeluarkan oleh tubuh.
Tujuan proses
biotranformasi suatu zat adalah dapat membuat bahan-bahan yang tidak bermanfaat menjadi lebih larut air sehingga dapat dikeluarkan dari tubuh.
Efek samping
biotransformasi adalah dihasilkannya toksin yang dapat berinteraksi dengan DNA. Terjadinya mutasi pada untaian DNA akan memicu perkembangan neoplastik yang akan menghasilkan tumor (Purwanto 2000). Tumor tumbuh melalui tiga tahap yang dikenal dengan tumorigenesis, yaitu inisiasi, promosi dan progresi lalu menjadi tahap ganas. Tahap inisiasi adalah proses
10
perubahan sel yaitu saat karsinogen berinteraksi dengan DNA dan menyebabkan kerusakan DNA. Tahap promosi adalah tahap mutasi sel terjadi dan menstimulasi pertumbuhan dengan memperbanyak sel. Asap rokok dan MNU bekerja pada tahap ini dalam pembentukan tumor. Selanjutnya tahap progresi terjadi saat sel tumor telah tumbuh melebihi sel normal (Schottenfeld dan Fraumeni 1996). Penggunaan MNU dalam induksi sel tumor telah dilaporkan memiliki beberapa keuntungan, antara lain kespesifikasikan terhadap organ yang diinduksi, tumor yang berasal dari kelenjar terutama yang bersifat ganas (Roomi et al. 2005). Pertumbuhan tumor akibat MNU terjadi melalui proses kumulatif. Jumlah paparan zat kimia karsinogenik yang banyak dapat menimbulkan tumor baik pada dosis bertingkat maupun tidak. Individu yang terpapar banyak MNU dapat terbentuk tumor pada tubuhnya sedangkan yang normal, tidak banyak terpapar MNU sehingga tidak akan tumbuh tumor), namun hal ini tidak sepenuhnya benar sebab masih ada faktor lain yang dapat menimbulkan tumor atau tidak pada tubuh hewan misalnya imunitas tubuh yang sangat baik pada hewan maka akan mencegah pembentukan tumor. Gen penekan tumor (Supressor gen tumor) juga merupakan salah satu faktor yang dapat menghambat pertumbuhan tumor. Gen penekan tumor yang aktif ketika tumor tumbuh adalah Rb protein dan P53. P53 dapat menghentikan siklus sel hingga DNA kembali normal, sebab beberapa karsinogen berinteraksi dengan DNA (Slauson dan Cooper 2002).
Macfarlane et al. (2000) menambahkan P53 juga memicu
terjadinya apoptosis. Apoptosis merupakan suatu proses aktif yakni kematian sel melalui digesti enzimatik oleh dirinya sendiri dan mekanisme yang efisien untuk mengeliminasi sel yang tidak diperlukan dan mungkin berbahaya bagi tubuh sehingga dapat menyelamatkan organisme (Syaifudin 2007). Beberapa karsinogen berinteraksi dengan DNA dan menyebabkan proliferasi sel pada tahapan siklus sel baik G1, G2, G0 serta S. Proses pembentukan tumor dapat dikenal dengan istilah tumorigenesis. Gambar 4 dibawah ini adalah tahapan pembentukan tumor mulai dari tumor jinak hingga tumor ganas. Gambar 4 tersebut memperlihatkan pembentukan tumor yang
11
dimulai dari tangga pertama yaitu sel yang masih normal kemudian pada tangga kedua sel mengalami inisiasi akibat pengaruh lingkungan yang banyak mengandung zat karsinogenik. Berikutnya sel bermutasi hingga sel onkogen aktif dan gen penekan tumor terbentuk dalam jumlah sedikit.
Apabila kejadian ini terus menerus
berlangsung maka akan menyebabkan proliferasi yang diperlihatkan pada tangga keenam. Apoptosis pun terjadi, yaitu kematian sel yang terprogram akibat bahan yang bersifat karsinogen.
Tujuan terjadinya apoptosis adalah untuk mengurangi
jumlah sel yang mengalami proliferasi dan mutasi. Pembentukan tumor ganas dapat terbentuk bila terjadi metastasis ke organ lain melalui pembuluh darah dan pembuluh limfe (Macfarlane et al. 2000).
Gambar 4 Langkah tangga pembentukan tumor. (Sumber: Macfarlane et al. 2000)
12
Respon Tubuh Terhadap Pertumbuhan Tumor Tumor menyebabkan apoptosis dan nekrosis serta menimbulkan peradangan (Degenhardt et al. 2006). Peradangan merupakan respon imun tubuh apabila ada antigen yang masuk ke dalam tubuh (Aughey dan Frye 2001). Antigen yang bersifat neoplastik
disebut
dengan
tumor-spesific
antigens
(TSA),
tumor-spesific
transplantation antigen (TSTA) atau tumor associated transplantation antigens (TATA). Peradangan juga menimbulkan reaksi persembuhan yang melibatkan makrofag, keping-keping darah. Lebih jelasnya dapat dilihat pada gambar 5 berikut
Gambar 5 Persembuhan luka. (Sumber: Macfarlane et al. 2000)
13
Proses persembuhan luka pertama kali adalah terbentuknya ulkus akibat peradangan akut kemudian terbentuk neovaskularisasi dan makrofag berdatangan misalnya neutrofil pada hari berikutnya. Seminggu kemudian jaringan ikat mulai terbentuk dan neovaskularisasi masih ada.
Kolagen terbentuk transversal serta
neovaskularisasi mulai berkurang pada minggu kedua (Macfarlane et al. 2000). Respon
tubuh
selain
proses
peradangan
dan
persembuhan
adalah
pembentukan imunitas. Tumor berhubungan dengan peradangan yang kemudian akan merespon infiltrasi makrofag dan limfosit-T yaitu CD4+ and CD8+ (Al Murri AM 2008). Observasi menjelaskan bahwa reaksi imun tubuh terhadap pembentukan tumor masih merupakan kontroversi. Antigen yang masuk ke dalam tubuh bukan berarti dapat menimbulkan reaksi imun, namun pembentukan imun sangat berperan dalam pertumbuhan tumor (Slauson dan Cooper 2002). Sel NK atau dikenal dengan sebutan natural killer cell merupakan sel utama yang bekerja dalam merespon tumor. Lebih jelasnya dapat dilihat pada gambar di bawah ini.
Gambar 6 Respon imun terhadap tumor. (Sumber: Tizard 1994)
Sel NK menghasilkan IFN-ᵞ (interferon) sebagai bentuk pertahanan tubuh yang kemudian akan mengaktifkan TNF-α yang bersifat sitotoksik atau membunuh sel tumor tersebut. Makrofag pun diaktivasi dan menghasilkan nitrit oksida yang dapat menghancurkan sel.
Lymphokine-activated killer cells (LAK cells) juga
terbentuk untuk melawan tumor (Tizard 1994).
14
Kelinci Kingdom kelinci adalah Animalia, filum vertebrata, kelas mammalia. Ordo Lagomorpha, famili Leporidae, Subfamili Leporine, Genus Oryctolagus dan Spesies Oryctolagus cuniculus (Sarwono 2005). Kelinci dapat dilihat pada gambar 7.
Gambar 7 Kelinci penelitian.
Kelinci adalah hewan yang dahulunya liar kemudian diternakan oleh manusia karena sifatnya yang jinak, daya reproduksi tinggi dan mudah diberi pakan. Kelinci diternakan untuk diambil bulu, daging, maupun digunakan sebagai hewan laboratorium. Kelinci dapat bertahan hidup dan bereproduksi pada daerah tropis dan memiliki kekuatan yang cukup sehingga dapat dijadikan hewan percobaan atau hewan laboratorium (Hustamin 2005).
Sebagai hewan laboratorium, kelinci
merupakan hewan ketiga setelah mencit dan tikus yang banyak digunakan dalam penelitian. Kelinci-kelinci terdiri dari berbagai macam jenis ras.
Ada ras Angora,
English, Japanese atau Harlequin dan jenis ras yang lain adalah American Chincilla, ras Flemish Giant, Polish, Himalayan, Lop, Silver dan Tan (Sarwono 2005). Jenis ras yang lain seperti Californian yang merupakan persilangan antara kelinci spesies New Zealand white dan Himalayan atau Chincilla. Ras California ini sangat terkenal di Amerika Serikat sebagai kelinci penghasil daging. Ada lagi jenis ras Dutch yang terkenal diseluruh dunia sebagai jenis kelinci peliharaan. Sebenarnya banyak lagi
15
jenis ras kelinci yang lain, seperti ras Havana dan Lop yang berciri khas mempunyai kepala lebar namun Havana mempunyai telinga tegak dan Lop telinganya terkulai ke bawah (Sarwono 2005). Kelinci yang dipelihara di Indonesia sebagian besar adalah jenis kelinci berketurunan ras Nederland dwarf (Sarwono 2005). Khususnya di Jawa, kelinci tersebut dibawa oleh orang-orang Belanda dan diternakkan di Indonesia yang dikenal dengan sebutan Lepus negricollis adapun yang berasal dari Sumatera dikenal dengan nama Nesolagus nerseherischlgel (Hustamin 2005). Kelinci jantan ras lokal (lepus negricollis) memiliki berat badan 1,5-7,0 kg dan kelinci betina 1,4-6,5 kg untuk yang dewasa, suhu tubuh kelinci normal adalah 38,0-40,1oC dengan rata-rata 39,5oC.
Kelinci mempunyai puting susu sebanyak
delapan puting yang terdiri dari satu pasang di daerah dada, dua pasang di daerah perut dan satu pasang lagi di daerah selangkangan. Plasenta kelinci bertipe diskoidal hemoendothelial. Uterusnya memiliki dua tanduk (bikornis) dan juga memiliki dua serviks. Pada umumnya kelinci dapat bertahan hidup selama 5-10 tahun bahkan sampai 12 tahun. Lama buntingnya 30-31 hari dengan melahirkan anak rata-rata 4 sampai 10 anak (Smith dan Mangkoewidjojo 1998).
16
MATERI DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Bagian Bedah dan Radiologi serta Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi serta kandang Hewan Percobaan yang dikelola oleh Unit Pelayanan Teknis Hewan Laboratorium (UPT Helab), Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Induksi tumor ini dilaksanakan dari awal bulan Mei sampai akhir Juli 2008 kemudian dilanjutkan bulan April 2009 sampai Januari 2010 untuk pengamatan jaringan.
Alat dan Bahan Alat Peralatan yang digunakan untuk memelihara kelinci adalah kandang, tempat makan dan tempat minum, syringe 1 ml dan kapas beralkohol. Peralatan untuk operasi adalah ruang operasi yang telah disterilisasikan terlebih dahulu pada sehari sebelum operasi, timbangan, lampu operasi, meja operasi, syringe 1 ml, syringe 3 ml, stetoskop, mistar, termometer, stopwatch, duk steril, klem, skalpel, needle holder, jarum jahit berpenampang bulat dan segitiga, pinset anatomis, pinset sirurgis, gunting bedah (lancip-tumpul, bengkok, dan lancip-lancip) serta tang arteri. Perlengkapan operasi seperti pakaian operasi, handuk, sikat, sarung tangan, masker beserta penutup kepala yang disterilisasikan. Peralatan untuk membuat sediaan histopatologi adalah peralatan nekropsi, tissue cassette, mikrotom, gelas objek, gelas penutup dan untuk mengamati sediaan histopatologi adalah mikroskop cahaya, sediaan histopatologi tumor dan kamera mikroskopi digital.
Bahan Hewan yang digunakan pada penelitian ini adalah kelinci betina (kelinci lokal) yang berumur 6 sampai 9 bulan (telah dewasa kelamin) sebanyak 7 ekor.
17
Pakan kelinci berupa pelet yang diberikan dua kali sehari serta air minum ad libitum. Bahan induksan tumor adalah N-metil-N-nitrosourea (MNU) dan NaCl fisiologis. Bahan yang digunakan pada saat operasi adalah alkohol 70%, kapas, iodium tincture 3%, ketamin HCl 10%, xylazine 2%, sabun, antibiotik penicillin yang telah diencerkan, antibiotik umum (Novamox-G®), NaCl fisiologis, benang cat gut 4/0, benang silk 3/0, tampon, kain kasa dan plester. Bahan untuk pembuatan sediaan histopatologi tumor adalah larutan fiksatif Buffer Netral Formalin 10%, larutan alkohol 70% alkohol 80%, 90%, 95%, larutan alkohol absolut, xylol dan parafin, serta pewarna hematoksilin-eosin (HE).
Metode Penelitian
Diagram alur penelitian
Pengadaptasian dan perlakuan terhadap kelinci Kelinci betina yang berumur 6-9 bulan (telah dewasa kelamin) sebanyak 7 ekor
diadaptasikan
selama
tiga
minggu
dalam
masing-masing
kandang.
Pengadaptasian ini bertujuan untuk menyesuaikan kondisi kelinci dengan lingkungan kandang dan mencegah kebuntingan. Kelinci-kelinci tersebut dikelompokkan menjadi dua kelompok yaitu: Kelompok kontrol terdiri dari satu ekor kelinci yang sedang laktasi dan kelompok perlakuan terdiri dari enam kelinci tidak sedang laktasi yang diinduksi MNU.
Induksi tumor Kelinci telah diadaptasikan selama tiga minggu dan diinduksi tumor dengan N-metil-N-nitrosourea (MNU). MNU yang digunakan sebanyak 1 mg dilarutkan
18
dalam 10 ml Nacl fisiologis (konsentrasi 100 µg/ml). Dosis MNU yang digunakan adalah 50 µg/kg BB. Induksi tumor dilakukan pada kelenjar mamari nomor dua pada sisi kiri dan kanan melalui puting (intramamari) sebanyak empat kali dalam empat minggu yaitu pada minggu pertama, kedua, ketiga dan keempat. Sebelum dilakukan penginduksian intramamari, berat badan kelinci ditimbang dan rambut-rambut di sekitar puting dicukur serta disucihamakan dengan menggunakan alkohol 70%. Penginduksian intramamari dilakukan tegak lurus terhadap sumbu tubuh kelinci. Perubahan jaringan kelenjar mamari akibat induksi MNU ini dipelajari dengan membandingkan kelinci kontrol (kelinci yang sedang laktasi). Kelinci laktasi ini mempunyai kelenjar mamari lebih jelas terlihat secara mikroskopis daripada kelinci normal. Pengamatan ada tidaknya lesio dilakukan pada 6 lapang pandang dari masing-masing bagian epidermis, interstitial dermis dan kelenjar mamari.
Mastektomi Mastektomi dilakukan pada minggu kelima yaitu setelah tumor teraba yang menandakan bahwa tumor telah tumbuh pada kelenjar mamari kelinci.
Sayatan
mastektomi berbentuk elips mengelilingi daerah kelenjar mamari yang telah diinduksi tumor. Adapun beberapa tahapan mastektomi yang dilakukan adalah sebagai berikut: Praoperasi, dilakukan pemeriksaan general pada kelinci untuk mengetahui kondisi umum kelinci meliputi temperatur tubuh, frekuensi jantung, frekuensi nafas dan gizi. Kemudian kelinci ditimbang untuk menentukan dosis anaestetikum yang akan diberikan yaitu xylazine 2% dengan dosis 2 mg/kg BB dan ketamin HCl 10% dengan dosis 10 mg/kg BB secara intramuskular. Selanjutnya bulu dicukur pada bagian abdomen dan sekitar mamari kemudian didesinfeksi dengan menggunakan alkohol 70% dan iodium tincture 3%. Operasi pengangkatan dilakukan secara perlahan dan teliti. Luka kemudian ditutup dengan verban dan plester. Post Operasi, selesai operasi, kelinci diberi antibiotik umum yaitu (NovamoxG®) secara intramuskular dengan dosis 50 mg/50 kg BB kemudian dirawat di dalam kandang. Selama masa perawatan, kelinci diberi pakan dan minum yang baik. Setiap
19
hari luka dibalut dengan verban dan diberi iodium tincture 3%. Verban diganti setiap hari serta diberi iodium tincture 3% untuk menjaga kebersihannya. Benang dibuka setelah luka kering yaitu sekitar seminggu setelah operasi.
Pembuatan sediaan histopatologi tumor Dilakukan pembuatan sediaan histopatologi tumor yang terdiri dari beberapa tahapan yaitu, tahap sampling dan fiksasi jaringan di dalalm larutan buffer netral formalin 10%; Proses jaringan (dehidrasi, clearing dan infiltrasi parafin dilakukan menggunakan automatic tissue processor); Tahap embedding atau penanaman jaringan di dalam parafin dilakukan menggunakan alat tissue embedding console; Tahap pemotongan jaringan setebal 5 µm dilakukan menggunakan mikrotom; Tahap pewarnaan jaringan menggunakan pewarna Hematoksilin dan Eosin. Proses detil dari pembuatan sediaan histopatologi ditampilkan dalam lampiran 1.
Pengamatan sediaan histopatologi tumor Pengamatan sediaan histopatologi tumor dilakukan di bagian Patologi FKH IPB. Mikroskop yang digunakan adalah mikroskop cahaya. Kemudian gambaran histopatologi yang mewakili difoto dengan kamera digital. Pengamatan dilakukan pada tiga area kelenjar mamari yaitu epidermis, dermis dan kelenjar mamari. Mengamati ada tidaknya lesio pada masing-masing area. Lesio yang diamati pada bagian epidermis adalah hiperplasia epidermis, pembentukan ulkus dan proliferasi folikel rambut, pada bagian interstisial dermis diamati proliferasi pembuluh darah, neovaskularisasi, hemoragi, serta proliferasi kolagen. Lesio yang diamati pada bagian kelenjar mamari adalah hiperplasi epitel kelenjar mamari, pertumbuhan epitel dengan pola papilari dan mitosis. Keberadaan lesio diamati pada 6 lapang pandang menggunakan perbesaran 4x lensa objektif. Lesio yang ditemukan pada masing-masing area pengamatan, dianalisa secara deskriptif, dikelompokkan dalam lesio tumorigenesis atau reaksi peradangan. Jenis lesio yang terjadi kemudian dihitung persentase kemunculannya. Lebih jelasnya dapat dilihat pada Lampiran 2 Tabel 4 dan 5.
20
HASIL DAN PEMBAHASAN
Lapisan epidermis pada kelinci perlakuan ditemukan adanya ulkus yang tidak disertai pertumbuhan massa tumor. Ulkus yang terbentuk ditandai dengan hilangnya lapisan epidermis yang digantikan oleh adanya fibrin dan cairan plasma serta sel-sel debris (Gambar 8). Menurut Macfarlane et al. (2000) ulkus merupakan hilangnya lapisan permukaan jaringan atau organ yang disebabkan oleh nekrosis dan digantikan oleh jaringan inflamasi. Timbulnya ulkus ini diduga dipicu oleh peradangan kronis pada dermis. Proses peradangan ini terjadi karena induksi N-metil-N-nitrosourea (MNU) intramamari menyebabkan iritasi jaringan dermis.
Gambar 8 Lapisan epidermis kulit kelenjar mamari. (a) Ulkus, (b) Infiltrasi sel radang, (c) Proliferasi kolagen. Pewarnaan HE, Skala 200 µm.
Lapisan epitel epidermis pada kelinci perlakuan mengalami hiperplasia dan terjadi peningkatan jumlah sel epidermis dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 9A dan 9B). Macfarlane et al. (2000) mengatakan bahwa reaksi hiperplasia dapat terjadi sebagai akibat reaksi adaptasi dari peradangan di bagian dermis.
21
Slauson dan Cooper (2002) menambahkan bahwa reaksi hiperplasia juga merupakan bagian dari tahap progresi dari tumorigenesis.
Gambar 9 Lapisan epidermis kelinci perlakuan (A) dan kelinci kontrol (B). (a) Epitel epidermis, (b). Dermis. Perwarnaan HE, Skala 100 µm, Gambar 21insert adalah perbesaran dengan skala 40 µm (c) Sel epidermis.
22
Pemberian MNU menyebabkan proliferasi folikel rambut seperti tampak pada gambar 10A pada kelinci perlakuan.
Jumlah folikel rambut terlihat meningkat
dibandingkan dengan kelinci kontrol (Gambar 10B).
Adanya proliferasi folikel
rambut mengindikasikan bahwa banyak sel yang melakukan pembelahan atau mitosis (Price dan Lorraine 2006). Pembelahan sel ini terjadi akibat adanya peningkatan fungsi organ tersebut (Jones et al. 2006).
Proliferasi folikel merupakan lesio
tumorigenesis. Apabila proliferasi terjadi maka biasanya diikuti dengan hiperplasia, yaitu hiperplasia sel-sel folikel rambutnya. Hiperplasia merupakan tahapan menuju pembentukan tumor (Jones et al. 2006). Pemberian MNU menyebabkan proliferasi folikel rambut terutama sel-sel matriks rambut yang berproliferasi pada tahap anagen atau pembentukan rambut seperti disebutkan Hai et al. (1997). Adanya proliferasi folikel rambut merupakan salah satu tahapan inisiasi pembentukan tumor pada bagian epidermis kelenjar mamari.
Joan (2008) menyatakan bahwa tumor folikel rambut pada umumnya
bersifat jinak.
Di bawah ini adalah gambaran folikel rambut kelinci perlakuan
(Gambar 10A) dan proliferasi folikel rambut pada kelinci kontrol (Gambar 10B).
23
Gambar 10 Folikel rambut kelinci perlakuan (A) dan kelinci kontrol (B). ( Perwarnaan HE, Skala 80 µm.
) Folikel rambut.
24
Gambar 11 Jaringan interstitial kelinci perlakuan (A) dan kelinci kontrol (B). (a) Kolagen, (b) Kelenjar mamari. Pewarnaan HE, Skala 200 µm.
Proliferasi kolagen nampak terlihat jelas pada kelinci perlakuan (11A) dibandingkan dengan kelinci kontrol (11B). Perbandingan banyaknya kolagen pada kelinci perlakuan dan kelinci kontrol ditunjukkan oleh tanda panah hitam. Proliferasi kolagen merupakan lesio peradangan menurut Macfarlane et al. (2000). Kolagen adalah komponen paling penting dalam extracellular matrix (ECM) dan memegang peranan dalam adhesi, pergerakan, diferensiasi, proliferasi dan metastasis tumor sel (Honma et al. 2007). Kolagen tipe I, IV, XV, XVIII dapat mengurangi proses angiogenesis dan tumorigenesis (Honma et al. 2007). Pertumbuhan tumor dapat mempengaruhi pembentukan kolagen.
Kolagen akan
bertambah sejalan dengan pertumbuhan tumor. Proses progresi mamari karsinoma menyebabkan kolagen degradasi sehingga kolagen semakin sedikit (Curino et al. 2005). Kolagen pada penelitian ini mengalami proliferasi dan tidak berimbang dengan tumor yang masih dalam pertumbuhan tahap awal. Kolagen pada penelitian ini merupakan reaksi dari peradangan. MNU menghasilkan ion methyl diazonium yang dapat menjadi karsinogen (King et al. 1981). Zat alkilasi ini bersifat toksik dan dapat menyebabkan iritasi dan mutasi (Irene 2007).
MNU menyebabkan iritasi pada dinding pembuluh darah
25
sehingga mengakibatkan darah keluar secara pereksis yang dikenal dengan hemorragi (Becker et al. 1996). Peristiwa ini terjadi pada kelinci perlakuan (Gambar 12).
Gambar 12 Jaringan interstitial kelinci perlakuan. ( 80 µm.
) hemorragi. Pewarnaan HE, Skala
Hemorragi menyebabkan banyaknya makrofag yang terbentuk yang dapat mereabsorpsi sel darah merah dengan memfagosit dan mendegradasi fibrin dan sel darah merah yang terbentuk di jaringan. Bentuk makrofag seperti ini disebut dengan hemosiderofag (Slauson dan Cooper 2002). Sel-sel radang yaitu neutrofil, eosinofil dan limfosit banyak ditemukan pada kelinci perlakuan terutama eosinofil di epitel duktus mamari (Gambar 13).
26
Gambar 13 Bagian duktus papila kelinci perlakuan. ( HE, Skala 20 µm.
) Sel radang eosinofil. Pewarnaan
Menurut Feldman dan Jain (2000) banyaknya eosinofil tersebut berkaitan langsung dengan tingkat keparahan peradangan yang terkait dengan respon imun. Peningkatan respon imun ini bertujuan untuk mencegah progresi sel-sel tumor. MNU akan memicu aktifitas sel T dengan meningkatkan sitokin diantaranya Interleukin 3 (IL-3) dan Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) (Scherer 1997). Limfosit tidak banyak ditemukan pada pembentukan tumor ini. Peradangan yang terjadi adalah subakut menuju kronis sehingga neutrofil masih dapat terlihat (Slauson dan Cooper 2002). Banyak ditemukan pembentukan kapiler baru atau neokapilerisasi pada bagian dermis.
Neokapilerisasi, dapat terjadi pada proses peradangan sebagai bagian
rangkaian dari persembuhan luka (proses peradangan) atau merupakan proses tumorigenesis.
Neovaskularisasi pada pertumbuhan tumor berbeda dengan
neovaskularisasi pada tahapan persembuhan proses peradangan.
Perbedaannya
27
adalah terletak pada neovaskularisasi yang persisten atau tidak akan hilang seperti pada peradangan namun akan tetap ada bahkan terus berproliferasi (Slauson dan Cooper 2002).
Sel radang banyak ditemukan pada neovaskularisasi akibat
peradangan sedangkan pada neovaskularisasi akibat tumor tidak ditemukan sel radang. Neovaskularisasi pada proses peradangan akan hilang dengan sendirinya setelah kira-kira satu sampai dua minggu (Macfarlane et al. 2000). Pada pembentukan tumor, sel neoplastik membutuhkan nutrisi dan oksigen untuk dapat bertahan oleh karenanya banyak terjadi pembentukan pembuluh darah baru atau neovaskularisasi. Banyaknya neovaskularisasi pada jaringan menyebabkan proliferasi pembuluh darah pada jaringan bahkan beberapa pembuluh darah bertambah besar ukurannya, hal ini mengindikasikan tumbuhnya tumor pembuluh darah atau dikenal dengan hemangioma (Slauson dan Cooper 2002). Berikut adalah gambar proliferasi pembuluh darah (Gambar 14).
Gambar 14 Jaringan interstitial kelinci perlakuan. (
) Proliferasi pembuluh darah.
Pewarnaan HE, Skala 200 µm.
28
Gambar 15 Dermal kolagen kelinci perlakuan (A) dan Kelinci kontrol (B).( darah. Pewarnaan HE, Skala 100 µm.
) Pembuluh
29
Gambar di atas adalah perbandingan gambaran pembuluh darah pada kelinci perlakuan (15A) dan kelinci kontrol (15B). Neovaskularisasi pada kelinci perlakuan banyak sekali ditemukan sedangkan pada kelinci kontrol tidak ada. Kelinci perlakuan (Gambar 16A) kelenjar mamari mengalami proliferasi yang ditunjukkan dengan adanya hiperplasia dari epitel kelenjar, sedangkan pada kelinci normal tidak ditemukan adanya hiperplasia epitel pada kelenjar.
Pada kelinci
perlakuan ditemukan adanya perubahan epitel kubus sebaris menjadi epitel silindris banyak baris. Ditemukan adanya lesio yang terbentuk di jaringan kelenjar mamari pada bagian dermis yang hanya terletak di lapisan dermis. Pemberian MNU pada kelenjar mamari kelinci menyebabkan perubahan hiperplastik dari epitel kelenjar mamari. Gambaran tersebut dapat dilihat pada gambar 16A. Menurut Roomi et al. (2004) bahwa lesio yang timbul akibat pemberian MNU adalah sel epitel kelenjar dan stroma proliferasi.
30
Gambar 16 Kelenjar mamari kelinci kelompok perlakuan (A) dan kelinci kontrol (B). ( ) Epitel kelenjar mamari. Pewarnaan HE, Skala 40 µm.
Epitel kelenjar mamari yang semula adalah epitel kubus sebaris pada kelinci kontrol menjadi epitel silindris banyak baris pada kelinci perlakuan (Gambar 16A). Kelenjar mamari yang diinduksi MNU menunjukkan adanya hiperplasia yang
31
menandakan awal pertumbuhan tumor (Jones et al. 2006). Pada kelinci kontrol kelenjar mamari juga mengalami hiperplasia. Hiperplasia yang terjadi ini adalah fisiologis karena kelinci tersebut adalah kelinci laktasi. Guyton dan Hall (1997) menyatakan bahwa hiperplasia pada kelenjar mamari laktasi terjadi akibat pengaruh hormon oksitosin, progesteron, prolaktin dan estrogen. Epitel kelenjar mamari hiperplasia merupakan lesio premalignant yang memungkinkan pembentukan karsinoma pada kelenjar mamari selanjutnya. (Underwood 1992). Tumor jenis malignant (tumor ganas) akan memperlihatkan area yang hemorragi, nekrosis dengan tingkat sel mitosis yang tinggi (Chand et al. 2006), namun pada penelitian ini tidak ditemukan sel mitosis karena pertumbuhannya yang lambat. Aktifitas mitotik pada tumor jinak jarang dan lambat (Anonim 1997). Kelenjar mamari selalu menjadi sasaran oleh N-metil-N-nitrosourea (MNU) dalam hal menimbulkan tumor karena efek onkogen pada kelenjar mamari sangat spesifik (Cardiff dan Munn 1995).
Bagian duktus kelenjar mamari mengalami
hiperplasia dan proliferasi kemudian berlanjut membentuk papiloma yang biasanya disebut dengan duktus papilloma. Duktus papilloma termasuk perubahan yang digolongkan tumor jinak yang tumbuh soliter di dalam duktus besar.
Kelenjar mamari pada duktus papilloma
terlihat sebagai struktur yang panjang berkelok-kelok dan lesio ini
ditemukan
sepanjang duktus (Sander 2007). Pola duktus papilloma ditemukan pada kelenjar mamari kelinci perlakuan (Gambar 17).
32
Gambar 17 Kelenjar mamari kelinci perlakuan yang membentuk Duktus papilloma (a). Pewarnaan HE, Skala 100µm.
Lumen kelenjar mamari tampak dipenuhi penjuluran-penjuluran dari epitel duktus tersebut.
Duktus papilloma merupakan tipe tumor mamari selain
fibroadenoma, adenoma dan tumor jaringan ikat (Underwood 1992).
Gambaran
mitosis pada epitel kelenjar mamari merupakan ciri menuju pembentukan karsinoma (Rivera et al. 1994), tetapi gambaran mitosis tidak terlihat pada pengamatan, menunjukkan induksi tumor akibat MNU pada kasus ini adalah bersifat jinak. Secara garis besar pembahasan di atas menjelaskan bahwa pemberian MNU secara intramamari menyebabkan beberapa lesio tumorigenesis dan lesio akibat peradangan. Lesio tumorigenesis yaitu terbentuknya hiperplasi epidermis, proliferasi folikel rambut, proliferasi pembuluh darah, neovaskularisasi, hemorragi, proliferasi dermal kolagen, hiperplasia epitel kelenjar mamari, pembentukan duktus papilloma. Lesio yang bukan tumorigenesis adalah terbentuknya ulkus. Frekuensi kemunculan masing-masing jenis lesio dihitung persentasenya dan disajikan pada Tabel 3.
33
Tabel 3 Frekuensi persentase lesio histopatologi pada mamari kelinci yang diinduksi MNU Area Pengamatan Epidermis
Dermis
Kelenjar mamari
Lesio yang diamati
Frekuensi (Persen)
Ulkus
5%
Hiperplasia epidermis
3%
Proliferasi folikel rambut
16%
Proliferasi kolagen Hemorragi Proliferasi pembuluh darah
10% 7%
Neovaskularisasi
24%
Duktus papilloma
1%
Hiperplasia epitel kelenjar mamari
15%
Mitosis
0%
19%
Persentase Duktus papilloma yang muncul pada penelitian ini minim yaitu sekitar 1%. Hal ini disebabkan pembentukan tumor yang terjadi masih pada tahap awal yaitu tahap inisiasi-promosi. Tahap inisiasi adalah suatu proses pada genom sel yang mengakibatkan potensi neoplastik.
Tahap promosi adalah proses stimulasi
proliferasi sel hingga transformasi sel (Underwood 1992). Lesio lainnya pada epidermis adalah proliferasi folikel rambut dan epidermis hiperplasia yang menunjukkan lesio tumorigenesis. Pada dermis, ada lesio proliferasi kolagen, proliferasi pembuluh darah, neovaskularisasi, hemorragi yang merupakan lesio tumorigenesis yang menunjukkan angka signifikan. Epitel kelenjar mamari hiperplasia pada kelenjar mamari juga merupakan lesio tumorigenesis sedangkan ulkus merupakan lesio peradangan. Tumor yang tumbuh dapat dikatakan masih pada tahap awal karena waktu perlakuan atau masa induksinya hanya satu bulan, sedangkan pada beberapa penelitian lainnya waktu yang digunakan adalah selama tiga bulan bahkan lebih (Roomi et al. 2005). Karakteristik tumor yang dapat diamati dalam penelitian ini adalah pertumbuhan tumor yang lambat kemudian batas pertumbuhannya juga jelas. Tahap tumorigenesis yang masih awal menunjukkan bahwa tumor yang terbentuk
34
pada penelitian ini adalah tergolong jinak. Lesio yang ditemukan pada penelitian ini umumnya merupakan lesio tumorigenesis dan juga menunjukkan bahwa tumor yang tumbuh masih tergolong jinak. Adapun beberapa lesio yang terlihat pada tumor jinak yaitu, hiperplasia lobular, hemorragi, hiperplasia epitel kelenjar, proliferasi epitel kelenjar (Anonim 1997).
35
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Dari hasil pengamatan yang dilakukan secara mikroskopis terhadap jaringan mamari kelinci disimpulkan bahwa pemberian MNU secara intramamari memicu lesio tumorigenesis yang besifat jinak dan lambat serta menimbulkan reaksi peradangan.
Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai gambaran histopatologi tumor kelenjar mamari yang diinduksi N-metil-N-nitrosourea dengan waktu yang lebih lama ditunjang dengan pemeriksaan kimia darah untuk mengetahui tipe tumornya serta rute pemberian N-metil-N-nitrosourea yang berbeda.
36
DAFTAR PUSTAKA [Anonim]. 1998. Tumor. http://id.wikipedia.org/wiki/Tumor (19 Desember 2008) [Anonim]. 1999. www.sinarharapan.co.id (28 Desember 2008) [Anonim]. 2000. http://en.wikipedia.org/wiki/N-Nitroso-N-methylurea (19 Desember 2008) [Anonim]. 1997. Benign Breast Lesions. www.breastdiseases.com/benignb3.htm (19 Februari 2010) [Anonim]. 2008. Comparative Breast Anatomy. http://bibliodyssey.blogspot.com/2008/12/comparative-breast-anatomy.html (4 Februari 2010)
Akhyar A. 2009. Neoplasma. Neoplasma-ahmad-akhyar.blogspot.com/ (31 Desember 2009) Al Murri AM, Hilmy M, Bell J, Wilson C, McNicol AM, Lannigan A, Doughty JC dan McMillan DC. 2008. The relationship between the systemic inflammatory response, tumour proliferative activity, T-lymphocytic and macrophage infiltration, microvessel density and survival in patients with primary operable breast cancer. British Journal of Cancer v.99(7) Aughey E and Frye FL. 2001. Comparative Veterinary Histology. UK: Manson Publishing Becker WM, Reece JB and Poenie MF. 1996. The World of The Cell. Menlo Park: USA Cardiff RD and Robert JM. 1995. Comparative Pathology of Mammary Tumorigenesis In Transgenic Mice. University of California 90: 13-19 Chand CK, RK Bhardwaj, Maj TJR. 2006. Study of 7 Cases of Giant Cell Tumor of Soft Tissue. MJAFI; 62 : 138-140 Cheville NF. 2006. Introduction To Veterinary Pathology (Third edition). USA : Blackwell Publishing Crist KA, Raymond DF, Bina C, Prabir C, Ming Y. 1996. Brief Communication: P53 Accumulation in N-metil-N-nitrosourea-Induced Rat Mammary Tumors. SAGE 24:370-375
37
Cunningham JG. 2002. Textbook of Veterinary Physiology (Third edition). Philadelphia: W.B. Saunders Company Curino AC , Lars HE, Susan SY, Kenn H, Leif RL, Alfredo AM, Niels B, Boye SN dan Thomas HB. 2005. Intracellular collagen degradation mediated by uPARAP/Endo180 is a major pathway of extracellular matrix turnover during malignancy. JCB,Volume 169, Number 6, 977-985. D’ Ambrosio SM, Wani G, Samuel M. 1990. Repair Of O6-Methylguanine Damage. Di dalam: Sutherland BM dan Woodhead AD, editor. DNA Damage and Repair In Human Tissues. Proceedings Of Brookhaven Symposium In Biology No. 36; New York, 1-4 Oktober 1989. New york: Plenum Press hlm 397-416 Degenhardt K, Robin M, Brian B, Kevin B, Diana A, Guanghua C, Chandreyee M, Yufang S, Celine G, Yongjun F, Deirdre AN, Shengkan J and Eileen W. 2006. Autophagy promotes tumor cell survival and restricts necrosis, inflammation, and tumorigenesis ELSEVIER INC. 10, 51–64 Dellmann HD dan Eurell JA., editor.1998. Textbook of Veterinary Histology. Philadelphia: Lippincott Williams &Wilkins Dellmann HD dan Carithers JR.,editor.1996. Cytology and Microscopic Anatomy. USA: Lippincott Williams &Wilkins Feldman Z dan Jain. 2000. Schalm’s Veterinary Hematology 5th edition. Baltimore: Lippincott william&wilkins Foster and Smith. 2010. Mammary Tumors (Cancer) in Dog. Http://www.peteducation.com/article.cfm?c=2+2087&aid=460 [9 februari 2010] Geneser F. 1993. Textbook of Histology. Copenhagen: Munksgaard Guyton AC dan Hall JE. 1997. Fisiologi kedokteran. Jakarta: Penerbit buku kedokteran ECG Hai H, MH Hardy, WD Black and MT Goldberg. 1997. The in Vivo Effect of the Tumor Promoter 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate on A/-Methyl-A/nitrosourea-lnduced Apoptosis in Mouse Hair Follicles. Department of Biomedical Sciences, University of Guelph 35, 177-181 Hartono. 1995. Histologi Veteriner. Bogor: IPB
38
Hamdani C. 1999. Evaluasi Pola Sitomorfologik dan Ekspresi Onkoprotein (p67cmyc, p53mutan, p185c-erb B-2) Pada Sel Tumor Epithelial Payudara. Jakarta: UI Press Himawan S. 1990. Patologi. Jakarta: UI press Honma K, Teruo M, Takahiro O. 2007. Type I Collagen Gen Suppresses Tumor Growth and Invasion of Malignant Human Glioma Cells. Cancer cell International 1475-2867 Hustamin R. 2005. Panduan Memelihara Kelinci Hias. Jakarta: Agromedia Ihle DSS. 2006. Small Animal Internal Medicine. USA: Black Publishing Irene. 2007. Information on Chemical Carcinogens. http://www.hku.hk/safety/pdf/CarInf.pdf (22 Januari 2010) Joan. 2008. Tumor Folikel Rambut. www.vetcancercare.com (9 februari 2010) Jones TC, Hunt RD, King NW. 2006. Veterinary Pathology (Six edition). USA: Blackwell Publishing Juchimiuk J, Agnieszka G dan Jolanta M. 2006. DNA damage induced by mutagens in plant and human cell nuclei in acellular comet assay. FOLIA HISTOCHEMICA 44:127-131 Kansekan J, Ramesh V, Aroon Y, Jake JT, Victor L, Prema MR, Srinivasan R, Dittakavi SRS. 2003. Effect of PSC 833, an inhibitor of P-glycoprotein on Nmethyl-N-nitrosourea induced mammary carcinogenesis in rats. Oxford University Press King MM, Paul BM, Stanley DK. 1981. Comparison of The Effect of Butylated Hydroxytoluene On N-Nitrosomethylurea and 7,12-Dimethylbenz[a]Anthracene Induced Mammary Tumours. Elsevier 14: 219-226 Kurnia I, Budiningsih S, Andrijono, Irwan R, Cholid B. 2008. Penggunaan AgNOR Sebagai Marker Proliferasi dalam Penilaian Respon Awal Radiasi pada kemoradioterapi Kanker Seviks. Http://202.46.3.98/nhc/images/iin3-3b.jpg (21 Januari 2010) Liska J, Stefan G, Danica M, Josef Z, Julius Brtk. 2000. Histopathology of Mammary Tumours In Female Rats Treated with 1-Methyl-1-Nitrosourea. Slovak Academy of Science 34:91-96
39
Lu SJ dan Michael CA. 1992. Ha-ras Oncogene Activation In Mammary Gland of Nmetil-N-nitrosourea treated Rats Genetically Resistant To Mammary Adenocarcinogenesis. Proc. Natl Sci USA 89:1001-1005 Macfarlane PS, Reid R, Callander R. 2000. Pathology of Illustrated. London: Churchill Livingtone Malole MBM dan Pramono CSU. 1989. Penggunaan Hewan Laboratorium. Bogor: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Muller GH, Kirk RW, Scott DW. 1989. Small Animal Dermatology. Philadelphia: WB Saunders O’Maley B. 2005. Clinical Anatomy and Physiology of Exotic Species. New York: Elsevier Saunders Price SA dan Lorraine MW. 2006. Patofisiologi: Konsep Klinis Proses PenyakitPenyakit. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC Purwanto DA. 2000. Penetapan Kadar Metil Pada Hasil Reaksi DNA Dengan Nmetil-N-nitrosourea Secara In Vitro. Surabaya: Faculty of Pharmacy Airlangga University Rivera ES, N Andrade, G Martin, G Melito, G Cricco, N Mohamad, C Davio, R Caro, RM Bergoc. 1994. Induction of Mammary Tumours In Rat by Intraperitoneal Injection of MNU: Histopathology and Estral Cycle Influence. Elsevier 86: 223- 228 Rochani S. 2007. Berternak Kelinci Dan Manfaatnya. Jakarta: JPBooks Roomi MW,Vadim I, Aleksandra N, Matthias R. 2004. Proceedings of the 8th Annual Multidisciplinary Symposium on Breast Disease; 13–16 February 2003. Jacksonville, FL: University of Florida Health Science Center. Antitumorigenic activity of Epican Forte in human breast cancer lines Roomi MW, Nusrath WR, Vadim I, Tatiana K, Aleksandra N, Rath M. 2005. Modulation of N-metil-N-nitrosourea Induced Mammary Tumors in SpragueDawley Rats by Combination of Lysin, Proline, Arginine, Ascorbic Acid and Green Tea Extract . Breast Cancer Res 7:291-295 Samuelson DA. 2007. Textbook Of Veterinary Histology. St. Louis: Saunders Elsevier Sander MA. 2007. Atlas Berwarna Patologi Anatomi. Jakarta: PT RajaGrafindo Persada 40
Sarwono. 2005. Kelinci Potong Dan Hias. Jakarta: Agromedia Scherer TA. 1997. Tumor Associated Blood Eosinophilia and Eosinophilic Pleural Effusion: Case Reportand Review of the Literature [xmlFilePath=journals/ijeicm/vol1n2/tumor.xml]. The Internet Journal of Emergency and Intensive Care Medicine. Volume 1 Number 2 Syaifudin M. 2007. Gen Penekan Tumor, P53, Kanker dan Radiasi Pengion. Buletin Alara, Volume 8 Nomor 3:119 – 128 Seolalita. 2008. Tumor Glandula Mammae. Http://www.dszoo.com (19 Desember 2008) Schottenfeld dan Fraumeni JF. 1996. Cancer Epidemiology and Prevention, 2nd edition. New York: Oxford University Press. Slauson DO dan Cooper BJ. 2002. Mechanisms of Disease: A Textbook of Comparative General Pathology. St.louis: Mosby Smith J dan Mangkoewidjojo. 1998. Pemeliharaan, Pembiakan Dan Penggunaan Hewan Percobaan Di Daerah Tropis. Jakarta: UI Press Tapan E. 2005. Kanker, Antioksidan Dan Terapi Klomplementer. Jakarta: PT. Gramedia Tizard IR. 1994. Immunology. Philadelphia: Saunders College Publishing Underwood JCE. 1992. General and Systemic Pathology. Hongkong: Churchill Livingstone Weinberg RA. 1992. Oncogenes, Tumor Suppressor Genes and the Deregulation of Cell Growth: An Overview.Di dalam: Sharp, PA, editor. Nuclear Processes And Oncogenes. California: Academic Press Inc. Hlm 3-9 Yager JA dan Scott DW. 1993. Pathology of Domestic Animal (fourth edition). Di dalam: Jubb KVF et al., editor. The skin and Appendages. San Diego: Academic Press Inc.
41
Lampiran 1
PEMBUATAN PREPARAT HISTOPATOLOGI
Pembuatan preparat histopatologi dilakukan dengan berbagai tahapan yaitu tahap sampling dan fiksasi jaringan, proses jaringan/Trimming (dehidrasi, clearing, infiltrasi dan embedding), pemotongan jaringan dan pewarnaan. Tahap sampling dan fiksasi dilakukan perendaman dengan larutan fiksatif Buffer Netral Formalin 10% selama 1-2 hari kemudian organ tersebut diiris tipis setebal 0.5 cm dimasukkan ke dalam wadah tissue cassette.
Selanjutnya organ
tersebut dipindahkan ke dalam larutan alkohol 70% selama 3-4 hari. Dehidrasi adalah suatu proses penarikan air dari jaringan secara bertahap untuk mencegah terjadinya pengerutan sampel yang diuji.
Sampel jaringan
didehidrasi dalam alkohol bertingkat (alkohol 70% selama 2 jam, 80% selama 2 jam sebanyak dua kali, 90% selama 2 jam, 95% selama 2 jam dan alkohol absolut sebanyak dua kali), xylol (I dan II) dan paraffin (I dan II) dengan menggunakan alat otomatis autotechnicon. Clearing atau penjernihan adalah proses intermedier antara proses dehidrasi dan proses embedding dengan paraffin. Proses ini dilakukan setelah jaringan terdehidrasi, dengan memasukkan ke dalam larutan xylol I, II, III masingmasing selama sejam. Embedding adalah suatu proses pembuatan blok parafin.
Proses ini harus
dilakukan di dekat sumber panas dengan alat-alat yang telah dihangatkan dahulu untuk mencegah pembekuan parafin sebelum proses selesai.
Setelah proses
penjernihan irisan sampel tumor direndam dalam paraffin cair selama 2 jam lalu sampel dicetak dalam bentuk blok paraffin dengan cara meletakkan jaringan sedemikian rupa pada dasar cetakan sehingga memudahkan orientasi baik saat memotong maupun mengenali jaringan. Selanjutnya mendinginkan parafin hingga kembali beku dan melepaskan parafin yang berisi jaringan sampel tumor dari cetakan. Sampel yang telah berbentuk blok kemudian dipotong menggunakan mikrotom. Embedding dilakukan menggunakan tissue embedding console
42
Sectioning adalah proses pemotongan jaringan dilakukan setelah disimpan dalam kulkas selama 24 jam dan blok jaringan dipotong menggunakan mikrotom. Pemotongan dengan beberapa tahapan yaitu tahapan pertama yaitu pemotongan kasar dengan cara pisau dipasang pada knife holder dan dikencangkan dengan clamping screw.
Kemudian blok ditempatkan pada object clamp dengan memperhatikan
permukaan atas tidak boleh melebihi pisau mikrotom dan longitudinal adjusmant knob dan transverse adjustmant knob diatur menjadi horisontal.
Lalu locking
handless dikencangkan. Sedikit semi sedikit blok dinaikkan sambil mulai dipotong sampai seluruh paraffin yang menutupi permukaan atas jaringan yang terkelupas dan mengunci pada posisi tersebut. Tahapan berikutnya proses pemotongan halus yang dilakukan dengan meratakan potongan jaringan dengan memotong sedikit demi sedikit menggunakan teknik pemotongan halus. Merubah posisi pisau sedemikian rupa sehingga daerah pisau yang paling tajam menghadapi jaringan dan mengulangi pemotongan jaringan dengan pemotongan halus dengan tissue thickness selector untuk memilih ketebalan jatingan yang dipotong yaitu biasanya 4-5 µm. Tahap selanjutnya adalah melebarkan lembaran potongan dengan memilih lembaran jaringan yang paling baik kemudian hasil sayatan diapungkan di permukaan air hangat suhu ± 40-42oC lalu dilekatkan di atas gelas objek dan dikeringkan di suhu ruang sampai air di antara jaringan dan kaca objek menguap, lalu gelas objek hasil potongan disimpan dalam inkubator selama minimal 2 jam. Staining adalah pewarnaan untuk mempermudah penglihatan dan pengenalan dengan mikroskop. Pewarnaan yang dilakukan adalah pewarnaan hematoksilin-eosin (HE) yaitu, 1. Deparafinisasi dalam larutan Xylol I, II, III masing-masing selama 2 menit 2. Rehidrasi ke dalam larutan alkohol absolut, alkohol 95%, 80% masing-masing 1 menit. 3. Dicuci dengan air keran selama 30 detik. 4. Pewarnaan dengan Mayer’s Hematoxyllin selama 2-8 menit.
43
5. Dicuci kembali dengan air keran selama 30 detik. 6. Pewarnaan dengan eosin alkohol selama 2-7 menit. 7. Dibilas kembali dengan air keran selama 30-60 detik. 8. Dehidrasi dalam larutan alkohol 95%, alkohol absolut I, II sebanyak sepuluh celupan. 9. Clearing dengan larutan Xylol I, II, III selama 2 menit. 10. Observasi dengan mikroskop untuk melihat penyerapan warna hematoksilin-eosin. 11. Preparat di-mounting dan ditutup dengan cover glass
Mikrofotografi adalah proses yang dilakukan setelah sediaan histopatologi selesai dibuat dan dapat diamati di bawah mikroskop dengan jelas.
44
Lampiran 2
Tabel 4 Jumlah lesio yang muncul dari enam lapang pandang pada kelompok I-VI Kelompok Ulkus
I II III IV 2 2 0 1
V VI 1 2
Hiperplasia lapisan epidermis Folikel rambut proliferasi
2 4
2 4
0 4
1 4
1 4
1 4
Proliferasi kolagen
3
4
1
2
3
2
Proliferasi pembuluh darah Hemorragi
0 3
0 6
1 6
4 3
2 6
3 5
Neovaskularisasi
6
6
6
6
6
6
Duktus papilloma Hiperplasia epitel kelenjar mamari
1 5
0 3
0 4
0 5
0 3
0 2
Mitosis
0
0
0
0
0
0
Tabel 5 Persentase hasil pengamatan kelompok I-VI Lokasi Pengamatan Epidermis
Dermis
Kelenjar mamari
Lesio yang diamati
Kelompok I
II
III
IV
V
VI
Hiperplasia lapisan epidermis
8%
7%
0%
4%
4%
8%
Ulkus
8%
7%
0%
4%
4%
4%
Proliferasi folikel rambut
15% 15% 18% 15% 15% 16%
Proliferasi kolagen
12% 15%
5%
8%
12%
8%
Hemorragi
0%
5%
15%
8%
12%
Proliferasi pembuluh darah
12% 22% 27% 12% 23% 20%
Neovaskularisasi
23% 22% 27% 23% 23% 24%
Duktus papilloma
4%
0%
0%
Hiperplasi epitel kelenjar mamari
19% 11% 18% 19% 12%
8%
Mitosis
0%
0%
0%
0% 0%
0% 0%
0% 0%
0%
45
