Prosiding Tugas Akhir Semester Genap 2011/2012
KAJIAN ANTITUBERKULOSIS PADA EKSTRAK N-HEKSAN MUNDU ALAS (Mammea odorata Raf) Mutia Devi Hidayati*), Taslim Ersam 1) Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember Abstrak Telah dilakukan penelitian untuk mengamati aktivitas antituberkulosis ekstrak nheksan, fraksi 1 dan fraksi 2 dari Mammea odorata Raf terhadap Mycobacterium tuberculosis yang dibiakkan secara in vitro. Uji aktivitas antituberkulosis dilakukan melalui pewarnaan bakteri dengan prosedur Ziehl Nielsen. Melalui pewarnaan tersebut dapat menentukan pertumbuhan bakteri dengan adanya warna merah pada pewarnaan basil tahan asam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak n-heksan dan fraksi 1 masing-masing aktif pada konsentrasi 400 µg/mL, 5 µg/mL selama dua minggu, sedangkan fraksi 2 tidak aktif terhadap M. tuberculosis. Kata kunci: Mammea odorata Raf, Clusiaceae, Mycobacterium tuberculosis resistance) menyebabkan bakteri TB resisten terhadap obat lini kedua (WHO, 2010). Dengan demikian, pencarian dan penemuan baru obat antituberkulosis yang aman dan efektif perlu dilakukan. Salah satunya dengan pemanfaatan bahan kimiawi dari tumbuhan untuk memperoleh senyawa aktif sebagai antituberkulosis. Mammea merupakan salah satu famili Clusiaceae yang memiliki bioaktivitas yang menarik seperti antioksidan, antimalaria, antikanker dan antibakteri. Berdasarkan penelitian sebelumnya, ekstrak etanol M. americana dilaporkan memiliki aktivitas penghambatan terhadap M. tuberculosis pada 50 µg/mL (Frame et al., 1998). Penelitian fitokimia menunjukkan bahwa genus Mammea merupakan salah satu sumber utama senyawa kumarin dan terpenoid (Chricton et al., 1978), santon (Poobrasert et al., 1998). M. odorata Raf merupakan tumbuhan tingkat tinggi yang satu Genus dengan M. americana. Tumbuhan ini
1. Pendahuluan Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit infeksi yang disebabkan oleh M. tuberculosis. Bakteri ini menyebabkan angka kematian terbesar di seluruh dunia, sekitar 2 sampai 9 juta orang terbunuh setiap tahunnya (WHO, 2004). Survey WHO tahun 2006, menempatkan Indonesia sebagai penyumbang TB terbesar ketiga di dunia setelah India dan Cina dengan jumlah kasus baru sekitar 539.000 dan jumlah kematian sekitar 101.000 orang pertahun (Depkes RI, 2006). Penemuan obat TB lini pertama seperti etambutol, isoniazid, pirazinamid, rifampisin dan streptomisin berdampak pada penurunan jumlah kasus tuberkulosis. Namun sejak 1980-an, kasus tuberkulosis di seluruh dunia meningkat karena munculnya MDRTB (multi drug resisten tuberculosis) (Chan et al., 2002). MDR-TB mendorong penggunaan obat TB lini kedua yang lebih toksik seperti kapreomisin, sikloserin, kanamisin, dan etionamid (Tripathi et al., 2005). Namun XDR-TB (extreme drug 1
Prosiding Tugas Akhir Semester Genap 2011/2012 dikenal oleh masyarakat biasa dengan mundu alas. Penelitian terdahulu mengenai kandungan kimia M. odorata menghasilkan senyawa 3,7-dihidroksi-4-fenilisokumarin (1) yang diisolasi dari ekstrak metanol (Herawati, 2005) dan senyawa β-sitosterol (2) yang diisolasi dari ekstrak nonpolar (Rini, 2005). Secara kemotaksonomi afinitas kimiawi dalam satu spesies dengan spesies lain dalam satu famili atau genus pada prinsipnya sama secara kualitatif. Perbedaanya hanya terdapat pada kuantitas dari senyawa yang dihasilkan, faktor yang mempengaruhi adalah ekosistem tempat tumbuh, geografis, iklim, topologi dan bagian tumbuhan yang digunakan (Venkataraman et al., 1972). Berdasarkan hipotesa di atas, maka penelitian ini merupakan penelitian terhadap eksplorasi bahan alam dari ekstrak M. odorata yang belum dilaporkan aktivitasnya sebagai antituberkulosis terhadap M. tuberculosis secara in-vitro. Ph
Me
yang digunakan di laboratorium tuberkulosis. Bahan yang digunakan dalam isolasi terdiri dari tumbuhan M. odorata, pelarut organik teknis seperti n-heksana, metilen klorida, kloroform, etil asetat, aseton, metanol. Plat KLT aluminium silika gel 60 GF 254 , Silika gel 60 GF 254 untuk KCV, kertas saring, kapas, aluminium foil, pereaksi penampak noda serium sulfat (Ce(SO 4 ) 2 ). Bahan-bahan yang digunakan untuk uji aktivitas antituberkulosis adalah bakteri M. tuberculosis (H 37 Rv), Middlebrook 7H 9 (medium cair), 7H 10 (media padat), larutan DMSO, larutan karbolfuksin 0,3 %, larutan asam alkohol 3 % dan larutan metilen blue 0,3 % yang berfungsi untuk pewarnaan MTB, rifampisin untuk kontrol positif, air steril destilat dan juga bahan kimia lain yang digunakan. 2.2 Persiapan Bahan Sampel tumbuhan M. odorata dipotong menjadi bagian kecil yang kemudian dikeringkan dan dihaluskan sehingga dihasilkan serbuk kering yang siap untuk ekstraksi. Serbuk kering masing-masing sebanyak 2 g dimasukkan ke dalam 5 buah vial, kemudian dimaserasi masing-masing dengan 10 ml pelarut yang berbeda yaitu n-heksan, metilen klorida, aseton, etil asetat dan metanol selama 24 jam. Hasil ekstrak yang diperoleh kemudian dimonitoring dengan KLT menggunakan eluen kloroform : metanol (9,5:0,5). Noda dideteksi menggunakan lampu UV kemudian disemprot menggunakan penampak noda ( larutan 1,5 % CeSO 4 dalam H 2 SO 4 2N) dan dipanaskan diatas oven.
Me
OH Me
O
HO O
(1)
HO
(2)
2. Metodologi 2.1 Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah erlenmeyer, gelas kimia, gelas ukur, pipet kapiler, pipet tetes, spatula, pinset, bejana pengembang (chamber), maserator, lampu UV (λ = 256 dan 366 nm), peralatan kromatografi cair vakum (KCV), rotary vacuum evaporator, neraca analitik, alat ukur titik leleh Fisher John. Peralatan yang digunakan dalam uji antituberkulosis adalah test tube, mikropipet, jarum ose, tip, petridisk, mikroskop, oven, laminar air flow, inkubator, vortex mixer dan alat-alat lain
2.3 Isolasi Fraksi Serbuk kering tumbuhan M. odorata sebanyak 1 kg diekstrak dengan metode maserasi menggunakan pelarut n-heksan 2
Prosiding Tugas Akhir Semester Genap 2011/2012 sebanyak 8 L selama 4x24 jam, kemudian disaring dan hasilnya dimonitoring dengan KLT menggunakan eluen kloroform : metanol (9,5 :0,5). Ekstrak cair heksan yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan rotary vacum evaporator bertekanan rendah sehingga dihasilkan ekstrak padat. Ekstrak padat difraksinasi dengan metode kromatografi cair vakum (KCV) mengggunakan eluen n-heksan : etil asetat dengan gradien kepolaran (0-100%). Fraksi-fraksi dengan R f yang sama dikelompokkan sehingga dihasilkan 4 fraksi gabungan yaitu fraksi A-D. Fraksi gabungan B dan C difraksinasi menggunakan eluen n-heksan : etil asetat (0-100%) dan dimonitoring KLT sehingga diperoleh 3 fraksi gabungan yaitu B 1 – B 3 . Selanjutnya fraksi B 1 difraksinasi menggunakan eluen n-heksan : etil asetat (3,5-100%), dan dimonitoring KLT sehingga diperoleh 4 fraksi gabungan yaitu B 1a -B 1d . Fraksi gabungan B 1b dan B 1c difraksinasi menggunakan eluen nheksan: etil asetat (0-100%) dan dimonitoring KLT sehingga diperoleh 3 fraksi gabungan yaitu B 1e - B 1g . Padatan dari fraksi gabungan B 1f dan B 1g serta padatan dari fraksi B 1e dimurnikan dengan cara rekristalisasi. Uji kemurnian dilakukan menggunakan uji KLT tiga eluen yang berbeda dan uji titik leleh.
aquadest kemudian dikocok homogen, selanjutnya disterilisasi menggunakan autoklaf ± 15 menit pada suhu 121° C selanjutnya medium dipindahkan ke dalam cawan petri dan ditunggu memadat lalu diinkubasi ± 2-3 hari pada suhu 37°C. Sampel uji (ekstrak n-heksan, fraksi 1 dan fraksi 2) M. odorata dilarutkan dalam dimetilsulfoksida (DMSO) sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok 10% (10 mg dalam 100 µL DMSO). Larutan stok diencerkan sehingga didapatkan sampel uji dengan konsentrasi 400, 200, 100, 50 dan 5 µg/mL. M. tuberculosis H 37 Rv diambil sebanyak 1 ose dan disuspensikan ke dalam tabung steril yang berisi 5 mL media cair 7H9 kemudian divortex selama 5 menit. Selanjutnya suspensi bakteri disetarakan dengan standar 1 Mc. Farland (107 sel bakteri/mL). Cairan supernatan diambil sebanyak 0,5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung steril yang berisi 4,5 mL media cair 7H 9 sehingga diperoleh kekeruhan suspensi sebesar 106 sel bakteri/ mL. 2.4.2 Pengujian Aktivitas Antibakteri Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan menggunakan metode dilusi cair yaitu penambahan sampel uji pada media cair yang kemudian divortex ± 1 menit. Sebanyak 0,5 mL suspensi bakteri (106 sel/ mL) ditambahkan ke dalam masingmasing tabung steril dan divortex ± 1 menit, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 hari. Subkultur diambil ± 50 µL dan diteteskan pada media padat 7H10 kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 minggu. Kontrol positif digunakan rifampisin 5 µg/mL, sedangkan kontrol negatif digunakan bakteri H 37 Rv. Kontrol positif dan negatif diperlakukan sama seperti sampel uji. Uji antibakteri ini dilakukan duplo. Selanjutnya dilakukan pengamatan dan pewarnaan basil tahan
2.4 Uji Aktivitas Antituberkulosis 2.4.1 Persiapan Uji Antituberkulosis Media cair dibuat dengan mencampur 0,94 g middle brook 7H9 dan 200 mL aquadest kemudian dikocok homogen. Media cair dimasukkan ke dalam tabung steril sebanyak 4,5 mL dan disterilisasi menggunakan autoklaf ± 15 menit pada suhu 121 °C, kemudian diinkubasi ± 2-3 hari pada suhu 37°C. Media padat dibuat dengan mencampur 11,4 g middlebrook 7H10 dan 200 mL 3
Prosiding Tugas Akhir Semester Genap 2011/2012 asam menggunakan prosedur Ziehl Nielsen untuk mengetahui pertumbuhan M. tuberculosis.
Fraksinasi ekstrak n-heksan padat dilakukan dengan metode KCV untuk memisahkan senyawa-senyawa target ke dalam fraksi yang lebih sederhana. Pemilihan metode ini dikarenakan prosesnya sederhana, mudah dan dapat memisahkan bahan sampel dalam jumlah yang cukup besar. Sampel yang akan difraksinasi dengan KCV terlebih dahulu diimpregnasi ke dalam silika gel 60. Tujuan dari impregnasi ini adalah agar senyawa yang sudah terimpregnasi ke dalam silika dapat tersebar merata diatas kolom, sehingga proses pengelompokan fraksi-fraksi berjalan maksimal. Fraksinasi pertama dilakukan terhadap ekstrak padat n-heksan sebanyak 21,1313 g menggunakan metode KCV dengan eluen n-heksan : etil asetat yang ditingkatkan kepolaran-nya (0-50%). Selanjutnya dilakukan monitoring KLT dan diperoleh empat fraksi gabungan yaitu A-D. Gabungan fraksi B dan C (11,6761 g) difraksinasi menggunakan eluen n-heksan: etil asetat yang ditingkatkan kepolarannya (2-50%), selanjutnya dimonitoring KLT dan diperoleh tiga fraksi gabungan B 1- B 3. Fraksi B 1 (7,5611 g) difraksinasi mengggunakan eluen n-heksa n: etil asetat yang ditingkatkan kepolarannya (3,5-50%), selanjutnya dimonitoring KLT dan diperoleh empat fraksi gabungan yaitu : B 1a - B 1d . Gabungan fraksi B 1b dan B 1c (5,6038 g) difraksinasi KCV mengggunakan eluen n-heksan:etil asetat yang ditingkatkan kepolarannya (1-25%). Selanjutnya dimonitoring KLT dan diperoleh tiga fraksi gabungan yaitu fraksi B 1e -B 1g . Berdasarkan Nilai R f fraksi B 1f dan B 1g yang relatif sama, dapat dihipotesis bahwa fraksi tersebut mengandung senyawa yang sama, sehingga padatan dari kedua fraksi tersebut digabung dan direkristalisasi untuk menghilangkan pengotor menggunakan n-heksan panas. Padatan B 1f dan B 1g disebut sebagai
3. 3.1
Hasil dan Pembahasan Uji pendahuluan Uji pendahuluan pada sampel ini dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa-senyawa metabolit sekunder serta pelarut organik yang sesuai untuk proses ekstraksi. Sebelum uji pendahuluan, sampel dipotong dan dikeringkan untuk menghilangkan kadar air dalam sampel tersebut. Selanjutnya dihaluskan hingga menjadi serbuk untuk memperluas permukaan sampel sehingga ekstraksi dapat berjalan maksimal. Ekstrak yang diperoleh kemudian dimonitoring menggunakan KLT dan dihasilkan adanya sekumpulan noda berwarna kuning yang mengindikasikan adanya senyawa fenolat. Uji KLT merupakan uji kualitatif yang dapat mengetahui distribusi senyawa dengan mudah dan cepat, serta menghemat sampel sebab jumlah sampel yang dibutuhkan hanya sedikit. 3.2. Isolasi Fraksi Serbuk kering M. odorata Raf sebanyak 1,0207 kg dimaserasi dengan pelarut n-heksan sebanyak 8 L selama 4 x 24 jam. Ekstrak cair n-heksan yang diperoleh dimonitoring dengan KLT yang bertujuan untuk mengetahui apakah semua senyawa fenolat telah terekstrak. Metode maserasi dipilih karena penggunaannya mudah, praktis, dapat mengekstrak sampel dalam jumlah yang cukup besar, dan dapat dilakukan pada suhu kamar sehingga senyawa-senyawa target tidak terdekomposisi (Kristanti et al., 2008). Ekstrak cair n-heksan yang diperoleh selanjutnya dipekatkan dengan rotari evaporator sehingga didapatkan ekstrak padat sebanyak 22,4224 g. 4
Prosiding Tugas Akhir Semester Genap 2011/2012 Fraksi 1 (0,2293 g). Fraksi B 1e berupa pasta kuning dengan endapan berwarna putih B 1h . Endapan tersebut dipisahkan dari pasta melalui penyaringan dan dimonitoring KLT, selanjutnya direkristalisasi dan dihasilkan Fraksi 2 (0,0371 g). Kemurnian F-1 dan F-2 hasil isolasi dari tumbuhan M. odorata dilakukan dengan uji KLT menggunakan 3 macam eluen yang berbeda kepolaran dan uji titik leleh. Kromatogram uji KLT Fraksi-1 menunjukkan noda tunggal dengan titik leleh sebesar 142-143 °C. Hal yang sama terlihat pada kromatogram dari uji KLT fraksi 2 menunjukkan adanya noda tunggal dan memiliki titik leleh 241-242 °C.
Hasil uji aktivitas antituberkulosis fraksi 1 pada minggu ke-1 tidak memperlihatkan adanya pertumbuhan bakteri TB pada konsentrasi sampel 5-400 μg/mL, Hasil pengujian menunjukkan bahwa fraksi 1 lebih aktif dibandingkan dengan ekstrak heksan. Hal ini disebabkan karena fraksi 1 merupakan fraksi yang lebih murni. Sehingga fraksi 1 dapat menghambat pertumbuhan bakteri TB pada konsentrasi 5 μg/mL. Pengamatan pada minggu ke-2 belum memperlihatkan adanya pertumbuhan bakteri TB pada konsentrasi 5-400 μg/mL. Pengamatan ini menunjukkan bahwa fraksi 1 dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Pengamatan minggu ke-3 memunjukkan fraksi 1 memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan bakteri TB sama halnya dengan ekstrak n-heksan, akan tetapi fraksi 1 memiliki aktivitas yang lebih rendah. Berdasarkan uraian di atas dapat dihipotesiskan bahwa terdapat fraksi lain pada ekstrak n-heksan M. odorata yang lebih aktif sebagai antituberkulosis dibandingkan dengan fraksi 1. Hasil uji aktivitas antituberkulosis fraksi 2 pada M. odorata pada minggu ke1 menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri TB pada konsentrasi sampel 5-400 μg/mL. Kontrol negatif memperlihatkan adanya pertumbuhan bakteri TB, sedangkan pada kontrol positif tidak memperlihatkan adanya pertumbuhan. Pengamatan pada minggu ke-2 memperlihatkan adanya pertumbuhan bakteri TB pada konsentrasi sampel 5-400 μg/mL. Pengamatan pada minggu ke-3 menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri TB pada konsentrasi sampel 5-400 μg/mL. Berdasarkan uraian di atas maka disimpulkan bahwa fraksi 2 tidak aktif terhadap M.tuberkulosis. Selain pengamatan secara visual, dilakukan juga pewarnaan menggunakan prosedur Ziehl Nielsen untuk memperkuat
3.3 Uji Antituberkulosis Sampel uji yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak n-heksan, fraksi 1, dan fraksi 2 dengan lima variasi konsentrasi, masing-masing 400, 200, 100, 50 dan 5 µg/mL dalam media cair. Kontrol positif yang digunakan dalam penelitian ini adalah rifampisin dengan konsentrasi 5 µg/mL dan kontrol negatif digunakan M.tuberculosis H 37 R v . Hasil uji aktivitas antituberkulosis pada ekstrak n-heksan M. odorata pada minggu ke-1 menunjukkan pertumbuhan bakteri TB pada konsentrasi sampel 5-200 μg/mL, sedangkan konsentrasi 400 μg/mL menunjukkan adanya penghambatan bakteri TB. Pengamatan minggu ke-2 memperlihatkan adanya pertumbuhan bakteri TB pada konsentrasi sampel 5-200 μg/mL. Sedangkan konsentrasi 400 μg/mL masih menunjukkan penghambatan. Pengamatan pada minggu ke-3 memperlihatkan adanya pertumbuhan bakteri TB pada konsentrasi sampel 5-400 μg/mL. Berdasarkan uraian di atas maka disimpulkan bahwa ekstrak n-heksan aktif terhadap M.tuberkulosis pada konsentrasi sebesar 400 μg/mL. 5
Prosiding Tugas Akhir Semester Genap 2011/2012 adanya pertumbuhan bakteri TB. Uji dinyatakan positif apabila ditandai dengan adanya warna merah pada proses pewarnaan basil tahan asam (Depkes RI, 2008) Penelitian sebelumnya pada ekstrak etanol M.americana dilaporkan memiliki penghambatan terhadap M. tuberculosis pada 50 µg/mL (Frame et al., 1998). Data peneliti satu tim yang lain menyatakan bahwa ekstrak metanol M. odorata memiliki penghambatan terhadap M. tuberculosis pada 50 µg/mL. Berdasarkan penelitian tersebut, disimpulkan bahwa senyawa-senyawa yang aktif dalam penghambatan M. tuberculosis pada M. odorata adalah senyawa-senyawa yang bersifat lebih polar, sedangkan pada ekstrak heksan lebih banyak mengikat senyawa yang lebih nonpolar, walaupun pada ekstrak tersebut terdapat senyawa lebih polar yang aktif, namun kurang dominan dibandingkan ekstrak metanol.
ada fraksi yang aktif terhadap bakteri M. tuberculosis. 5. Ucapan Terima Kasih Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kebun Raya Purwodadi atas bantuan penyedian sampel M. odorata; Laboratorium Kimia Bahan Alam dan Sintesis, yang memberi bantuan fasilitas dan sarana Laboratorium selama penelitian ;Tropical Disease Center (TDC), Universitas Airlangga atas bantuan pengujian terhadap M. tuberculosis H 37 Rv. 6. Daftar Pustaka Chan, E.D., Iseman, M.D., (2002), Current medical treatment for tuberculosis, British Medical Journal, 325, 1282–1286. Crichton, E.G., Waterman, P.G., (1978), Dihydromammea C/OB : New Coumarin From Seed of Mammea africana, Pytochemistry, 17. pp. 1783-1786. Depkes RI, (2006), Pedoman Nasional Penanggulangan Tuberkulosis, Jakarta, Depkes RI. Direktorat Jendral Bina Pelayanan Medik, (2008), Standar Reagen Ziehl Nielsen, Jakarta, Depkes RI. Frame, A.D., Olivares, E.R., Jesus, L.D., Ortiz, D., Pagan, J dan Mendez, S., (1998), Plant from Puerto Rico with antiMycobacerium tuberculosis properties, Health Sci J, 17, 3, 243-252. Herawati, N., (2005), 7-dihidroksi-4fenilisokumarin pada fraksi polar diklorometan dari ekstrak metanol kulit batang tumbuhan mundu alas (Mammea odorata), Skripsi, ITS, Surabaya Kristanti, A.N., Aminah, N.S., Tanjung, M., Kurniadi, B., (2008), Buku Ajar Fitokimia, Laboratorium Kimia Organik, Jurusan Kimia-FMIPA, UNAIR, Airlangga University Press, Surabaya Poobrasert, O., Constant, H.L., Beecher, C. W.W., Farnsworth, N. R., Kinghorn, A.D., Pezzuto, J. M., Cordell, G.A., Santisuk, T., Reutrakul, V., (1998), Xanthones from the Twigs of Mammea
4. Kesimpulan Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, diperoleh kesimpulan bahwa uji antituberkulosis terhadap ekstrak nheksan, fraksi 1 dan fraksi 2 menunjukkan bahwa ekstrak n-heksan dan fraksi 1 aktif terhadap M.tuberculosis masing-masing pada 400 µg/mL, 5 µg/mL selama dua minggu, sedangkan pada fraksi 2 tidak aktif dalam penghambatan M. tuberculosis. Agen aktif antituberkulosis pada M. odorata bukan pada ekstrak heksan tetapi lebih dominan pada estrak metanol. Agar dapat digunakan sebagai obat antituberkulosis, maka perlu dilakukan proses pemurnian lebih lanjut pada fraksi 1 dan fraksi 2 serta penentuan struktur dan modifikasi struktur untuk meningkatkan aktivitasnya. Apabila tumbuhan ini dijadikan agen aktif antitubenkulosis lebih baik digunakan ekstrak yang bersifat lebih polar walaupun pada ekstrak nonpolar juga 6
Prosiding Tugas Akhir Semester Genap 2011/2012 siamensis, Phytochemistry,47, No. 8, 1661-1663. Rini, M., (2005), β-sitosterol dari fraksi nonpolar diklorometan pada kulit batang mundu alas (Mammea odorata Raf), Skripsi, ITS, Surabaya. Tripathi, R.P., Tewari, N., Dwivedi, N., Tiwari, V.K., (2005), Fighting tuberculosis: an old disease with new challenges, Medicinal Research Reviews, 25, 93– 131. Venkataraman, K.,(1972), Wood Phenolic in the Chemotaxonomy of the Moraceae, Phytochemistry, 11, 1571-1586. World Health Organization., (2004), Global Tuberculosis Report, WHO Report, Geneva, Switzerland. World Health Organization., (2010), Multidrug and Extensively Drug-Resistant Tb (M/XDR-TB), Global Report on Surveillance and Response.
7
