Jiří Pazourek MODERNÍ ELEKTROFORETICKÉ ANALYTICKÉ METODY. (přednášky pro magisterské studium) Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6

Jiří Pazourek MODERNÍ ELEKTROFORETICKÉ ANALYTICKÉ METODY (přednášky pro magisterské studium)

1. ÚVOD .............................................................................................................................................................3 1.1. Význam kapilární elektroforézy..............................................................................................................3 1.2. Historický vývoj ......................................................................................................................................5 1.3. Různá prostředí pro elektroforézu ...........................................................................................................7 1.4. SDS-Polyakrylamidová Gelová Elektroforéza proteinů (SDS-PAGE) .................................................10 1.5. Zpracování gelu po separaci. Vybarvování stříbrem nebo organickými barvivy..................................12 1.6. Blotting (Southern blotting + Nothern blotting + Western blotting) .....................................................15 1.7. 2D-elektroforéza (Two-Dimensional Electrophoresis) .........................................................................18 1.8. Elektroforéza v kapiláře = kapilární elektroforéza (capillary elecrophoresis).......................................19 2. ANALYTY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE .......................................................................................21 2.1. Typy molekul, které lze analyzovat kapilární elektroforézou ...............................................................21 2.2. Proteiny = polypeptidy. Náboj polypeptidů ..........................................................................................22 2.3. Elektroforetická titrační křivka..............................................................................................................23 3. TEORETICKÝ POPIS ELEKTROFORÉZY ...............................................................................................25 3.1. Základní fyzikální principy elektroforézy – elektroforetická pohyblivost µ .........................................25 4. ELEKTROOSMOTICKÝ TOK....................................................................................................................26 4.1. Elektroosmotická pumpa.......................................................................................................................26 4.2. Animace endoosmotického toku. Animace kapilární elektroforézy......................................................28 4.3. Modifikátory elektroosmotického toku (EFM) – tenzidy neboli surfaktanty........................................33 5. ZÁKLADY INSTRUMENTACE.................................................................................................................34 5.1. Pracovní podmínky ...............................................................................................................................36 5.2. Nepřímá detekce v CE...........................................................................................................................38 6. SEPARAČNÍ MÓDY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE .......................................................................40 6.1. Kapilární zónová elektroforéza (CZE) ..................................................................................................41 6.2. Izotachoforéza (ITP)..............................................................................................................................47 6.3. Kapilární gelové elektroforéza (CGE)...................................................................................................56 6.4. Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) ............................................................................57 6.5. Kapilární elektrochromatografie (CEC) ................................................................................................61 6.6. Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) ...............................................................................................64 6.7. Diskontinuální elektroforéza .................................................................................................................65 6.8. CE v nevodném prostředí (NON-AQUEOUS CE) ...............................................................................66 7. OMEZENÍ ROZMÝVÁNÍ ZÓN V CE. OPTIMALIZACE .........................................................................67 7.1. Odvod Joulova tepla..............................................................................................................................67 7.2. Elektroosmotický tok ............................................................................................................................67 7.3. On-capillary detekce..............................................................................................................................68 7.4. Molekulární difúze ................................................................................................................................68 7.5. Rozmytí zón způsobené dávkováním....................................................................................................69 8. VYHODNOCOVÁNÍ DAT KAPILÁRNÍ ZÓNOVÉ ELEKTROFORÉZY................................................73 8.1. Detekční limit ........................................................................................................................................73 8.2. Validace v CE........................................................................................................................................74 9. KLINICKÉ A FARMACEUTICKÉ APLIKACE ........................................................................................77 9.1. Chirální separace - Separace optických izomerů kapilární elektroforézou............................................79 9.2. Spojení CE a laserem indukované fluorescence (LIF). Kompetitivní immunoassay bílkovin ..............80 9.3. SDS-CGE proteinů................................................................................................................................82 9.4. Separace sacharidů pomocí MEKC s derivatizací.................................................................................84 9.5. CE-MS...................................................................................................................................................85 9.6. Sekvenování DNA. PCR .......................................................................................................................86 9.7. Miniaturizace.........................................................................................................................................88

Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003

2

1. ÚVOD

HPCE nachází široké uplatnění ve výzkumu i v praxi mnoha oblastí chemie, biochemie, molekulární

1.1. Význam kapilární elektroforézy

Electrophoresis,

klinické

chemie, biotechnologie,

zemědělství,

v chemickém,

farmaceutickém a potravinářském průmyslu, v ekologii apod.

Pojmem kapilární elektroforéza, resp. vysokoúčinná kapilární elektroforéza (HighPerformance Capillary

biologie,

HPCE)

je

dnes

označována

celá

rodina

elektromigračních separačních metod realizovaných v kapilárním instrumentálním formátu:

Nejmasovější využití elektroforézy je dnes spojeno s analýzami proteinů a nukleových kyselin (Projekt lidského genomu, medicinské vužití detekce genetického polymorfismu, PCR, DNA čipy).

zónová elektroforéza (CZE), izotachoforéza (CITP), izoelektrická fokusace (CIEF), elektroforéza v síťovacích prostředích, klasických agarosových i polyakrylamidových gelů (CGE) i v kapalných síťovacích mediích (SDS-elektroforéza bílkovin), bioafinitní elektroforéza a dále též kombinované elektromigrační a chromatografické techniky, Odkazy

elektrokinetická chromatografie (MEKC) a kapilární elektrochromatografie (CEC). Pro svou účinnost dosahující stovek tisíc až miliónů teoretických pater a citlivost na úrovni femtomol-zeptomol (10-15-10-21 mol) analytu v nanolitrových objemech analyzovaných

http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/electrophoresis/contents.html

vzorků, jsou HPCE techniky považovány za nejúčinnější a nejperspektivnější analytické

http://www.ceandcec.com

separační metody. Stávají se stále více uznávaným protějškem, resp. doplňkem dosud

http://ntri.tamuk.edu/ce/ce.html

nejrozšířenějších

http://mobilise.com

separačních

metod

-

různých

variant

vysokoúčinné

kapalinové

chromatografie (HPLC). I když analytické využití HPCE metod výrazně převládá, lze tyto techniky použít též pro mikropreparaci (na úrovni nanomol / pikomol) a fyzikálně chemickou charakterizaci separovaných látek. Podle charakteru vzorku a účelu separace můžeme rozlišit následující typy aplikací: ⇒ Analýza (kontrola čistoty nebo kvality) syntetických nebo z přirodního materiálu izolovaných preparátů, např. chemikálií, barviv, léčiv, vitamínů, enzymů a hormonů. ⇒ Analýza komplexních směsí: stanovení biologicky nebo chemicky významných analytů, např. metabolitů, léčiv, jedů, škodlivin, aditiv a polutantů v biologických tekutinách (sérum, plazma, moč), tkáňových extraktech, potravinách, odpadních vodách a reakčních směsích. ⇒ Sledování biologických a chemických přeměn, např. chemických a enzymatických reakcí a přeměn metabolitů, léčiv a chemikálií. ⇒ Fyzikálně-chemické charakterizace analytů: stanovení elektroforetických pohyblivostí, relativních molekulových hmotností, efektivních nábojů, disociačních a asociačních konstant, difúzních koeficientů a jiných charakteristik.


3


4

vybarvování gelů, immunoelektroforetické techniky, dvourozměrná elektroforéza a různé

1.2. Historický vývoj http://hendrix.pharm.uky.edu/che626/electrophoresis/electrophoresis.html http://www.geocities.com/bioelectrochemistry/tiselius.htm

Historie elektroforézy

blotting-techniky. ČASOVÉ MILNÍKY KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY: první experimenty v U trubicích: F. von Reuss (1808), G. Wiedeman (1856), H. Buff (1858), O. Lodge (1886), W. Whetham (1893)

Koncept elektroforézy jako techniky využívající elektrického pole, které způsobuje pohyb nabitých částic v matrici, byl vyvíjen ve dvacátém století. První vědecká elektroforetická aparatura byla

1897 F. Kohlrausch odvodil rovnici pro migraci iontů v roztoku elektrolytu

vyvinuta Tiseliem v roce 1937. Tiselius obdržel za svůj příspěvek k

1.pol. 20.stol. gelová elektroforéza a isoelektrické fokusování na gelových deskách

analýze proteinů Nobelovu cenu o 11 let později. Tiselius popsal metodu "pohyblivého rozhraní" (moving boundary), která je dnes známá jako zónová elektroforéza, a použil ji k separaci sérových proteinů (1). Elektroforéza se začala vyvíjet až v padesátých letech, kdy byla použita i pro

aminokyseliny

dokonce

a

anorganické

ionty. Objevily se i další

1958 1965 1970 1974 1974 1979 1981 1983 1984 1985 1987 1987

S. Hjertén ZE v rotujících trubicích 1-3 mm A. Tiselius ZE v 3 mm trubicích F. Everaerts ITP na vlastním přístroji R.Virtanen CZE v 200-500 µm skleněných kap. V. Pretorius EOF mobilní fáze sorbentem F. Mikkers CZE v 200 µm teflonových kapilárách J. Jorgenson, K. Lukacs CZE v 75 µm kapilárách S. Hjertén CGE pro biologické látky S. Terabe MEKC pro neutrální látky S. Hjertén CIEF pro biologické látky J. Knox, I. Grant CEC v 50 µm kapilárách s ODS B. Karger, A. Cohen vysoká účinnost CGE pro DNA

1988 dostupnost prvního komerčního přístroje (Beckman Instruments)

elektroforetické techniky: izoelektrická fokusace a

Literatura:

izotachoforéza. Tyto tři

1.

metody jsou založeny na

2.

poněkud

3. 4.

odlišných

principech a mohou být pro praktické účely kombinovány. Rozdíl mezi těmito metodami lze vidět i podle prostředí, která se v nich historicky používala: polymerní gel, papír a kapilára. Papír byl používán v začátcích elektroforézy k separaci látek, protože byl levný a lehce

5. 6. 7.

Tiselius, A., A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures, Trans. Faraday. Soc., 33, 524, 1937. Smithies, O., Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults, Biochem. J., 61, 629, 1955. Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta, 2, 297, 1957. Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis, Distillation Products Industries (Division of Eastman Kodak Co.), 1959. Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis, Science, 130, 711, 1959. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Anal. Chem., 53, 1928, 1981. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, 1983.

použitelný (nemusel se zvláštně připravovat). Smithies použil škrobový gel jako médium pro elektroforézu v roce 1955 (2). O dva roky později Kohn použil pro elektroforézu acetát celulózy jako nosič (3). V roce 1959 Ornstein a Davis (4) a Raymond s Weintraubem (5) použili polyakrylamidový gel. Gelový nosič se stále používá k separaci proteinů (slab-gel electrophoresis), i v kapilárním měřítku (CGE). Kapiláry byly do elektroforézy zavedeny Jorgensonem a Lukacsem (6,7) na začátku devadesátých let dvacátého století. Detekční techniky se v průběhu let také vyvíjely. Většina separovaných složek je prostému oku neviditelná. Proto byly vyvíjeny vizualizační a kvantifikační techniky, jako Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003

5


6

http://hendrix.pharm.uky.edu/che626/electrophoresis/matrix.html

Papír napuštěný elektrolytem byl používán pro první elektroforetické separace, protože byl levný a laboratorně používaný pro filtrace resp. papírovou chromatografii (Whatman 3MM

1.3. Různá prostředí pro elektroforézu •

Papír

•

Agarosa

•

Polyakrylamid

•

Kapilára

(0.3 mm) a Whatman No.1 (0.17 mm). Papír také obvykle nenese náboje, které by nežádoucím způsobem interagovaly s analytem. Vzorek se nanáší přímo na plochu papíru, který leží na chladící desce a jehož konce jsou ponořeny do elektrolytových rezervoárů, do nichž jsou také ponořeny konce elektrod. Ke sledování migrace jsou používány společně se vzorkem ionizovaná barviva a standardy. Aplikovaná napětí jsou větší než v případě gelů, protože elektrický odpor papíru je větší. Nevýhodou papírové elektroforézy je fakt, že póry papíru (velikost, kvalita) nejsou uživatelem přímo kontrolovatelné a tudíž tato technika není příliš citlivá ani reprodukovatelná.

Dnes je elektroforéza převážně používána pro biologické a jiné polymerické vzorky (komerčně), např. DNA analýza pro kriminalistické a vědecké účely, dále pro proteinovou a

•

Elektroforéza v gelu

enzymovou analýzu - v těchto případech se nejčastěji jedná o elektroforézu v gelu (Projekt lidského genomu). Gel ”síťovým efektem” zpomaluje pohyb nabitých molekul na základě

Efekt omezené difúze : Ačkoli elektroforéza může být prováděna nejjednodušeji ve volném

jejich velikostí resp. velikosti pórů gelu.

roztoku (CZE), konvekční pohyb kapaliny v důsledku tepla přirozeně uvolňovaného průchodem elektrického proudu může separaci narušit, případně zónu analytu úplně rozmýt.

•

Tato úvaha vedla v elektroforéze k zavedení gelu jako separačního prostředí. Tímto gelem je

Elektroforéza na papíře

obvykle agarosa (polysacharid z mořských řas) nebo synteticky připravovaný polyakrylamid

paperelectrophoresis2.swf

(chemicky síťovaný polymer, CH2=CHCONH2). •

Agarosový gel Ředěné agarosové gely jsou dostatečně rigidní a jednoduché pro přípravu v nízkých

koncentracích, proto se typicky používají k separaci velkých makromolekul, jako např. velkých bílkovin nebo DNA (až 20 kbp). Polyakrylamidové gely se typicky používají k separaci nukleových kyselin do 2 kbp (ale v určitých modifikacích i pro větší fragmenty). Agar se isoluje z červené řasy rodu Rhodophycae, je tvořen dvěma komponentami - agarosou a agaropektinem. Agarosa je vhodná jako elektroforetická matrice, protože je takřka nenabitá. Agarosa je řetězec opakujících se jednotek D-galaktózy a 3,6-anhydro-L-galaktózy jak je vidět na obrázku s bočním řetězcem 6-methyl-D-galaktózy: Agarosa je schopna utvořit třírozměrnou strukturu šroubovice s trojnásobně zalomenou osou, která vytváří dutinu dostatečně

http://tutor.lscf.ucsb.edu/instdev/sears/biochemistry/tw-exp/paperelectrophoresis.htm

velkou pro přijetí vody (agarosový gel může obsahovat až


7


8

1.4. SDS-Polyakrylamidová Gelová Elektroforéza proteinů (SDS-PAGE)

SDS, sodium dodecylsulfate, je také známý jako sodium lauryl sulfáte. Hydrofobní konec molekuly SDS silně interaguje s proteinovým řetězcem. Počet molekul SDS, které se váží na protein je úměrný délce proteinu. Neredukované (viz dále) proteiny váží 0,9-1,0 gram SDS na gram proteinu. Každá molekula SDS přispívá negativním nábojem a samozřejmě překrývá případný náboj proteinu. To dovoluje separovat vzorek pouze podle molekulové hmotnosti (velikosti), nikoli podle náboje, protože konečný náboj proteinu po asociaci s SDS je vždy negativní a úměrný VELIKOSTI proteinu (poměr náboj/velikost, který je v zónové elektroforéze klíčový a pro dosažení separace nutně různý, je v SDS-PAGE konstantní). SDS také ruší terciální strukturu proteinů (denaturace). Použijeme-li při přípravě vzorku navíc β-merkaptoethanol, který přerušuje disulfidické vazby v proteinu, vzniknou tzv. redukované proteiny, které pak na sebe váží 1.4 gramu SDS na gram proteinu. SDS-PAGE tedy spojuje výšeuvedený efekt omezené difúze molekul analytu a „size exclusion“ mechanismus (podobný gelové filtraci/permeační chromatografii). Mechanismus Protože elektroforetická mobilita je definovaná jako vzdálenost uražená za určitý čas, v SDS-PAGE tedy můžeme psát

Nebo použijeme-li tzv. relativní mobilitu Rf definovanou jako

elektromigrační dráha neznámé bílkoviny Relativní mobilita (Rf ) = ---------------------------------------------------celková délka elektroforézy


10

Kalibrační závislost log MW = f (Rf)

1.5. Zpracování gelu po separaci. Vybarvování stříbrem nebo organickými barvivy

Po separaci v gelové elektroforéze je obvykle analyt prostým okem neviditelný. Pro kvantifikaci (určení množství analytu v zóně) používáme často metody vybarvování

gelu (angl. „staining“,

alternativou je radiografie, pokud byl analyt radioaktivně značen, viz dále):

pozn.: vyjímkami v tomto chování jsou velmi hydrofobní (membránové) proteiny a glykosylovanéproteiny. Vybarvování (Staining) Vybarvování proteinů je běžně prováděno třemi možnými reagenciemi: Amido Black, Coomassie Brilliant Blue G-250 nebo stříbrem. Amido black není příliš citlivá, reaguje s Závěr (SDS-PAGE):

proteiny, které jsou snadno přístupné, např. které byly přeneseny z gelu na nitrocelulózový

Elektroforéza v přítomnosti SDS = SDS PAGE je jednoduchá a rychlá metoda pro charakterizaci a srovnání bílkovin. Tato metoda separuje bílkoviny na základě rozdílné relativní molekulové hmotnosti. SDS se zde váže na bílkovinný řetězec v poměru 1.4 g SDS na 1g bílkoviny, přičemž délka komplexu SDS + bílkovina je úměrná jeho molekulové hmotnosti. Na základě srovnání relativních mobilit neznámé bílkoviny a standardů je pak

papír. Coomassie Blue a stříbro interagují s více proteiny a jsou více citlivé. Coomassie Blue, používaná pro agarosové a polyakrylamidové gely, je 5x citlivější (0.3 ug/zónu) než Amido black. Vybarvování stříbrem je 100x citlivější (1 ng/zónu) než Coomassie Blue a používá se převážně pro polyakrylamidové gely. Toto vybarvování se používá v případech malého množství proteinu nebo chceme-li detekovat co možná nejvíce zón.

možné určit její relativní molekulovou hmotnost. příklad: Detekce bílkovin stříbrem krok 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.


11

roztoky 60 ml 50 % acetonu, 1.5 ml 50 % TCA , 25 µ l 37 % HCHO opláchněte 3x deionizovanou vodou promytí deionizovanou vodou opláchněte 3x deionizovanou vodou 60 ml 50 % acetonu 100 µ l 10 % Na2S2O3 v 60 ml deionizované vody opláchněte 3x deionizovanou vodou 0.8 ml 20 % AgNO3 , 0.6 ml 37 % HCHO , 60 ml H2O opláchněte 2x deionizovanou vodou 60 ml 2 % Na2CO3 ,25 µ l 37 % HCHO , 25 µ l 10 % Na2 S2O3 1 % HAc promytí deionizovanou vodou


čas 5 min 3x5s 5 min 3x5s 5 min 1 min 3 x 5s 8 min 2 x 5s 10-20 s 30 s 10 s

12

Po té, co byl gel vybarven, mohou být proteiny kvantifikovány densitometricky. Gel může být fotografovány nebo skenovány, intenzita zabarvení je srovnána s kalibrační křivkou standardů. Všechny uváděné procesy vybarvování jsou poměrně dlouhé: např. vybarvování stříbrem může zabrat až několik hodin. Navíc takováto barvení jsou obtížně reverzibilní a většina proteinů nemůže být neporušeně získáná zpět (pro další analýzu).

Stupeň zesíťování monomeru určuje velikost pórů gelu, čili rozsah molekulových hmotností, při kterých bude gel účinný. Tento pracovní rozsah nastavíme procentuálním obsahem síťovadla ve směsi. Složení výsledného polymeru můžeme vyjadřovat 2 způsoby: %T nebo %T, %C: %T je hmotnostní procento celkového monomeru (akrylamid + síťovadlo) Např. 15% gel znamená obsah 15% w/v akrylamidu a bisakrylamidu. Platí, že čím větší %T, tím menší póry

Jinou modifikací detekce je autoradiografie. Radioaktivní vzorek separovaný v gelu je s gelem vysušen na papíře a přenesen na rentgenový film, který je radioktivími atomy exponován. Radioaktivní zóny jsou tedy na výsledném snímku světlé a film je opět densitometricky vyhodnocen.

(propustnost) gelu. U způsobu %T, %C přidáváme ještě informaci o procentuálním zastoupení síťovadla %C. 15%T, 5%C-bis říká, že kromě celkové koncetrace 15% w/v akrylamid + bisakrylamid je bisakrylamidu 5% celkové hmotnosti gelu. Takto lze také nastavovat velikost pórů: pro

objektivní vyhodnocování: schéma optického densitometru

jakékoli %T, 5% C tvoří nejmenší póry. Zvětšení nebo zmenšení %C zvětší póry gelu. Na rozdíl od agarosového gelu, polymerace akrylamidu vyžaduje aditiva. Běžný iniciátor je peroxodisulfát amonný (NH4)2S2O8 a tetramethylendiamin (TEMED) funguje jako katalyzátor. TEMED vytváří z peroxodisulfátu volné radikály, které způsobují vlastní polymeraci. Polyakrylamidový gel je univerzální gel, běžně používaný pro elektroforézu proteinů a nukleových kyselin.

•

NH2

Elektroforéza v polyakrylamidu

O

Polyakrylamidový gel separuje většinu proteinů a malých oligonukleotidů, vzorků, které jsou sami menší Polyakrylamidové

gely

jsou

než v případě agarosového gelu. tvořeny

z

monomeru

akrylamidu

(CH2=CHCONH2), který je polymerizován (síťován) do dlouhých řetězců kovalentně tzv. crosslinkerem. Nejpoužívanější crosslinker je N,N'-methylenbisakrylamid [(CH2=CHCONH)2CH2]


O NH NH O

13


14

1.6. Blotting (Southern blotting + Nothern blotting + Western blotting)

Blotting je technika, kdy proteiny jsou z gelu přeneseny do jiné matrice, např. nitrocelulózový papír, protože by síť gelu bránila jiným velkým molekulám, např. bílkovinným protilátkám nebo jiným reagentům s proteiny rychle a kvantitativně reagovat, což je právě proces, který využíváme k citlivé detekci. Po přenesení je papír podroben této inkubační reakci: v Southern blotting je papír inkubován s radioaktivní DNA komplementární k DNA, kterou stanovujeme. Northern blotting používá obdobný postup, ale s RNA. Ješte lze využít immunologickou detekci, kde papír s přeneseným analytem reaguje se specifickou protilátkou (= western blotting), případně k přenosu analytu místo toku kapaliny využít mobilizaci elektroforeticky. Možnost reakce s analytem dává i možnost citlivější detekce densitometricky, případně chemiluminiscenčně nebo fluorescenčně (s fluorescenčně aktivním reagentem).

http://www.dnalc.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htm


15

1.7. 2D-elektroforéza (Two-Dimensional Electrophoresis)

ENZYME-ASSISTED IMMUNOELECTROBLOTTING (IEB neboli WESTERN BLOTTING)

Dvourozměrná elektroforéza používá dvě posoběnásledující elektroforetické metody: izoelektrickou fokusaci a SDS-Page elektroforézu. Izoelektrická fokusace je prováděna nejdříve v jednom směru (rozměru), kdy jsou separovány látky dle svých isoelektrických bodů (pI) a následuje SDS-PAGE ve směru kolmém, kdy dělíme podle molekulových hmotností. Takto lze odlišit i proteiny lišící se o jediný náboj. Vzniklé dvourozměrné “mapy” lze po skenování (snímkování) katalogizovat a použít jako identifikační nástroj.


17


18

1.8. Elektroforéza v kapiláře = kapilární elektroforéza elecrophoresis)

(capillary

Charakteristika, výhody, problémy: Kapilární elektroforéza probíhá v křemenné kapiláře o vnitřním průměru 20 - 200 µm a je naplněna elektrolytem nebo gelem. Výhodou provádění elektroforézy v kapiláře je její relativně velký povrch vůči objemu. Proto nutně vznikající Jouleovo teplo, které je omezujícím faktorem u elektroforézy na ploše, může být proto velmi účinně odváděno (okolním vzduchem, případně chladící kapalinou). Na druhé straně kapilární rozměry tohoto separačního systému přináší problémy s dávkováním, čištěním povrchu kapiláry a detekcí. Množství vzorku musí být přizpůsobeno velikosti separační kapiláry: typický objem kapiláry je 1-10 ul, objemy vzorku nepřekračují 0.1-1% této hodnoty. Protože se většinou používá on-line (on-column) detektory, musejí být citlivé, aby takováto malá množství detekovaly. Nejběžnější je detektor optický (UV-VIS nebo fluorescenční), případně vodivostní. Stav povrchu kapiláry (elektroosmotický tok, interakce se vzorkem) představuje stále oříšek bránící kapilární elektroforéze stát se vážným konkurentem HPLC v oblasti kvantitativní analýzy. Protože separační kapilára není určena na jedno použití, po každé analýze musí být její vnitřní povrch vyčištěn, resp. uveden do opakovatelného stavu. Jedním z možných řešení je modifikace vnitřního povrchu (coating) buď dynamicky, adsorbcí nebo

Nejjednodušší zařízení pro kapilární elektroforézu

kovalentní chemickou vazbou. Tento problém je samozřejmě eliminován u kapilár plněných gelem. Na druhé straně, existenci elektroosmotického toku u nemodifikovaní křemenné

Srovnání kapiláry a slab-gelu

kapiláry, který mobilizuje celý objem kapaliny v kapiláře ke katodě, lze výhodně využít i k detekci aniontů, jejichž výsledný pohyb směřuje také ke katodě. Výhodami kapilární elektroforézy je jednoduchost přípravy vzorku i separační aparatury, efektivní chlazení a eliminace off-line densitometrického vyhodnocování na ploše

Souhrn:

gelu, protože signál získáváme přímo z on-column detektoru.

• separace se typicky uskutečňuje v kapiláře z taveného křemene vně pokryté polyimidem (jiná možnost je teflonová kapilára nebo skleněná kapilára) případně plněná gelem • Křemenná kapilára je 5 - 100 cm dlouhá s vnitřním průměrem 25-100 µm. • hydroxylové skupiny křemene mohou disociovat a nabíjet tak vnitřní stěnu kapiláry negativně • malý objem kapiláry vyžaduje malé objemy dávkovaného vzorku (1-10 nl) • on-column detekce na kapiláře vyžaduje citlivý detektor

Je důležité pochopit, že kapilára je z taveného křemene. Křemen na rozdíl od skla neobsahuje příměsi kationtů silně absorbující světlo v UV oblasti, je to prakticky čistý oxid křemičitý. Když mluvíme o taveném křemeni, odkazujeme na kapiláru. Z některých obrázků se sice může zdát, že tavený křemen je uvnitř kapiláry, ale tavený křemen je kapilárou. Tavený křemen není nic jiného než křemen zbavený nepravidelností krystalové struktury. Přetavený křemen je lépe propustný pro UV záření. Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003

19


20

2. ANALYTY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE

Migrace molekul v CE závisí na velikosti a náboji molekuly a na elektroosmotickém toku. Obvykle předpokládáme, že elektroosmotický tok je během experimnetu konstantní.

2.1. Typy molekul, které lze analyzovat kapilární elektroforézou Aplikační možnosti kapilárních elektromigračních metod jsou neobyčejně široké. Lze je využít

pro

separaci

a

analýzu

všech

typů

rozpustných

ionogenních

nízko-

i

vysokomolekulárních látek, např. anorganických i organických kyselin a bází, kovových iontů, aminokyselin, peptidů, bílkovin, sacharidů, nukleosidů, nukleotidů a nukleových kyselin, syntetických polymerů a též pro separaci nabitých (bio)částic, např. virů, buněk a buněčných organel. Kromě toho v režimu elektrokinetické chromatografie a elektrochromatografie mohou být separovány i látky neionogenní, např. alifatické a aromatické uhlovodíky a jejich deriváty (alkoholy, aldehydy, ketony, aminokyseliny a peptidy s chráněnými ionogenními skupinami aj.). Vysoké separační účinnosti HPCE technik se využívá též při separaci polohových a optických izomerů biologicky aktivních látek. Náboj

Typ molekuly

= = o o + + ++ ++

malý anion -1 velký anion -1 malý anion -2 velký anion -2 malá molekula 0 velká molekula 0 malý kation +1 velký kation +1 malý kation +2 velký kation +2

Detekce separovaných proteinů (podrobněji viz výše):

Migrační rychlost 4* 3 2 1 6 5 8 7 10 9

• • • •

Coomassie blue Fluoreskamine Autoradiografie Immunoblotting (otisk)

2.2. Proteiny = polypeptidy. Náboj polypeptidů Náboj polypeptidu při třech pH

*největší číslo znamená nejrychlejší molekulu. Molekuly s identickým nábojem migrují podle své velikosti.

Rychlost proteinu při elektroforetickém experimentu je přímo úměrná náboji a nepřímo úměrná velikosti molekuly a viskozitě elektrolytu (viz dále). Typ použitého pufru a jeho pH jsou tedy zásadní, poněvadž určují celkový náboj proteinu. Náboj proteinu závisí na stupni ionizace kyselých (COOH) a zásaditých skupin (NH2) proteinu, což je právě funkcí pH obklopujícího média.


21


22

Příklad Crotalus viridis (chřestýš zelený)

2.3. Elektroforetická titrační křivka

ETK poskytuje informaci o pI (elektroforetické mobilitě) je prováděna na vertikální ploše s použitím velkoporézní gelové matrice, jako např. agarosa nebo nízkosíťovaný polyakrylamid. Na této ploše je předem vytvořen horizontální gradient pH (pomocí patřičných amfolytů (Ampholinů). Na obrázku je vzorek (směs proteinů) po vpravení do středové jamky a aplikaci napětí.

Titrační křivka provedená na IEF 3-9 PhastGelu™. Vzorkem byl nasbíraný jeden pík jedu chřestýše oddělený na katexu LC. Pík byl dialyzován, lyofylizován a rozpuštěn ve vodě. Bylo naneseno cca 87.5 µg proteinu. K vybarvování byla použita stříbrná sůl.

Náčrt experimentálního stanovení elektroforetické titrační křivky Běhen elektroforézy se pohybují proteiny buď ke atodě nebo k anodě nebo, pokud se pH rovná jejich izoelektrickému bodu, se nepohybují vůbec. Rychlost tohoto pohybu závisí na rozdílu pH-pI. Po proběhnutí elektroforézy je obvykle gel "vybarvován" a posuzuje se vznilá titrační křivka. Typická sada takto získaných křivek je na dalším obrázku. Podle největší vzdálenosti mezi křivkami usoudíme na pH, které je optimální pro separaci např. pro eluci v iontové chromatografii.

Elektroforetické titrační křivky isoenzymů laktát dehydrogenasy


23


24

3. TEORETICKÝ POPIS ELEKTROFORÉZY

3.1. Základní pohyblivost µ

fyzikální

principy

4. ELEKTROOSMOTICKÝ TOK

elektroforézy

–

elektroforetická

Působí-li síla F (např. elektrická) na hmotnost m, bude tato hmota urychlována zrychlením a (Newton, 1667, F = m * a). Zrychlení je definováno jako rychlost změny rychlosti, jak ukazuje rovnice 1: v − v0 a= (1) t a = zrychlení, v = rychlost dosažená v čase t, v0 = počáteční rychlost v čase 0.

4.1. Elektroosmotická pumpa Obrázek: Kapilára = ENDOOSMOTICKÁ PUMPA 1/kapilára z taveného křemene s obnaženými hydroxylovámi skupinami

Zrychlení kulové molekuly nesoucí elektrický náboj v kapalině bude nulové, pokud se odporová (zadržovací) síla okolní kapaliny bude rovnat této urychlující síle F(a) (rovnice 2)

Fa = Fd

(2)

což je případ kapilární zónové elektroforézy (obrázek, ion je zdržován iontovou atmosférou). Pak se bude molekula pohybovat rovnoměrným pohybem s konstantní rychlostí. Urychlující elektrická síle se rovná součinu síly elektrického pole (ve V/m) a náboje molekuly (v Coulombech) (rovnice 3).

Fa = E * Q

E = U/d

2/ Disociace hydroxylových skupin zanechá na vnitřním povrchu negativní náboj

(3)

U = napětí, d = vzdálenost, Q = náboj Odporová síla F(d) je funkcí velikosti a tvaru molekuly a viskozity okolní kapaliny podle Stokesovy rovnice, která pro kulovou molekulu má tvar

F(d) = 6 * π * η * r * vef

(4)

r = poloměr molekuly,η = viskosita, vef = rychlost Protože F(a) = F(d), pak E * Q = 6 * π * η * r * vef Dostaneme důležitou veličinu zvanou elektroforetické mobilita µ:

µ = vef/E = Q / 6 * π * η * r

3/ Zapnutím napětí se začně kapalina pohybovat ke katodě - je mobilizována endoosmotickým tokem !

(5)

a rychlost pohybu je tedy

v=µE

(6)

pozn.: mobilita (µ) např. proteinu je úměrná náboji (Q) a nepřímo úměrná velikosti molekuly a viskozitě elektrolytu. Druh elektrolytu a jeho pH jsou proto důležité, neboť celkový náboj proteinu je dán pH elektrolytu (pufru). Jinými slovy, celkový náboj proteinu závisí na stupni ionizace kyselých a zásaditých skupin na proteinu, který je závislý na pH prostředí. Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003

25


26

Jednoduché vysvětlení elektroosmotického toku

Povrch křemenné kapiláry obsahuje negativně nabité funkční skupiny, které přitahují pozitivně nabité protiionty. Pozitivně nabité ionty migrují k negativní elektrodě a unáší molekuly rozpouštědla stejným směrem. Tento celkový pohyb kapaliny je nazýván elektroosmotický tok. Během separace se neutrální molekuly pohybují stejným směrem jako elektroosmotický tok (s nepatrnou vzájemnou separací). Positivně nabité ionty jsou elektroosmotickým tokem urychlovány, negativně nabité naopak zpomalovány.


27

Stěny taveného křemene obsahují silanolové skupiny, které mohou ionizovat při vyšším pH roztoku elektrolytu. Tato disociace produkuje negativně nabitou stěnu. Vrstva kovových kationtů proto u stěny kompenzuje náboj, aby byla zachována elektroneutralita. Když zapneme napětí, tyto kationty a jejich solvatační obaly vody migrují ke katodě. Tento pohyb je zdrojem pohybu celé kapaliny. Tento toko vlastně pumpuje ionty vzorku ale i celou kapalinu a může být považován za "elektricky-řízenou pumpu". Při nízkém pH jsou silanoly nedisociované a proto elektroosmotický tok je mnohem slabší, při velmi nízkých pH skoro nulový.

Jedním z důsledků existence EOF je možnost detekce kationtů a aniontů v jednom experimentu v případěch, kdy velikost EOF je vyšší než elektroforetická mobilita aniontů (např. při pH>7), protože tok kapaliny unáší všechny látky ke katodě, kde je detektor.

Disociace silanolových skupin

Velikost elektroosmotického toku je závislá na náboji kapiláry, viskozitě elektrolytu a elektrické permitivitě elektrolytu:

µ(eo) = ε ζ / η r µ(eo) = "EOF mobilita" (rychlost EOF), η = viskozita, ζ = zeta potenciál (elektrostatický potenciál vzniklý v důsledu náboje na povrchu kapiláry), r = poloměr kapiláry, ε - permitivita elektrolytu. Všimněme si, že ε ∗ ζ je náboj (v Coulombech) podobně jako µ=q/6πηr.

Obrázek 4: Pohyb aniontů a kationtů v kapiláře z taveného křemene po aplikaci elektrického pole.Dva (+) resp.(–) označují větší náboj, krychle a kužele neutrální látky.

Velikost EOF je značně závislá na pH elektrolytu, poněvadž zeta potenciál je řízen ionizací silanolových skupin. Do pH=4 je ionizace malá, a nad pH=9 jsou již prakticky všechny skupiny ionizované (horní modrá křivka v obrázku).

Nejdůležitější praktické důsledky: • Pozitivní a negativní i neutrální molekuly se budou pohybovat amohou být detekovány, tedy i separovány !!! • elektrolyt je pumpován od anody ke katodě (situaci lze analogicky obrátit, je-li povrch kapiláry nabitý pozitivně)


29


30

Pohyb (migrace) závisí na elektroforetickém pohybu nabitých molekul. V některých případech elektroforézy s nemodifikovanou kapilárou, je endoosmotický tok větší než

JAK VZNIKÁ ELEKTROFEROGRAM rychlost zóny :

elektroforetický pohyb. Proto se jak kationty, tak anionty pohybují směrem ke katodě.

POČÍTÁNÍ POHYBLIVOSTÍ tmig,i , teof

ld , lc , U

Čas t, který potřebuje analyt, aby přemigroval délkou kapiláry L, je nepřímo úměrný jeho celkové rychlosti, která je (vektorovým) součtem rychlosti elektroforetické a té, kterou přispívá EOF:

t = (vr

EO

L r + v ef

)

znamená to, že při výpočtu skutečné elektroforetické mobility z experimentálně změřeného času, musíme příspěvek elektroosmotického toku vektorově odečítat.


31

mef,i > 0 pro kationty mef,i < 0 pro anionty mpoz,i > 0 pro oboje, pokud


32

4.3. Modifikátory elektroosmotického toku (EFM) – tenzidy neboli surfaktanty

5. ZÁKLADY INSTRUMENTACE

Bližší pohled na surfaktanty Surfaktanty jsou známé povrchově aktivní látky, např. mýdla. Molekula surfaktantu má oddělenou polární a nepolární

část.

Při

malých

koncentracích tvoří běžné (pravé) roztoky, při vysokých však již nejsou v kapalině homogeně

rozptýlené.

Zásadní vlastností surfaktantů je jejich zakoncentrovávání se na mezifázích. V případě systému křemenná kapilára – roztok může dojít k navázání surfaktantů nejen adsorpcí, ale i elektrostatickými silami. V případě kationogenních tenzidů lze tímto způsobem elektroosmotický tok zmenšit, dokonce i obrátit jeho směr, jak je znázorněno na obrázku. 5.1. Pracovní podmínky • Křemenná kapilára (I.D. 10-100 um) • Řada známých elektrolytů s tlumícími schopnostmi • Vysoké napětí (5-30 kV)

MEKC Je-li koncentrace surfaktantu vyšší než tzv.

Proud (1-200 uA)

kritická micelární koncentrace, vytvoří se micely. Micely jsou shluky, které mají (ve

5.2. Dávkování vzorku • Elektrokinetické • Hydrostatické • Hydrodynamické (pneumatické)

vodném prostředí) hydrofobní jádro a navenek obnaženy hydrofilní části molekul (micelární fáze). Analyty tak při pohybu v elektrolytu, kde se vyskytuje micelární fáze, mohou být distribuovány mezi elektrolyt a micely (podle své chemické afinity k micele) a tím měnit svoji celkovou rychlost pohybu kapilárou. Tato změna rychlosti je obvykle zvýšena tím, že sama micela nese náboj a proto se v elektrickém poli sama pohybuje.


Surfaktanty jsou používány k separaci malých velmi málo nabitých nebo nulově nabitých molekul – surfaktant v nadkritické micelární koncentraci tvoří micely a tomuto módu elektroforézy se říká Micelární elektrokinetická chromatografie (MECC nebo MEKC)

33

5.3. Módy detekce • UV/Vis detektor • Fluorescenční detektor • Vodivostní detektor • Elektrochemický detektor • Hmotnostní (MS, Mass spectrometry) • Radioaktivní detektor (s beta zářičem) Post column dervatizační detekce


34

5.1. Pracovní podmínky Typická napětí jsou v rozsahu 5 - 30 kV, aby produkovaly proudy v rozsahu 10 - 100 µA. Vyšší proudy mohou způsobovat nadměrný ohřev uvnitř kapiláry, který už nelze efektivně odvádět, což má za následek rozmývání zón a ztrátu rozlišeni (separace). • kapiláry Kapiláry jsou obvykle z taveného křemene, na vnějším povrchu chráněné polyimidovým potahem, protože tavený křemen je velmi křehký (existují ale i kapiláry z UV propustného polymeru). Kvůli optické detekci, část ochraného potahu je sejmuta a toto „okénko“ je centrováno do detektoru mezi dvě kulové čočky. Délka kapiláry je typicky 10100 cm, vnitřní průměr 50 nebo 75 mikrometrů. Na komerčních zařízeních bývá kapilára upevněna v kazetě, aby se zabránilo přelomení případně pohybu kapiláry v optickém okénku. Vnitřní povrch kapiláry může být modifikován dynamicky (EFM, např. surfaktantem v základním elektrolytu) nebo chemicky kovalentní (např. PVA). • regulace teploty Regulace teploty kapiláry je nutná pro zajištění dobrého rozlišení a reprodukovatelnosti. Uživatelem sestavované přístroje nebyly vybaveny termostatem (spoléhají na přirozené chlazení vzduchem), komerční přístroje jsou vybaveny chlazením kapiláry nucenou ventilací chlazeného bloku, ale např. fa Beckman má kazety s kapilárou neprodyšně uzavřenou a chlazenou chladící kapalinou. • detektory Většina přístrojů CE používá optický UV detektor, případně vybavený diodovým polem, díky kterému je přístroj schopen velmi rychle (v průběhu analýzy) snímat celá spektra. Možností jsou i fluorescenční detektory s laserovou indukcí záření, které jsou vysoce citlivé, ale omezeny na fluoreskující látky. Třetí nejpoužívanější detektor je vodivostní, který má buď elektrody přímo v elektrolytu nebo je bezkontaktní, nasunut kolem kapiláry. Při napojení MS za kapiláru (vyžaduje speciální interface) lze hovořit o detektoru hmotnostním (CE-MS), který dává strukturní informace o separovaných zónách. Pro zvýšení citlivosti, což je jeden z problému CE, byly zkonstruovány tzv. bubble cells, kde je lokálně zvětšen vnitřní průměr kapiláry, nebo Z-cely, kde je kapilára přerušena, radiálně posunuta a optická dráha měrného paprsku je tak několikanásobně prodloužena (podobný princip jako u UV detektorů v LC).


35


36

Z-cela

5.2. Nepřímá detekce v CE Nepřímá detekce představuje možnost, jak získat nejběžnějším UV-VIS detektorem signál

Detektory jsou běžně spojeny s počítačem, který řídí sběr dat a umožňuje pohodlnou kvantitativní analýzu.

analytů, které samy v této oblasti neabsorbují (tzn. nemají vhodný chromofor, což je celé řada malých anorganických kationtů i aniontů). Principem nepřímé detekce je použití elektrolytu, který sám absorbuje; putující zóny představují pro optický detektor zóny zředění, čili poklesu

• dávkování vzorku Roztok vzorku nuceně vniká do jednoho konce kapiláry, typicky vzdálenějšího od detektoru. Typické dávkované objemy jsou mezi 10-100 nl (objemy kapiláry jsou 1-2 µl). Je-li kapilára volně v prostoru, lze použít hydrostatické dávkování zvednutím dávkovacího konce kapiláry nad úroveň druhého konce (sifonový efekt). Většinou se ale používá aplikace přetlaku na nádobku u injekčního konce kapiláry nebo podtlaku na nádobku u detektorového konce. To samozřejmě vyžaduje pneumaticky uzavřený systém nádobky-kapilára. Třetí možností je dávkování aplikovaným napětím, kdy na dávkovacím konci kapiláry je nádobka se vzorkem. Tento poslední způsob je např. jediný možný u gelové kapilární elektroforézy, ale má nevýhodu, že dávkuje přednostně mobilnější ionty na úkor méně mobilních či neutrálních (nedávkujeme reprezentativní vzorek)

signálu (viz obrázek). Při výběru absorbujícího elektrolytu musíme mimo optické vlastnosti zvažovat i znaménko a velikost elektroforetické pohyblivosti absorbujících iontů.

Dávkování vzorku v CE

-


37


+

38

6. SEPARAČNÍ MÓDY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE • • • • • • • •

CZE (FSCE) CGE CIEF CITP CEC MEKC (MECC) Diskontinuální elektroforéze (Discontinous Electrophoresis) CE v nevodném prostředí

• Capillary Zone Electrophoresis • Capillary IsoElectric Focusing • Capillary IsoTachoPhoresis


39

CZE CIEF CITP


40

von Smoluchovského rovnice pro rychlost elektroosmotického pohybu: http://chem.external.hp.com/cag/products/cetech.html#CZE

6.1. Kapilární zónová elektroforéza (CZE)

CZE je nejužívanější mód kapilární elektroforézy. V jednom experimentu migrují kationty a anionty opačným směrem, pokud, jak již bylo uvedeno, není elektroosmotický tok tak velký, že u jednoho druhu iontů tento směr obrátí (typicky u aniontů) a ty pak migrují až za neutrálními analyty, které se pohybují rychlostí EOF. Též se někdy nazývá Free solution capillary electrophoresis (FSCE).

L = 0,5 m, U = 30 000 V, meof = 0,0005 cm2/Vs →

veof = 3 mm/s

MIKROPOHLED NA ELEKTROOSMOTICKÝ POHYB - ELEKTRICKÁ DVOJVRSTVA

Již jsme si odvodili základní rovnici pro pozorovanou rychlost v(ef) pohybu zóny v CZE:

E : intenzita elektrického pole [V/m], U : napětí [V], L : délka kapiláry [m], elektroforetická rychlost : vef,i [m/s], elektroforetická pohyblivost : mef,i [m2/Vs] pojmy: elektroforetická pohyblivost limitní iontová pohyblivost – při nekonečném zředění, tj. při I → 0 aktuální iontová pohyblivost – při jisté koncentraci elektrolytů v roztoku, tj. při I > 0 POVRCHOVÝ NÁBOJ efektivní poloměr iontu souvisí s hydratační sférou iontu efektivní náboj iontu souvisí s iontovou sílou roztoku, která se projevuje retardačním a relaxačním efektem

,

pK = 5,5

Příklady (limitních) elektroforetických pohyblivostí: Iont Li+ Na+ K+ Rb+ Cs+ NO2NO3SO42HSO4-

ri [nm] 0,152 0,186 0,227 0,248 0,265

rh [nm] 0,380 0,316 0,272 0,268 0,268

mi [10-4 cm2/Vs] 4,01 5,19 7,92 8,06 8,00 -7,44 -7,40 -8,29 -5,18 ZETA POTENCIÁL ( ζ ) = potenciál jako důsledek existence povrchového náboje

ri iontový poloměr rh poloměr hydratovaného iontu mi limitní (maximální) iontová pohyblivost (nekonečně zředěný roztok)


41


42

Elektroforetickápohyblivost amfolytů VÝHODNÝ RYCHLOSTNÍ PROFIL V KAPILÁŘE SLABÉ ELEKTROLYTY (kyseliny) HA + H2O ↔ A- + H3O+

meff,HA efektivní elektroforetická pohyblivost mA- iontová pohyblivost

SLABÉ ELEKTROLYTY (zásady)

TEPLOTNÍ PROFIL KŘEMENNÉ KAPILÁRY

BH+ + H2O ↔ B + H3O+

Jouleovo teplo :

meff,B efektivní elektroforetická pohyblivost mBH+ iontová pohyblivost


43


44

VÍCESYTNÉ ELEKTROLYTY

VLIV KONCENTRACE PUFRU

kyselina m-hydroxybenzoová pKa,1 = 4,06 ; mef,HA- = -3,36·10-4 cm2/Vs pKa,2 = 9,92 ; mef,A2- = -5,38·10-4 cm2/Vs

distribuční diagram

1 tyramin, 2 thiomočovina, 3 uracil, 4 m-nitrofenol, 5 kyselina benzoová, 6 o-nitrofenol

efektivní mobilita

Na2B4O7 20 mM 10 mM 5 mM 2,5 mM

PUFRY tetraboritan sodný, Na2B4O7, pKa = 9,2 kyselina fosforečná, fosforečnan, H3PO4, pKa = 2,1, mi = -3,4 kyselina fosforečná, fosforečnan, H3PO4, pKa = 7,2, ;mi = -5,8 kyselina fosforečná, fosforečnan, H3PO4, pKa = 12,7, mi = -7,1 kyselina octová, octan, CH3COOH, pKa = 4,8, mi = -4,2 kyselina citronová, citrát, C6H8O7, pKa = 3,1, mi = -3,1 kyselina citronová, citrát, C6H8O7, pKa = 4,8, mi = -5,4 kyselina citronová, citrát, C6H8O7, pKa = 6,4, mi = -7,0 MES, O(CH2CH2)2N-CH2CH2-SO3H, pKa = 6,1, mi = -2,7 MOPS, O(CH2CH2)2N-CH2CH2CH2-SO3H, pKa = 7,2, mi = -2,4 TRIS, (HOCH2)3C-NH2, pKa = 8,1, mi = 2,9 CHES, CH2(CH2CH2)2CH-NH-CH2CH2-SO3H, pKa = 9,5 CAPS, CH2(CH2CH2)2CH-NH-CH2CH2CH2-SO3H, pKa = 10,4


45

meof [cm2/Vs] 8,08·10-4 8,33·10-4 8,90·10-4 9,74·10-4

R5,6 2,24 1,49 0,85 0


vysvětlení: efektivní náboj iontu souvisí s iontovou sílou roztoku, která se projevuje retardačním a relaxačním efektem

46

Teoretická část

6.2. Izotachoforéza (ITP) ITP používá 2 různé elektrolyty – vedoucí (leading, LE) a koncový (terminating TE), mezi které se dávkuje vzorek. Specifickým rysem ITP je to, že v rovnovážném stavu se všechny zóny uspořádají podle klesající elektroforetické mobility, putují stejnou rychlostí k detektoru a jejich

Izotachoforéza se liší od ostatních elektroforetických metod tím, že vzorek je vnášen mezi dva různé elektrolyty - vedoucí (leading L) a koncový (terminating T). Ty musí být vybrány tak, aby pro jejich pohyblivosti (mobility) platilo:

uL > ui,ef > uT

koncentrace se upravuje podle koncentrace vedoucího elektrolytu. Poslední fakt je výhodně využíván k zakoncentrování analytů z velmi zředěných vzorků (až 1000x). EOF je eliminován, v jednom experimentu lze separovat buď anionty nebo kationty. Specifické je také vyhodnocování izotachoforegramů – záznam nejběžněji používaného vodivostního detektoru je schodovitý, protože zóny jsou seřazeny podle svých vodivostí. Vodivost, čili

V jednom experimentu mohou být separovány pouze ionty jediného znaménka, buď anionty nebo kationty. Po připojení elektrického pole na systém začne probíhat izotachoforetický proces.

výška schodu je kvalitativní charakteristikou příslušné zóny, její délka, v důsledku adjustace koncetrací podle LE, je pak charakteristikou kvantitativní.

Izotachoforetickýproces

Rozdíl mezi zónovou elektroforézou a izotachoforézou

Průběh izotachoforézy můžeme rozdělit do dvou částí. V první z nich dochází k separaci složek vzorku, migrační rychlosti jednotlivých částic ve směsné zóně jsou různé. V druhé časti, kterou označujeme jako ustálený stav, jsou částice rozděleny a všechny se pohybují stejnou rychlostí. Dynamika separace směsi složek A a B, pro které platí uA > uB je ukázána na obrázku. Ustáleného stavu je dosaženo, když oddělené zóny s ostrými rozhraními, následující jedna za druhou, představují čisté složky A a B. Od této doby se všechny zóny pohybují konstantní rychlostí v:

v = uL EL = uA EA = uB EB = uT ET = konst Je zřejmé, že od zóny k zóně se skokem mění napětový gradient, takže společný protiion R migruje v jednotlivých zónách postupně rostoucí rychlostí, přenáší tedy stále větší náboj. Protože celkový hnací proud musí být ve všech zónách stejný, dochází k přizpůsobení koncentrací v jednotlivých zónách vzhledem ke koncentraci vedoucího elektrolytu.


47


48

Tento problém je možno objasnit na jednoduchém modelu: vedoucí elektrolyt je složen z

Jednotlivé zóny jsou ostré a stabilizované samozaostřujícím efektem. Opustí-li ion např.

iontů L a R, koncový elektrolyt z iontů T a R. Jde o silné uni-univalentní elektrolyty v

difuzí svou zónu a pronikne do následující zóny s vyšším potenciálovým gradientem, jeho

neutrálním prostředí. Proud I v obou zónách je konstantní (IL = IT = I). Z podmínky

rychlost vzroste a ion se vrátí opět do své zóny. Přejde-li do předchozí zóny s nižším

elektroneutrality vyplývá, že koncentrace kladných a záporných iontů v jednotlivých zónách

gradientem, klesne jeho rychlost a ion se vrátí.

musí být stejná: cL = cR(L)

cT = cR(T) Podmínka úplné separace

kde cR(L) a cR(T) jsou koncentrace protiiontu v příslušných zónách. Jelikož vL = vT

Aby došlo k úplné separaci, musí kolonou projít určitý náboj. Lze dokázat, že tento tzv.

uL EL = uT ET

a množství iontů za sekundu resp. náboj za sekundu (tj. proud), které projdou průřezem

separační náboj QS je dán vztahem NA uA,ef (1 - uR/uA) + NB uB,ef (1 - uR/uB)

kapiláry je N = S Σ(ci vi) = S Σ(ci ui Ei)

⇒

QS = F —————————————————

I = Q / t = F S Σ(ci ui Ei)

uA,ef - uB,ef

kde F je Faradayova konstanta, platí pro hnací proud I

kde NA,NB jsou absolutní látková množství látek A a B.

I = EL S F cL (uL + uR) = ET S F cT (uT + uR)

Poznámka: uA, uB a uR jsou vektory, uR má vždy opačné znaménko, výrazy v závorkách jsou vždy větší než 1.

Úpravou dostáváme vztah mezi koncentracemi cT a cL, tzv. Kohlrauschovu regulační funkci: Separační náboj tedy nezávisí na geometrii kapiláry a hnacím proudu, závisí na dávkovaném

cT = c L .

objemu vzorku (respektive na jeho koncentraci), na rozdílu mobilit separovaných látek, na

E L .(u L + u R ) u .(u + u R ) = cL . T L ET . (uT + u R ) u L. (uT + u R )

teplotě a na hodnotě pH (vliv na efektivní mobility).

Analogické vztahy platí mezi koncentracemi stanovovaných iontů v jednotlivých zónách a

Kolonová zádrž

koncentrací vedoucího elektrolytu. V ustáleném stavu koncentraci ci i-té částice (bez ohledu na počáteční koncentraci ve vzorku) odpovídá vždy jistá hodnota, která závisí jedině na koncentraci vedoucího elektrolytu cL a pohyblivosti i-té částice ui a iontu vedoucího a koncového elektrolytu uL a uT. Z analytického hlediska se jedná o velmi důležitý rys izotachoforézy. Složky s vyšší koncentrací v původním vzorku se zředí během separace a složky s původně nižší koncentrací se koncentrují.

Další charakteristickou veličinou je tzv. kolonová zádrž QL, což je náboj, který musí projít kapilárou, aby zadní rozhraní vedoucího elektrolytu právě dorazilo do detektoru. Q L = I tL

tL . . . doba průchodu proudu

Jde o veličinu snadno experimentálně stanovitelnou. Jelikož k separaci dochází i při průchodu první čisté zóny detektorem, je požadovaná

Z předchozího vidíme, že rozložení potenciálového gradientu podél separační kolony není konstantní, ale závisí na rozložení specifické vodivosti κ, a tedy na koncentraci ci a na pohyblivosti (ui)ef jednotlivých částic (viz obrázek). S klesající efektivní pohyblivostí částic v

minimálni zádrž kolony pro dosažení úplné separace dána vztahem QL,min = QS - NA F (1 - uR/u A)

jednotlivých zónách klesá elektrická vodivost (stoupá odpor), a tedy intenzita elektrického

Tyto vztahy umožňují předběžnou orientaci při řešení daného separačního problému.

pole stoupá. S průchodem elektrického proudu zónou o vyšším odporu se uvolňuje více tepla

Jelikož hodnota odečítaného výrazu je velmi malá, stačí pro posouzení možnosti úspěšné

a teplota příslušné zóny je tedy vyšší než teplota zóny předchozí. Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003

49


50

separace porovnání vypočteného separačního náboje s experimentálně stanovenou kolonovou zádrží (QL ≥ QS).

U inertních materiálů (teflon) je elektroosmotický tok minimální, zdrojem nábojů fixovaných na povrchu kapiláry může být pouze adsorpce ionogenních látek. Adsorpcí vhodně zvoleného kationaktivního tenzidu na povrchu kapiláry je možno obrátit polaritu povrchové dvojvrstvy a tím zlepšit profil zón při aniontové izotachoforéze. K minimalizaci

Instrumentace

vlivu

elektroosmózy

jsou

používány

přídavky

neionogenních

tenzidů

(např.

polyvinylalkoholu, hydroxyethylcelulózy apod.) do vedoucího elektrolytu. Tenzid se Zdroj napětí

adsorbuje na fázovém rozhraní, oddělí od sebe nábojové vrstvy a tím sníží hustotu náboje v

Podmínkou reprodukovatelnosti izotachoforetického stanovení je konstantní hnací proud.

povrchové vrstvě elektrolytu. Tenzid zároveň zvyšuje viskozitu elektrolytu, čímž rovněž

Napěťový zdroj je konstruován jako ampérostat, konstantní hodnota proudu je udržována

přispíva ke stabilizaci zón. Na délce a průřezu kapiláry zavisí její separační kapacita.

regulací napětí. Celkový odpor systému v průběhu separace roste (separační kapilára se

U některých typů přístrojů lze separační kapiláru měnit.

postupně zaplňuje málo

vodivým koncovým elektrolytem). Při

běžně užívaných

koncentracích vodicího elektrolytu (0.01 M) bývá počáteční napětí kolem 2 kV a postupně vzrůstá na 4 - 6 kV podle typu použitého koncového elektrolytu. Hnací proudy se v závislosti

Detektor

na průřezu kapiláry pohybují mezi 20 - 500 µA. Napájecí zařízení bývá vybaveno napěťovou

K detekci se využívá fyzikalně-chemických

ochranou, která automaticky vypne obvod v případě, že odpor v separační kapiláře nadměrně

vlastností jednotlivých separovaných zón. Z

vzroste (bublina v kapiláře).

výše

popsaného

principu

izotachoforetické

separace vyplývá, že v jednotlivých zónách se postupně skokem zvyšuje napěťový gradient, Separační kapilára

roste výkon a tím i teplota v jednotlivých zónách

Z důvodu minimalizace elektroosmotického toku jsou používány výhradně kapiláry z plastu,

a klesá koncentrace. Toho je možno využít

zpravidla teflonové. Zcela nevhodné je sklo. Vzhledem k průměru kapiláry, která je nadto z

k univerzální detekci jednotlivých zón na konci separační kapiláry.

jedné strany uzavřena membránou, projevuje se elektroosmóza v izotachoforéze jinak než v

Potenciometrický detektor je tvořen dvěma elektrodami umístěnými těsně za sebou ve

kapilární elektroforéze. Elektroosmotický tok a protisměrný hydrodynamický tok působí

směru migrace. Elektrody snímají potenciálový gradient v jednotlivých zónách. Výhodou je

rušivě na ostrost rozhraní jednotlivých zón. U kationtové izotachoforézy je vliv

jednoduchost, nevýhodou je to, že zóny, jejichž délka je srovnatelná se vzdáleností elektrod,

elektroosmózy menší, může dojít i ke zlepšení profilu rozhraní, protože zpětný

nejsou zřetelně detekovány.

hydrodynamický tok může kompenzovat vliv teplotního gradientu uvnitř kapiláry, který

Teplotní

detektor

měří

teplotu

v

způsobuje větší rychlost migrace ve středu kapiláry. U aniontové izotachoforézy působí

jednotlivých zónách. Dnes se již prakticky

elektroosmóza naopak vysloveně rušivě (viz obrázek).

neužívá, protože detekce není dostatečně ostrá. Nejběžnější je konduktometrický detektor, který měří vodivost v jednotlivých zónách. Elektrody jsou umístěny proti sobě a ostrost detekce je zajištěna tím, že jejich rozměr ve směru podélné osy kapiláry je velmi malý.


51


52

kapalinové

Pro kvantitativní vyhodnocení zejména sériových analýz je metoda kalibračního grafu

chromatografii) může být universální (nepřímá detekce pomocí vhodného absorbujícího

Spektrofotometrický detektor

(analogie

fotometrického

detektoru

v

nejpoužívanější. U jednotlivých analýz je též používána metoda standardního přídavku: délka

protiiontu přidaného do vedoucího elektrolytu) nebo selektivní (přímá detekce zón látek

zóny l x původního vzorku se srovnává s délkou zóny po přídavku standardu x do vzorku

absorbujících při zvolené vlnové délce). Fotometrická detekce usnadňuje identifikaci složek vzorku, zvláště v případě možnosti užití několika vlnových délek, případně záznamu

Určitým problémem zůstává správné odečtení délek jednotlivých zón. Rozhraní nejsou absolutně

absorpčního spektra. I selektivní fotometrický detektor zpravidla zaznamenává průchod

ostrá, schodovitý záznam závislosti vodivosti nebo potenciálového gradientu na čase není přesně

dostatečně ostrých rozhraní jednotlivých zón (změna indexu lomu na rozhraní vyvolá malou

pravoúhlý, sestupné časti mají sigmoidní charakter. Proto se délka vlny určuje jako vzdálenost dvou

změnu v intenzitě procházejícího paprsku). Neostré rozhraní se nezaznamená (viz obrázek).

sousedních inflexních bodů. S výhodou lze použít záznamu derivační křivky, kde poloha inflexu je vyznačena maximem na derivační křivce.

Kvalitativní analýza Kvalitativní vyhodnocení záznamů universálních detektorů je analogické s vyhodnocením chromatogramů. Určuje se relativní poloha (výška schodu) vzhledem k poloze vedoucího elektrolytu a koncového elektrolytu.

Volba operačního systému Volba operačního systému vyžaduje určité předběžné znalosti o analyzovaném vzorku. Je totiž nutno zejména terminátor volit tak, aby žádná složka vzorku neměla menší mobilitu než

hrel ( I ) =

hL − hI hL − hT

je mobilita terminátoru. Naproti tomu volba vodicího iontu je poměrně jednoduchá. S výjimkou iontu OH- má největší pohyblivost chloridový ion, který se v aniontové izotachoforéze běžně používá, v kationtové izotachoforéze se jako vodicí ion používa K+ (největší mobilita - s výjimkou H+). Důležitá je rovněž úprava pH vodícího elektrolytu, tj.

Tato relativní výška (obrázek) se porovnává s relativními výškami

zón

látek,

jejichž

přítomnost

ve

volba pufrujícího protiiontu, podle které se řídí i pH v jednotlivých separovaných zónách. V

vzorku

kationtové izotachoforéze pH jednotlivých zón od leadingu k terminátoru klesá, v aniontové

předpokládáme. Potvrzením identity je přídavek standardu

izotachoforéze naopak stoupá. Pro dělení slabých elektrolytů je nutné takové pH, při kterém

stanovované složky do vzorku - identická zóna se vzhledem k

ostatním

zónám prodlouží.

je elektrolyt disociován z 10 - 90%, tedy pH v rozmezí pK ± 1.

Identifikaci usnadňují

selektivní spektrofotometrické detektory. Typické operační systémy pro aniontovou izotachoforézu: 1) L: 0.002 až 0.02 M HCl, protiion β-alanin, pH 3.1 - 4.1 T: kyselina glutamová nebo kapronová

Kvantitativní analýza Při izotachoforetické separaci se nadávkovaný vzorek objemu V, v němž má stanovovaná látka koncentraci cx, rozdělí na jednotlivé složky - zóny. Zóna látky x zaujímá v separační kapiláře objem Vx a koncentrace cx´ látky x v této zóně je dána Kohlrauschovou regulační funkcí.

2) L: 0.002 až 0.02 M HCl, protiion kyselina ε-aminokapronová, pH 4.1 - 5.1 T: kyselina glutamová, kapronová nebo morfolinethansulfonová 3) L: 0.002 až 0.02 M HCl, protiion histidin, pH 5.5 - 6.5 T: kyselina morfolinethansulfonová

V praxi se většinou stanovuje délka zóny lx na zapisovači, pro kterou platí

Do vedoucího elektrolytu se přidává povrchově aktivní látka (polyvinylalkohol,

lx = tx vI

hydroxymethylcelulóza) k potlačení elektroosmózy.

kde vI je rychlost posunu papíru zapisovače. Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003

53


54

Výrazných změn mobility jednotlivých iontů lze dosáhnout použitím speciálních protiiontů. Příkladem je stanovení síranového a dusičnanového iontu, které se v normálním operačním systému nedaří. Přidáme-li do vodícího elektrolytu dvojmocný ion (optimální je bis-tris-propan, stačí však i vápenatý ion), zpomalí se síranový ion a zóny se oddělí. Přídavkem kademnatého iontu do vodicího dusičnanového elektrolytu se zpomalí ion Cltak, že vytvoří samostatnou zónu, přestože jeho normální mobilita je vyšší než u

6.3. Kapilární gelové elektroforéza (CGE)

CGE je CE-analog tradiční slab-gel elektroforézy a je používána pro velikostní separace biologických makromolekul, typicky oligonukleotidů, DNA fragmentů a proteinů. Separace se provádí v kapiláře naplněné zesíťovanou matricí gelu, např. zesíťovaným polyakrylamidem, agarósou nebo vyměnitelným roztokem lineárních polymerů. Hlavní výhoda kapilárních rozměrů gelové elektroforézy je širší škála aplikovatelných gelů, on-line detekce, tím pádem lepší kvantifikovatelnost a automatizace.

dusičnanového iontu. V tomto případě jde o tvorbu slabého komplexu chloridu s kademnatým iontem. Různé stability komplexů vhodných činidel s kovovými ionty lze použít v kationtové

viz aplikace: 9.3

izotachoforéze k dosažení dobrého rozdělení i v případě, kdy se kationty jako takové nedělí. Příkladem může být separace kovů vzácných zemin s použitím kyseliny hydroxyizomáselné jako protiiontu. Mobility iontů vzácných zemin jsou velmi blízké. Stabilita komplexu s výše uvedenou kyselinou výrazně stoupá v pořadí rostoucích atomových čísel a tím se výrazně snižuje jejich mobilita, což vede k jejich dobrému rozdělení.


55

Kapilární gelová elektroforéza (CGE = Capillary Gel Electrophoresis) dělí velké molekuly s nábojem (ionty) na základě jejich rozdílných elektroforetických pohyblivostí. Kapilára je naplněna gelem, který zvyšuje rozdíly mezi elektroforetickými rychlostmi velkých iontů různých tvarů, jež jsou nuceny migrovat póry gelu. Přítomnost gelu zabraňuje vzniku elektroosmotického toku, a tak pouze jeden druh iontů (kladné nebo záporné) se pohybují směrem k detektoru a mohou být separovány a detekovány běhěm jednoho experimentu. Kapilární gelová elektroforéza je použitelná pouze pro ionty a využívá se zejména pro velké ionty jako peptidy, bílkoviny, sacharidy, štěpy DNA a RNA.


56

Retenční čas neutrálního analytu je vždy mezi t0 and t (mc) :

6.4. Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) MEKC byla původně vyvinuta pro rozdělení nenabitých látek, které nemohou být děleny CZE. Do elektrolytu je přidán surfaktant v koncentraci vyšší než je kritická micelární koncentrace (CMC) a jeho molekuly se začnou samovolně agregovat. Analyt se tak může rozdělovat mezi fázi elektrolytu a micelární podle chemické afinity. Čím silnější interakce, tím déle zůstává analyt v micelách a tím více se změní jeho migrační čas. Nejběžněji používaným surfaktantem, který vytváří v základním elektrolytu micely, je sodium dodecyl sulfát (SDS). Jeho micely mají hydrofilní vnější povrch a hydrofobními jádro, které je tvořeno nepolárními řetězci molekul, a do něhož se může analyt rozdělovat. Protože SDS micely mají sami negativní náboj, migrují proti EOF. Avšak velikost EOF je obvykle vyšší, takže i micely dosáhnou detektoru. Schematický princip MEKC

    1 ' + k  t0 tr =   t0  k ' 1+ t mc  

(5)

Kapacitní faktor k’ pro neutrální látky v MEKC lze spočítat:

tr −1 0 t ' k = t 1− r tmc

(6)

Analyt, který migruje s časem t0, má kapacitní faktor 0, analyt, který migruje s micelami (tmc) má kapacitní faktor nekonečný. Analyt, který stráví stejný čas v micelární fázi i v elektrolytu, má kapacitní faktor 1. Jinými příklady používaného surfaktantu je cetyltrimethylammonium bromid (CTAB, kationogenní surfaktant) nebo cholát sodný (anionogenní surfaktant, steroid, navíc chirální) nebo směsi neionogenních surfaktantů (Twee + Brij). Selektivita je nastavitelná výběrem surfaktantu a také přídavky dalších modifikátorů do základního elektrolytu – organických rozpouštědel a iontopárových činidel, stejně jako v HPLC. Separace jsou převážně prováděny při vyšších pH, abychom aktivovaly vnitřní povrch kapiláry. DETERGENTY CMC Pro MEKC existují dva důležité limitní migrační časy: t0 je čas nutný pro micelami nezadržovanou látku, aby se dostala od nástřiku do detektoru, tmc je čas, který potřebuje pro uražení této dráhy micela.

aniontové dodecylsíran sodný, SDS dodecylsulfonan sodný kyselina cholová kyselina deoxycholová

n

MW

8,3 9,8 14,0 5,0

62 54 3 4

18000 15000 14000 17000

14,6

61

19300

4,4

64

19000

0,9

78

28000

0,1

40

48000

0,2

140

90000

Separační okno v MEKC Látky, které silně intragují s micelami, migrují později než látky, které s micelami interagují omezeně. Málo interagující látky budou migrovat těsně za t0. Extrémně hydrofobní látky, které budou prakticky zcela přítomny v micelách, budou detekovány s časem tmc – to je např. Sudan III (barvivo), které se nejčastěji používá jako marker tmc pro optické UV-VIS detektory.

kationtové dodecyltrimetylamoniumbromid, DTAB tetradecyltrimetylamonium bromid, TTAB hexadecyltrimetylamonium bromid, CTAB neiontové polyoxyethylen-23-laurylether, Brij 35 Triton X-100 3

CMC [mmol/dm ] = kritická micelární koncentrace, n = agregační číslo, MW [g/mol] = micelární hmotnost


57


58

OBRÁCENÍ EOF POMOCÍ DETERGENTU +

+ +

+

+

+ +

+

+

+

+

+

+

+ +

MEKC separace směsi steroidů 10

+

CTAB TTAB DTAB

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+

+

+

+ +

+

4 2

+

0 -2 -4

+

+

+

+

2

+

+

+

+

+ + +

6

-4

+ +

-

EOF

+

meof [10 cm /Vs]

8

+ +

+

-6 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3

3.0

c [mmol/dm ]

RETENČNÍ FAKTOR v MECC 10 mM TRIS / H3BO3 (pH= 8,5), 50 mM SDS ELEKTROFEROGRAM

7

Absorbance [mAU]

6

1

5

2

4

2

7 8

6

3

3

Sudan III

CH3OH

1 0

5 4

tmig [min] k methanol 7,0 1 1,3-dihydroxybenzen 2 fenol 3 p-nitroanilin 4 4-methylfenol 5 2,6-dimethylfenol 14,8 6 toluen 7 1,2-dimethylbenzen 8 propylbenzen Sudan III 24,0

0

5

10

15

20

25

30

Migration Time [min]

Separace kortikosteroidů pomocí MEKC. BGE = 100 mM cholát sodný, 100 mM tetraborát sodný, pH 8.45. 1, triamcinolone; 2, hydrocortisone; 3, betamethasone; 4, hydrocortisone acetate; 5, dexamethasone acetate; 6, triamcinolone acetonide; 7, fluocinolone acetanide; 8, fluocinolone.

0 8,3 0,27 9,4 0,55 11,6 1,28 12,3 1,54 2,89 15,0 3,06 18,8 7,70 21,8 23,17 ∞

MEKC vs. HPLC Ikdyž MEKC je v podstatě chromatografickou technikou (využívá chemické afinity v dvoufázovém systému jako třeba HPLC), selektivita je dosahována nejen rozdělováním mezi dvě fáze, ale ještě i elektroforetickou mobilitou. MEKC tudíž může být s výhodou použita pro separaci směsí nabitých a neutrálních látek. Navíc další rozdíl od HPLC spočívá v tom, že zde existuje „separační okno“ mezi t0 a tmc (minimální a maximální čas migrace).

ELUČNÍ OKNO v MECC a HPLC HPLC

k= 4 teof 2 0 1

0

2

6

8

10 20

tmc

Detector Response

Detector Response

1000 100

8

MECC

40

4 6 8 10 Migration Time [min]

12


k= tM 0

0

1

2

2

3

4

5 6

7

8

9 10

4 6 8 10 Retention Time [min]

•

12

59

MEEKC

Existuje ještě varianta elektrokinetické chromatografie, kde se používa mikroemulse: tedy kapičky oleje jako mobilní fáze suspendovaná v elektrolytu obsahujícím surfaktant, který tuto emulzi stabilizuje (brání kapénkám v agregaci a vydělení olejové fáze). Tato technika se označuje mikroemulzní elektrokinetická chromatografie (microemulsion electrokinetic capillary chromatography, MEEKC). Nejpoužívanějším elektrolytem je tetraborát sodný při vysokém pH obsahující SDS a oktan. Alkohol, např. butan-1-ol se často používá k další stabilizaci emulze.


60

STACIONÁRNÍ FÁZE v CEC

6.5. Kapilární elektrochromatografie (CEC) CEC je kříženec kapalinové chromatografie (LC) a CE. V CEC je toiž kapilára naplněna stacionární fází tak, jako kolony v HPLC. Po aplikaci elektrického proudu, EOF, který vzniká i na povrchu kuliček náplně, posunuje kapalinu s pístovým rychlostním profilem, což značně redukuje rozmytí zón. Navíc vzorek interaguje se stacionární fází (rozdělování kapalina-kapalina, jako u HPLC), takže je možno chemickou selektivitou ovlivňovat migrační časy, hlavně u neutrálních analytů. • • • • •

částice náplně 3 µm a 5 µm ODS, C18 navázány na silikagelu (reversní) β-CD navázán na silikagelu (chirální) SCX kationtový iontoměnič (-CH2CH2CH2SO3H) APLIKACE CEC léčiva : - nečistoty - chirální separace - hlavní komponenta - zásaditá farmaka (na SCX)

Separační kapilára je naplněna stacionární fází. Mobilní fáze je hnána pomocí elektroosmózy. EOF je generován větší měrou na povrchu stacionární fáze než na vnitřním povrchu kapiláry. Separace nenabitých analytů je způsobena jejich rozdílnou distribucí mezi sorbentem a eluentem. Separace nabitých analytů je navíc ještě podporována jejich rozdíly v elektroforetických mobilitách.

polyaromatické uhlovodíky (PAH) benzeny a chlorbenzeny textilní barviva

SEPARAČNÍ KOLONA pro CEC

VÝHODY A NEVÝHODY CEC

I.D. : 50 µm, 75 µm a 100 µm LEPENÁ SEPARAČNÍ KOLONA pro CEC

Výhody

Nevýhody

1. rovný rychlostní profil EOF: 1–3×105 pater / 1 m (tj. 3 až 4 krát větší účinnost než v HPLC) 2. žádné velké tlaky 3. možnost velmi malých částic 4. neutrální, lipofilní a ve vodě nerozpustné analyty 5. malá spotřeba vzorku a mobilní fáze 6. isokratická a gradientová eluce 7. možnost použití MS detekce 8. jednotný přístroj pro CZE, CEC a CLC

1. příprava naplněných kapilár, frity 2. křehkost naplněných kapilár 3. bubliny (rozdíly v EOF, Jouleovo teplo) 4. elektrokinetické dávkování (interní standard) 6. menší citlivost

http://www.natur.cuni.cz/~pcoufal/cec.html


61


62

CEC-LIF : polyaromatické uhlovodíky 75 µm ID × 365 µm OD, 33 cm naplněná kapilára 3 µm ODS (90 %) a 1 µm silikagel (10 %) 80 % acetonitril a 4 mM tetraboritan sodný separační napětí : 15 kV dávkování : 5 kV / 5 s

6.6. Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) CIEF se používá k separacím biologických molekul – hlavně proteinů – lišících se v isoelektrickém bodě (pI). CIEF se provádí naplněním kapiláry směsí několika amfolytů a vzorku. Amfolyty vytvářejí v délce separační kapiláry gradient pH. Aplikací elektrického pole, přičemž u katody se nachází bazický elektrolyt a u anody kyselý, analyt migruje tak dlouho, dokud se nedostane do oblasti, kde pH elektrolytu odpovídá jeho pI a tam se zastaví. V důsledku existence gradientu pH jsou i zóny analytu velmi úzké.

píky : 1 naftalen, 2 acenaftylen, 3 acenaften a fluoren,4 fenanthren, 5 anthracen, 6 fluoranthen, 7 pyren, 8 benz[a]anthracen, 9 chrysen, 10 benzo[b]fluoranthen, 11 benzo[k]fluoranthen, 12 benzo[a]pyren, 13 dibenz[a,h]anthracen, 14 benzo[ghi]perylen,15 indeno[1,2,3-cd]pyren

Kapilární izoelektrické fokusování (CIEF, IEF = Capillary Isoelectric Focusing) dělí molekuly mající amfolytickou povahu na základě jejich rozdílných isoelektrických bodů pI (tj. pH, při kterém má molekula celkový náboj roven nule). Dělící kapilára se naplní roztokem dělených amfolytických látek a pomocného amfolytu, který je schopen pufrovat celý rozsah pH. Z opačných konců migrují do kapiláry OH- a H+ ionty, které v ní vytvářejí spojitý lineární pH gradient. Dělené molekuly (ionty) putují roztokem dokud nedosáhnou pH, které se rovná jejich pI. V tomto místě kapiláry (pH = pI) se stanou neutrální, zastaví se a vytvoří úzkou zónu (fokusují). Po fokusaci se zóny mobilizují (uvedou do pohybu), aby prošly detektorem a byly detekovány. Kapilární izoelektrické fokusování je použitelné pouze pro amfolytické molekuly (tj. molekuly, které mohou mít kladný, záporný anebo žádný celkový náboj podle CEC : kyselá léčiva 50 µm i.d. × 210 mm naplněná kapilára 3 µm Hypersil C18 a 3 µm Hypersil C18/SCX CH3CN / NaH2PO4 (50 mM) / H2O 60:20:20 v/v/v separační napětí : 30 kV tlak : 8 bar dávkování : 5 kV / 15 s detekce : DAD 210 nm

pH okolního prostředí).

píky : 1 p-hydroxybenzoová kyselina, 2 bumetanid, 3 flurbiprofen


63


64

6.7. Diskontinuální elektroforéza

6.8. CE v nevodném prostředí (NON-AQUEOUS CE)

Diskontinuální elektroforéza se používá pro separaci proteinů. Tato technika používá 2 gely, které jsou pufrovány na různá pH. Protein při přechodu z jednoho gelu do druhého zůstane zkoncentrovaný to úzké zóny, čímž získáváme užší zóny než v konvenční slab-gel elektroforéze. Obrázek ukazuje schéma aparatury pro diskontinuální elektroforézu


65

CE je běžně prováděno ve vodných roztocích elektrolytů, protože voda je nejčastěji používané rozpouštědlo. Existují ovšem látky ve vodě nerozpustné, které mohou být separaovány CE v nevodném prostředí. Podmínkou této metody samozřejmě elektrická vodivost použitého rozpouštědla, typicky se jedné o směs acetonitril-methanol s přídavkem např. octanu sodného Tento příklad byl vybrán z Altria KD and Bryant SM, Chromatographia, 46 1997 122-130


66

7. OMEZENÍ ROZMÝVÁNÍ ZÓN V CE. OPTIMALIZACE Velkou výhodou kapilárních rozměrů CE je přirozená minimalizace většiny zdrojů rozšiřování zón oproti konvenční elektroforéze nebo HPLC (minimum spojovací článků „kolony“, protože se nepoužívají kohouty, externí detektory atd. a mj. efektivní odvod tepla).

7.1. Odvod Joulova tepla

Vývoj Joulova tepla je přirozený důsledek průchodu proudu (pohybu náboje) v každém elektrickém vodiči. V tomto případě toto teplo způsobuje lokální ohřev kapaliny/gelu v kapiláře a tudíž její konvekční pohyb, což má za následek promíchávání procházejících zón, jejich rozšiřování projevující se rozšířením píků, případně ztrátou jejich rozlišení. Hranice, kdy toto teplo ještě můžeme efektivně odvádět, tedy definuje největší napětí, které můžeme v systému aplikovat, abychom neztratili separační účinnost.

Rychlostní profil EOF a laminárního toku

7.3. On-capillary detekce

Rozmytí zón cestou do detekční cely je běžný proces v HPLC, kde separační kolonu spojuje s detektorem několikacentimetrové spojky. Toto je v kapilární CE přirozeně odbouráno faktem, že detektor je umístěn přímo na kapiláře.

Teplotní profil typické separační kapiláry při generaci Joulova tepla.

7.4. Molekulární difúze

7.2. Elektroosmotický tok Jak bylo výše zmíněno, elektroosmotický tok způsobuje pohyb celé kapaliny v kapiláře, obvykle ke katodě. Tento tok může zásadně urychlit analýzy kationtů, případně umožnit v jednom experimentu i separaci aniontů. Schéma elektroosmotického toku (EOF)

Rychlost tohoto toku je typicky malá (mm/min), takže v kapiláře existuje laminární proudění. Navíc protože kapalina je mobilizována povrchovým nábojem vnitřního povrchu, distribuce rychlostí (rychlostní profil) kapaliny není parabolická (tak jako u kapaliny tlačené tlakem), nýbrž „pístová“. Tedy prakticky v každém místě průřezu kapaliny se části zóny pohybují stejnou rychlostí, což minimalizuje rozmytí zóny, oproti konvenčním tlakovým pumpám, kde se kapalina uprostřed kapiláry pohybuje nejrychleji a u stěn nejpomaleji (obrázek).


67

Zdrojem rozmytí zón v CE zůstává molekulární difúze analytu procházajícího kolonou. Tato difúze je nejmenší pro největší molekuly, protože ty mají malý difúzní koeficient. Teoreticky lze u velkých molekul (nukleotidy, proteiny) získat počet teoretických pater až několik miliónů. Odvození:

 t  N =   σ ( t )

2

t=L/v

v=µE=µU/L

v jednorozměrném případě platí:

σ( x ) = 2 * D * t

N=

(µ

EOF

σ ( t ) = σ( x ) / v = 2 * D * t / v , čili

+ µ EF ) U 2D

(7)

kde D je difúzní koeficient, U aplikované napětí a m je elektroforetická mobilita.


68

7.5. Rozmytí zón způsobené dávkováním

OPAKOVÁNÍ

Dalším nežádoucím příspěvkem k celkovému rozmytí zón v CE je fyzická délka zóny dávkované do kapiláry, která může být až několik milimetrů, což představuje relativně značnou délku ve srovnání s detekčním okénkem, které je široké zhruba 0.1 mm (optická šířka paprsku). Počáteční délka zóny však může být zredukována procesem zvaným „stacking“. Tento proces nastane, je-li vodivost nadávkované zóny vzorku menší, než vodivost okolního elektrolytu. Po zapnutí napětí jsou ionty vzorku nuceny nést proud, který mimo zónu obstarávají ionty elektrolytu. Ionty vzorku jsou proto nuceny doputovat na rozhraní vzorek/eletrolyt, čímž jsou vlastně zakoncentrovány (na obrázku je znázorněn možný případ stackingu kationtů). Proto je čsato výhodné mít vzorek připraven v deionizované vodě, případně zředěném elektrolytu.

KAPILÁRNÍ ELEKTROMIGRAČNÍ SEPARAČNÍ METODY 1) Kapilární zónová elektroforéza (CZE) 2) Kapilární gelová elektroforéza (CGE) 3) Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC, MEKC) 4) Elektrochromatografie v naplněných kapilárách (EC, CEC) 5) Kapilární izoelektrické fokusování (CIEF, IEF) 6) Kapilární izotachoforéza (CITP, ITP) Kapilární zónová elektroforéza (CZE) je vhodná pro separaci molekul s nábojem (iontů) lišících se svou molekulovou hmotností, tvarem a nábojem. Kapilární gelová elektroforéza (CGE) umožňuje dělení vysokomolekulárních biologicky aktivních látek, jako peptidů, bílkovin, štěpů DNA a RNA.

Princip stacking efektu

Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC, MEKC) využívající micel vytvářených povrchově aktivními látkami (detergenty), se s výhodou používá pro separaci neutrálních molekul i iontů. Elektrochromatografie v naplněných kapilárách (EC, CEC) kombinuje elektroforetický chromatografický separační mechanismus a umožňuje dělení neutrálních i nabitých molekul.

a

Kapilární izoelektrické fokusování (CIEF, IEF) dělí látky amfolytické povahy (tj. látky, které mohou nést kladný, záporný nebo žádný náboj podle pH okolního prostředí) v lineárním pH gradientu. Kapilární izotachoforéza (CITP, ITP) separuje ionty podle rozdílných elektroforetických mobilit. Elektromigrační separační metody využívají dvou transportních jevů, elektroforetické migrace iontů v elektrickém poli a elektroosmotického toku kapaliny kapilárou. Elektroforetickou migrací iontů rozumíme pohyb iontů v elektrickém poli vlivem elektrostatického přitahování elektrického náboje k opačně nabité elektrodě. Ionty různých poloměrů nesoucí různé náboje se v homogenním elektrickém poli pohybují konstantní elektroforetickou rychlostí, která je přímo úměrná intenzitě elektrického pole a velikosti náboje iontu a nepřímo úměrná jeho poloměru. Elektroosmotický tok (elektroosmóza, EOF) je tok kapaliny kapilárou, v níž je vytvořeno elektrické pole vložením napětí desítek kilovoltů mezi elektrody na koncích kapiláry. Naplníme-li kapiláru z taveného křemene roztokem nějakého elektrolytu, dochází k disociaci křemičitanových skupin na vnitřní stěně kapiláry. Vnitřní povrch kapiláry tak získává negativní náboj a uvolňované vodíkové protony vytvářejí pozitivně nabitou vrstvu v roztoku přilehlém k vnitřní stěně kapiláry. Po vložení elektrického napětí mezi elektrody na koncích kapiláry dochází k pohybu hydratovaných vodíkových protonů ve vzniklém elektrickém poli směrem ke katodě. Tyto vodíkové protony obalené molekulami vody strhávají veškerý roztok uvnitř kapiláry s sebou směrem ke katodě, čímž vzniká elektroosmotický tok. Lineární rychlost elektroosmotického toku je přímo úměrná intenzitě elektrického pole a závisí na velikosti negativního náboje, který nese vnitřní stěna kapiláry. Čím je vyšší pH roztoku uvnitř kapiláry, tím větší negativní náboj je rozprostřen po vnitřní stěně a tím rychlejší elektroosmotický tok pozorujeme. Elektroosmotický tok vykazuje téměř rovinný rychlostní profil, který vede k velmi malému rozmývání zón separovaných látek, a proto se v elektromigračních separačních metodách setkáváme s mnohem užšímí píky než v HPLC.


69


70

Kapilární zónová elektroforéza (CZE = Capillary Zone Electrophoresis) dělí molekuly s nábojem (ionty) na základě jejich rozdílných elektroforetických pohyblivostí (mobilit). Elektroosmotický tok separačního pufru uvnitř kapiláry unáší kladné i záporné ionty k detektoru a tyto ionty navíc migrují svými rozdílnými elektroforetickými rychlostmi uvnitř pufru, a tím se vzájemně dělí. Běhěm jednoho experimentu lze dělit a detekovat oba dva druhy iontů (kladné i záporné). Kapilární zónová elektroforéza je použitelná pouze pro nabité molekuly (ionty).

(ionty). Během jednoho experimentu lze dělit a detekovat pouze jeden druh iontů (kladné nebo záporné).

NÁZVOSLOVÍ V ELEKTROFORÉZE Kapilární gelová elektroforéza (CGE = Capillary Gel Electrophoresis) dělí velké molekuly s nábojem (ionty) na základě jejich rozdílných elektroforetických pohyblivostí. Kapilára je naplněna gelem, který zvyšuje rozdíly mezi elektroforetickými rychlostmi velkých iontů různých tvarů, jež jsou nuceny migrovat póry gelu. Přítomnost gelu zabraňuje vzniku elektroosmotického toku, a tak pouze jeden druh iontů (kladné nebo záporné) se pohybují směrem k detektoru a mohou být separovány a detekovány běhěm jednoho experimentu. Kapilární gelová elektroforéza je použitelná pouze pro ionty a využívá se zejména pro velké ionty jako peptidy, bílkoviny, sacharidy, štěpy DNA a RNA. Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC, MEKC = Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography) dělí nabité a především neutrální (hydrofobní a hydrofilní) molekuly na základě jejich rozdílných rozdělovacích koeficientů mezi vodní a micelární fází. Do vodného pufru (vodná fáze) je přidána povrchově aktivní látka (detergent, např. SDS = sodium dodecylsulphate = dodecylsíran sodný), který vytváří v pufru micely tzv. micelární, pseudostacionární fázi. Povrchově nabité micely migrují uvnitř pufru vlastní elektroforetickou rychlostí a unáší molekuly a ionty separovaných sloučenin, které jsou více či méně přítomny uvnitř hydrofobních dutin (tj. prostůrků, interiérů popř. kavit) micel. Všechny micely migrují stejnou rychlostí, ale stupeň solvatace molekul micelami udává rychlost unášení těchto molekul micelami. Elektroosmotický tok pufru unáší micely a molekuly/ionty všech separovaných látek směrem k detektoru. Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie je použitelná pro neutrální molekuly a ionty.

ACE affinity capillary electrophoresis CAE capillary affinity electrophoresis CE capillary electrophoresis CEC capillary electrochromatography CES capillary electroseparation CD-MEKC cyclodextrin micellar electrokinetic chromatography CGE capillary gel electrophoresis CIEF capillary isoelectric focusing CITP capillary isotachophoresis CMEC capillary micellar electrokinetic chromatography CZE capillary zone electrophoresis EC electrochromatography EKC electrokinetic chromatography FSCE free solution capillary electrophoresis

FZE free zone electrophoresis HPCE high performance capillary electrophoresis HPE high performance electrophoresis HPZE high performance zone electrophoresis MEC micellar electrokinetic chromatography MECC micellar electrokinetic capillary chromatography MEKC micellar electrokinetic chromatography MEEKC microemulsion electrokinetic chromatography OTEC open tubular electrochromatography SEKC suspension electrokinetic chromatography

PARAMETRY PRO OPTIMALIZACI SEPARACE Elektrochromatografie v naplněných kapilárách (CE, CEC = Capillary Electrochromatography) dělí nabité i neutrální molekuly na základě jejich rozdílných rozdělovacích koeficientů mezi mobilní a stacionární fází. Mobilní fáze je hnána pomocí elektroosmotického toku ložem stacionární fáze v naplněné kapiláře. Molekuly dělených látek jsou unášeny mobilní fází k detektoru a zároveň zpožďovány interakcí se stacionární fází. Tato technika je modifikací mikrokapalinové chromatografie (mikro HPLC, CLC) a je vhodná pro neutrální molekuly i ionty. Kapilární izoelektrické fokusování (CIEF, IEF = Capillary Isoelectric Focusing) dělí molekuly mající amfolytickou povahu na základě jejich rozdílných isoelektrických bodů pI (tj. pH, při kterém má molekula celkový náboj roven nule). Dělící kapilára se naplní roztokem dělených amfolytických látek a pomocného amfolytu, který je schopen pufrovat celý rozsah pH. Z opačných konců migrují do kapiláry OH- a H+ ionty, které v ní vytvářejí spojitý lineární pH gradient. Dělené molekuly (ionty) putují roztokem dokud nedosáhnou pH, které se rovná jejich pI. V tomto místě kapiláry (pH = pI) se stanou neutrální, zastaví se a vytvoří úzkou zónu (fokusují). Po fokusaci se zóny mobilizují (uvedou do pohybu), aby prošly detektorem a byly detekovány. Kapilární izoelektrické fokusování je použitelné pouze pro amfolytické molekuly (tj. molekuly, které mohou mít kladný, záporný anebo žádný celkový náboj podle pH okolního prostředí). Kapilární izotachoforéza (CITP, ITP = Capillary Isotachophoresis) dělí ionty na základě jejich rozdílných elektroforetických mobilit. Roztok dělených iontů je dávkován jako rozhraní dvou rozdílných pufrů. První pufr před vzorkem se nazývá vedoucí (leading) a obsahuje iont mající náboj stejného znaménka ale větší elektroforetickou pohyblivost než všechny separované ionty. Druhý pufr za vzorkem se nazývá uzavírající (terminating) a obsahuje iont stejného znaménka jako dělené ionty, ale má menší elektroforetickou pohyblivost než všechny dělené ionty. Každý separovaný iont vytváří během analýzy svoji vlastní zónu. Zóny všech dělených iontů jsou uzavřeny mezi vedoucí a uzavírající elektrolyt (pufr) a jsou seřazeny bezprostředně za sebou podle klesající elektroforetické pohyblivosti dělených iontů. Kapilární izotachoforéza je použitelná pouze pro molekuly s nábojem


71

CZE pH druh a koncentrace pufru komplexační činidla organická rozpouštědla Mg 2+, Ca2+ chirální činidla MECC druh a koncentrace detergentu pH druh a koncentrace pufru organická rozpouštědla CEC druh stacionární fáze druh organického rozpouštědla koncentrace organického rozpouštědla pH chirální činidla

http://www.natur.cuni.cz/~pcoufal/ces.html


72

Plochu píku jako základní kvantitativní charakteristiku, lze odečíst z papírového záznamu např. triangulací (aproximací píku trojúhelníkem a výpočtem jeho plochy), ale drtivá většina přístrojů pro elektroforézu jsou dnes řízeny počítačem a tak je samozřejmostí vyhodnocovací software, který plochy píku odečítá digitální integrací. Jediným problémem zůstává správné určení základní linie, aby pak plocha byla správně odečtena.

8. VYHODNOCOVÁNÍ DAT KAPILÁRNÍ ZÓNOVÉ ELEKTROFORÉZY

8.1. Detekční limit

Limit detekce (LOD), limit kvantifikace (LOQ) Jak již bylo uvedeno, projevem jednotlivých zón putujících kapilárou je odezva (koncentračního) detektoru (typicky UV-VIS detektor) před koncem kapiláry, který má charakter píku, ovšem velmi často je trojúhelníkovitý - jak frontující, tak chvostující (elektromigrační disperze). Obdobně jako u chromatografie, migrační čas píku tr charakterizuje analyt kvalitativně, kvantitativní charakteristikou je plocha píku (méně často se používá výška píku). V případě, že pík je alespoň přibližně gaussovský, má smysl počítat i další charakteristiky: počet teoretických pater N, jakožto míru účinnosti kolony. N je vysoké pro „úzké“ píky (základna píku w!0) a zadržované (tr!∞) píky.

N = 16

tr 2 w

2

  pro elektroforézu  

také =

µU   2D 

µ je mobilita, U napětí, D difúzní koeficient. (pozn. tr a w musí být vyjadřovány ve stejných jednotkách např. mm !!!). Rozlišení Rs je mírou separace dvou píků. Např. hodnota Rs=1,00 udává, že dva stejné píky vykazují jen 2 %-ní překryv, při Rs = 1,50 považujeme píky za kvantitativně oddělené.

Jednou z důležitých charakteristik jakékoli metody stanovení (nejen v elektroforéze) je zjištění limitu detekce, resp. kvantifikace (budeme mluvit jen o dolním limitu detekce, tj. minimální detekovatelné koncentraci/množství, ikdyž existuje i horní, maximální). Existuje několik možností, zde uvedeme jen dvě nejběžnější (nejjednoduší). Asi nejsprávnější je metoda postupného zřeďování, kdy dávkovaný analyt postupně ředíme až do okamžiku, kdy poskytnutý signál má ještě výšku 3x větší než průměrný šum. Tento stav definuje nejmenší spolehlivě detekovatelnou koncentraci = dolní limit detekce. Jinou, experimentálně méně pracnou možností, je vypočítat statisticky průměrný šum základní linie (prakticky z části jakéhokoli elektroforeogramu, nejlépe však ze slepého experimentu) a z kalibrační křivky (výška píku vs. koncentrace) odečíst odpovídající koncentraci. Limit kvantifikace (LOQ) je někdy dvojnásobkem, ale nejčastěji 3.3 násobkem limitu detekce – je to množství, které jsme schopni spolehlivě nejen detekovat, ale i stanovit.

8.2. Validace v CE

Každá metoda stanovení, aby mohla být skutečně používána v praxi, musí projít sadou

tr2 − tr1 Rs = (w2 + w1 ) / 2

statisticky vyhodnotitelných testů jednak v dané laboratoři a posléze paralelně v několika laboratořích, které ohodnotí resp. garantují její spolehlivost – tomuto procesu se říka validace metody. Tato spolehlivost je zřejmě mimořádně důležitá např. v oblasti analýzy léčiv. Nároky, které musí daná metoda splňovat, jsou vyžadovány mezinárodními předpisy

tr 2

(IFPMA, AOAC, ISO, CAC). tr 1

Validace v CE. Proč potřebujeme validační protokol? Již jsme diskutovali základní rysy kapilární elektroforézy i její přednosti, jako např.

h

vysokou účinnost, selektivitu, rychlost, malou spotřebu vzorku. Je vynikajícím nástrojem pro rychlou kvalitativní analýzu. Na druhé straně je kvantitativní analýza (opakovatelnost a sta r t

w 1

reprodukovatelnost + výtěžnost) ve srovnání s HPLC stále slabou stránkou CE a to hlavně v

w 2

důsledku aktivity vnitřního povrchu kapiláry a malé absolutní citlivosti on-capillary detektorů (optická dráha 25-75 µm). V přehledném článku o přesnosti CE [Mayer, B. X.; J. Chromatography A , 907, 21-37 (2001)], Mayer uvádí následující vybrané příklady z praxe:


73


74

stanovení insulinu v dávkách: RSD 13%, opakovatelnost určité metody na 4 stejných komerčních přístrojích Beckman: 0.6-17.7% (CE) resp. 2.0-14.6% (MEKC). US FDA (Federal Drug Administrtion) vyhodnotila mezilaboratorní testy jako nepřijatelně různé: RSD(čas)=0.1-2.0%, RSD(plocha)=1.8-7.1% a přesnost výtěžnosti 37-281%. Ačkoli je tedy zřejmé, že každá CE metoda musí být pro praktické účely validována, stále neexistuje obecně přijatá norma, které upravuje kritéria, resp. postupy validace v CE. Existují doporučení pro validaci metod CE [IFPMA, AOAC, ISO, CAC], avšak ta jsou většinou odvozovaná od metod HPLC a pro konkrétní aplikaci CE ne zcela jednoznačná. Proto je prakticky jen na autorech (resp. jejich editorech odborných časopisů), které testy a jakým způsobem budou provedeny. Proto nacházíme v literatuře termín „validace“ použitý pro víceméně náhodný soubor testů (linearita kalibrační křivky, přesnost, správnost (výtěžnost), opakovatelnost) apod., většinou bez nutného důsledného otestovaní robustnosti .

Robustnost Robustnost (anglicky robustness / ruggedness) analytické

procedury je míra její

kapacity zůstat neovlivněná malými, ale náhodnými změnami v experimentálních parametrech. V případě CE by robustní metoda měla poskytovat přijatelné výsledky (to může znamenat migrační čas, rozlišení nebo plochu píku) i kdyby nastavované experimentální parametry: napětí, vlnová délka, dávkovací tlak, koncentrace roztoků, pH atd. se v důsledku běžné (akceptovatelné) nepřesnosti (tj. nepřesnosti nádobí a pomocných přístrojů) lišili od požadovaných. Někteří autoři doporučují tyto testy dělat až jako poslední stádium vývoje metody. V případech vývoje metody na zakázku je ale nebezpečí, že v takovém případě pracně optimalizovaná metoda až při testech robustnosti nesplní některý požadavek zadavatele, což může znamenat plýtvání časem a prostředky. Proto je rozumnější zabudovat testy robustnosti přímo do procesu optimalizace metody, jak doporučuje následující diagram.

" "

Nejdůležitější úkoly testování robustnosti jsou: navrhnutí odezvové funkce (response function), která bude používána v kalibračním grafu (např. plocha/čas) a případně regression model této kalibrační křivky (lineární, nelineární..) zjištění faktorů (experimentálních), které významně ovlivňují odezvu a stanovení mezí, v který je tento vliv přijatelný


75


76

Rozšíření CE v oblasti kvantitativní klinické diagnostiky zatím rel. maá citlivost a

9. KLINICKÉ A FARMACEUTICKÉ APLIKACE

opakovatelnost (reprodukovatelnost). Na druhé straně má ale tato metoda velký potenciál

Kapilární elektroforéza je účinný prostředek v klinické diagnostice, protože je schopna rychle a relativně levně separovat v biologických vzorcích širokou škálu biologických

kvůli jednoduchosti, rychlosti a menší finanční náročnosti ve srovnání s HPLC nebo gelovou elektroforézou.

molekul i anorganických iontů, jako např. Na+, chloridy, dusičnany, dusitany, organické kyseliny, aminokyseliny, peptidy, léčiva, vitamíny, hormony, steroidy, uhlovodíky a nukleové kyseliny (1). Mnoho úsilí se věnovalo vyvíjení elektroforetických metod, které jsou schopny hodnotit lidské nemoci. Existují CE metody detekující v mozku laboratorních krys deriváty různých neurotransmiterů (GABA, glycin, glutamáte, aspartát, norepinephrin, dopamin) a aminokyselin (2). Další metody dokaží detekovat uvolňování neuropeptidů β-endorphinu a neuropeptidu Y (3). Kapilární elektroforéza byla použita ke srovnání různých aminokyselin v cerebrospinálním moku pacientů s Alheimerovou chorobou a dětí s neurologickými poruchami (4). Tyto experimenty mohou vést k vývoji diagnostických metod těchto chorob. CE je nápomocná při diagnostikování fenylketonurie, kde stanoví úroveň fenylalaninu v séru novorozence (5). CE je také používána ve spojení s PCR pro prenatální diagnostický screening cystické fibrosy (6). CE se používá v klinické analýze léčiv ke stanovení hladin léčiv a jejich metabolitů, např. pro monitorování nedovolených přípravků ve sportu, případně pro kontrolu narkomanie: kokain a morfin byl ve vlasech stanoven na úrovni 0.15 ng/mL zpracováním 100 mg vzorku (7,8). CE se používá také pro chirální separace racemických léčiv, protože optické izomery téže látky mohou mít různé fyziologické účinky. V jedno případě byla vyvinuta metoda stanovení racemethorphanu a racemorphanu v moči s detekčním limitem 20 ppb (9). CE se používá k detekci endogenních sloučenin (anorganické ionty, aminokyseliny,

1. Xu,Yan. Anal. Chem. 1995, 67, 463R-473R. 2. Weber, P.L.; O'Shea, T.J.; Lunte, S.M. J. Pharm. Biomed. Anal. 1994, 12, 319-324. 3. Advis, J.P.; Guzman, N.A. J. Liq. Chromatogr. 1993, 16, 2129-2149. 4. Bergquist, J.; Gilman, S.D.; Ewing, A.G.; Ekman, R. Anal. Chem.1994, 66, 3512-3518. 5. Tagliaro, F.; Moretto, S.; Valentini, R.; Gamboro, F.; Moffa, M.; Tato, L. Electrophoresis 1994, 6, 94-97. 6. Gelfi, C.; Orsi, A.; Righetti, P.G.; Brancolini, V.; Cremonesi, L.; Ferrari, M. Electrophoresis 1994, 15, 640-643. 7. Tagliaro, F.; Poiesi, C.; Aiello, R.; Dorizzi, R.; Ghielmi, S.; Marigo, M. J. Chromatogr. 1993, 638, 303-309. 8. Tagliaro, F.; Antonioli, C.; Moretto, S.; Archetti, S.; Ghielmi, S.; Marigo, M. Forensic Sci. Int. 1993, 63, 227-238. 9. Aumatell, A.; Wells, R.J. J. Chromatogr. Sci. 1993, 31, 502-508. 10. Motomizu, MS.; Oshima, M.; Matsuda, S.; Obata, Y.; Tanaka, H. Anal. Sci. 1992, 8, 619-625. 11. Leone, A.M.; Francis, P.L.; Rhodes, P.; Moncada, S. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 200, 951-957. 12. Janini, G.M.; Chan, K.C.; Muschil, G.M.; Issaq, H.J.; J. Chromatogr., B: Biomed. Appl. 1994, 657, 419-423. 13. Koh, E.V.; Bissell, M.G.; Ito, R.K. J. Chromatogr. 1993, 633, 245-250. 14. Ma, Y.; Wu, A.; Furr, H.C.; Lammi-Keefe, C.; Craft, N.E.; J. Chromatogr., Biomed. Appl. 1993, 616, 31-37. 15. Soucheleau, J.; Denoroy, L. J. Chromatogr. 1992, 608, 181-188. 16. Denoroy, L. Electrophoresis 1994, 15, 46-50. 17. Pascual, P.; Martinez-Lara, E.; Barcena, J.A.; Lopez-Barea, J.; Toribio, F. J. Chromatogr. 1992, 581, 49-56. 18. Landers, J.P.; Schuchard, M.D.; Subramanian, M.; Sismelich, T.P.; Spelsberg, T.C. J. Chromatogr. 1992, 603, 247-257.

organické kyseliny, uhlovodíky, peptidy a enzymy. Ionty jako Ba2+, Sr2+, Ca 2+, and Mg2+ byly úspěšně separovány během 16 minut (10). Byly vyvinuty metody separace dusičnanů a dusitanů v krevní plazmě (11) a moči (12). Existuje několik metod stanovení vitamínu C (13), vitamínu A (14) a mnoha dalších malých organických molekul. Dále byly vyvinuty metody na analýzu peptidů, např. ze střevní sliznice (15), z myších mozků nebo jiných neuropeptidů v lidských tkáních (16). Pomocí CE lze též detekovat enzymovou aktivitu např. glutathion peroxidasy (17), stanovením redukovaného a oxidovaného glutathionu. Monitorováním obsahu substrátu byla stanovena též aktivita acetyltransferasy (18) (přeměna acetyl-CoA s chloramphenicolem na acetyl-chloramphenicol a CoA).


77


78

9.1. Chirální elektroforézou

separace

-

Separace

optických

izomerů

kapilární

Zhruba 75 % všech nově vyvíjených léků je chiralních, tzn., že existují jako zrcadlově symetrické molekuly. Mnoho těchto léků bylo původně vyráběno jako směs izomerů (nejčastěji racemát), ale nyní se vyvábějí jako čistý izomer L nebo D, což představuje nejen výrobní, ale i kontrolní problém (druhý izomer je méně aktivní, vyjímečně dokonce toxický).

9.2. Spojení CE a laserem indukované fluorescence (LIF). Kompetitivní immunoassay bílkovin Immunoassays (imunologická stanovení) se běžně používají pro důkaz a stanovení malých i velkých molekul v biologických tekutinách a dalších složitých matricích. Tradičně se immunoassay provádí s radioaktivní detekcí (RIA) nebo s detekcí pomocí komplementárního enzymu antibody nebo antigenu (EIA). CE s laserem indukovanou fluorescencí byla použita pro kompetitivní immunoassay bílkovin. Vysvětlení metody: Rozlišovací schopnost CE je použita k rozdělení vázaného a volného antigenu, což eliminuje použití pevné fáze (jako nosiče). LIF detekce je vysoce specifická a produkuje interpretačně jednoduché elektroforeogramy, ikdyž matrice je velmi komplikovaná, jako např. sérum. Stanovení je rychlé (separační čas 3 min), vysoká je přesnost (104% recovery při c=5 ng/mL) a citlivost CE (2x10-10 M LOD). Navíc, provedení znamená úsporu času a prostředků při optimalizaci reprodukovatelné imobilizace antibody nebo antigenu. Při reakce se tvoří kovalentní vazba mezi alfa-amino skupinou Nterminálního aspartátu angiotensinu II a jednou nebo dvěma karboxylovými skupinami Cy5. K séru obsahujícímu neznačený antigen se přidá známé množství značeného antigenu (metoda izotopického ředění). Sérum může obsahovat buď známé množství antigenu (případ kalibrační křivky) nebo neznámé množství (když je množství značeného antigenu vybráno podle očekávaného množství). Volný Cy5 di-kyselina je přidávána jako vnitřní standard.

Hlavní výhoda chirální CE je rychlost (levnost) vývoje metody na rozdíl od HPLC (menší spotřeba rel. drahých chemikálií, žádné chirální stacionární fáze), nevýhodou může být citlivost, chceme-li kvantifikovat „nečistoty“ pod 0,5 %. I separační čas je menší, což může být výhodné u sledování kinetiky rychlých enantiomerických transformací nebo u on-line výrobní kontroly. Prostředkem pro získání separace chirálních izomerů je přídavek chirálního selektoru (nejčastěji cyklodextrinu) do základního elektrolytu. Když oba enantiomery migrují kapilárou, jeden z nich interaguje s chirálním selektorem více a tato interkce má za následek změnu jeho efektivní mobility, čili jeho rychlosti a doby průchodu kapilárou k detektoru. Typickým chirálním selektrorem je β-cyklodextrin a jeho deriváty (dimethylovaný- nebo hydroxy-propylovaný) v koncentraci 1-100 mM. Komerčně dostupné jsou již i specifické cyklodextriny jako sulfonované nebo karboxylované β-cyklodextriny.

Separační mechanismus (obrázek): L-izomer tvoří stabilní komplex s cyklodextrinem a je separován od D-izomeru protože stráví v „dutině“ cyklodextrinu více času.


79


80

http://www.beckmancoulter.com/beckman/articles/ds827/ds827.asp

9.3. SDS-CGE proteinů (A. Guttman, P. Shieh, and N. Cooke, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) Jak již bylo vysvětleno, vazba SDS na proteinové řetězce způsobuje vznik bílkovin se stejným poměrem hmota (velikost) / náboj a separace se pak v síťované matrici uskutečňuje jen na základě velikosti proteinů, kteroužto určujeme srovnáním s kalibrační křivkou velikostních standardů. Před nadávkováním na gel je vzorek denaturován zahřátím v přítomnosti redukovadla (beta-merkaptoethanolem). Kapilární gelová elektroforéza (Capillary gel electrophoresis, CGE) byla úspěšně využita pro hodnocení čistoty syntetických oligonukleotidů [Guttman, A., and Cooke, N. Am. Biotech. Lab. 9:4, 10 (May, 1991)]. V tomto případě byl použit polyakrylamidový gel (Beckman Coulter capillary: eCAPTM-U-100-P) s močovinou. Původní metoda SDS-PAGE [Cohen, A. S. and Karger, B. L. J. Chromatogr. 397, 409 (1987)] měla dávkování možné jen elektrokineticky a neměla optimalní optickou propustnost pro detekci proteinů při nizkých vlnových délkách, nověji je používán transparentní gel [Karger, B. L. Lecture, 4th Int. Symp. High Performance Capillary Electrophoresis, Amsterdam, 1992] (UV transparent při 214 nm) společně se 100 µm kapilárou a tento gel navíc může být nahrazen (vymytím z kapiláry a opětovným naplněním). Obrázek ukazuje separaci (SDS-CGE) 6 standardních proteinů (14,400-94,000 daltons) za 17 min. UV detekce při 214 nm, teplota 20 °C. SDS, beta-mercaptoethanol a Orange G pro vybarvování byly přidány ke vzorku před vlastní CGE (detaily lze zjistit na Beckman Coulter SDS-Protein Gel Column Kit, part number 338490). Vložený proužkový záznam pochází ze slab gel SDS-PAGE, pro srovnání jsou zde srovnány korespondující zóny.

SDS-CGE 6 proteinových standardů na 47-cm dlohé kapiláře (40 cm k detektoru) x 100 µm i.d. Základní elektrolyt: 100mM TRIS-CHES, pH 8.8, 0.1% SDS. Pufr vzorku: 60mM TRISHCL, pH 6.6. dávkování tlakem 60s. Píky: (1) alfa-laktalbumin; (2) soybean trysin inhibitor; (3) carbonic anhydrase; (4) ovalbumin; (5) bovine serum albumin; (6) phosphorylase B. Orange G (OG) byla přidávána přímo se vzorkem, koncentrace proteinů = 0.1 mg/mL. Detekce, 214 nm. teplota, 20°C. intenzita el.pole, 300 V/cm. proud, 25-30 µA.


81


82

Ke zvýšení citlivosti detekce (nadávkování většího množství vzorku) se používá tzv. systém diskontinuálního pufru, kdy je vzorek dávkován přetlakem (u běžné CGE se dávkuje elektrokineticky) a po každém experimentu je gel tlakově vyměněn (obnoven), což přispívá i k opakovatelnosti (reprodukovatelnosti). Na obrázku je kalibrační graf závislosti molekulové hmotnosti na mobilitě.

9.4. Separace sacharidů pomocí MEKC s derivatizací

(Morgan Stefansson a Milos Novotny) CE byla použita pro identifikaci redukujících mono- a disacharidů v mikromolárních koncentracích. Metoda má vynikající rozlišení strukturně podobných sacharidů, citlivost byla zvýšena derivatizací fluoreskujícím činidlem. Sacharidy Sacharidy jsou skupina látek se sumárním vzorcem CnH2nOn mající strukturu polyhydroxy aldehydů (aldosy) a ketonů (ketosy). Těmto se říká sacharidy a ty se mohou spojovat do přímých nebo větvených řetězců s různým počtem jednotek: monosacharidy (1), oligosacharidy (2-3) a polysacharidy (>100). Existuje více než 100 přírodních monosacharidů, běžné jsou také jejich amino-, acetamido-, fosfáto- nebo karboxylátové deriváty. Tato fakta znamenají značnou variabilitu molekulových struktur těchto látek. Navíc mnoho z těch sacharidů, které tvoří řetězce (celulosa, škrob), se mohou kombinovat s proteiny a lipidy a tím zastávát mnoho různorodých funkcí v biomolekulách. Poněvadž mnoho biomolekul může být izolováno jen v malém množství, je důležité aplikovat techniku, které toto malé množství dostačuje. Za tímto účelem separace a indentifikace těchto látek bylo použito několik technik: GC s trimethylsilyl (TMS) derivatizací (mono- and disacharidy a cukerné alkoholy jako inositol a sorbitol). Komplikací pro kvantifikaci je zde přítomnost vody (hydrolýza TMS). LC může být prováděna bez derivatizace cukrů, ale mnoho cukrů koeluuje. Navíc citlivost refraktometrického detektoru je nízká. Objevují se aplikace CE – jak CZE, tak MEKC byly aplikovány na separace mono-, oligo- a polysacharidů (1,2). Zde byla použita MEKC s derivatizací 4-aminobenzonitrile (4-ABN) a UV detekcí při 280 nm, která je vhodná pro většinu běžný sacharidů (3). Metoda byla aplikována na směs běžných mono- a disacharidů, jak je znázorněno na obrázku. Derivatizace bylo dosaženo smísením reagentů s vodnými roztoky standardů a zahřátím uzavřené vialky na 90° C po dobu 15 minut. Tuto techniku nelze aplikovat na neredukující cukry, jako např. cukrosa.

Závislost molekulové hmotnosti na mobilitě (semilogaritmická škála). Data byla vzata z předchozího obrázku CGE. R=0.995. Závěr SDS-CGE: SDS-CGE s vyměňovaným gelem lze aplikovat na proteiny. Na rozdíl od klasické SDSPAGE se slab gely, není potřeba provádě vybarvování a experimentální časy jsou tak mnohonásobně kratší. Gel umožňuje dávkova větší množství vzorku a také být vyměněn po každém experimentu, což zvyšuje opakovatelnost a reprodukovatelnost metody.

1. Oefner, P.; et al.J.Cap.Elec.,1994,1,5-26. 2. Stefansson, M.; Novotny, M. Anal. Chem., 1994, 66, 3466-3471. 3. Schwaiger, H.; et al. Electrophoresis, 1994, 15, 941-952.


83


84

9.5. CE-MS Spojení CE k MS detektoru bylo popsano D. Figeysem a R. Aebersoldem (Electrophoresis. 19 (1998) 885) a interface jsou komerčně dostupné od několika výrobců MS. Jsou i review, které se speciálně zabývají tímto důležitým tématem (elektrosprej, J.F.Banks, Electrophoresis 18 (1997) 2255 nebo iontová past, J.T. Wu, M.G. Qian, M.X. Li, K.F. Zheng, P.Q. Huang and D.M. Lubman, J. Chromatogr.A 794 (1998) 377). Nejběžnějším ionizačním modem je elektrosprej spolu s detekčním módem pozitivních iontů. Pro CE-MS je zvlášť slibné z hlediska citlivosti použití nevodné CE. Více o CE-MS http://www.abrf.org/ABRFNews/1996/December1996/CEMS.html publikace o CE-MS http://www.emsl.pnl.gov:2080/docs/msd/mass_spec/ce-ms/ce-ms.html

Schéma CE-MS interface


85

9.7. Miniaturizace Automatizace analytiky a rychle se rozvíjející genomika s výhodou využívá mikrosystémů. Existuje elektroforéza na čipu pro PCR i kompletní elektroforetický analytický systém (microarray). Pro výrobu čipů je nejběžnější litografické leptání křemíkových monokrystalů – systém kanálků může pak představovat transportní i mísící prostor pro syntézu peptidů (nebo DNA), aplikace napětí vyvolává tok kapaliny a může fungovat jako pumpa. Na čipech také mohou být imobilizovány specifické proteiny v případě imunoanalýz.

Ilustrativní vysvětlení přípravy a separace sekvencí DNA


87


88

Jiří Pazourek MODERNÍ ELEKTROFORETICKÉ ANALYTICKÉ METODY. (přednášky pro magisterské studium) Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6

Recommend Documents