Ivo Sedláček Brno

Ivo Sedláček 11. 12. 2008 Brno

Mikroorganizmy

- rezervoár mikrobiálních genetických zdrojů - všudypřítomné ve většině prostředí - zajištění stability a funkce přírodních ekosystémů - producenti látek -farmaceutický, potravinářský, chemický průmysl, zemědělství X někteří patogenní účinek - biodegradační schopnosti (likvidace toxických odpadů) Prokaryota mohou, a také to dělají, téměř cokoliv …..

Prokaryota mohou, a také to dělají, téměř cokoliv …..

Prokaryotní organizmy jednobuněčné, není jaderná membrána organely nezávislé na CPM systému pevná stěna, peptidoglykan (murein) ribozómy rozptýleny v cytoplazmě, sedimentační koeficient 70S výživa v molekulární formě

Doména Archaea - organizmy ve vodách, na souši (anaerobní, hyperslané, hydrotermálně či geotermálně vyhřívané prostředí); trávicí trakt = extremofilové Znakem je: - přítomnost éterové vazby mezi glycerolem a vyššími mastnými kyselinami u lipidů v plazmatické membráně (u bakterií je esterová) - postrádají murein (peptidoglykan obsahující kyselinu muramovou) v buněčné stěně

- tři fenotypová oddělení (G-; G+; 0) - dávalo představu o diverzitě bakterií - nebralo v úvahu chemotaxonomii, molekulární taxonomii, fylogenetické vztahy Bakterie = nejpočetnější biotická složka (saprofyt, komenzál, patogen) G- bakterie s buněčnou stěnou - stěna složena z vnější LPS membrány a vnitřní tenké PG vrstvy + kyselina MRM - barví se G-, přítomnost exopolysacharidové vrstvy okolo vnější membrány = G+ - buňky kulaté, oválné, tvaru tyček, šroubovic či vláken; s pochvou nebo opouzdřené - fototrofní nebo nefototrofní, a to jak litotrofní, tak i heterotrofní G+ bakterie s buněčnou stěnou - chybí vnější membrána a PG vrstva je tlustá - stěna - kyselina teichoová, neutrální polysacharidy, mykolové kyseliny, barví se G+ - buňky kulaté, tyčkovité, vláknité, mohou se větvit; někteří – endospóry; heterotrofní

Znak

Bacteria

Archaea

Buněčná stěna obsahuje kyselinu muramovou

+

-

Éterová vazba mezi glycerolem a karboxykyselinami

-

+

MK navázány na glycerol esterovou vazbou

+

-

První aminokyselinou při proteosyntéze je: Metionin N-Formylmetionin

+

+ -

Některé tRNA geny obsahují introny

-

+

Blízká příbuznost mezi doménami Archaea a Eucarya (NE mezi Archaea a Bacteria, určité molekulární znaky mají archaea shodné s doménou Eucarya)

• charakterizovat mikroorganizmy • zařadit je do jednotek, tzv. taxonů

Taxonomie - teoretické studium klasifikace (vlastnosti, principy, postupy, pravidla) Systematika - studium diverzity a vzájemné příbuznosti (klasifikace, ekologie, genetika, ...) Taxonomie je • dynamický subjekt, který se může měnit dle dostupných údajů • ze tří oddělených, ale současně i navzájem provázaných oblastí:

klasifikace

nomenklatury

identifikace

Taxonomie = synonymum systematiky (klasifikace, nomenklatura, identifikace); statická?

Klasifikace - zařazování do skupin (taxonů) na základě podobnosti a příbuznosti

- znalost význačných charakteristik (experimentální, pozorovací techniky) Klasifikace prokaryot je veličina vytvořená pro mikrobiology a ne pro jednotky, které jsou klasifikovány!!! - založena na komplexu dostupných údajů Numerická taxonomie - vyvíjí se jako část náročných analýz (80. léta) - cílem bylo navržení stabilní sestavy metodik pro klasifikaci

- sdružování do fenotypových skupin - totožné s taxony (forma matic)

Nomenklatura = označení jednotek definovaných pomocí klasifikace Je řízena mezinárodním nomenklatorickým kódem (ICNB) Nezávislá na: botanické nomenklatuře (!řasy, houby) zoologické nomenklatuře (!prvoci) Jméno je založeno na: Validní publikaci – Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Legitimitě – pravidla z International Code of Nomenclature of Bacteria Prioritě publikace – dřívější pojmenování je platné Efektivitě publikace - zveřejnění tištěných materiálů dostupných vědecké komunitě za účelem poskytnutí stálého záznamu

Jméno a validní publikace -představuje binární kombinaci rodového jména a druhového označení

(vyjádření vlastností, místa, aj.; poddruhové jméno)

- musí vyhovovat pravidlům z ICNB (mezinárodně akceptována, bakteriální nomenklatura se jim musí podrobovat) – priorita popisu, typová kultura, podrobný popis - stabilní, jednoznačná, nezbytná Approved Lists of Bacterial Names International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM) - originální článek - Validation List - nomenklatura následuje klasifikaci - využití fenotypových, genetických a fylogenetických charakteristik vedlo ke změnám v klasifikaci i v nomenklatuře

Validní jméno

- proces porovnávání neznámého se známým - praktickou aplikací klasifikace a nomenklatury Bakteriální identifikace je prováděna pomocí mikrotestů Identifikační schémata X klasifikační schémata Pro klasifikaci má každá zjištěná charakteristika stejnou váhu X pro identifikaci mohou být některé znaky zvýhodněny oproti druhým Automatizované systémy - citlivost k ATB, hemokultury (změna pH, uvolnění chromogenu či fluorogenu, detekce metabolitů) Imunodiagnostické metody – antigen x protilátka Chromatografické metody – rozdílná rozpustnost látek Bakteriální identifikace a typizační postupy jsou taxonomickými klasifikacemi!

Historické hledisko - morfologická kritéria (mikroskopická, makroskopická) Praktická klasifikace (morfologické, biochemické a fyziologické údaje, sérologie) = fenotypizace

Fylogenetická klasifikace - fenotypové vlastnosti doplněné o výsledky metod molekulární biologie a o chemotaxonomické údaje Oficiální klasifikace???

•

Fyz. + bioch. vlastnosti

komerční soupravy konvenční testy

•

kultivace na KA/24h

•

„úspěšnost“ typizace

•

absence standardní metody

Sérologické techniky – využívají chemického složení stěny bakteriálních buněk chovat se jako antigen, tj. vyvolat produkci protilátek (aglutinace, precipitace, komplement fixační reakce nebo munofluorescence)

- poprvé aplikováno před > 40 lety - jednou z hlavních technik (% G+C, RNA/DNA hybridizace, denaturace a renaturace DNA) Genotypové informace - odvozeny od nukleových kyselin

Genotypové metody - přímo zaměřeny na studium polymorfizmu DNA nebo RNA molekul - obráží přirozené příbuzenské vztahy kódované DNA - cíleny buď na celkovou DNA nebo jen na určitý úsek DNA (případně plazmidové DNA)

Studium celkové DNA: Mol %G+C; RFLP analýza; PFGE; velikost genomu; DNA reasociace

Studium části DNA: Ribotypizace, AFLP, PCR /ERIC-PCR, rep-PCR, tRNA-PCR/; DNA sondy; DNA sekvencování

„Fingerprinting“ plazmidové DNA: Analýza polymorfizmu plazmidové DNA; RFLP/AFLP analýza pl. DNA Klíčovou metodou systematiky prokaryot je srovnání rRNA DNA-rRNA hybridy v 16S rRNA katalogizace v kompletní sekvencování

- stanovení fylogenetického postavení (97%) - částečné sekvence - pro identifikaci organizmů / zařazení do ustanovených skupin - genomospecies - poddruh - variety, přípona –var (-typ): biovar, fagovar, patovar, serovar, aj. - rod Taxonomie prokaryot - domény Bacteria a Archaea Sekvencování vysoce konzervativních oblastí genomu - revoluce v taxonomii

Rozvoj molekulárně biologických technik - molekulární typizace – univerzálně aplikovatelné (klonální potomstvo jedné buňky = geneticky identické)

Typizační techniky - děleny do tří skupin: 1.) založené na lipopolysacharidech a mastných kyselinách: SDS-PAGE lipopolysacharidů FAME - pro G- tyčky 2.) založená na analýze složení proteinů buněčné stěny a vnější membrány: SDS-PAGE, subtypizace G- bakterií multilokus enzymová elektroforéza

3.) založené na nukleových kyselinách: DNA sekvencování - přímé stanovení sekvencí nukleotidů v DNA restrikční analýza chromozomální DNA - srovnání počtu a velikostí fragmentů po působení RE (univerzálně aplikovatelná, citlivá, snadná metoda) – ribotypizace restrikční analýza plazmidů - extrakce, separace (není univerzální x rychlá) pulzní gelová elektroforéza - velké fragmenty DNA, analýza fragmentů bez nutnosti hybridizačních metod polymerázová řetězová reakce – amplifikační metoda, znásobení specifických sekvencí DNA nebo RNA, detekce (opakování cyklu denaturace, připojení primerů, prodloužení, znovu denaturace a tyto kroky se mnohonásobně opakují) PCR nahrazuje biologickou amplifikaci (enzymatická duplikace NK in vitro)

- významná úloha v klinických mikrobiologických laboratořích - detekovat a charakterizovat organizmus odpovědný za onemocnění - využití tam, kde způsobující agens je málo aktivní (nebylo izolováno) - aplikace adaptovány nejen pro výzkum, ale i k diagnostickým účelům

Sonda nukleové kyseliny Enzym

Enzym

Přidání značené sondy DNA Enzym

Zahřátí Enzym

•Cílová DNA

Denaturovaná (jednořetězcová) DNA

Sonda DNA hybridizovaná s cílovou DNA

Sondy NK = segmenty DNA nebo RNA, které byly označeny (komerčně připravované )

DNA sondy - značeny radioaktivním fosforem; nyní - jiné látky (enzymy, chemiluminescentní molekuly, látky afinitní povahy) - po hybridizaci jsou imunologicky detekovány

Výhody použití sond: - zkracuje se čas nezbytný k identifikaci náročného mikroorganizmu - laboratoř může zvýšit počet patogenů, které detekuje a identifikuje - umožňuje průkaz agens, které kultivační techniky neumožňovaly - rozlišení biochemicky podobných patogenních a nepatogenních kmenů

- založena na stanovitelných chemických znacích (metody analytické chemie) - orientuje se primárně na analýzu chemického složení buněčné stěny nebo jen její části v pevné fázi (vlastní masa buněk) přítomnost/nepřítomnost stabilních chemických znaků; poměrné zastoupení – profil

v tekuté fázi (metabolity, supernatant stráveného kultivačního média) peptidoglykan – chemické složení kyseliny teichoové – význam u G+ bakterií polární lipidy - fosfolipidy, glykolipidy, fosfoglykolipidy mastné kyseliny – cca 100 má význam (nasycené, nenasycené, větvené, hydroxykyseliny); MIDI Sherlock System mykolové kyseliny – v buněčné stěně, vázané na peptidoglykan chinony, steroly, karotenoidní pigmenty polyaminy – významné především u termofilních bakterií lipopolysacharidy, cytochromy, bakteriochlorofyly

„Použitelnost“ klasifikačních metod

Polyfázová taxonomie - taxonomie založená na kombinaci údajů získaných rozmanitými technikami - obsahuje všechny dostupné genotypové, fenotypové a fylogenetické informace - použití jen jedné metody je nedostatečné a je vyžadován mnohostranný přístup – tzv. „polyphasic approach“

Druh - seskupení jednotek (fenotypová podobnost x odlišnost od jiných seskupení) Fylogenetická definice druhu: • skupina příbuzných kmenů (typový kmen) • 70% a vyšší DNA-DNA homologie • 16S rDNA je vyšší než 97% • shodné fenotypové znaky • některé odlišné znaky od jiných skupin

Aeromonas spp. = vhodný příklad polyfázového přístupu - popis „Bacillus hydrophilus“ již v roce 1871 - celosvětově rozšířený rod - patogen x komenzál x saprofyt - velký taxonomický rozvoj Čeleď Aeromonadaceae (1986/1989) dle analýzy 5S rRNA Až do r. 1991 – pouze 8 druhů aeromonád (5 patogenních) - pohyblivé - nepohyblivé - psychrofilní

- ubikvitérní, OFF, OXI, tyčinkovitý až kokovitý tvar - autochtonní ve vodním prostředí; < letní měsíce - patogenní pro zvířata (široké spektrum); MOT = oportunně patogenní - numerická taxonomie: < 50 fenotypových vlastností - fenon: 80 – 85% podobnost = bakteriální druh Phenospecies ≠ Genomospecies (HGs) DNA-DNA hybridizace - A. salmonicida (jednotná skupina; studenokrevní, prostředí) - MOT+, mezofilní (extrémně heterogenní; klinický materiál)

Fenotypová kritéria (90 léta) Aplikace DNA reasociace (HG skupiny) A. hydrophila komplex (Ahy, Abe, Asa, Apo) A. caviae komplex (Aca, Ame, Aeu) A. sobria komplex (Aso, Ave, Asc, Aja, Aal) Aeromonas spp. Mezofilní aeromonády – biochemicky značně aktivní Fylogenetická klasifikace – cca posledních 10 let

< 1991

A. hydrophila A. caviae A. sobria A. schubertii A. veronii A. salmonicida (5 poddruhů?) A. media A. eucrenophila

< 1991

< 1998

A. hydrophila A. caviae A. sobria A. schubertii A. veronii = A. veronii bv. Veronii, A. veronii bv. Sobria A. salmonicida (5 poddruhů?) A. media A. eucrenophila A. enteropelogenes (1991) A. ichthiosmia (1991) = A. veronii bv. Sobria (1993) A. allosaccharophila (1992) A. jandaei (1992) A. trota (1992) A. encheleia (1995) A. bestiarum (1996) A. popoffii (1997)

< 1991

< 1998

< XII/2008

A. hydrophila – ssp. hydrophila, ssp. dhakensis (2002), ssp. ranae (2003) A. caviae A. sobria A. schubertii A. veronii = A. veronii bv. Veronii, A. veronii bv. Sobria A. salmonicida (5 poddruhů?) A. media A. eucrenophila A. enteropelogenes (1991) A. ichthiosmia (1991) = A. veronii bv. Sobria (1993) A. allosaccharophila (1992) A. jandaei (1992) A. trota (1992) = A. enteropelogenes (2002) A. encheleia (1995) A. bestiarum (1996) A. popoffii (1997) A. culicicola (2002) = A. veronii bv. Sobria (2006) A. molluscorum (2004) A. simiae (2004) A. sharmana (2006) = ??? A. bivalvium (2007) A. aquariorum (2008) A. tecta (2008)

Chybná jména aeromonád: validní jméno < 1995 A. veronii bv. Sobria < 2000

neplatné synonymum A. ichthiosmia

/

> 2000 A. enteropelogenes A. veronii bv. Sobria

/ A. trota A. culicicola

---------------------------------

(A. veronii bv. Sobria ?

A. allosaccharophila) A. sharmana

K 1.12. 2008 je validních 19 druhů aeromonád

Biotypizace aeromonád: - rodová diferenciace (OFF, OXI, Pte, NaC, TWE+GEL, ...) - druhová identifikace (MOT, GLG, VPT, ESL, IND, ARG, ARA, SUC, SAL, MAN, …) Komerční soupravy mikrotestů většinou nevhodné (testy, taxony)! Reprodukovatelnost reakcí!!! A. hydrophila komplex: GLG(+), VPT(+), ESL(+) A. caviae komplex: GLG(-), VPT-, ESL(+) A. sobria komplex: GLGd, VPTd, ESLChybí jednoznačně rozlišující testy

Fenotypová klasifikace: Biotyp, sérologie, FAME, SDS-PAGE Genotypová klasifikace: HG skupiny, Ribotypizace, Eric PCR, Multiplex PCR, …… Fylogenetické analýzy: 16S rDNA, gyrB, gyrA, rpoD, dnaJ - nejednotné výsledky pro druhovou diferenciaci - klinický materiál x prostředí

Aeromonas spp. = nevzácný původce gastroenteritid??? - komunitní infekce, nozokomiální infekce 70% a více v létě i na podzim – oportunně patogenní A. hydrophila ssp. hydrophila: infekce ran, GI trakt A. caviae: GI trakt A. veronii bv. Sobria: spojena s GI traktem a bakteremií < 85% izolátů = HG1, HG5, HG8 Mezofilní kmeny – skupiny A. hydrophila, A. caviae, A. sobria

Intestinální infekce:

A. hydrophila (2. nejčastější) A. veronii bv. Sobria (dominantní) A. caviae (děti, starší lidé) A. enteropelogenes

Extraintestinální infekce:

A. hydrophila A. veronii bv. Veronii A. veronii bv. Sobria A. jandaei A. schubertii A. enteropelogenes

Veterinární zdroj:

A. bestiarum A. sobria A. salmonicida (poddruhy)

Expozice vodnímu prostředí, konzumace mořských živočichů: četnost 0,5-8%

Člověk - akutní gastroenteritida - septikemie (JV Asie > svět, imunodeficientní osoby) - infekce ran, oka (chirurgické zákroky, celulitida, myonekrózy) - peritonitida (není vzácná), meningitida - infekce RT, infekce kostí a kloubů (vzácné) Živočichové studenokrevní: osteomyelitis, pneumonie, septikemie, stomatitida, kožní léze a vředy; chovy na farmách teplokrevní: septikemie, pneumonie, peritonitida, různé lokalizované infekce

Zvýšený zájem o aeromonády

Druhy aeromonád se liší v patogenitě x různá diverzita humánních kmenů a izolátů z prostředí Průkaz patogenů - průkaz LPS; profilů mastných kyselin - immunobloting buněčných proteinů - PCR techniky - sondy NK - ……………… dostupná technika = taxonomický nástroj Zlepšení taxonomie = podpoření procesu identifikace objasnění role aeromonád

-potencionální indikátor patogenity

Faktory svázané s buněčným povrchem - proteiny vnější membrány (Ahy – S-vrstva) - lipopolysacharidový endotoxin (Ahy – studenokrevní) Extracelulární faktory virulence - toxiny: hemolyziny (aerolyzin, Aeromonas spp.) cytotoxin enterotoxin (A. hydrophila) - enzymy: chitináza, lipáza, fosfatáza, elastáza, fibrinolyzin, proteázy (poškození tkání), ribonukleáza, fosfolipáza (rozpouští CP-membránu – hemolýza) Aeromonas spp. = psychrotrofní mezofilové > patogenní potenciál!

Taxonomické hledisko x epidemiologické zhodnocení Fenotypové metody Biotypizace – nepostihuje dostatečně rozmanitost mezi kmeny Fagotypizace – specializované laboratoře (shodný lysotyp) Sérotypizace – somatické i flagelární antigeny SDS-PAGE Složení buněčných MK – chromatografická analýza FAME (podobnost) Genotypové metody Analýza plazmidů – malý epidem. význam (20-70% má plazmid) PFGE REA, RFLP (ribotypizace ) Selektivní amplifikace restrikčních fragmentů (AFLP) – detekuje DNA polymorfizmus; AFLP skupiny = DNA HGs Sekvencování 16S rRNA genů – geny kódující RNA malých podjednotek ribozómů (16S rDNA) mají relativně konzervativní nukleotidové sekvence a přesně odráží bakteriální fylogenezi (použito v reklasifikaci aeromonád) Ribotypizace – univerzální nástroj pro epidemiologická šetření - restrikční profil rRNA genů je v souladu s údaji DNA reasociace

Typizace bakteriálních izolátů – ribotypizace selektivní hybridizace a následná detekce restrikčních fragmentů genomové DNA nesoucích geny pro rRNA

buněčná kultura izolace DNA štěpení restrikčním enzymem

gelová elektroforéza

přenos na membránu

hybridizace a detekce fragmentů obsahujících geny pro rRNA

Aeromonas: EcoRI, HindIII, PvuII 700< ribotypizací

RiboPrinter MIS

- EcoRI nebo PvuII - sonda rrnB operon E. coli - proces ribotypizace 8 hodin; standardnost x cena

Pigmentující aeromonády: biotyp, ribotyp, FAME A. hydrophila ssp. dhakensis: biotyp, ribotyp, FAME (A. encheleia: biotyp, ribotyp, SDS-PAGE, ERIC-PCR) A. popoffii: biotyp, ribotyp, RiboPrinter, SDS-PAGE, MALDI A. hydrophila komplex: biotyp, ribotyp, m-PCR Aquitalea sp.: biotyp, ribotyp, 16S rRNA

(sekvencování)

Biotypizace:

A. hydrophila komplex A. sobria komplex (A. veronii bv. Sobria) A. caviae komplex

A. caviae komplex > A. hydrophila komplex > A. veronii bv. Sobria Ribotypizace: EcoRI, (HindIII), PvuII FAME A. hydrophila komplex – multiplex-PCR (ISAP, 2005)

Dendrogram hybridizačních profilů (PvuII) komplexu A. hydrophila z humánního klinického materiálu A. . hydrophila komplex

P1030

. hydrophila komplex A.

P1076

.A. hydrophila komplex

P1088


P1017

A. . hydrophila komplex

P1092


P1100


P1054

.A. popoffii

CCM 4708


P1173


P1163

A. hydrophila ssp. ranae

CCM 7147

.A. bestiarum

CCM 4707


P1000


P1015


P1066

A. hydrophila ssp. hydrophila

CCM 7232T


P1007

A. hydrophila ssp. dhakensis

CCM 7146


CCM 4528


P1094

.A. bestiarum

P1050


P1002


P1070


P1011


P1020


P1084


P1003


P1096


P1074


P1026

.A. hydrophila komplex λ marker EcoRI/HindIII

P1095

(bp)

947

831

1,375

1,587

2,027 1,904

3,530

4,269

5,14 8 4,973

21,227

100

90

80

70

60

50

40

podobnost, %

T

T T

T

Dendrogram hybridizačních profilů (PvuII) kmenů Aeromonas veronii bv. Sobria z humánního klinického materiálu 100

A. enteropelogenes (= " A. trota")

CCM 4368

A. enteropelogenes

CCM 7243

A. jandaei

CCM 4355

T T

A. veronii bv. Sobria

P1021


P1031


P1036


P1093


P1159


P1058

A. veronii biov. Veronii

CCM 4359


P1161


CCM 4360


P1090


P1012


P1082


P1027


P1044


P1013


P1069


P1004


P1157

A. veronii biov. Sobria

CCM 1254


P1091

A. allosaccharophila

CCM 4363

A. sobria komplex

P1051

A. allosaccharophila (referenční-gyrB)

CCM 4531


CCM 1242


P1072

A. sobria

CCM 2807T

A. schubertii λ marker EcoRI/ HindIII

CCM 4356T

(bp)

831

947

1,375

1,587

2,027 1,904

3,530

4,269

5,148 4,973

A. veronii biov. Sobria (= "A. culicicola ") CCM 7323

21,227

90

80

70

60

50

40

podobnost, %

T

T

Průkaz Aeromonas hydrophila subsp. dhakensis - humánní klinický materiál Ribotypizace (EcoRI) a FAME; NE biotyp

- průkaz izolátů jako původců akutního průjmu (importovaná nákaza) - CCM 7329

Dendrogram hybridizačních profilů (EcoRI) a shluková analýza FAME dvou izolátů Aeromonas hydrophila subsp. dhakensis z akutních průjmů 100

. hydrophila ssp. hydrophila A.

CCM 2280

. hydrophila ssp. hydrophila A.

CCM 7232T

. hydrophila ssp. ranae A.

CCM 7147T

A. . hydrophila ssp. dhakensis

P 1097 = CCM 7329


P 1165


CCM 7146

A. . bestiarum

CCM 4707T

T

(bp)

947

831

1 .375

1,587

2,027 1 ,904

3 ,530

4 ,269

5,148 4,973

λ marker EcoRI/HindIII 21 ,227

90

80

70

60

50

40

30

20

podobnost, %

C13:0 a C17:1 ω8c

Pigmentující izoláty z různých typů vod Biotypizace: fenon A. media, A. caviae, Aeromonas sp. Ribotypizace (EcoRI, HindIII, PvuII); FAME ?atypické izoláty? gyrB sekvencování A. media (MOT) A. allosaccharophila (PIG) (Folia Microbiol, 2008)

Dendrogram hybridizačních profilů (HindIII) pigmentujících izolátů aeromonád z vod 100

A. salmonicida

P192

T A. salmonicida subsp. pectinolytica CCM 7020

A. salmonicida subsp. salmonicida CCM 1307 A. salmonicida subsp. salmonicida

CCM 1318

A. media

CCM 3654

A. media

CCM 3653

A. media

P189

A. media

P186

A. media

P185

(bp)

1,587 1,375

2,027 1,904

3,530

5,148 4,973 4,269

hydrophila group

T

A. media

P183

A. media

P188

A. media

P184

A. media

P190

A.allosaccharophila

P187

λ marker EcoRI/Hin dIII 21,227

80

60

40

20

podobnost, %

A. media cluster

SUC-negativní izoláty (A. popoffii, A. jandaei, A. schubertii, A. hydrophila ssp. ranae, A. enteropelogenes, A. encheleia, A. eucrenophila)

ESLbiotypizace ribotypizace (3 RE, RP) SDS-PAGE MALDI sekvencování (16S rDNA, gyrB) DNA-DNA hybridizace

ESL+ biotypizace (fenon) ribotypizace (3 RE) SDS-PAGE sekvencování (gyrB)

doplňující popis A. popoffii (ISAP, 2005)

(Let Appl Microb, 2008)

100

A. trota A. jandaei Aeromonas sp. SUCAeromonas sp. SUC-Ino+ Aeromonas sp. SUC-Ino+ Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas

sp. SUC-Ino+ sp. SUC-Ino+ sp. SUCsp. SUCsp. SUCsp. SUCsp. SUC-

EcoRI

HindIII

90

80

70

60

50

Aeromonas sp. SUCA. popoffii A. eucrenophila A. hydrophila ssp. ranae A. schubertii

CCM 4368 CCM 4355 P 668 P 664 P 657 P 671 P 669 P 661 P 667 P 660 P 666 P 655

?nový taxon?

P 658 CCM 4708 CCM 4354 CCM 7147 CCM 4356

1 00

90

80

70

60

50

40

Dendrogramy hybridizačních profilů SUC-negativních izolátů aeromonád z vod

P 660 P 661 P 667 Aeromonas sp. SUCP 671 sp. SUC-Ino+ Aeromonas Aeromonas sp. SUC-Ino+ P 664 Aeromonas sp. SUC-Ino+ P 669 Aeromonas sp. SUC-Ino+ P 657 P 668 Aeromonas sp. SUCP 655 Aeromonas sp. SUCAeromonas sp. SUCAeromonas sp. SUC-

Aeromonas sp. SUCAeromonas sp. SUC-

P 658 P 666

Dendrogram hybridizačních profilů (PvuII) SUC-negativních izolátů aeromonád z vod podobnost, %


CCM 2280


CCM 7232T

A. hydrophila ssp. dhakensis

CCM 7146T

Aeromonas sp.

P2338

Aeromonas sp.

P2340

Aeromonas sp.

P2335

A. bestiarum

CCM 4707T

A. popoffii atyp.

P667

A. popoffii

P1640

A. popoffii (ref.-gyrB)

P2189

A. popoffii

P1663

A. popoffii

P1905

A. popoffii

P1754

A. popoffii

P1770

A. popoffii

P1662

A. popoffii

P1761

A. popoffii (ref.-16S rDNA)

P666

A. popoffii

P1461

A. popoffii (referenční)

CCM 7330 (= P661)

A. popoff i

P660

A. popoffii

CCM 4708T

A. popoffii (ref.-gyrB)

CCM 7332 (= P671)

A. popoffii

P669

A. popoffii

P664

A. popoffii

P2975

A. popoffii

P657

A. hydrophila ssp. ranae

CCM 7147T

A. popoffii

CCM 4961 (=P1638)

A. popoffii

P1807

A. popoffii

P2976

A. popoffii

P655

A. popoffii (ref.-16S rDNA)

P658

A. popoffii (referenční)

CCM 7331 (= P668)

A. popoffii

P1136

A. popoffii

P1762

A. popoffii

P1641

A. popoff i

P2175

A. popoffii

P2245 60C

A. popoffii

P2246

A. popoffii

P2250

A. popoffii

P2249

A. popoffii atyp.

P1639

A. sobria

CCM 2807T

A. enteropelogenes

P924

A. sobria komplex

P1703


CCM 1254


CCM 4359T

A. jandaei

CCM 4355T


CCM 4363T

A. schubertii λ marker Eco RI/Hin dIII

CCM 4356T

(bp)

947 831

1,587

1,375

2,027 1,904

3,530

100

4,269

80

5,148 4,973

60

21,227

40

- nutnost geograficky rozmanitých izolátů - časové hledisko (rozšíření spektra izolátů)

Potvrzení izolátů jako A. popoffii: - sekvencování - DNA reasociace

Dendrogram (RiboPrinter) SUC-negativních izolátů aeromonád z vod 60.00

40.00

25.00

20.00

15.00

12.00

9.00

8.00

7.00

6.0 0

4.5 0

4.0 0

3.50

3.00

2.50

2.0 0

1.50

1.20

1.00

100

90

80

70

60

50

40

30

20

podobnost, % Kb

A. popoffii

P1761

A. popoffii

P1762

A. popoffii

P1638

A. popoffii

P2249

A. popoffii

P1807

A. popoffii

P1461

A. popoffii

P657

A. popoffii

P664

A. popoffii

P669

A. popoffii

P1639

A. popoffii

P660

A. popoffii

CCM 7330

A. popoffii

P666

A. popoffii

P1662

A. popoffii

P1640

A. popoffii

P2189

A. popoffii

P1905

A. popoffii

P1770

A. popoffii

P658

A. popoffii

P2175

A. popoffii

CCM 4708T

A. popoffii

CCM 4708

A. popoffii

P2250

A. sobria komplex P1703

Dendrogram (MALDI) SUC-negativních izolátů aeromonád z vod A. popoffii CCM 7330 a .i.

350

300

250

200

150

100

50

0 6000

8000

- ionizace molekul - separace iontů - detekce

10000

m /z

Dendrogram profilů celobuněčných proteinů SUC-negativních izolátů aeromonád z vod 100

A. popoffii

P1639

A. popoffii

P1640

A. popoffii

P2250

A. popoffii

P2245

A. popoffii

P2246

A. popoffii

P2249

A. popoffii

P2175

A. popoffii

P1905

A. popoffii

P2189

A. popoffii

P1807

A. popoffii

P1762

A. popoffii

P658

A. popoffii

P668

A. popoffii

P655

A. popoffii

P1761

A. popoffii

P1461

A. popoffii

P1638

A. popoffii

P1136

A. popoffii

P1641

A. popoffii

P1754

A. popoffii

P1770

A. popoffii

P669

A. popoffii

P657

A. popoffii

P671

A. popoffii

CCM 4708

A. popoffii

P664

A. popoffii

P667

A. popoffii

P661

A. popoffii

P660

A. popoffii

P666

A. encheleia

P1669

A. encheleia

P1767

A. encheleia

P1769

A. encheleia

P1700

A. encheleia

CCM 4582

Shluky shodné s ribotypizací

Potvrzení vnitrodruhové variability A. popoffii

T

Jednoznačné odlišení A. encheleia T

14.2 (kDa)

20

29

36

55

84

Marker molekulové hmotnosti 116

80

60

40

20

Podobnost, %

Dendrogram hybridizačních profilů SUC-negativních izolátů A. encheleia/A. eucrenophila z vod 100

(bp)

831

947

1,375

1,587

2,027 1,904

3,530

4,269

5,148 4,973

T

A. eucrenophila

CCM 4354

A. eucrenophila atyp.

P2530


P1802


P1819

A. encheleia atyp.

P1700

A. eucrenophila

P2371

A. encheleia

CCM 4582

A. encheleia atyp.

P2970

A. encheleia (referenční-gyrB)

P2953

A. encheleia

CCM 7406 (= P1669)

A. encheleia (referenční-gyrA)

CCM 7407 (= P1767)

A. encheleia

P1769

A. encheleia (referenční-gyrA)

CCM 7408 (=P1688)

A. encheleia

P2986

A. encheleia

P2988

λ marker EcoRI/HindIII

21,227

80

60

40

podobnost, %

T

-Izoláty z prostředí jsou variabilnější než z klinického materiálu -Jedna metoda, nebo neověřený screening, jsou nevyhovující -I „spolehlivá“ metoda nemusí vést ke správnému výsledku:

Ribotypizace Identifikace A sobria komplex; jedinečný ribotyp Nová aeromonáda? Aquitalea sp. CCM 7557 (IUMS, 2008)

Dendrogram hybridizačních profilů (PvuII) kmenů komplexu Aeromonas veronii bv. Sobria z vod 100

A. schubertii

CCM 4356T

A. schubertii

CCM 4357

A. jandaei

CCM 4355T

A. sobria

P1760

A. sobria

P2315

A. veronii biov. Sobria ("A. ichthiosmia")

CCM 7244


CCM 1254


CCM 4359T


CCM 4360

A. sobria

CCM 2807T


CCM 1242


CCM 4363T


CCM 4531

A. sobria

CCM 4529

A. enteropelogenes

CCM 7243

A. enteropelogenes (" A. trota")

CCM 4368

Aquitalea sp.

P1297

T

83 1

(bp)

947

1,375

1,587

2,027 1,904

3,530

4,269

5,148 4,973

Lambda DNA Eco RI / HindIII Marker 21,227

90

80

70

60

50

40

Similarity (%)

Aquitalea sp. CCM 7557 (=P1297) potvrzena sekvencováním 16S rDNA

Polyfázová taxonomie, fylogenetická příbuznost DNA Celková DNA: % obsah G+C restriční profil (RFLP, PFGE) velikost genomu DNA reasociace

RNA RNA sekvencování analýza nízkomolekulárních RNA

Úseky DNA: PCR metody ((rep-PCR, RAPD, AFLP) ribotypizace DNA sondy DNA sekvencování

plazmidová DNA

Proteiny Chemotaxonomické znaky mastné kyseliny (FAME) mykolové kyseliny polární lipidy chinony

(upraveno podle Vandama a kol., 1996)

elektroforetický profil celobuněčných peoteinů enzymový profil (MLEE)

Fenotyp morfologie biochemie a fyziologie (API, Biolog) sérologie

- vzájemná syntéza získávání nových poznatků - a jejich uplatňování v praxi (“musíme vědět a znát, co chceme hledat“) CÍL

- přesnější stanovení mikrobiálního agens - zrychlení celého identifikačního procesu Popis nového taxonu MUSÍ postihovat vnitrodruhovou diverzitu - nekompletní popis: Candidatus - popis dle jednoho kmene: species proponenda

Děkuji za pozornost.

Ivo Sedláček Brno

Recommend Documents