ISOLASI SENYAWA ANTIOKSIDAN EKSTRAK METANOL DAUN KERSEN (Muntingia calabura Linn.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Persyaratan Ujian Sarjana Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jenderal Achmad Yani
NENDEN NURHASANAH 3311081067
JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JENDERAL ACHMAD YANI CIMAHI 2012
HALAMAN PENGESAHAN
ISOLASI SENYAWAN ANTIOKSIDAN EKSTRAK METANOL DAUN KERSEN (Muntingia calabura Linn.)
Agustus, 2012
NENDEN NURHASANAH 3311081067
Disetujui oleh :
Clara Sunardi, DR., MS., Apt. Pembimbing
Julia Ratnawati, MS., Apt Pembimbing
Mengetahui
Dekan Fakultas MIPA
Eddie Krishna P., Drs., MT. NID : 412110561
Ketua Jurusan Farmasi
Afifah B. Sutjiatmo DR., MS., Apt NID : 412116294
ABSTRAK
Tanaman kersen (Muntingia calabura Linn.) dapat dengan mudah ditemui di Indonesia. Tanaman ini kaya akan flavonoid, flavon dan flavanon. Salah satu manfaat flavonoid adalah sebagai antioksidan. Telah dilakukan isolasi senyawa antioksidan dari daun Kersen yang diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut campuran metanol-air selanjutnya difraksinasi menggunakan pelarut air, n- heksana dan etil asetat. Kandungan kimia yang terdapat dalam daun Kersen yaitu alkaloid, polifenol, tanin, flavonoid, monoterpen-seskuiterpen, steroid-triterpenoid, kuinon serta saponin. Hasil uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH menunjukkan fraksi etil asetat memiliki aktivitas antioksidan paling tinggi dengan nilai EC50 2,807 ppm. Kemudian dilakukan pemisahan lebih lanjut pada fraksi etil asetat dengan Kromatografi Kolom Gravitasi menggunakan fasa gerak bergradien n-heksana, etil asetat dan metanol dihasilkan fraksi 18-24. Fraksi tersebut digabung (Fraksi A) kemudian dilakukan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif didapat isolat yang memiliki aktivitas antioksidan dengan penyemprotan larutan DPPH 0,2%, kemudian diidentifikasi dengan menggunakan spektroskopi ultraviolet (UVVisible) dan spektroskopi inframerah (FT-IR). Dari hasil spektrum dapat disimpulkan bahwa isolat tersebut termasuk kedalam flavonoid minor jenis flavanon. Kata kunci: Muntingia calabura Linn., Antioksidan, DPPH, Flavanon
ABSTRACT
Kersen plant (Muntingia calabura Linn.) easily can be found in Indonesia. It was rich with flavonoids, flavones and flavanones. One of the benefits of flavonoids was as an antioxidant. The research of isolation antioxidant compound from the Kersen leaves had been done. Kersen leaves were extracted by maceration with mixture solvent of methanol-water then fractination using water, n-hexane and ethyl acetate. Chemical constituents in Kersen leaves were alkaloids, polyphenols, tannins, flavonoids, monoterpenes-sesquiterpene, steroid-triterpenoids, quinones and saponins. The result of antioxidant activity measurement using DPPH method showed ethyl acetate fraction had the highest antioxidant activity with value of EC50 2.807 ppm. The separation of ethyl acetate fraction by Gravitation Column Chromatography used gradual mobile phase n-hexane, ethyl acetate and methanol produced fractions 18-24. Those fractions were merged (Fraction A) then performed Preparative Thin Layer Chromatography obtained an isolate that have antioxidant activity by sprayed of 0.2% DPPH solution. The isolate was identified by Ultra Violet Spectroscopy (UV-Visible) and Infra Red Spectroscopy (FT-IR). The spectrum showed that the isolate was a flavanone which included into minor flavonoid group. Keywords: Muntingia calabura Linn., Antioxidants, DPPH, Flavanones
KATA PENGANTAR
Alhamdulillahirrobil‟alamin, segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan segala rahmat, hidayah juga pembelajaran serta petunjuk-Nya, sehingga skripsi yang berjudul “Isolasi Senyawa Antioksidan Daun Kersen (Muntingia calabura Linn)” dapat diselesaikan tepat pada waktunya. Adapun maksud dan tujuan penyusunan skripsi ini diajukan dalam upaya mencapai gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jenderal Achmad Yani. Penyusunan skripsi ini tidak akan terselesaikan dengan baik tanpa bantuan banyak pihak, baik secara moril maupun materil. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada : 1.
Bapak Eddie Krishna Putra, Drs., MT., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jenderal Achmad Yani.
2.
Ibu DR. Afifah B. Sutjiatmo, MS., Apt. selaku Ketua Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jenderal Achmad Yani.
3.
Ibu DR. Clara Sunardi, MS., Apt selaku dosen pembimbing yang telah memberikan dukungan dan bantuan pemikiran, serta kesabaran dalam membimbing penulis selama menyelesaikan Tugas Akhir ini.
4. Ibu Dra. Julia Ratnawati, MS., Apt. selaku dosen pembimbing serta selaku dosen wali akademik, yang telah memberikan pengarahan, dukungan, motivasi serta semangat secara langsung disaat penulis tengah mengerjakan Tugas Akhir ini. 5.
Seluruh keluarga tercinta atas semua doa, perhatian, dukungan moril dan materil. Without them, I couldn’t imagine what would it be. Someday, I’ll be a reason for their happy smile.
i
6.
Seluruh staf pengajar, karyawan dan staf laboratorium Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jenderal Achmad yani.
7.
Rekan – rekan farmasi angkatan 2008 Universitas Jenderal Achmad Yani yang selalu memberikan semangat serta berbagai pihak yang tidak dapat penyusun sebutkan satu persatu. I realize I always need friends and all of you are so irreplacable, thanks for give me so much love. Disadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna,
oleh karena itu diharapkan adanya kritik dan saran yang membangun untuk penyempurnaan penelitian ini. We’ll never stop to learn as long as we live. Akhir kata, semoga segala bantuan yang telah diberikan mendapat balasan dari Allah SWT dan semoga tugas akhir ini dapat bermanfaat bagi semua pihak, Aamiin.
Cimahi, Agustus 2012
Penulis
ii
DAFTAR ISI
Halaman KATA PENGANTAR................................................................................. ........... i DAFTAR ISI................................................................................................. ........ iii DAFTAR LAMPIRAN................................................................................ ........ iv DAFTAR GAMBAR.................................................................................... ..........v DAFTAR TABEL ............................................................................................... vii BAB I.
PENDAHULUAN ...........................................................................................1
II. TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................3 2.1
Tinjauan Botani .......................................................................................3
2.2
Ekstraksi ..................................................................................................6
2.3
Partisi .......................................................................................................8
2.4
Parameter Standar dan Metode Uji Ekstrak ............................................9
2.5
Isolasi .....................................................................................................11
2.6
Flavonoid ...............................................................................................16
2.7
Radikal bebas .........................................................................................21
2.8
Pengujian Antioksidan dengan Metode DPPH......................................23
2.9
Spektrofotometer UV-Visible ...............................................................25
2.10 Pereaksi Geser ...................................................................................... 26 2.11 Spektrofotometer Infra Merah ...............................................................28 III. METODE PENELITIAN .............................................................................32 IV. BAHAN DAN ALAT ....................................................................................35 V. HASIL PENELITIAN ..................................................................................36 VI. PEMBAHASAN ............................................................................................44 VII.KESIMPULAN DAN SARAN .....................................................................54 DAFTAR PUSTAKA ...........................................................................................55 LAMPIRAN ..........................................................................................................58
iii
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran
Halaman
1.
GAMBAR TANAMAN DAN DAUN KERSEN ........................................58
2.
DETERMINASI TANAMAN BAHAN PENELITIAN .............................59
3.
PARAMETER MUTU SIMPLISIA ............................................................60
4.
PENAPISAN FITOKIMIA .........................................................................63
5.
UJI AKTIFITAS ANTIOKSIDAN .............................................................69
6.
EKSTRAKSI DAN FRAKSINASI .............................................................79
7.
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS FRAKSI ETIL ASETAT .....................81
8.
PEMISAHAN FRAKSI ETIL ASETAT .....................................................82
9.
KROMATOGRAFI KOLOM GRAVITASI ...............................................83
10.
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF FRAKSI KOLOM 18-24 ............................................................................................86
11.
KLT ISOLAT ..............................................................................................87
12.
KLT 2 DIMENSI .........................................................................................88
13.
SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET-SINAR TAMPAK..................90
14.
SPEKTROFOTOMETRI INFRAMERAH .................................................96
15.
CONTOH PERHITUNGAN .......................................................................97
16.
DAFTAR PEREAKSI DAN LARUTAN PERCOBAAN ........................102
iv
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
II.1 Kerangka Flavonoida, Isoflavonoid, Neoflavonoida ....................................17 II.2 Golongan Flavonoid .....................................................................................17 II.3 Reaksi peredaman DPPH oleh antioksidan ................................................24 II.4 Struktur Kimia Kuersetin ..............................................................................25 II.5 Skema Alat dan Komponen Spektrofotometer IR ............................ ...........29 V.1 Tanama Kersen ...........................................................................................58 V.2 Daun Tanaman Kersen .................................................................................58 V.3 Hasil Determinasi Tanaman Kersen .............................................................59 V.4 Karakteristik Makroskopik Simplisia ...........................................................60 V.5 Fragmen Mikroskopis Daun Kersen Rambut Penutup .................................61 V.6 Fragmen Mikroskopis Daun Kersen Epidermis ...........................................61 V.7 Fragmen Mikroskopis Daun Kersen Stomata ...............................................61 V.8 Mikroskopis Fragmen Trakea .......................................................................61 V.9 Penapisan Fitokimia Simplisia Daun Kersen ...............................................64 V.10 Skrining Fitokimia Ekstrak Daun Kersen .....................................................65 V.11 Skrining Fitokimia Fraksi Air Daun Kersen .................................................66 V.12 Skrining Fitokimia Fraksi Etil asetat Daun Kersen ......................................67 V.13 Skrining Fitokimia Fraksi n-heksana Daun Kersen ......................................68 V.14 Uji Kualitatif Antioksidan menggunakan DPPH ..........................................72 V.15 Spektrum Serapan Maksimum DPPH 30 μg/ml ...........................................73 V.16 Kurva Regresi linier % Peredaman Ekstrak Daun Kersen ...........................74 V.17 Kurva Regresi linier % Peredaman Fraksi Air Daun Kersen .......................75 V.18 Kurva Regresi linier % Peredaman Fraksi Etil Asetat Daun Kersen............76 V.19 Kurva Regresi linier % Peredaman Fraksi n-Heksana Daun Kersen ...........77 V.20 Kurva Regresi linier % Peredaman Isolat Kuersetin ....................................78 V.21 Bagan Ekstraksi dan Fraksinasi Simplisia Daun Kersen ..............................79 V.22 Bagan Isolasi Fraksi Etil Asetat ....................................................................80 V.23 KLT Fraksi Etil Asetat..................................................................................81 V.24 Bagan Isolasi Fraksi Etil Asetat ....................................................................82
v
V.25 Hasil KLT Kromatografi Kolom Fraksi 18 - 24 ...........................................84 V.26 Hasil KLT Fraksi Kolom menggunakan beberapa Pereaksi Semprot ..........85 V.27 KLTP Hasil Kolom .......................................................................................86 V.28 Hasil KLT Isolat menggunakan beberapa Pereaksi Semprot .......................87 V.29 Hasil KLT Isolat pada Dua Macam Komposisi Eluen yang Berbeda ..........88 V.30 Hasil KLT Dua Dimensi ...............................................................................89 V.31 Spektrum isolat dalam MeOH ......................................................................90 V.32 Spektrum MeOH, MeOH/NaOH, dan MeOH/NaOH setelah 5 menit .........91 V.33 Spektrum MeOH dan MeOH/AlCl3..............................................................92 V.34 Spektrum MeOH dan AlCl3/HCl ..................................................................93 V.35 Spektrum MeOH dan NaOAc .......................................................................94 V.36 Spektrum MeOH dan NaOAc/H3BO3 ..........................................................95 V.37 Hasil spektrofotometri inframerah ................................................................96
vi
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
II.1 Sifat Berbagai Golongan Flavonoid .............................................................18 II.2 Tingkat Kekuatan Antioksidan dengan metode DPPH ................................24 V.1 Penetapan Karakterikstik Makroskopik Simplisia Daun Kersen..................60 V.2 Pemeriksaan Parameter Mutu Simplisia(Muntingia calabura L).................62 V. 3 Hasil Skrining Fitokimia Simplisia Daun Kersen .......................................63 V.4 Penapisan Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas Dengan DPPH ..............71 V.5 Persentase Peredaman Ekstrak Daun Kersen terhadap DPPH .....................74 V.6 Persentase Peredaman Fraksi Air Daun Kersen terhadap DPPH ................75 V.7 Persentase Peredaman Fraksi Etil Asetat Daun Kersen terhadap DPPH ......76 V.8 Persentase Peredaman Fraksi n-Heksana Daun Kersen terhadap DPPH......77 V.9 Persentase Peredaman Pembanding Kuersetin terhadap DPPH ...................78 V.10 Konsentrasi EC50 Ekstrak dan Fraksi Daun Kersen serta Pembanding ........78 V.11 Komposisi Fasa Gerak Kromatografi Kolom Gravitasi ..............................83 V.12 Pengukuran Spektrum Serapan Isolat dalam Metanol ..................................90 V.13 Pengukuran Spektrum Serapan Isolat dalam Metanol dengan Penambahan Natrium Hidroksida 2M ..........................................................91 V.14 Pengukuran Spektrum Serapan Isolat dalam Metanol dengan Penambahan Alumunium Klorida ................................................................92 V.15 Pengukuran Spektrum Serapan Isolat dalam Metanol dengan Penambahan Alumunium dan Asam Klorida ...............................................93 V.16 Pengukuran Spektrum Serapan Isolat dalam Metanol dengan Penambahan Natrium Asetat ........................................................................94 V.17 Pengukuran Spektrum Serapan Isolat dalam Metanol dengan Penambahan Natrium Asetat dan Asam Borat .............................................95 V.18 Interpretasi Bilangan Gelombang untuk Gugus Fungsi Hasil Pengukuran menggunakan Spektrofotometri Inframerah .............................96
vii
BAB I PENDAHULUAN Tanaman kersen (Muntingia calabura Linn.) dapat dengan mudah ditemukan di Indonesia. Kersen merupakan tumbuhan yang berasal dari daerah Amerika dan secara luas dikultivasi di daerah Asia. Secara empiris, tanaman ini telah digunakan dalam pengobatan di berbagai Negara.(1) Akarnya digunakan sebagai abortivum di Malaysia, sementara di Filipina bunganya digunakan untuk mengobati sakit kepala, flu, anti-dispeptik (nyeri lambung), antispasmodik dan diaforetik. Infus bunganya digunakan sebagai penenang dan tonikum di negara Kolombia.(3) Efek farmakologinya dibuktikan dengan adanya kemampuan sebagai anti inflamasi dan anti piretik.(5) Ekstrak dari daun kersen merupakan sumber anti mikroba untuk mengobati infeksi yang disebabkan oleh Staphylococcus aureus.(4) Tanaman ini kaya akan flavonoid, flavon dan flavanon.(2) Hasil penelitian menunjukkan bahwa simplisia daun kersen dan ekstrak etanol daun ini mengandung senyawa golongan flavonoid, kuinon, polifenolat, saponin, steroid dan triterpenoid, monoterpenoid dan seskuiterpenoid.(8) Penelitian tentang isolasi senyawa flavanon, flavon, kalkon dan isoflavon serta struktur senyawanya telah dilakukan
di
Chicago,
trihydroxyflavanone;
hasil
penelitiannya
5-hydroxy-7methoxyflavanone;
yaitu
7-methoxy-3,5,8-
2′,4′dihydroxychalcone;
4,2′,4′-trihydroxychalcone,7-hydroxyisoflavone; 7,3′,4′-trimethoxyisoflavone.(7) Salah satu manfaat dari kandungan flavonoid adalah sebagai antioksidan. Aktivitasnya telah banyak diteliti, dimana flavonoid memiliki kemampuan untuk merubah atau mereduksi radikal bebas dan juga sebagai anti radikal bebas.(9) Sebagai contoh, daun katuk misalnya, mempunyai aktivitas antioksidan yang kuat, karena memiliki senyawa flavonoid.(10) Contoh lain kandungan aktif antioksidan diisolasi dari ekstrak kasar metanol dari daun jambu biji (Psidium guajava L.) diantaranya quercetin serta dua jenis flavonoid quercetin-3-O-glucopyranoside dan morin.(11) Flavonoid yang sama dapat memiliki kemampuan sebagai anti 1
2 oksidan dan juga prooksidan tergantung dari konsentrasi dan sumber radikal bebasnya. Flavonoid berguna sebagai antioksidan melawan radikal bebas tetapi dapat juga berperan sebagai prooksidan jika digunakan pada logam transisi.(13) Senyawa tumbuhan lain, selain flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan diantaranya polifenol dan saponin. Penelitian tentang perbedaan kandungan total polifenol dan flavonoid yang terkandung dalam kulit pitaya (dragon fruit) menunjukkan adanya aktivitas antioksidan.(14) Penelitian aktivitas antioksidan dari saponin, secara langsung menunjukkan penurunan kadar lipid hydroperoxide pada serum lemak kelompok tikus yang diberi saponin.(15) Sumber-sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun antioksidan alami. Tetapi saat ini penggunaan antioksidan sintetik mulai dibatasi karena dari hasil penelitian yang telah dilakukan ternyata antioksidan sintetik seperti BHT (Butylated Hydroxy Toluena) dapat meracuni binatang percobaan dan bersifat karsinogenik. Oleh karena itu industri makanan dan obat-obatan beralih mengembangkan antioksidan alami dan mencari sumber-sumber antioksidan alami baru.(12) Dari bukti ilmiah berkenaan dengan kandungan senyawa dalam daun kersen yang telah disebutkan diatas diharapkan bahwa daun kersen memiliki suatu golongan senyawa tumbuhan yang mempunyai sifat antioksidan. Hal ini perlu dibuktikan melalui penelitian yang dimulai dengan pembuatan ekstrak daun kersen dan uji antioksidan kemudian dilanjutkan dengan penelitian fraksi-fraksinya.
2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tinjauan Botani Tinjauan mengenai tumbuhan Kersen (Muntingia calabura Linn), meliputi beberapa aspek, seperti klasifikasi tumbuhan, nama daerah, deskripsi tumbuhan, kandungan kimia, ekologi penyebaran dan kegunaannya 2.1.1 Klasifikasi Tumbuhan (16) Kingdom
: Plantae (tumbuhan)
Sub kingdom
: Tracheobionta (berpembuluh)
Super divisi
: Spermatophyta (berbiji)
Divisi
: Magnoliophyta (berbunga)
Kelas
: Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil)
Sub kelas
: Dilleniidae
Bangsa
: Malvales (Culumniferae)
Suku
: Elaeocarpaceae
Marga
: Muntingia
Jenis
: Muntingia calabura L.
2.1.2 Nama Daerah(17, 18) Jawa: talok, kersem, keres, kersen (Sunda). Jakarta: kadang-kadang disebut ceri. Lumajang: anak-anak menyebutnya baleci. Nama-nama lainnya di beberapa negara adalah: Capulin, Jamaica cherry (Inggris); datiles, aratiles, manzanitas (Filipina), mat sam (Vietnam); khoom somz, takhob (Laos); takhop farang (Thailand); krakhob barang (Kamboja); dan kerukup siam (Malaysia). Juga dikenal sebagai capulin blanco, cacaniqua, nigua, niguito (bahasa Spanyol); dan nama yang tidak tepat Japanse kers (Belanda). 2.1.3 Deskripsi Tumbuhan(19, 20) Daun tanaman ini tunggal, berseling, bulat telur bentuk lanset, panjang 6-10 cm, ujung dan pangkal runcing, tepinya bergerigi, berbulu, sistem 3
4 pertulangan menyirip, tidak simetris, hijau, mudah layu. Bunganya berisi 1-3-5 kuntum, terletak di ketiak agak di sebelah atas tumbuhnya daun, bertangkai panjang, berkelamin dua dan berbilangan 5, kelopak berbagi dalam, taju meruncing bentuk benang, berambut halus, mahkota bertepi rata, bundar telur terbalik dan putih tipis. Benang sari berjumlah banyak, 10 sampai lebih dari 100 helai. Bunga yang mekar menonjol keluar, ke atas helai-helai daun, namun setelah menjadi buah menggantung ke bawah, tersembunyi di bawah helai daun. Umumnya hanya satu-dua bunga yang menjadi buah dalam tiap berkasnya. Tanaman ini biasanya tumbuh dengan ukuran kecil namun kadang juga bisa berukuran besar bahkan ada yang bisa mencapai tinggi hingga 12 meter. Daunnya selalu hijau terus menerus, berbunga dan berbuah sepanjang tahun. Cabang-cabang mendatar, menggantung di ujungnya. membentuk naungan yang rindang. Ranting-ranting berambut halus bercampur dengan rambut kelenjar demikian pula daunnya. Buah memiliki diameter hingga 1,5 cm berbentuk seperti ceri jika matang maka akan berwarna merah dan berasa manis. Sedangkan bijinya berbentuk bulat, kecil, putih kekuningan, tiap buah mengandung ratusan biji, dan pada akarnya tunggang. 2.1.4 Kandungan Kimia (17, 21) Daun dan kulit batang Muntingia calabura L. mengandung alkaloid, tanin, saponin, flavonoida, polifenol, flavonol (kaemferol dan kuersetin) serta proantosianidin dan sianidin, beberapa mioinositol. Serta setiap 100 gram tanaman ini memiliki kandungan : 76,3 g air, 2,1 g protein, 2,3 g lemak, 17,9 g karbohidrat, 4,6 g serat, 1,4 g abu, 125 mg kalsium, 94 mg fosfor, 0,015 mg vitamin A, 90 mg vitamin C. Nilai energinya 380 kJ/100 g.
5 Kersen merupakan salah satu jenis dari marga Muntingia yang tumbuh selalu hijau sepanjang tahun. Tumbuhan ini kaya senyawa flavonoid dengan jenis flavon, flavonon, flavan dan biflavon sebagai kandungan yang penting.(1) 2.1.5 Ekologi penyebaran (18) Pohon kersen umumnya tidak dibudidayakan, tetapi tersebar secara spontan. Kersen berasal dari Meksiko selatan, Amerika tengah, Amerika selatan yang beriklim tropis dan Trinidad. Kersen memiliki penyebaran yang luas terutama di daerah yang beriklim tropis/panas seperti India dan Asia tenggara (Indonesia, Malaysia dan Filipina). 2.1.6 Kegunaan/Khasiat (20, 5) Daun kersen berwarna hijau dan berbulu berkhasiat sebagai obat batuk, peluruh dahak, antitumor dan rebusan daun kersen dapat menghambat pertumbuhan
mikroba
seperti
Corynebacterium
diphteriae,
Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis serta dapat digunakan sebagai antiseptik, dan dapat mengatasi penyakit gula darah. Secara tradisional daun kersen telah lama digunakan di negara Peru dengan pemakaian seperti mengkonsumsi teh untuk menghilangkan rasa sakit seperti sakit kepala dan juga antiradang. Buah kersen dapat dimanfaatkan untuk mengobati sakit kuning, serta jus buah kersen sangat baik dijadikan sebagai minuman bagi seorang atlet untuk mencegah cedera otot saat beraktivitas. Bagian-bagian tanaman ini telah digunakan sebagai obat-obatan di daerah Asia Tenggara dan di bagian tropis benua Amerika. Akar kersen telah digunakan sebagai abortifacient di Malaysia. Bunga kersen telah biasa digunakan untuk mengobati sakit kepala, antiseptik, antikejang, dan diaporetik. Cairan pada bunga tanaman kersen di minum sebagai obat penenang. (3)
6 2.2 Ekstraksi (22,23) Ekstraksi adalah metode pemisahan senyawa dari campurannya dengan menggunakan pelarut atau metode penarikan kandungan senyawa kimia metabolit sekunder dari bagian tumbuhan dengan menggunakan pelarutpelarut yang sesuai. Dalam pemilihan pelarut pengekstraksi berlaku prinsip polar loves polar dan non polar loves non polar, artinya bila kita akan mengekstraksi senyawa non polar, harus digunakan pelarut non polar dan bila kita akan mengekstraksi senyawa polar harus digunakan pelarut polar. Contoh pelarut polar adalah air, metanol, dan etanol, pelarut semi polar misalnya aseton, dan etil asetat, serta pelarut non polar yang umum digunakan adalah normal heksana, eter minyak tanah, kloroform, dan diklorometana. Dalam pustaka-pustaka sering dinyatakan ekstraksi dengan benzena atau kloroform atau karbon tetraklorida sebagai pelarut non polar, tetapi kini benzena, kloroform, dan karbon tetraklorida mulai ditinggalkan karena sifat hepatotoksiknya yang tinggi. Ekstraksi dengan menggunakan pelarut dibagi menjadi dua yaitu ekstraksi cara dingin dan ekstraksi cara panas. 2.2.1 Ekstraksi Cara Dingin (23) Ekstraksi cara dingin dibedakan atas: i. Maserasi Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan mengunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan. Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan yang kontinu. Remaserasi berarti dilakukan
pengulangan
penambahan
pelarut
setelah
dilakukan
penyaringan maserat pertama, dan seterusnya. ii. Perkolasi Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada
7 temperatur ruangan. Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap
maserasi
antara,
tahap
perkolasi
sebenarnya
(penetesan/penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahan. 2.2.2 Ekstraksi Cara Panas (23) Ekstraksi cara panas antara lain: i.
Refluks Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna.
ii.
Ekstrasi kontinyu dengan alat Soxhlet Ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.
iii.
Digesti Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50oC.
iv.
Infus Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96-98oC) selama waktu tertentu (15-20 menit).
v.
Dekok Dekok adalah
infus pada waktu yang lebih lama (≥30oC) dan
temperatur sampai titik didih air. vi.
Pressurized Hot Water Extraction (PHWE)(42) PHWE adalah ekstraksi menggunakan pelarut air dengan temperatur tinggi dan pada kondisi tekanan yang terkendali sehingga dapat menarik komponen organik atau non-polar.
8 2.3 Partisi (25,18) Ekstraksi juga dapat digolongkan berdasarkan bentuk campuran yang diekstraksi dan proses pelaksanaannya, yaitu: 2.3.1 Bentuk campurannya i. Ekstraksi Padat-cair. Zat yang diekstraksi terdapat di dalam campuran yang berbentuk padatan. Ekstraksi jenis ini banyak dilakukan di dalam usaha mengisolasi zat berkhasiat yang terkandung di dalam bahan alam seperti steroid, hormon, antibiotika dan lipida pada biji-bijian ii. Ekstraksi cair-cair Zat
yang
diekstraksi
terdapat
di
dalam campuran yang
berbentuk cair. Ekstraksi cair-cair atau ekstraksi pelarut banyak dilakukan untuk memisahkan zat seperti iod, atau logam-logam tertentu dalam larutan air. 2.3.2 Proses pelaksanaannya Menurut
proses
pelaksanaannya,
ekstraksi
dibedakan
menjadi
ekstraksi berkesinambungan (kontinyu) dan ekstraksi bertahap. i. Ekstraksi Kontinyu. Pada
ekstraksi
kontinyu, pelarut yang sama digunakan secara
berulang-ulang sampai proses ekstraksi selesai. Tersedia berbagai alat dari jenis ekstraksi ini seperti alat soxhlet atau Craig Countercurent. ii. Ekstraksi Bertahap Pada ekstraksi bertahap, setiap kali ekstraksi pelarut
yang
baru,
sampai
selalu
digunakan
proses ekstraksi selesai. Alat yang
biasanya digunakan adalah berupa corong pisah. Ekstraksi cair padat adalah pemisahkan satu atau lebih senyawa dengan
menggunakan
satu pelarut dimana senyawa tersebut akan terdistribusi menurut tingkat kepolarannya menggunakan magnetik stirrer atau sentrifus, dan yang tidak larut akan membentuk endapan. Ekstraksi cair padat pada prinsipnya sama dengan ekstraksi cair-cair. Pada ekstraksi cair-padat, pelarut yang digunakan hanya satu macam.
Dengan
demikian
9 kompoen
kimia
akan
terdistribusi
kesatu macam pelarut saja.
Sehingga akan diperoleh ekstrak yang larut dan tidak larut. Ekstraksi cair-cair (corong pisah) merupakan pemisahan komponen kimia di antara 2 fase pelarut yang tidak saling bercampur di mana sebagian komponen larut pada fase pertama dan sebagian larut pada fase kedua, lalu kedua fase yang mengandung zat terdispersi dikocok, lalu didiamkan sampai terjadi pemisahan sempurna dan terbentuk dua lapisan fase cair, dan komponen kimia akan terpisah ke dalam kedua fase tersebut
sesuai
dengan
tingkat
kepolarannya
dengan
perbandingan konsentrasi yang tetap. Ekstraksi cair-cair merupakan cara pemisahan satu atau lebih senyawa dengan menggunakan dua pelarut
yang
tidak
bercampur, dimana senyawa tersebut akan
terdistribusi diantara dua fase sesuai dengan derajat kelarutannya sehingga masing-masing jenuh dengan perbandingan konsentrasi tertentu
dan
terjadi
pemisahan.
Metode ekstraksi ini sering kali
disebut proses partis dari ”crude extract” atau ekstrak kasar sehingga diperoleh sekumpulan senyawa kimia dengan tingkat polaritas yang berbeda-beda. Penyarian merupakan proses pemisahan dimana suatu zat terbagi dalam dua pelarut yang tidak bercampur. 2.4 Parameter Standar dan Metode Uji ekstrak (23) 2.4.1 Parameter Non Spesifik Parameter non spesifik meliputi : i. Susut Pengeringan Susut pengeringan merupakan pengukuran sisa zat setelah pengeringan pada temperature 105°C selama 30 menit atau sampai berat konstan, yang dinyatakan dalam persen. Dalam hal khusus jika bahan tidak mengandung minyak menguap/atsiri dan sisa pelarut organik identik dengan
kadar
air,
yaitu
kandungan
atmosfer/lingkungan udara terbuka.
air
karena
berada
di
10 ii. Bobot Jenis Parameter
bobot
jenis
ekstrak
merupakan
parameter
yang
mengindentifikasi spesifikasi ekstrak uji. Memberikan batasan tentang besarnya masa per satuan volume yang merupakan parameter khusus ekstrak cair sampai ekstrak pekat (kental) yang masih dapat dituang. Memberikan gambaran kimia terlarut. iii. Kadar Air Kadar air adalah banyaknya hidrat yang terkandung dalam zat atau banyaknya air yang diserap dengan tujuan untuk memberikan batasan minimal atau rentang tentang besarnya kandungan air dalam bahan. iv. Kadar Abu Kadar abu merupakan parameter uji mutu yang erat hubungannya dengan kemurniaan simplisia dan memberikan gambaran kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya ekstrak. 2.4.2 Parameter Spesifik (23) Parameter spesifik meliputi: i. Identitas Identitas ekstrak meliputi : Dekripsi tata nama: a. Nama ekstrak (generic, dagang, paten) b. Nama latin tumbuhan (sistematika botani) c. Bagian tumbuhan yang digunakan (rimpang, daun) d. Nama Indonesia tumbuhan ii. Organoleptik Parameter organoleptik digunakan untuk mendeskripsikan bentuk, warna, bau, rasa, menggunakan pancaindra dengan tujuan pengenalan awal yang sederhana seobyektif mungkin. iii. Senyawa Terlarut Dalam Pelarut Tertentu Parameter senyawa terlarut dalam pelarut tertentu digunakan untuk mengetahui jumlah kandungan senyawa kimia dalam sari simplisia.
11 Parameter senyawa terlarut dalam pelarut tertentu ditetapkan sebagai parameter uji bahan baku obat tradisional karena kandungan senyawa kimia
dalam
sari
simplisia
akan
berkaitan
erat
dengan
reproduksibilitasnya dalam aktivitas farmakodinamik simplisia tersebut. 2.4.3 Parameter Uji Kandungan Kimia Ekstrak (23) Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui parameter uji kandungan kimia ekstrak adalah kromatografi lapis tipis (KLT). Pola kromatogram mempunyai tujuan untuk memberikan gambaran awal komponen kandungan kimia berdasarkan pola kromatogram kemudian dibandingkan dengan data baku yang ditetapkan terlebih dahulu. 2.5 Isolasi (22) Faktor paling utama yang harus dipertimbangkan sebelum merancang sebuah prosedur isolasi adalah sifat alami senyawa target yang terdapat dalam suatu ekstrak atau fraksi. Gambaran umum sifat molekul yang akan diisolasi sangat membantu
dalam
menentukan
proses
isolasi
meliputi
kelarutan
(hidrofobisitas atau hidrofilisitas), sifat asam basa, stabilitas, dan ukuran molekul. Jika mengisolasi suatu senyawa yang sudah diketahui atau dari sumber yang baru, dapat dicari informasi dari literatur mengenai sifat kromatografi senyawa target tersebut, sehingga mudah untuk menentukan metode isolasi yang sesuai. Penentuan prosedur isolasi untuk ekstrak dengan kandungan senyawa yang sama sekali belum diketahui tipe senyawanya dapat menimbulkan kesulitan. Oleh karena itu, disarankan untuk dilakukan uji kualitatif untuk mengetahui tipe senyawa seperti: fenolik, steroid, alkaloid, flavanoid, dan sebagainya dengan menggunakan kromatografi lapis tipis atau profil kromatografi cair kinerja tinggi. Metode isolasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah kromatografi kolom gravitasi dengan menggunakan Sephadex LH-20 sebagai fase diam dan sebagai fase gerak adalah pelarut yang sesuai. Sephadex merupakan media filtrasi gel yang digunakan untuk pemisahan golongan
12 senyawa dan pemurnian senyawa komplek menjadi senyawa tunggal. Prinsip pemisahan menggunakan sephadexdidasarkan pada berat molekul senyawa yang dipisahkan. Sepadhex dibuat cross linking dextran yang secara spesifik dikembangkan untuk filtrasi gel bahan alam. 2.5.1 Fraksinasi
(23,26)
Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan yang bertujuan memisahkan golongan utama kandungan yang satu dari kandungan yang lain. Senyawa yang bersifat polar akan masuk ke pelarut polar dan senyawa non polar akan masuk ke pelarut non polar. Metode fraksinasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah menggunakan kromatografi kolom. Kolom diisi dengan penyerap padat sebagai fase tetap dan dialiri dengan pelarut sebagai fase gerak. Cuplikan yang akan difraksi dimasukan ke dalam kolom dan dialiri fase gerak yang akan membentuk jalur-jalur serapan dari senyawa. Bila pelarut dibiarkan mengalir melalui kolom, ia akan mengangkut senyawa-senyawa
yang
merupakan
komponen-komponen
dari
campuran. Pemisahan komponen suatu campuran tergantung pada tingkat kepolaran dari fase gerak dan senyawa yang terkandung dalam campuran tersebut. 2.5.2 Kromatografi (29) Beberapa metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat di laboratorium kimia. Gagasan dasarnya sederhana untuk dipahami caranya beragam, mulai dari cara sederhana sampai yang agak rumit dari segi kerja dan peralatan, tetapi metode ini dapat dipakai untuk setiap jenis senyawa, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Hampir setiap campuran kimia, mulai dari bobot molekul rendah sampai tinggi dapat dipisahkan menjadi komponen-komponennya dengan beberapa metode kromatografi. Jenis pemisahan, apakah analitik atau preparatif, tidak
13
ditentukan oleh ukuran cuplikan, dan kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari campuran. i.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (22, 29) KLT adalah salah satu metode pemisahan yang paling banyak digunakan. Prinsip kerjanya yaitu berdasarkan pada perbedaan koefisien partisi senyawa dalam fasa diam dan fasa gerak, atau berdasarkan daya adsorpsi senyawa pada adsorben yang bertindak sebagai fasa diam. Fasa diam adalah fasa yang terikat pada pendukung, sedangkan fasa gerak adalah fasa yang bergerak melalui fasa diam. Senyawa yang akan dipisahkan ikut bergerak bersama fasa gerak. Selama senyawa bergerak, terjadi proses partisi komponen antara fasa gerak dan fasa diam, atau terjadi proses adsorpsi senyawa oleh adsorben yang bertindak sebagai fasa diam. Akibat adanya perbedaan koefisien partisi dan afinitas adsorpsi, terjadilah perbedaan kecepatan gerakan senyawa-senyawa yang menyebabkan terjadinya pemisahan. Pada KLT, umumnya sering terjadi gangguan yang dapat terlihat pada bercak yang tampak pada lempeng. Gangguan-gangguan yang sering terjadi diantaranya: a. Pembentukan ekor Jika senyawa yang dipisahkan berekor panjang, bukan berupa bercak yang agak bundar, gejala ini yang disebut pembentukan ekor. Penyebab utama pembentukan ekor adalah cuplikan terlalu banyak atau pembebanan yang berlebih. Ini merupakan akibat dari isoterm cembung pada sebagian besar proses penjerapan dan hanya dapat dihilangkan dengan mengurangi cuplikan. Selain itu dapat pula disebabkan tidak adanya pengendalian pH yang memadai pada lapisan. Asam dan basa berada dalam keseimbangan dengan ion karboksilat atau ion amonium yang jauh lebih polar. pH pada lapisan harus sedemikian rupa sehingga asam dan basa berada dalam suasana sistem yang sesuai.
14 b. Pencampuran pelarut Jika dua pelarut yang sifatnya sangat berbeda dicampur untuk memperoleh sistem pelarut, sistem ini dapat memisah pada lapisan, membentuk dua garis depan pelarut. Kedua daerah kromatogram tersebut akan mempunyai sifat yang berbeda. Oleh karena itu, hanya pelarut yang sifatnya sama yang diperbolehkan dicampur. c. Garis depan tidak mendatar Garis depan pelarut kadang-kadang membentuk busur dengan bercak rendah di tengah. Ini umumnya disebabkan oleh ketidakjenuhan bejana atau suhu yang tidak sama pada lapisan. Bejana harus dijenuhkan dengan pelarut dan harus diusahakan agar tidak ditempatkan di tempat yang beraliran udara. ii.
Kromatografi Kolom Kromatografi kolom merupakan yang tertua dari cara kromatografi yang banyak itu, dan seperti yang di praktekan secara tradisional, merupakan bentuk kromatografi cair. Fase diam, baik bahan yang jerap (Kromatografi Cair Vakum) atau film zat cair pada penyangga, ditempatkan didalam tabung kaca bentuk silinder, pada bagian bawah tertutup dengan katup atau keran, dan fase gerak dibiarkan mengalir kebawah melaluinya. Kromatografi cair yang dilakukan di dalam kolom besar merupakan metode kromatografi untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar (lebih dari 1 gram). Kadang-kadang cara ini disebut kromatografi cair preparatif. Pada kromatografi kolom, terdapat beberapa faktor yang harus diperhatikan, antara lain: a. Kolom kromatografi Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena daya tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu di bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut. Setiap rancangan kolom, terdapat penopang atau sejenis piringan pelat di dalam tabung, diatas keran yang
15 berguna untuk menahan penjerap. Penopang tersebut dapat berupa segumpal kecil wool atau kapas yang ditutupi pasir bersih 50-100 mesh setebal 30-60 nm, maupun dapat berupa piringan kaca masir. b. Banyaknya campuran yang dipisahkan Campuran kasar kadang-kadang mengandung ter atau produk berupa polimer
yang tidak
bergerak
sama
sekali
didalam
sistem
kromatografi yang dapat menggerakkan produk utama. Untuk menghilangkan senyawa yang tidak bergerak, kolom tebal yang agak pendek (10 x ,5 cm) dengan perbandingan antara penjerap dengan zat terlarut yang rendah (10:1).
Untuk pemisahan normal,
perbandingan bobot 30:1 ternyata memadai jika pemisahan tidak terlalu sukar. Jika pemisahan lebih sukar, harus digunakan perbandinga penjerap dengan zat terlarut lebih tinggi, mungkin sekitar 100:1 atau bahkan 300:1, dan lebih sering digunakan kolom kecil panjang. c. Penjerap atau Fase diam Sifat, derajat, atau tingkat keaktifan penjerap, dan ukuran partikelnya betul-betul penting dalam pengembangan sistem kromatografi. Mengemas kolom harus dilakukan dengan hati-hati, agar dihasilkan kolom kemas yang serba sama. Jika kolom tidak mempunyai penyaring kaca masir, maka kita harus menyumbat kolom dengan segumpal kaca wool atau kapas. Sumbat ini harus terendam dengan pelarut pengelusi setinggi 10 cm. Selanjutnya kemasan kolom dijadikan bubur dalam gelas piala memakai pelarut yang sama, lalu dituangkan hati-hati ke dalam kolom dan tidak terputus-putus, untuk mencegah terbentuk lapisan. Setelah itu kemasan dibiarkan turun dan kelebihan pelarut dikeluarkan melalui keran. Laju gerakan zat dipengaruhi oleh sejumlah variabel, diantaranya daya absorpsi zat penjerap, ukuran partikel dan luas permukaan, sifat dan polaritas pelarut, tekanan yang digunakan dan suhu sistem kromatografi .
16 Terdapat beberapa jenis fase diam yang dapat dipakai untuk kolom, namun ada 2 jenis fase diam yang paling berguna dan mudah didapatkan, antara lain:
Alumina adalah salah satu fase diam yang paling banyak digunakan dan terdapat dalam beberapa bentuk modifikasi. Hampir semua senyawa organik, kecuali hidrokarbon alifatik jenuh, terjerap oleh alumina basa yang lazim. Akan tetapi, alumina dapat diperlakukan memakai asam klorida untuk diubah menjadi bentuk netral. Alumina asam sangat banyak dipakai untuk pemisahan asam amino dan peptida asam, sedangkan alumina
netral
dipakai
untuk
pemisahan
kortikosteroid,
glikosida, ketal, lakton, dan beberapa ester, dan untuk menghidrasi pelarut.
Silika gel atau asam silikat, seperti alumina, merupakan penjerap yang paling banyak dipakai dan dianggap sebagai penjerap yang paling serbaguna. Silika gel dapat digunakan dengan semua pelarut, tetapi ia menunjukkan kemampuan berikatan hidrogen dengan beberapa zat terlarut dan pelarut jika ada air sehingga memperlambat aliran pelarut jika ada air. Bahan ini paling berguna untuk memisahkan aglikon yang kurang polar, misalnya isoflavon, flavanon, metil flavon, dan flavonol. Sering kali lebih baik dicuci terlebih dahulu untuk menghilangakan sesepora besi yang menyebabkan banyak flavonoid terikat kuat pada kemasan kolom.
2.6 Flavonoid (38,22) Flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang tersebar di alam, dan berasal dari tumbuhan tinggi. Menurut perkiraan, kira-kira 2% dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuhan ( atau kira-kira 1 x 109 ton/tahun) diubah menjadi flavonoid atau senyawa yang berikatan erat dengannya. Istilah flavonoid diberikan untuk senyawa-senyawa fenol yang berasal dari
17 kata flavon, yaitu nama dari salah satu jenis flavonoid yang terbesar jumlahnya dalam tumbuhan. Senyawa-senyawa flavon ini mempunyai kerangka 2-fenilkroman, dimana posisi orto dari cincin A dan atom karbon yang terikat pada cincin B dari 1,3-diarilpropana dihubungkan oleh jembatan oksigen sehingga membentuk cincin heterosiklik yang baru (cincin C).
(a)
(b)
(c)
Gambar 2.1. Kerangka Flavonoida (a); Isoflavonoid (b); Neoflavonoida (c) (38) Flavonoid dan senyawa turunannya biasanya terdapat pada tumbuhan sebagai glikosida yang tersusun dari satu atau lebih gugus fenil dan gugus gula. Gugus hidroksi hampir selalu ditemukan pada posisi 5 dan 7 pada cincin A, sedangkan cincin B umumnya mengandung gugus hidroksi dan alkoksil pada posisi 4‟ atau pada posisi 3‟ dan 4‟. Glikosida dari flavonoid dapat mengandung gugus gula pada setiap gugus hidroksi.
Gambar 2.2. Golongan Flavonoid
(38)
18 Flavonoid
merupakan
kandungan
khas
tumbuhan
hijau
dengan
mengecualikan alga. Flavonoid sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, nektar bunga, buah buni dan biji. Hanya sedikit saja catatan yang melaporkan adanya flavonoid pada hewan, misalnya dalam kelenjar bau berang – berang “propolis” (sekresi lebah) dan di dalam sayap kupu – kupu; itupun dengan anggapan bahwa flavonoid tersebut berasal dari tumbuhan yang menjadi makanan hewan tersebut dan tidak dibiosintesis di dalam tubuh mereka. 2.6.1 Golongan Flavonoid Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran; jarang sekali dijumpai hanya flavonoid tunggal dalam jaringan tumbuhan. Di samping itu, sering terdapat campuran yang terdiri atas flavonoid yang berbeda kelas. Penggolongan jenis flavonoid dalam jaringan tumbuhan mula-mula didasarkan kepada telaah sifat kelarutan dan reaksi warna. Kemudian diikuti dengan pemeriksaan ekstrak tumbuhan yang telah dihidrolisis, secara kromatografi satu arah, dan pemeriksaan ekstrak etanol secara dua arah. Akhirnya, flavonoid dapat dipisahkan dengan cara kromatografi. Komponen masing-masing diidentifikasi dengan membandingkan kromatografi dan spektrum, dengan memakai senyawa pembanding yang sudah dikenal. Tabel 2.1. Sifat Berbagai Golongan Flavonoid (38) Golongan Flavonoid Antosianin
Proantosianidin
Flavonol
Penyebaran Pigmen bunga merah marak, merah, merah senduduk, dan biru;juga dalam daun dan jaringan lainnya. Terutama tanwarna, dalam galih dan daun tumbuhan berkayu.
Ciri khas Larut dalam air, λmaks 515545 nm, bergerak dengan BAA pada kertas.
Menghasilkan antosianidin (warna dapat diekstraksi dengan amil alkohol) bila jaringan dipanaskan dalam HCl 2M selama setengah jam. Terutama ko-pigmen tanwarna Setelah hidrolisis, berupa dalam bunga sianik dan bercak kuning murup pada asianik; tersebar luas dalam kromatogram Forestal bila
19
daun. Flavon
Seperti flavonol.
Glikoflavon
Seperti flavonol.
Biflavonil
Tanwarna; hampir seluruhnya terbatas pada gimnospermae.
Khalkon dan Auron
Pigmen bunga kuning, kadang-kadang terdapat juga dalam jaringan lain.
Flavonon
Tanwarna; dalam daun dan buah (terutama dalam citrus).
Isoflavon
Tanwarna; sering kali dalam akar; hanya terdapat dalam satu suku, Leguminosae
disinari dengan sinar UV ; maksimal spektrum pada 350 – 386 nm. Setelah dihidrolisis, berupa bercak coklat redup pada kromatogram Forestal ; maksimal spektrum 330 – 350 nm. Mengandung gula yang terikat melalui ikatan C-C; bergerak dengan pengembang air, tidak seperti flavon biasa. Pada kromatogram BAA berupa bercak redup dengan RF tinggi. Dengan amoniak berwarna merah (perubahan warna dapat diamati insitu), maksimal spektrum 370 – 410 nm. Berwarna merah kuat dengan Mg/HCl; kadangkadang sangat pahit. Bergerak pada kertas dengan pengembang air; tak ada uji warna khas.
i. Flavon dan Flavonol Flavon terdapat sebagai glikosida. Jenis yang paling umum adalah 7glukosida, contohnya luteolin 7-glikosida. Flavon juga terdapat yang terikat pada gula melalui ikatan karbon sederetan glikosiflavon, salah satu contohnya adalah orientin, yaitu luteolin 8-C-glukosida. Ikatan karbon-karbon yang sangat tahan terhadap glikolisis asam sehingga membedakan C-glikosida dengan O-glikosida yang lebih mudah terhidrolisis.Flavon sangat tersebar luas dalam tumbuhan, baik sebagai kopigmen antosianin dalam daun bunga maupun dalam daun tumbuhan tinggi. ii. Isoflavon Isoflavon termasuk ke dalam golongan flavonoid minor karena penyebarannya yang terbatas. Isoflavon merupakan suatu isomer
20
flavon, tetapi jauh lebih langka. Hampir semua terdapat dalam anak suku Leguminosae (Papilionoideae). Isoflavon dapat dipilih menjadi tiga kelas berdasarkan sifat fisiologinya. Senyawa seperti 7-4‟dihidroksiisoflavon
(daidzein)
dan
5,7,4‟-trihidroksiisoflavon
(genistein) merupakan estrogen asam lemah, terdapat dalam semanggi. Isoflavon rumit, misalnya rotenon, merupakan insektisida alam kuat, sementara kumestan yang sekerabat, misalnya pisatin, adalah fitoaleksin, yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan sebagai tanggapan terhadap serangan penyakit. iii. Khalkon dan Auron Khalkon dan auron merupakan „antoklor‟, yaitu pigmen kuning yang dapat dideteksi berdasarkan kenyataan bahwa bila daun bunga yang berwarna kuning diasapi dengan asap basa dari sebatang cerutu, atau diuapi dengan uap amonia warnanya berubah menjadi jingga atau merah. Senyawa ini terdapat khas dalam Compositae (terutama Coreopsis). iv. Flavonon Flavonon merupakan isomer khalkon dan kedua kelas senyawa ini berantar-alih-bentuk secra in vitro. Khalkon sering kali dijumpai di alam bersama-sama dengan analog flavon, tetapi sebaliknya belum tentu demikian. v. Xanton Xanton ialah pigmen fenol kuning yang reaksi warnanya serta gerakan kromatografinya serupa dengan flavonoid. Karena alasan tersebut deteksi dan analisisnya dimasukkan dalam bagian ini. Secara kimia xanthon berbeda dengan flavonoid dan mudah dibedakan dari flavonoid berdasarkan sifat spektrumnya yang khas. vi. Antosianin Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar luas dalam tumbuhan. Pigmen yang berwarna kuat dan larut dalam air ini adalah penyebab hampir semua warna merah jambu, merah marak,
21
merah, merah senduduk, ungu dan biru dalam daun bunga, daun, dan buah pada tumbuhann tinggi. 2.7 Radikal Bebas (31, 32) 2.7.1 Pengertian Radikal Bebas (31) Radikal bebas ialah senyawa kimia yang mempunyai satu atau lebih elektron tidak berpasangan, sehingga tidak stabil dan sangat reaktif. Senyawa radikal bebas timbul akibat berbagai proses kimia kompleks dalam tubuh, metabolisme oksidatif mitokondria, atau ketika tubuh terpapar polusi lingkungan. Radikal bebas bersifat destruktif, sangat reaktif dan mampu bereaksi dengan makromolekul sel, seperti: protein, lipid, karbohidrat, atau DNA. Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu penyakit, antara lain: i. Kerusakan DNA pada inti sel Senyawa radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab kerusakan DNA dengan mengoksidasi DNA. Jika sel yang mengandung DNA rusak (damaged DNA) membelah sebelum DNA tersebut diperbaiki, akan mengakibatkan perubahan genetik secara permanen, hal tersebut merupakan langkah pertama dalam karsinogenesis. Oksidasi DNA oleh senyawa radikal bebas dapat menginisiasi terjadinya kanker. ii. Kerusakan protein Perubahan LDL (low density lipoprotein) menjadi bentuk LDL teroksidasi yang diperantarai oleh radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan dinding arteri dan kerusakan bagian arteri lainnya. Meningkatnya kadar LDL oleh oksigen reaktif dapat merusak dinding arteri yang menyebabkan aterosklerosis. iii. Kerusakan lipid peroksida Radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan oksidatif pada ikatan lemak tak jenuh dalam fosfolipid membran biologi (lipid peroksidasi).
22 Lipid peroksidasi yang tak terkontrol disebabkan reaksi berantai radikal bebas merupakan proses toksik yang dapat menimbulkan kemerosotan fungsi membran biologis. 2.7.2 Sumber radikal bebas(32,30) Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh kita sendiri (endogen), bisa pula dari luar tubuh (eksogen). Radikal endogen terbentuk akibat reduksi oksigen dalam mitokondria yang kurang sempurna, sehingga terbentuk superoksida, interaksi superoksida atau hidrogen peroksida dengan ion logam transisi. Sedangkan radikal bebas eksogen berasal dari polusi udara, radiasi, zat-zat kimia (obat-obatan, insektisida) dan makanan-makanan tertentu. Sumber endogenus maupun eksogenus terjadi melalui sederetan mekanisme reaksi. Yang pertama pembentukan awal radikal bebas (inisiasi), lalu perambatan atau terbentuknya radikal baru (propagasi), dan tahap terakhir (terminasi), yaitu pemusnahan atau pengubahan menjadi radikal bebas stabil dan tidak reaktif. 2.7.3 Antioksidan (27,32) Antioksidan adalah zat yang mampu memberikan 1 elektron kepada radikal bebas sehingga bersifat netral. Antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas, dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari terbentuknya radikal bebas. Antioksidan dapat digunakan sebagai peredam radikal yang bermanfaat apabila setelah bereaksi dengan radikal bebas, akan menghasilkan radikal baru yang stabil atau senyawa bukan radikal. Berdasarkan mekanismenya, antioksidan dapat dikelompokan menjadi dua yaitu: i. Antioksidan primer (30) Antioksidan primer mengikuti mekanisme pemutusan rantai reaksi radikal dengan mendonorkan atom hidrogen secara cepat pada suatu
23 lipid yang radikal, produk yang dihasilkan lebih dari produk inisial. Contoh antioksidan ini adalah flavanoid, tokoferol, senyawa thiol, yang dapat memutus rantai reaksi propagasi dengan menyumbang elektron pada peroksi radikal dalam asam lemak ii. Antioksidan sekunder (27) Antioksidan ini dapat menghilangkan penginisiasi oksigen radikal maupun nitrogen atau bereaksi dengan komponen atau enzim yang menginisiasi reaksi radikal antara lain dengan menghambat enzim pengoksidasi dan menginisiasi enzim pereduksi atau mereduksi oksigen tanpa membentuk spesies radikal yang reaktif. Contoh antioksidan sekunder: sulfit, vitamin C, betakaroten, asam urat, billirubin, dan albumin. 2.8 Pengujian Antioksidan dengan Metode DPPH (27) Beberapa metode uji yang digunakan untuk melihat aktivitas antioksidan, Metode conjugated diene, Metode penangkapan radikal hidroksil, Metode Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP), Metode Trapping Antioxidant Parameter (TRAP).
Salah satu metode yang digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan adalah metode DPPH. Metode DPPH didasarkan pada kemampuan antioksidan untuk menghambat radikal bebas dengan mendonorkan atom hidrogen. Perubahan warna ungu DPPH menjadi ungu kemerahan sampai kuning, dimanfaatkan untuk mengetahui aktivitas senyawa antioksidan. Metode ini menggunakan kontrol positif sebagai pembanding untuk mengetahui aktivitas antioksidan sampel. Kontrol positif ini dapat berupa tokoferol, BHT, dan vitamin C. Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH menggunakan 1,1-difenil-2-pikrilhidra-zil sebagai radikal bebas. Prinsipnya adalah reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH dari senyawa antioksidan, misalnya troloks, yang mengubahnya menjadi 1,1-difenil-2pikrilhidrazin.
24 Tabel 2.2 Tingkat kekuatan antioksidan dengan metode DPPH (27) Intensitas
Nilai IC50
Sangat kuat
< 50 µg/mL
Kuat
50-100 µg/mL
Sedang
101-150 µg/mL
Lemah
> 150 µg/mL
Gambar 2.3 Reaksi peredaman DPPH oleh antioksidan(27)
DPPH
DPPH-H
(Ungu)
(Kuning)
λmax = 516-520 nm
λmax = 330 nm
2.8.1 Kuersetin(27) Nama lain dari kuersetin adalah 3,4-dihydroxy-5,7-dihydroxy-2-(4hydroxyphenyl)-4-benzopyrone;
5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)
croman-4-one; naringetol; salipurpol. Rumus kimia kuersetin yaitu C15H12O5 dengan BM 272,25, panjang gelombang maksimum kuersetin dalam etanol adalah 255,374 nm.
Kuersetin merupakan senyawa
flavonoid golongan flavonol. Kuersetin larut dalam alkohol, eter, dan benzen hampir tidak larut dalam air. Stuktur kimia dari kuersetin adalah sebagai berikut:
25
Gambar 2.4 Struktur kimia kuersetin (27)
Sebuah penelitian yang menguji aktivitas antioksidan secara in vivo dan in vitro dari senyawa isoflavon yang terkandung dalam kedelai, memiliki
kerja
perlindungan
sebagai
sistem
antioksidan
kardiovaskular.
yang Dalam
berkontribusi industri
untuk
polimer,
antioksidan diperlukan untuk menghambat oksidasi dan menjamin efek degradasinya. Antioksidan primer, seperti fenol terhalang merupakan penangkap radikal. (27) 2.9 Spektrofotometri UV – Visible (34, 35,22 ) Spektrofotometri ultraviolet merupakan metode analisa suatu senyawa yang menggunakan instrumen spektrofotometer, dimana prinsip kerja alat tersebut berdasarkan pengukuran terhadap transmitan atau absorban suatu sampel atau berdasarkan kemampuan atom/molekul mengabsorpsi dan memancarkan cahaya. Sinar tampak (Visible) adalah sinar polikromatis yang dengan bantuan monokromator misalnya prisma dapat diuraikan menjadi beberapa sinar monokromatis dengan berbagai panjang gelombang. Analisa spektrofotometri UV-Visible biasanya dilakukan pada panjang gelombang absorpsi maksimum (λ maks) yang didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak dari suatu gelombang. Dimana sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200 – 400 nm sedangkan sinar tampak pada panjang gelombang 400 – 800 nm. Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dalam larutan yang sangat encer dengan pembanding blanko pelarut serta menggunakan spektrofotometer yang merekam otomatis. Senyawa tanpa warna diukur pada
26 jangka 200 sampai 400 nm, senyawa berwarna pada jangka 200 sampai 700 nm. Panjang gelombang serapan maksimum dan minimum pada spektrum serapan yang diperoleh direkam dalam nm (nano meter), demikian juga kekuatan absorbansinya pada maksima dan minima yang khas. Bahan yang diperlukan hanya sedikit saja karena sel spektrofotometri baku (1x1 cm) hanya dapat diisi 3 ml larutan. Penyerapan sinar UV-visible oleh suatu molekul akan menyebabkan transisi diantara tingkat energi elektronik dari molekul. Transisi ini dapat terjadi antar orbital ikatan (bonding) atau ikatan anti-bonding. Panjang gelombang yang diserap sebanding dengan perbedaan tingkat energi orbital. Kegunaan utama spektroskopi
ini
adalah
untuk
mengidentifikasi
jumlah
ikatan
rangkap/konjugasi aromatik. Pelarut yang banyak digunakan untuk spektroskopi UV – Visible adalah etanol 95% atau etanol absolut karena kebanyakan golongan senyawa larut dalam pelarut tersebut. Alkohol niaga harus dihindari karena mengandung benzena yang menyerap di daerah UV pendek. Pelarut lain yang sering digunakan ialah air, metanol, heksana, eter minyak bumi, dan eter. Pelarut seperti kloroform dan piridina umumnya harus dihindari karenya menyerap kuat di daerah 200-260 nm ; tetapi sangat cocok untuk mengukur pigmen tumbuhan, seperti karotenoid, di daerah spektrum tampak. Pemurnian merupakan suatu keharusan sebelum kita melakukan telaah spektrum, dan kandungan tumbuhan yang menunjukkan ciri serapan yang khas harus diulangi pemurniannya sampai ciri tersebut tidak berubah lagi. Spektrum serapan mempunyai nilai khusus pada telaah pigmen tumbuhan dan demikianlah halnya, baik untuk bahan pewarna tumbuhan yang larut dalam air maupun yang larut dalam lipid. 2.10Pereaksi Geser (38) Kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dapat ditentukan
27 dengan menambahkan pereaksi („pereaksi geser‟) ke dalam larutan cuplikan dan mengamati pergeseran puncak serapan yang terjadi. Secara tidak langsung cara ini berguna untuk menentukan kedudukan gula atau metil yang terikat pada salah satu gugus hidroksil fenol. Pereaksi-pereaksi yang biasa digunakan sebagai pereaksi geser antara lain Natrium metoksida (NaOMe), Natrium asetat (NaOAc), Alumunium klorida(AlCl3), Asam klorida (HCl) serta Asam borat (H3BO3). Kita tidak perlu menambahkan pereaksi geser ke dalam sel pembanding karena perbaikan spektrum yang diperoleh tidak sebanding dengan waktu yang diperlukan untuk melakukan hal itu. Tetapi cara ini mungkin bermanfaat jika jumlah flavonoid sedikit karena beberapa pereaksi geser itu sendiri terutama (NaOAc) terserap di daerah panjang gelombang rendah dan mungkin saja menurunkan daya pisah pita II dalam larutan cuplikan encer.
Dengan
pereaksi geser ini, maka akan menghasilkan perubahan spektrum dari spektrum awal. Penafsiran perubahan didasarkan pada jenis flavonoid. Spektrum NaOMe merupakan spektrum flavonoid yang gugus hidroksil fenolnya sampai batas tertentu terionisasi. Karena itu spektrum ini biasanya merupakan petunjuk „sidik jari‟ pola hidroksilasi dan juga bermanfaat untuk mendeteksi gugus hidroksil yang lebih asam dan tidak tersubstitusi. Degradasi atau pengurangan kekuatan spektrum setelah waktu tertentu merupakan petunjuk baik akan adanya gugus yang peka terhadap basa. Spektrum NaOAc hnaya menyebabkan pengionan yang berarti pada gugus hidroksil flavonoid yang paling asam. Jadi natrium asetat ini digunakan terutama untuk mendeteksi adanya gugus 7-hidroksil bebas. Sedangkan spektrum NaOAc/H3BO3 menjembatani kedua gugus hidroksil pada gugus odihidroksi dan digunakan terutama untuk mendeteksinya. Spektrum AlCl3 dan AlCl3/HCl membentuk kompleks tahan asam antara gugus hidroksil dan keton yang bertetangga dan membentuk kompleks tak
28 tahan asam dengan gugus orto-dihidroksil, pereaksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi kedua gugus tersebut. Jadi spektrum AlCl3 merupakan penjumlahan pengaruh semua kompleks terhadap spektrum, sedangkan spektrum AlCl3/HCl hanya merupakan pengaruh kompleks hidroksi-keto. 2.11 Spektroskopi Inframerah(37, 36, 22) Spektroskopi Inframerah berkaitan dengan vibrasi molekul. Panjang gelombang sinar Inframerah lebih panjang dibandingkan dengan panjang gelombang sinar UV-Vis karena energi vibrasi lebih rendah dibandingkan energi elktronik yangberkaitan dengan spektroskopi UV-Vis. Besaran yang digunakan adalah bilangan gelombang (v) dengan satuan cm-1, yang merupakan kebalikan daripanjang gelombang (λ) yangmemiliki satuan µm. Spektrum
inframerah
senyawa
tumbuhan
dapat
diukur
dengan
spektrofotometri infra merah yang merekan secara otomatis dalam bentuk larutan, bentuk gerusan dalam minyak nuyol atau bentuk padat yang dicampur dengan kalium bromida. Jangka pengukuran mulai dari 4000 – 667 cm
-1
(atau 2,5 sampai 15 µm), dan perekaman spektrum memakan waktu
kira-kira tiga menit. Kenyataan yang menunjukkan bahwa banyak gugus fungsi dapat diidentifikasi dengan menggunakan frekuensi getaran khasnya mengakibatkan spektrofotometri IR merupakan cara paling sederhana dan paling sering terandalkan untuk menentukan golongan senyawa. Walaupun demikian, dalam fitokimia spektrum IR paling sering digunakan sebagai alat pembuat sidik jari untuk membandingkan cuplikan alam dengan cuplikan sintesis.
29
Gambar 2.5 Skema Alat dan Komponen Penyusunnya.(37) Skema Spetrometer IR yang ditunjukkan pada gambar terdiri dari : Sumber sinar berupa pemijar globar ataupun pemijar Nerst. Pemijar globar, berupa SiC2 (silikon karbida) yang dipijarkan pada suhu 1.200oC. Pemijar Nerst, berupa batang zirkonium dan ytrium oksida (ZrO2 + Y2O3) yang dipijarkan pada suhu 1.500oC. Monokromator yang digunakan dapat berupa grating (kisi difraksi) atau prisma yang dibuat dari bahan MaCl, KBr, CsBr (cesium bromida), atau LiF. Bahan-bahan ini sangat higroskopis. Fungsinya mengubah sinar polikromatis menjadi monokromatis. Chopper atau alat pencincang cahaya berupa cermin berputar yang akan menyebabkan detektor menerima berkas sinar bakudan berkas sinar cuplikan sevara bergantian, maka akan timbul arus bolak-balik dalam detektor yang selanjutnya akan diperkuat oleh amplifier. Detektor panas yang digunakan seperti termokopel, bolometer, sel Golay digunakan untuk mendeteksi sinar inframerah. Amplifier yang digunakan hanya untuk memperkuat arus bolak-balik Baji optik berfungsi untuk menurunkan intensitas sinar baku sehingga intensitasnya sama dengan intensitas sinar yang melewati cuplikan. Rekorder terdiri dari pena yang digerakan secara mekanik sesuai dengan gerakan baji optik. Gerakan pena menghasilkan gambar spektrum yang merupakan pita serapan dari senyawa yang dianalisis.
30 Spektrum inframerah suatu senyawa adalah grafik dari panjang gelombang atau frekuensi atau bilangn gelombang yang secara berkesinambungan berubah sepanjang suatu daerah sempit dari spektrum elektromagnetik, versus transmitan-persen atau absorban (A). Pita-pita infra merah dalam suatu spektrum dapat dikelompokan menurut intensitasnya, kuat (s), medium (m) dan lemah (w).
Banyaknya gugus identik dalam sebuah molekul akan
mengubah kuat relatif pita absorbansi dalam suatu spektrum infra merah. Faktor-faktor yang mempengaruhi perjodohan vibrasi: Perjodohan vibrasi Ikatan hidrogen Efek listrik Sudut ikatan Efek medan Informasi tentang vibrasi molekul dapat diperoleh dengan cara : Menentukan spektru inframerahnya (cara langsung) Dengan cara ini akan diperoleh frekuensi dalam spektrum yang sama dengan frekuensi vibrasi dalam molekul Menentukan spektrum Raman-nya (tidak langsung) Dari spektrum inframerah, jika vibrasi gugus fungsi diketahui, gugus fungsi akan diketahui. Informasi ini dapat digunakan untuk diidentifikasi jenis senyawa.
Untuk sampel berbentuk cair dapat diletakan diantara dua lempeng NaCl dengan konsentrasi 1-5%, sedangkan untuk sampel berbentuk padat dapat diletakan dalam kisi KBr pelet ataupun Nujol Mull. Untuk pembuatan KBr pelet, cuplikan dicampur dengan KBr dengan konsentrasi cuplikan 0,1 – 2 % berat campuran, kemudian digerus dalam mortat agat dan dipres sehingga dihasilkan lempeng yang transparan menunjukkan bahwa lempeng ini tidak menjebak udara. Untuk pembuatan Nujol Mul, cuplikan dicampur dengan Nujol (hidrokarbon fraksi berat seperti lilin), digerus sehingga dihasilkan
31
pasta (Mull). Pasta dipindahkan ke lempeng NaCl, ditutup dengan lempeng NaCl, kemudian ditekan dengan pres hidrolik sehingga dihasilkan lapisan tipis. Apabila cuplikan cair berasal dari padatan yang dilarutkan, pelarut harus dipilih dengan kriteria yang tidak boleh melarutkan sel NaCl, seperti misalnya H2O, tidak boleh yang mempunyai spektrum inframerah yang rumit seperti alkohol karena sangat mengganggu dalam pembacaan spektrum. Contoh pelarut yang baik adalah CCl4, CS2, dan kalau terpaksa CHCl3. Kristal NaCl bersifat transparan terhadap sinar inframerah. Spektrum inframerah mempunyai banyak serapan yang berhubungan dengan sistem vibrasi yang berinteaksi di dalam suatu molekul. Daerah serapan pada bilangan gelombang 900-1400 cm
-1
yang mempunyai sejumlah vibrasi yang
tidak dapat dimengerti tersebut dikenal dengan daerah sidik jari. Jadi, untuk molekul yang tidak diketahui dapat diidentifikasi dengan membandingkan spektrumnya dengan spektrum senyawa standar. Dalam aplikasinya, pita serapan diamati beberapa nilai bilangan gelomban, kemudian dicari pada tabel korelasi sehingga dapat diketahui pita serapan dari gugus gugus apa. Dalam keadaan tertentu, tidak dapat mengandalkan satu jenis pektrum saja. Biasanya digunakan beberapak spektrum untuk elusidasi struktur suatu senyawa.
BAB III METODE PENELITIAN
Penelitian ini melibatkan beberapa proses dan tahapan berturut-turut mulai dari penyiapan simplisia, pemeriksaan karakteristik simplisia, penapisan fitokimia, pembuatan ekstrak, fraksinasi, penapisan fitokimia ekstrak dan fraksi, penapisan aktivitas penangkapan radikal bebas, uji aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi serta isolasi dan identifikasi isolat. Tahap penyiapan simplisia meliputi pengumpulan simplisia daun kersen (Muntingia calabura L), pembersihan, perajangan, dan pengeringan. Bahan tanaman diperoleh dari kebun desa Cikahuripan kecamatan lembang Bandung Barat) dan determinasi dilakukan di Herbarium Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati,
Institut
Teknologi
Bandung.
Selanjutnya
dilakukan
pencucian,
pengeringan, dan penggilingan simplisia, sehingga diperoleh serbuk kering simplisia yang siap untuk diekstraksi.
Pemeriksaan
karakteristik
simplisia
meliputi
pemeriksaan
makroskopik,
mikroskopik, penentuan kadar abu total, penentuan kadar abu larut air, penentuan kadar abu tidak larut asam, penetapan kadar air simplisia, penetapan kadar sari larut air, penetapan kadar sari larut air simplisia yang dilakukan sesuai dengan standar.
Penapisan fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan kandungan alkaloid, kuinon, polifenol, tanin, flavonoid, saponin, monoterpenoid-seskuiterpenoid, steroid-triterpenoid. Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi. Maserasi menggunakan maserator dengan pelarut metanol:air (9:1) selama 6-12 jam. Setelah disaring, residu di maserasi kembali dengan metanol:air (1:1) (2-3 kali maserasi). Dilakukan pemantauan kandungan senyawa dalam filtrat dengan metode penapisan fitokimia. Maserat pertama dan kedua digabungkan kemudian diuapkan
32
33 bersamaan (dipekatkan) dengan rotavapor hingga diperoleh ekstrak pekat dan dilanjutkan dengan penguapan diatas tangas air (water bath) sampai hampir seluruh metanol menguap sehingga diperoleh ekstrak kental .
Ekstrak kemudian difraksinasi dengan metode ekstraksi cair-cair dengan pelarut n-heksana, etil asetat dan air sehingga diperoleh fraksi air, fraksi etil asetat, dan fraksi n-heksana. Tiap fraksi yang diperoleh kemudian dikentalkan kembali dengan menguapkan pelarut.
Penapisan fitokimia ekstrak dan fraksi dilakukan seperti penapisan fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan kandungan alkaloid, kuinon, polifenol, tanin, flavonoid, saponin, monoterpenoid-seskuiterpenoid, steroid-triterpenoid.
Uji kualitatif aktivitas antioksidan pada ekstrak dan fraksi dilakukan dengan prinsip metode dinamolisa. Sampel (ekstrak dan fraksi) yang kental diencerkan telebih dahulu dimasukkan ke dalam cawan petri, selanjutnya diberi sumbu agar fraksi atau ekstrak yang telah diencerkan akan bergerak naik. Dibiarkan mengembang membentuk lingkaran sampai kertas saring kering. Kemudian disemprotkan pereaksi DPPH 0,1% b/v.
Uji kuantitatif aktivitas antioksidan pada ekstrak dan fraksi ditentukan secara spektrofotometri UV-Visible pada panjang gelombang maksimum (λmax) 515,5 – 517 nm dengan menentukan nilai EC50 yaitu konsentrasi bahan uji yang dapat menurunkan intensitas radikal DPPH sebesar 50%. Harga EC50 diperoleh dari perhitungan regresi linier dari kurva Perbandingan antara konsentrasi sampel uji terhadap besarnya peredaman radikal bebeas DPPH. Sebagai pembanding digunakan larutan kuersetin dalam metanol.
Rangkaian isolasi dimulai dari Kromatografi Kolom Gravitasi untuk fraksi yang memiliki nilai EC50 paling kecil. Kromatografi Kolom Gravitasi mengggunakan eluen bergradien dimulai dari campuran n-heksana-etilasetat (100:0) hingga n-
34 heksana-etilasetat (0:100) dilanjutkan dengan eluen etil asetat:metanol (100:0) sampai etil asetat:metanol (0:100).
Kemudian hasil yang diperoleh dipantau
dengan kromatografi lapis tipis dan penyemprotan DPPH 0,2% dalam metanol. Subfraksi yang dipilih kemudian dimurnikan dengan kromatografi preparatif. Lalu isolat diuji kemurniannya dengan kromatografi lapis tipis dua dimensi. Isolat murni dikarakterisasi secara kromatografi lapis tipis dengan penyemprotan larutan DPPH 0,2% dalam metanol serta menggunakan pereaksi semprot lainnya. Isolat yang diperoleh diuji kemurniannya dengan Kromatografi Lapis Tipis 2 Dimensi menggunakan 2 macam eluen baik tunggal ataupun campuran. Setelah didapat suatu isolat murni, selanjutnya di identifikasi menggunakan Spektrofotometri UV-Sinar tampak serta Spektrofotometri Infra Merah.
BAB IV ALAT DAN BAHAN
3.1 Alat Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroskop (BN 170), kaca objek dan penutup, mortir dan stemper, blender, alat penetapan kadar air, bejana kromatografi, pipa kapiler, penggaris, penggiling, cawan penguap, termometer, krus porselin, oven (Memmert), timbangan analitik (Sartorius BL 210 S), pelat tetes, vial, batang pengaduk, pipet tetes, pipet volume, piknometer, corong pisah, peralatan laboratorium, kolom gravitasi, gelas kimia, tanur (NaberthermGermany), desikator, botol semprot, penyemprot pereaksi, labu ukur, rotavapor (Boeco), spektrofotometri UV-Visible (UV 1700 Pharmasec Shimadzu), spektrofotometri Infra Merah (Shimadzu IRAfinity-1) 3.2 Bahan Penelitian Bahan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Kersen yang diperoleh dari perkebunan Manoko-Lembang, bahan-bahan kimia dan berbagai jenis pelarut organik seperti metanol 80%, n-heksana, toluena P, kloralhidrat, ammonia, kloroform, n-butanol, asam asetat, etil asetat, asam klorida, amil alkohol, besi(III)klorida, eter, aseton, pereaksi Dragendorff (mengandung bismuth subnitrat dan raksa(II)klorida), Libermann-Burchard (mengandung asam asetat anhidrat dengan asam sulfat pekat), Mayer (mengandung kalium iodida dan raksa (II) klorida), serbuk magnesium, asam klorida 2N, KOH, larutan gelatin 1%, pereaksi DPPH, baku pembanding kuersetin, lempeng silika gel GF254, silika gel GF60, kertas saring, kertas saring bebas abu, alumunium foil, pelet KBr.
35
BAB V HASIL PENELITIAN 5.1. Penyiapan Simplisia Pada penelitian ini digunakan daun kersen sebagai bagian tanaman yang akan diteliti. Daun kersen diambil dari kebun di daerah Desa Cikahuripan Kecamatan Lembang Bandung Barat. Determinasi dilakukan di Herbarium Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung (ITB). Hasil determinasi menunjukkan bahwa tumbuhan yang digunakan sebagai bahan baku simplisia adalah Muntingia calabura L. Pengumpulan simplisia dilakukan pada bulan Desember tahun 2011 sebanyak 1 Kg, kemudian dicuci dengan air bersih yang mengalir dan dibersihkan dari pengotor seperti debu, serta bagian lain yang tidak dibutuhkan, selanjutnya bahan dikeringkan dibawah sinar matahari tidak langsung, agar zat yang tidak tahan panas tidak rusak. Simplisia kering yang dihasilkan kemudian dihaluskan dan disimpan dalam wadah yang bersih dan tertutup rapat. Gambar tanaman dan simplisia daun kersen dapat dilihat pada Lampiran 1, Gambar V.1, V.2. Hasil determinasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 2, Gambar V.3. 5.2. Penetapan Parameter Mutu Simplisia Penetapan parameter mutu simplisia dilakukan menurut metode yang terdapat dalam Materia Medika Indonesia yang meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik serbuk simplisia, penetapan kadar air simplisia, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut asam dan larut air, penetapan kadar sari larut etanol dan larut air. Hasilnya dapat dilihat pada Lampiran 3, Tabel V.1, Tabel V.2
5.2.1 Pemeriksaan Makroskopik Pemeriksaan makroskopik dilakukan pada daun kersen yang masih segar dan simplisia daun meliputi pemeriksaan bentuk, warna, bau, dan rasa. Hasil penelitian dapat dilihat pada Lampiran 3, Tabel V.1.
36
37
5.2.2 Pemeriksaan Mikroskopik Serbuk Simplisia Pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia dilakukan pada serbuk simplisia daun kersen yang menunjukkan beberapa fragmen yang dapat dilihat pada Lampiran 3, Gambar V.5, V.6, V.7 dan V.8
5.2.3 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia i) Pemeriksaan Kadar Abu Total Sejumlah 2 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam krus silika atau krus platina yang telah dipijarkan dan ditara, lalu serbuk diratakan. Krus dipijarkan perlahanlahan hingga suhu 500-600oC hingga arang habis, didinginkan dan ditimbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat hilang, ditambahkan air panas, disaring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa kertas dan kertas saring dalam krus yang sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, diuapkan. Dipijarkan kemudian ditimbang hingga bobot tetap. Dihitung kadar abu dalam persen terhadap simplisia yang telah dikeringkan diudara. Kadar abu total rata-rata yaitu 7,55% Hasil penelitian dapat dilihat pada Lampiran 3 , Tabel V.2. ii) Penetapan Kadar Abu Larut Air Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total, dididihkan dengan 25 ml air panas selama 5 menit, disaring melalui penyaring kaca masir atau kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas, kemudian dipijar pada suhu lebih kurang 450oC, kemudian ditimbang hingga bobot tetap. Hitung kadar abu larut air dihitung dalam persen terhadap simplisia yang telah dikeringkan di udara. Kadar abu larut air yang diperoleh yaitu 5,335%. Hasil penelitian dapat dilihat pada Lampiran 3 , Tabel V.2. iii)Penetapan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total, dididihkan dengan 25 ml asam klorida pekat selama 5 menit, dikumpulkan bagian yang tidak larut dalam asam, disaring melalui krus kaca masir atau kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas, dipijar pada kompor selama
38
15 menit, kemudian pemijaran dilanjutkan pada oven dengan suhu kurang lebih 450oC hingga bobot tetap, kemudian ditimbang. Dihitung kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara. Kadar abu tidak larut asam ratarata yaitu 1,665%. Hasil penelitian dapat dilihat pada Lampiran 3 , Tabel V.2. iv) Penentuan Kadar Sari Larut Air Ditimbang 5 g simplisia, kemudian dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air kloroform LP menggunakan labu bersumbat sambil berkalikali dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Ekstrak disaring, kemudian diuapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Setelah itu residu dipanaskan pada suhu 105oC hingga bobot tetap. Kadar dihitung dalam persen senyawa yang larut dalam air, dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara. Kadar sari larut air rata-rata yaitu 5,335%. Hasil penelitian dapat dilihat pada Lampiran 3, Tabel V.2. v) Penentuan Kadar Sari Larut dalam Etanol Ditimbang 5 g simplisia, kemudian dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml etanol (95%) menggunakan labu bersumpat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Ekstrak disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol, kemudian diuapkan 25 ml filtrat hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Setelah itu residu dipanaskan pada suhu 105oC hingga bobot tetap. Kadar dihitung dalam persen senyawa yang larut dalam etanol (95%), dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara. Kadar sari larut etanol yang diperoleh rata-rata 15,17% Hasil penelitian dapat dilihat pada Lampiran 3 , Tabel V.2. vi) Penetapan Kadar Air dengan Cara Destilasi Dimasukkan serbuk simplisia yang ditimbang seksama sebanyak 5 g yang diperkirakan mengandung 2 – 4 mL air kedalam labu kering. Dimasukan lebih kurang 200 ml toluen P yang dijenuhkan dengan air ke dalam labu. Tabung pendingin dan tabung penerima yang sudah
39
dibersihkan dan dikeringkan, dihubungkan dengan labu, kemudian labu dipanaskan selama 15 menit dengan hati - hati. Setelah toluen mendidih, disuling dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes/detik, hingga sebagian
besar
air
tersuling.
Kemudian
dinaikkan
kecepatan
penyulingan hingga 4 tetes/detik. Setelah semua air tersuling, dicuci bagian dalam pendingin dengan toluen, sambil dibersihkan dengan sikat tabung yang disambung pada sebuah kawat tembaga dan telah dibasahi dengan toluen. Dilanjutkan penyulingan selama 5 menit. Tabung penerima dibiarkan hingga suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca. Jika ada tetesan air yang melekat pada dinding tabung penerima, digosok dengan karet yang diikat pada sebuah kawat tembaga dan dibasahi dengan toluen hingga tetesan air turun. Kadar air dihitung terhadap bahan awal dalam % v/b. Kadar air simplisia daun kersen yang didapat rata-rata sebesar 8,88%. Hasil penelitian dapat dilihat pada Lampiran 3 , Tabel V.2. 5.3. Penapisan Fitokimia Simplisia Penapisan fitokimia serbuk meliputi pemeriksaan golongan senyawa alkaloid, polifenol, tanin, flavonoid, monoterpen dan seskuiterpen, steroid dan triterpenoid, kuinon, saponin. Hasil penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 , Gambar V.9 – V.13 dan Tabel V.3 . 5.4. Ekstraksi Ekstraksi dilakukan terhadap 500 gram serbuk simplisia daun Kersen dengan cara maserasi menggunakan pelarut campur metanol-air sebanyak 20 liter. Filtrat remaserasi yang ketujuh di pantau dengan skrining menggunakan FeCl3 untuk melihat apakah masih tersisa senyawa fenol serta dilihat bagaimana kandungan flavonoidnya menggunakan cara skrining flavonoid pada umunya. Ekstrak pekat yang diperoleh diuapkan menggunakan tangas air pada suhu 50-70oC sehingga diperoleh ekstrak kental sebanyak 97,9 gram dengan rendemen 20,915% b/b. Diagram alir ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran 6, Gambar V.21
40 5.5. Fraksinasi dan Pemantauan Fraksi Fraksinasi ekstrak dilakukan dengan metode ekstraksi cair-cair (ECC) menggunakan pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda dan tidak saling bercampur. Sebanyak 14,17 gram ekstrak kental dilarutkan dalam air dan diekstraksi cair-cair dengan pelarut n-heksana (1:1) sampai terekstraksi sempurna dan diperoleh lapisan air dan lapisan
n-heksana. Lapisan air
difraksinasi kembali dengan pelarut etil asetat (1:1) sampai terekstraksi sempurna dan menghasilkan lapisan air dan lapisan etil asetat. Setelah itu lapisan air, lapisan n-heksana dan lapisan etil asetat yang terkumpul dipekatkan dengan rotary evaporator dan diuapkan diatas penangas air, sehingga diperoleh 4,817 gram fraksi air-metanol dengan rendemen 34% b/b, 2,349 gram fraksi n-heksana dengan rendemen 16,579% b/b, dan 6,986 gram fraksi etil asetat dengan rendemen 49,301% b/b. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Lampiran 6, Gambar. V.21 – V.22. 5.6 Uji Kualitatif dan Kuantitatif Aktivitas Antioksidan Peredaman radikal bebas oleh ekstrak dan fraksi dilakukan dengan prinsip metode dinamolisa menggunakan pereaksi DPPH 0,1% b/v. Ektrak dan fraksi yang bersifat peredam radikal bebas akan menunjukkan bercak kuning dengan latar ungu. Hasil peredaman pada ekstrak dan fraksi-fraksi dapat dilihat pada Lampiran 5, Gambar V.14, Tabel V.4
Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan pereaksi DPPH terhadap ektrak kental metanol-air dan fraksi-fraksi. Pengukuran secara kuantitaif dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometri UVVisible dengan mengukur penurunan serapan DPPH yang sudah direaksikan dengan bahan uji (ekstrak dan fraksi) dengan berbagai konsentrasi pada panjang gelombang maksimal 515,5 nm - 517 nm.
Daya antioksidan
dinyatakan dengan nilai EC50 yang menyatakan nilai konsentrasi efektif larutan uji yang diperlukan untuk menurunkan 50% intensitas serapan larutan pereaksi. Nilai EC50 ini dihitung dari persamaan regresi linier antara konsentrasi larutan uji terhadap persen peredaman yang lainya berbanding
41
lurus. Sehingga semakin besar konsentrasi uji maka persen peredamannya pun semakin tinggi. Dari hasil uji aktivitas antioksidan pada ekstrak dan fraksi-fraksi, diperoleh EC50 ekstrak daun kersen, fraksi n-heksana, fraksi air, dan fraksi etil asetat berturut-turut sebesar
4,252µg/mL, 12,132µg/mL,
11,12µg/mL, 2,807µg/mL. Spektrum DPPH serta kurva peredaman dapat dilihat pada Lampiran 5, Tabel V.5 – V. 8 Gambar. V. 15 – V. 19. Sebagai pembanding digunakan kuersetin. Kurva peredaman Kuersetin terhadap DPPH dapat dilihat di Lampiran 5, Tabel V. 9, Gambar. V. 20. 5.7 Isolasi Dari hasil uji kuantitatif tersebut diatas, maka fraksi yang selanjutnya akan diisolasi adalah fraksi etil asetat.
Fraksi etil asetat selanjutnya dipantau
menggunakan kromatografi lapis tipis menggunakan pengembang etil asetat : n-butanol : asam format dengan perbandingan 7:1:2. Hasil pemantauan tersebut menunjukkan bahwa terdapat dua bercak floresensi hijau dengan Rf 0,7 dan 0,8. Hasil dapat dilihat pada Lampiran 7 , Gambar V.23
Setelah dilakukan pemantauan fraksi dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis, dilanjutkan pemisahan kromatografi kolom pada fraksi etil asetat dengan fase gerak n-heksana:etil asetat:metanol secara gradasi dimulai dari campuran n-heksana:etil asetat (100:0), etil asetat:metanol (100:0) sampai etil asetat:metanol (0:100).
Diagram alir pemisahan fraksi etil asetat serta
komposisi eluen dapat dilihat pada Lamporan 8, Gambar V.24 dan Tabel V.11. Fraksi-fraksi tersebut dipantau dengan KLT menggunakan pelat silika gel GF254 dan pengembang etil asetat : n-butanol : asam format (7:1:2). Dari fraksi-fraksi yang diperoleh, fraksi ke 18 – 24 dengan perbandingan eluen etil asetat : metanol 8:2 diambil untuk kemudian dilakukan kromatografi preparatif, dibawah sinar UV 366 nm
dengan Rf 0,7; 0,8 dan memiliki
aktivitas antioksidan. Hasil dapat dilihat pada Lampiran 9, Gambar V.25.
42
Fraksi yang diperoleh digabungkan dan dipekatkan. kemudian dipantau kembali dengan Kromatografi Lapis Tipis. Dari hasil KLT terlihat secara visual tidak terdapat bercak warna apapun. Setelah diberikan pereaksi semprot seperti FeCl3maka terdapat bercak warna hitam secara visual, sedangkan dengan pereaksi semprot AlCl3 terjadi perubahan warna spot dibawah sinar UV 366 nm yaitu dari hijau menjadi hijau terang . Sedangkan setelah diuapi uap amonia maka terlihat perubahan warna spot dari hijau menjadi hijau kekuningan. Hasil dapat dilihat pada Lampiran 9, Gambar V.26.
Setelah dipantau dengan Kromatografi Lapis Tipis, kemudian dilakukan pemisahan dengan metode Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) pada pelat kaca silika gel GF254 dengan pengembang pengembang etil asetat : nbutanol : asam format dengan perbandingan 7:1:2. Hasil dapat dilihat pada Lampiran 10 Gambar V.27
Kemudian isolat yang didapat dipantau menggunakan pereaksi semprot seperti FeCl3, Vanilin HCl, AlCl3, serta DPPH 0,2%. Secara visual, hasil menyatakan bahwa isolat tersebut memiliki daya antioksidan, setelah disemprot dengan FeCl3 terlihat bercak warna hitam sedangkan setelah diberi Vanilin HCl terlihat warna lembayung. Dibawah sinar UV 366 nm setelah diberi pereaksi semprot AlCl3 terlihat perubahan dari warna hijau menjadi kuning, kemudian setelah diuapii uap amonia terjadi perubahan warna spot dari hijau menjadi hijau terang.
Hasil dapat dilihat pada Lampiran 11,
Gambar V.28.
Pada pengujian kemurnian dengan KLT 2 dimensi, pengembang pertama yang digunakan yaitu etil asetat : n-butanol (3:1) Rf 0,4 serta etil asetat : asam format (1:1) Rf 0,37. Diperoleh satu bercak berwarna biru pada daerah UV 366 nm. Hasil dapat dilihat pada Lampiran 12, Gambar V.29. Terdapat satu spot dengan flouresensi warna hijau, hasil dapat dilihat pada Lampiran 12, Gambar V.30.
43
Pada identifikasi isolat menggunakan Spektrofotometri UV-Visible, didapat spektrum dengan panjang gelombang 275 nm pada pita I dan 224,8 nm pada pita II. Profil spektrum dapat dilihat pada Lampiran 13, Gambar V.31 dan Tabel V.12.
Untuk mengetahui keberadaan gugus hidroksi pada struktur flavonoid, ke dalam larutan ditambahkan pereaksi geser seperti natrium hidroksida, alumunium(III)klorida, alumunium(III)klorida – asam klorida, natrium asetat dan natrium asetat – asam borat. Pereaksi geser yang pertama adalah natrium hidroksida, pereaksi geser kedua adalah alumunium(III)klorida, selanjutnya ditambahkan asam klorida dan pereaksi geser ketiga adalah natrium asetat anhidrat, selanjutnya ditambahkan asam borat. Profil spektrum dapat dilihat pada Lampiran 13, Gambar V.32 sampai Gambar V.36 dengan interpretasi pergeseran dapat dilihat pada tabel V.13 sampai dengan V.17.
Instrumen selanjutnya yang digunakan yaitu Spektrofotometri Infra Merah, menunjukkan adanya gugus – gugus fungsi pada isolat tersebut. Hasilnya dapat dilihat pada Lampiran 14, Gambar V.37 dengan interpretasi bilangam gelombang pada Tabel V.18.
BAB VI PEMBAHASAN
Determinasi tumbuhan dilakukan untuk membuktikan kebenaran identitas dari suatu tumbuhan. Pada penelitian ini digunakan daun kersen sebagai bagian tanaman yang akan diteliti. Daun kersen diambil dari kebun di daerah Desa Cikahuripan Kecamatan Lembang Bandung Barat. Determinasi dilakukan di Herbarium Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung (ITB). Hasil determinasi menunjukkan bahwa tumbuhan yang digunakan sebagai bahan baku simplisia adalah Muntingia calabura L.
Pada pemeriksaan makroskopis, daun kersen apabila disentuh akan terasa kesat. Baunya aromatis memberikan rasa hangat. Terdapat rambut halus pada daun. Sedangkan pada pemeriksaan mikroskopis, terdapat stomata tipe anisosit, epidermis, rambut penutup tipe bintang serta fragmen trakea bernoktah.
Kadar abu dilakukan untuk mengetahui kandungan mineral yang terdapat dalam simplisia. Kadar abu tidak larut asam menunjukkan banyaknya abu non fisiologis yang bukan berasal dari simplisia seperti pasir dan silika yang mencemari simplisia. Kadar abu larut air menunjukkan jumlah abu fisiologis seperti alkali dan alkali tanah yang terdapat dalam simplisia. Sampai saat ini belum ada acuan spesifik pada pustaka tentang persentasi kadar abu tanaman kersen. Hasil yang diperoleh menunjukkan, persentasi kadar abu total simplisia kersen adalah 7,55 ±0,1%
kadar abu larut air 2,165 ±0,135 dan kadar abu tak larut asam 1,66 ±0,233. Jumlah kadar abu tak larut asam ini dapat diakibatkan dari pencemar misalnya debu yang berasal dari tempat pengambilan daun ataupun dari cara pengeringan yang mungkin mempengaruhi hasil tersebut.
Selanjutnya untuk penetapan kadar sari larut etanol dan larut air. Terlihat perbedaan yang sedikit antara kadar sari larut air dan etanol. Kadar sari larut etanol sebesar
15,17 ±0,8% sedangkan kadar sari larut air sebesar 13,386
±0,244%. Itu artinya terdapat banyak senyawa-senyawa yang tertarik ke dalam
44
45
pelarut etanol yang bersifat kurang polar daripada air. Air akan menarik senyawasenyawa yang bersifat polar.
Untuk kadar air, diperoleh hasil sebesar 8,88 ±1,213%. Ini dilakukan untuk melihat kualitas dari simplisia yang digunakan. Kadar air yang ada tidak lebih dari 10%, karena jika lebih dari 10% maka simplisia akan mudah rusak karena air akan memicu terjadinya pertumbuhan mikroba serta reaksi-reaksi kimia yang disebabkan karena kelembapan misalnya reaksi enzimatis ataupun hidrolisis.
Hasil penapisan fitokimia dilakukan terhadap simplisia daun kersen, ekstrak kental serta fraksi hasil ekstraksi cair-cair. Tujuan dilakukan penapisan fitokimia yaitu untuk mendeteksi senyawa metabolit sekunder yang positif terkandung didalam simplisia. Pada simplisia daun kersen hasil penapisan fitokimia positif mengandung polifenol, tanin, flavonoid, monoterpenoid-seskuiterpenoid, steroidtriterpenoid, dan saponin. Pada ekstrak daun kersen, hasil penapisan fitokimia positif
alkaloid,
polifenol,
kuinon,
tanin,
flavonoid,
monoterpenoid-
seskuiterpenoid, steroid-triterpenoid, dan saponin. Sedangkan pada fraksi air positif mengandung alkaloid, polifenol, tanin, flavonoid, dan saponin. Kemudian pada
fraksi
n-heksana
hasil
positif
mengandung
polifenol,
flavonoid,
monoterpenoid-seskuiterpenoid serta steroid-triterpenoid. Untuk fraksi etil asetat menunjukkan
hasil
positif
untuk
polifenol,
kuinon,
flavonoid
serta
monoterpenoid-seskuiterpenoid. Dengan diperolehnya data dari penapisan fitokimia ini dapat mendukung dugaan mengenai efek farmakologi yang mungkin terjadi.
Untuk mengetahui senyawa metabolit sekunder golongan alkaloid, pertama-tama simplisia, ekstrak serta fraksi-fraksi diekstraksi terlebih dahulu dengan kloroform pada suasana amonia. Penambahan amonia ini bertujuan untuk membasakan sehingga pH naik. Tumbuhan yang memiliki senyawa alkaloid yang bersifat basa biasanya terdapat di dalam sel tumbuhan dalam bentuk garam yang tak larut pelarut organik, dengan suasana basa pada penambahan amonia alkaloid ini akan kembali kebentuk basanya yang dapat larut dalam pelarut organik misalnya
46
kloroform. Kemudian ekstrak dalam kloroform dibuat asam dengan HCl 2N. Pada suasana asam, alkaloid akan kembali kebentuk garamnya lebih tertarik kedalam fasa air. Karena pada kondisi terjadi penggaraman pada senyawa golongan alkaloid yang menyebabkan sifatnya lebih larut dalam air. Fase asam yang diperoleh dipisahkan dan diuji dengan pereaksi Mayer dan Dragendorff. Komponen yang positif alkaloid akan memberikan endapan putih dengan penambahan pereaksi Mayer dan akan menimbulkan endapan jingga-coklat pada penambahan pereasi Dragendorff. Hal ini disebabkan terjadinya pembentukan kompleks yang tidak larut. Hasil positif didapat dari ekstrak kental daun kersen serta fraksi air daun kersen. Terdapat endapan saat diberi pereaksi Dragendorff. Endapan tersebut merupakan kompleks kalium alkaloid. Prinsip dari metode analisis ini adalah reaksi pengendapan yang terjadi karena adanya penggantian ligan. Atom nitrogen yang mempunyai pasangan elektron bebas pada alkaloid dapat mengganti ion iod dalam pereaksi Dragendorff maupun Mayer. Pereaksi Dragendorff mengandung bismut nitrat dan kalium iodida dalam larutan asam asetat glasial [kalium tetraiodobismutat (III)]. Metode ini memiliki kelemahan yakni pereaksi-pereaksi tersebut tidak saja dapat mengendapkan alkaloid tetapi juga dapat mengendapkan beberapa jenis senyawa antara lain, protein, kumarin, α-piron, hidroksi flavon, dan tanin. Reaksi tersebut dikenal dengan istilah "falsepositive". (43)
Golongan tanin akan menghasilkan endapan putih jika ditambah gelatin. Oleh sebab itu dapat terjadi kemungkinan bahwa hasil positif juga dapat diberikan oleh senyawa fenolik lain dalam sampel. Secara umum daun kersen memiliki senyawa tanin. Itu sebabnya rasa daun kersen kesat. Hasil penapisan senyawa tanin yang negatif hanya terjadi pada fraksi n-heksana. Karena tanin sendiri bersifat polar, sehingga kemungkinan tidak akan terdapat pada fraksi n-heksana.
Untuk penapisan senyawa polifenol. Semua fraksi, ekstrak serta simplisia menunjukkan hasil yang positif. Diperkirakan FeC13 bereaksi dengan salah satu gugus hidroksil yang ada pada senyawa-senyawa tersebut. Hasil reaksi itulah yang
47
akhirnya menimbulkan warna. Pereaksi FeCI3 digunakan secara luas untuk mengidentifikasi senyawa fenol.
Golongan flavonid dideteksi dengan adanya warna kuning hingga merah yang dapat ditarik oleh amil alkohol yang sebelumnya sampel direaksikan terlebih dahulu dengan serbuk Mg dalam suasana asam dan dipanaskan. Serbuk Mg dan HCl akan bereaksi membentuk gas H2. Warna merah yang dihasilkan menandakan adanya flavonoid akibat dari reduksi pada gugus hidroksil oleh asam klorida pekat dan magnesium. (44)
Adanya senyawa monoterpenoid-seskuiterpenoid ditunjukan dengan terjadinya perubahan warna hijau ungu setelah penambahan larutan pereaksi vanilin 10% dalam asam sulfat. Kedua senyawa ini merupakan komponen penyusun minyak atsiri.
Saponin memiliki glikosil yang berfungsi sebagai gugus polar dan gugus steroid dan triterpenoid sebagai gugus nonpolar. Senyawa yang memiliki gugus polar dan nonpolar bersifat aktif permukaan sehingga saat dikocok dengan air saponin dapat membentuk misel. Pada struktur misel gugus polar menghadap ke luar sedangkan gugus nonpolarnya menghadap ke dalam. Keadaan inilah yang tampak seperti busa, karena itu dalam analisis ini dilihat kemampuan sampel dalam membentuk busa.
Untuk proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi menggunakan pelarut campur metanol-air. Alasan menggunakan pelarut campur ini
dikarenakan
adanya
penelitian
yang
menyebutkan
bahwa
dengan
menggunakan pelarut campuran yang mengandung air mempengaruhi jumlah EC50 menjadi semakin kecil
yang artinya menunjukkan kemampuan daya
antioksidan yang makin tinggi.(41)
Fraksinasi dilakukan bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak berdasarkan tingkat polaritasnya. Fraksinasi yang
48
dilakukan yaitu menerapkan prinsip distribusi senyawa dalam dua pelarut yang berbeda tingkat polaritasnya yang tidak saling bercampur. Fraksinasi ini menggunakan tiga pelarut diantaranya pelarut polar yaitu air, pelarut semipolar yaitu etil asetat, dan pelarut nonpolar yaitu n-heksana. Dari hasil fraksinasi ini diharapkan senyawa-senyawa metabolit dalam ekstrak dapat terpisah sesuai tingkat polaritasnya sehingga diperoleh senyawa metabolit yang polar, semipolar, dan nonpolar. Pembahasan tentang hasil penapisan fitokimia untuk fraksi telah dijelaskan di atas.
Ekstrak kental metanol-air yang dihasilkan mempunyai rendemen 19,58 ±1,887 % b/b. Ekstrak kental sebanyak 14,17 diekstraksi cair-cair lalu diperoleh rendemen etil asetat 6,985 gram, fraksi n-heksana 2,349 gram dan fraksi air 4,817 gram. Dari hasil perhitungan rendemen menunjukkan bahwa zat lebih banyak yang terambil pada fraksi etil asetat, hal itu menunjukkan bahwa senyawa yang tertarik pada proses fraksinasi adalah senyawa-senyawa yang bersifat polar dan semipolar.
Peredaman radikal bebas oleh ekstrak dan fraksi secara kualitatif dilakukan dengan prinsip metode dinamolisa. Yaitu sampel (ekstrak dan fraksi) yang kental diencerkan telebih dahulu dimasukkan ke dalam cawan petri, selanjutnya diberi sumbu agar fraksi atau ekstrak yang telah diencerkan akan bergerak naik. Dibiarkan mengembang membentuk lingkaran sampai kertas saring kering. Kemudian disemprotkan pereaksi DPPH 0,1% b/v. Ektrak dan fraksi yang bersifat peredam radikal bebas akan menunjukkan bercak kuning dengan latar belakang ungu. Dengan metode seperti ini dapat diamati dengan jelas perubahan warna hasil reaksi antara radikal DPPH dengan sampel uji yang terjadi. Semua fraksi serta ekstrak memiliki daya peredaman secara kualitatif. Perubahan warna ini terjadi karena adanya reaksi antara radikal DPPH sebagai akseptor proton dengan senyawa yang bersifat antoksidan sebagai donor proton. Reaksi ini mengakibatkan perubahan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) yang berwarna ungu menjadi 1,1difenil-2-pikrilhidrazin (DPPH-H) yang berwarna kuning.
49
Pengujian aktivitas antioksidan secara kuantitatif dilakukan dengan menggunakan metode DPPH terhadap ekstrak kental metanol-air dan fraksi-fraksi. Pengukuran secara kuantitaif dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometri UVVisible dengan mengukur penurunan serapan DPPH yang sudah direaksikan dengan bahan uji (ekstrak dan fraksi) berbagai konsentrasi pada panjang gelombang maksimal 515,5 nm - 517 nm. Perubahan warna terjadi dengan adanya pergeseran panjang gelombang maksimum dari 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) λmax = 515,5-517 nm menjadi 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin (DPPH-H) λmax = 330 nm. Daya antioksidan dinyatakan dengan nilai EC50 yang menyatakan nilai konsentrasi efektif larutan uji yang diperlukan untuk menurunkan 50% intensitas serapan larutan pereaksi. Nilai EC50 ini dihitung dari persamaan regresi linier antara konsentrasi larutan uji terhadap persen peredaman. Semakin besar konsentrasi uji maka persen peredamannya pun semakin tinggi.
Dari hasil uji aktivitas antioksidan pada ekstrak dan fraksi-fraksi, diperoleh EC50 ekstrak daun kersen, fraksi n-heksana, fraksi air, dan fraksi etil asetat berturutturut sebesar
4,252µg/mL, 12,132µg/mL, 11,12µg/mL, 2,807µg/mL. Data
tersebut menunjukan bahwa fraksi etil asetat daun kersen memiliki daya antioksidan paling kuat dengan nilai EC50 sebesar 2,807µg/mL. Hal ini menunjukan dalam fraksi ini lebih banyak terkandung senyawa antioksidan. Bisa dikatakan bahwa daun kersen memiliki daya aktivitas antioksidan yang sangat kuat.
Ini berarti, banyak senyawa-senyawa yang bersifat antioksidan yang
terekstrak pada pelarut etil asetat. Senyawa tersebut dapat bersifar polar dan semi polar.
Sebagai
pembanding
digunakan
kuersetin.
Pemilihan
kuersetin
sebagai
pembanding didasarkan karena bahan yang akan diuji adalah senyawa metabolit sekunder dari tumbuhan, maka dipilih pula senyawa isolat tumbuhan sebagai pembanding. Alasan lain menggunakan kuersetin sebagai pembanding yaitu karena komponen trebesar yang terkandung pada daun kersen adalah flavonoid, maka dipilih kuersetin yang juga merupakan golongan flavonoid.
50
Dari hasil uji kuantitatif tersebut diatas, maka fraksi yang selanjutnya akan diisolasi adalah fraksi etil asetat. Langkah-langkah isolasi fraksi tersebut antara lain dengan metode kromatografi kolom gravitasi dengan eluen bergradien serta kromatografi preparatif.
Fraksi etil asetat selanjutnya dipantau menggunakan kromatografi lapis tipis menggunakan pengembang etil asetat : n-butanol: asam format dengan perbandingan 7:1:2. Hasil pemantauan tersebut menunjukkan bahwa terdapat dua bercak flouresensi biru dengan Rf 0,7 dan 0,8.
Setelah dilakukan pemantauan fraksi dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis, dilanjutkan pemisahan dengan kromatografi preparatif pada fraksi etil asetat dengan fase gerak bergradien menggunakan n-heksana, etil asetat serta metanol dimulai dari campuran n-heksana:etil asetat (100:0) hingga n-heksana:etil asetat (0:100) dilanjutkan etil asetat:metanol (100:0) sampai etil asetat:metanol (0:100). Banyaknya fraksi disebabkan terjadi pengulangan elusi pada setiap gradasi, tujuannya yaitu agar pita-pita pada kolom tersebut dapat terpisah dengan baik. Fraksi-fraksi tersebut dipantau dengan KLT menggunakan pelat silika gel GF254 dan pengembang etil asetat: n-butanol: asam format (7:1:2). Dari fraksi-fraksi yang diperoleh, maka dipilih fraksi ke 18 – 24 dengan perbandingan eluen etil asetat : metanol 8:2 memiliki Rf 0,7 dan 0,8 kemudian fraksi 18 – 24 tersebut digabung menjadi Fraksi A. Lalu dilakukan uji kualitatif terhadap gabungan fraksi 18 – 24 (Fraksi A) tersebut dengan menggunakan pereaksi semprot antara lain larutan DPPH 0,2%, larutan FeCl3, larutan AlCl3 serta diuapi uap NH3. Uji kualitatif menggunakan Kromatografi Lapis Tipis ini bertujuan sebagai pemantauan identifikasi dengan bantuan beberapa penampak bercak. Dari hasil KLT terlihat secara visual tidak terdapat bercak warna apapun kecuali pada penyemprotan DPPH 0,2% yang menunjukkan adanya daya antioksidan pada fraksi tersebut. Lalu pada penyemprotan dengan larutan FeCl3 yang menunjukkan adanya bercak warna hitam yang artinya senyawa yang terdapat dalam fraksi tersebut merupakan golongan fenol. Sedangkan dengan menggunakan penampak bercak AlCl3 5%, hasil menunjukkan sedikit ada perubahan, sedangkan dengan
51
penampak bercak uap NH3 telihat flouresensi hijau berubah menjadi hijau kuning dibawah sinar UV 366 nm. Penampak bercak tersebut digunakan untuk mendeteksi adanya senyawa golongan flavonoid.
Setelah dipantau dengan Kromatografi Lapis Tipis, kemudian dilakukan pemisahan dengan metode Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) pada pelat kaca silika gel GF254 dengan pengembang yang sama. Tujuan KLTP yaitu untuk memisahkan senyawa berdasarkan pita-pita yang terlihat di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm. Hasilnya diketahui bahwa terdapat pita berfloresensi hijau di bawah sinar UV 366 nm. Pita tersebut dikerok kemudian dilarutkan dalam metanol lalu dipekatkan sampai kering dan dilarutkan kembali dalam metanol untuk kemudian diuji menggunakan KLT 2 dimensi. Pengembang pertama yang digunakan yaitu etil asetat : n-butanol (3:1 Rf 0,4) dilanjutkan dengan pengembang kedua etil asetat : asam format (1:1 Rf 0,37). Perubahan komposisi eluen dikarenakan untuk mendapatkan nilai Rf yang lebih kecil. Diperoleh satu bercak berwarna hijau pada daerah UV 366 nm.
Setelah itu dilakukan uji kualitatif terhadap isolat. Hasilnya, dapat dikatakan bahwa isolat yang telah diisolasi tersebut memiliki aktivitas antioksidan. Kemudian dengan pereaksi semprot larutan FeCl3 menunjukkan warna hitam yang artinya isolat tersebut termasuk ke dalam golongan fenol. Sedangkan setelah di uapi uap amonia, terjadi perubahan yaitu spot yang asalnya berwarna hijau jadi berwarna hijau kekuningan. Kemudian pada penyemprotan dengan AlCl3 spot yang asalnya berwarna hijau menjadi kuning. Dari hasil perubahan pereaksi semprot AlCl3 dan uap amonia ini menunjukkan bahwa isolat tersebut merupakan golongan flavonoid.
Hasil spektrum isolat menunjukkan terdapat dua buah puncak yang memberikan serapan yaitu satu puncak kuat terdapat pada panjang gelombang 224, 80 nm dan puncak kedua terdapat pada panjang gelombang 275,00 nm. Dari hasil data spektrum dapat dikatakan bahwa isolat yang telah diisolasi tersebut merupakan
52
senyawa flavanon. Hasil lain yang mendukung adalah hasil skrining fraksi etil asetat yang menunjukkan warna merah ceri kuat pada lapisan amil alkohol.
Beberapa flavanon berwarna hijau-kuning atau biru muda pada kertas bila disinari dengan sinar UV dan diuapi amonia. Uji warna yang penting dalam larutan alhokol ialah reduksi dengan serbuk Mg dan HCl pekat, diantara flavonoid hanya flavanon yang menghasilkan warna merah ceri kuat. Sifat spektrum flavanon berbeda dengan sifat spektrum flavonoid lain, yaitu satu puncak kuat terdapat pada kira-kira 225 nm, puncak lain pada 278 atau 288 nm.(22)
Penambahan
perekasi
geser
AlCl3,
menunjukkan
terjadinya
pergeseran
batokromik sebesar 4,4 nm pada pita I yaitu dari panjang gelombang 275,00 nm menjadi 279,4 nm. Pergeseran panjang gelombang dari spektrum tersebut yang terjadi tidak dapat ditafsirkan. Kemudian setelah ditambahkan pereaksi geser HCl, pada pita I terjadi pergeseran hipsokromik sebesar 3,2 nm yaitu dari panjang gelombang 275 nm menjadi 278,2 nm. Sedangkan pada pita II tidak terjadi pergeseran. Penambahan HCl ini menunjukan adanya gugus OH pada atom C nomor 5 dan gugus prenil pada atom C nomor 6. Gugus prenil ini memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Tetapi pada flavanon, pergeseran ini tidak dapat ditafsirkan.
Penambahan pereaksi geser NaOH, menunjukkan terjadinya pergeseran batokromik sebesar 60 nm pada pita I yaitu dari panjang gelombang 275 nm menjadi 335 nm dengan menunjukkan kenaikan kekuatan di 335 nm. Ini menunjukkan adanya gugus OH pada atom C nomor 7.
Penambahan pereaksi geser NaOAc lalu kemudian setelah ditambahkan pereaksi geser H3BO3, pada pita I terjadi pergeseran hipsokromik sebesar 10,5 nm dari 275,3 menjadi 264,8 nm hal ini menunjukkan adanya orto dihidroksi pada cincin A (pada posisi 6,7 atau 7,8).
53
Karakterisasi dengan spektrofotometri inframerah dilakukan untuk menentukan adanya gugus fungsi yang terkandung dalam senyawa yang di uji. Hasil spektrofotometri inframerah menunjukkan adanya gugus fungsi O-H pada spektrum bilangan gelombang 3394,86 (cm-1), ikatan C-H pada spektrum bilangan gelombang 2929,03 dan 2868,27 (cm-1), ikatan C=C pada spektrum bilangan gelombang 1598,00 ; 1462,11 dan 1383,02 (cm-1), gugus karbonil C-O khas flavonoid 1250,89 dan 1045,46 (cm-1), ikatan C-H pada 786,03 (cm-1). Gugus fungsi ini merupakan ciri-ciri yang ada pada struktur flavonoid yang diperkirakan adalah flavonoid jenis flavanon. Diduga struktur flavonoid seperti dibawah ini
OH HO
7, 8-dihidroksi flavonoid
BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpulan Dari hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap daun kersen, dapat disimpulkan : 1. Daun kersen memiliki kandungan senyawa metabiolit sekunder alkaloid, flavonoid, polifenol, steroid-triterpenoid, tanin, monoterpena-seskuiterpena serta saponin. 2. Fraksi etil asetat memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dibandingkan dengan ekstrak, fraksi lain maupun kuersetin dengan nilai EC50 yaitu 2,807 ppm. 3. KLT Isolat menunjukkan spot flouresensi warna hijau pada sinar UV 366 nm dengan Rf 0,4 eluen etil asetat : n-butanol (3:1) dan Rf 0,37 eluen etil asetat : asam format (1:1). 4. Isolat tersebut memiliki daya antioksidan ditunjukkan dengan adanya penampakan secara visual warna kuning dengan latar belakang ungu pada KLT isolat. 5. Isolat merupakan senyawa yang termasuk ke dalam flavonoid minor jenis flavanon. 7.2 Saran Perlu diidentifikasi lebih lanjut tentang isolat tersebut menggunakan instrumen Spektroskopi Massa (MS), Spektroskopi Resonansi Magnet Inti Proton (RMI-1H) dan Spektroskopi Resonansi Magnet Inti Karbon (RMI-13C).
54
DAFTAR PUSTAKA
1.
Chin, W.Y., 1989. A guide to the wayside tress of Singapore. BP Singapore Science Centre, p: 145
2.
C M Nshimo., 1993. Cytotoxic Constituents of Muntingia calabura Leaves and Stems Collected in Thailand Vol. 31, No. 1, p: 77-81
3.
Perez-Arbealaez E., 1975. Plants medicinales y venenosas de Colombia. Medellin Colombia. p:192
4.
Zakaria ZA., 2006. The in vitro Antibacterial Activity of Muntingia calabura Linn Extracts
5.
Z. A. Zakaria., Antinociceptive, anti-inflammatory and antipyretic effects
of Muntingia calabura aqueous extract in animal models. J.OF NAT MEDICINES Volume 61, Number 4, p: 443-448, DOI: 10.1007/s11418-0070167-2 6.
Nivethetha, M., 2009. Effects of Muntingia calabura L. on isoproterenolinduced myocardial infarction. Singapore Med J Vol 50 p: 300.
7.
Bao-Ning Su., 2002. Activity-guided isolation of the chemical constituents of Muntingia calabura using a quinone reductase induction assay. University of Illinois at Chicago, Chicago, IL 60612, USA.
8.
Redhamahsya. 2011. Standardisasi Simplisia Dan Ekstrak Etanol Daun Kersen (Muntingia calabura L). Universitas Jenderal Ahmad Yani.
9.
Pietta, Pier-Giorgio. 2000. Flavonoids as Antioxidants. J. of Nat Prod, vol 63, p: 1035-1042.
10. Zuhra, Cut Fatimah Tarigan, Juliati Br. Sitohang, Herlince. 2008. Aktivitas
Antioksidan Senyawa Flavonoid Dari Daun Katuk (Sauropus Androgunus (L) Merr)J. Bio Sumatera » Vol. 3(1) hlm. 7 – 10. ISSN 1907-5537 11. Indriani,Susi. 2006. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Jambu Biji (Psidium
guajava L.) J.ll. Pert.Indon. Vol. 11(1). 12. Takashi, Miyake. Shibamoto, Takayumi., 1997. Antioxidant activities of Natural Compound Found in Plants. J. Agric. Food. Chem. 45. p: 1819-1822 13. Tachakittirungrod S, Olonogi S, Chowwanapoonpohn S. 2007. Study on antioxidant activity of certain plants in Thailand: mechanism of antioxidant action of guava leaf extract. Food Chem vol 103 p: 381–88. 14. Hyoen Ji Kim., 2010. Comparative Antioxidant and Antiproliferative Activities of Red and White Pitayas and Their Correlation with Flavonoid and Polyphenol Content . J.of Foods Sci Volume 76 (1) 15. Rodrigues HG., 2005. Antioxidant effect of saponin: potential action of a soybean flavonoid on glucose tolerance and risk factors for atherosclerosis. Int J Food Sci Nutr.;56(2) p:79-85.
55
56
16. Cronquist,A. 1981. An Integrated System of Classification of Flowering Plants, Columbia Press, New York. P: 1262. 17. Sutrisno, R. B., Taksonomi Spermatophyta untuk Farmasi Edisi 1, 1998,
Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jakarta, Hal 122. 18. Morton, J. 1987. Jamaica Cherry. In: Fruits of warm climates. Miami, p: 65– 69 19. Ogata, Y., (Comite Members) 1995. Medicinal Herb Index in Indonesia
(Second Edition). PT. Eisai Indonesia. Jakarta. Hal 75. 20. Perry, L. M., 1980. Medicinal Plant of East and Southeast Asia, The MIT Press, Cambridge Massachusetts and London English, 132. 21. Zakaria ZA. 2007, Natural Medicines, Department of Medicine and Healt
Science, Universiti Putra Malaysia. Hal 443-448 22. Harborne, J.B.,1987 : Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Terbitan Kedua, Penerbit ITB, Bandung, 8-15. 23. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, 2000 : Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Cetakan Pertama, Jakarta, 2, hal 3-11, 13-18 24. Yazid, Estien. 2005. Kimia Penerbit Andi
Fisika
untuk
Paramedis. Yogyakarta :
25. Sudjadi. 1986. Metode Pemisahan. Yogyakarta : UGM Press 26. Sastrohamidjodjo, H., 2002, Kromatografi, Penerbit Liberty, Yogyakarta 27. Mulholland PJ, Ferry DR, Anderson D, et al. 2001Pre-clinical and clinical study of QC12, a water-soluble, pro-drug of quercetin. Ann Oncol;12(2) p:245-248. 28. Borochov-Neori,H., 2008. Phenolic antioxidants and atherogenic effect of Marula (Sclerocarrya birrea Subsp. Caffra) friut juice in healthy humans. J.of Agri and Food Chem (56) p: 9884-9891 29. Gritter, R.J., Bobbit, J.M., dan Schwarting, A.E., (1991) : Pengantar Kromatografi, Edisi Kedua, diterjemahkan oleh Dr. Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung, 1, 2, 9, 111, 160-169. 30. Stahl, Egon. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. ITB : Bandung. Hal 3-5 31. Langseth, L. 1995. The health effects of vitamin C supplementation. J. Am. Coll. Nutr. 14, 124-136. 32. Ronald Ross Watson, Joe K. Gerald, Victor R. Preedy – 2010. Nutrients, Dietary Supplements, and Nutriceuticals. Springer 33. Windono, T., Soediman, S., Yudhawati, U., Ernawati, E., Srielita, A.,
Erowati, T.I., 2001, Uji Peredam Radikal Bebas Terhadap 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) dari Ekstrak Kulit Buah dan Biji Anggur (Vitis vinifera L.) Probolinggo Biru dan Bali, Artocarpus, Vol.1 (1) hal: 34-43.
57
34. Silverstein, R.M., Bassler, G.C., and Morril, T.G., (1991) : Spectrometric Identification of Organic Compounds, fifth edition, John Wiley and Sons, Canada, p: 291-292. 35. John Wiley & Sons Ltd, (2007) : Chemical Analysis : Modern Instrumentation Methods and Techniques, University of Le Mans, Francis, p: 167-206. 36. Supratman, Unang. 2009. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Bandung :
UNPAD hal: 9-23 37. Panji, Tri. 2011. Teknik Spektroskopi untuk Elusidasi Struktur Molekul.
Yogyakarta : Garah Ilmu hal:17-21 38. Markham, K.R., Cara Mengidentifikasi Flavonoid. ITB. Bandung hal:16 39. Farnsworth, N. R, 1966, Biological and Phytochemical Screening of Plant ,J.Pharm Science,55 (3) : 225-227 40. S.Mythili, A.Sathiavelu, T.B.Sridharan., 2011. Evaluation of Antioxidant Activity of Cassytha filiformis, Int J.of App Bio and Pharm Tech.Volume: 2: (2): ISSN 09764550 School of Biosciences and Technology, VIT University p:385 41. Balakrishnan. 2011. Tyrosinase Inhibition and Antioxidant properties of
Muntingia calabura Extracts : In Vitro studies. Int J o.Pharm and Bio Sci ; ISSN 0975-6299 2(1) p:294-301. 42. Teo, C.C., Tan, S.N., Yong, J.W.H., Hew, C.S., Ong, E.S. : Journal of Chromatography A 1217 (2010), Elsevier, Natural Sciences and Science Education Academic Group, Nanyang Technological University, Singapore, 2484-2494.
43. Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. 44. Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Terjemahan Prof. Dr. Kosasih Padmawinata. ITB, Bandung.
58
LAMPIRAN 1 GAMBAR TANAMAN DAN DAUN KERSEN (Mintingia calabura Linn)
Gambar V. 1 Tanaman Kersen
Gambar V.2 Daun tanaman Kersen
59
LAMPIRAN 2 DETERMINASI TANAMAN BAHAN PENELITIAN
Gambar V.3 Surat determinasi tanaman Kersen
60
LAMPIRAN 3 PARAMETER MUTU SIMPLISIA
KARAKTERISTIK MAKROSKOPIK SIMPLISIA
Gambar V. 4 Makroskopik simplisia Daun Kersen
Tabel V.1 Penetapan Karakterikstik Makroskopik Simplisia Daun Kersen (Muntingia calabura Linn) Komponen yang
Daun segar
Simplisia
Bentuk
bulat telur
bulat telur
Warna
hijau tua
cokelat kehijauan
Bau
khas
khas
Rasa
tidak berasa agak kesat
Tidak berasa agak kesat
Panjang 6-10 cm,
Panjang 6-10cm,
Lebar 1-5
Lebar 1-5
diperiksa
Ukuran
61
LAMPIRAN 3 (LANJUTAN)
PEMERIKSAAN MIKROSKOPIK SERBUK SIMPLISIA DAUN KERSEN (Muntingia calabura Linn)
Gambar V.5 Mikroskopik serbuk simplisia fragmen rambut penutup bentuk bintang (Perbesaran=100x Pereaksi Kloral hidrat)
Gambar V.7 Mikroskopik fragmen Stomata tipe anisositik banyak (Perbesaran 400x Pereaksi Kloral hidrat)
Gambar V.6 Mikroskopik serbuk simplisia fragmen epidermis segi banyak (Perbesaran 400x Pereaksi Kloral Hidrat) (p
Gambar V.8 Mikroskopik fragmen trakea (Perbesaran 400x Pereaksi Kloral hidrat)
62
LAMPIRAN 3 (LANJUTAN)
PARAMETER MUTU SIMPLISIA Tabel V.2 Pemeriksaan Parameter Mutu Simplisia (Muntingia calabura Linn) No Parameter
Hasil Pengujian
1
Kadar abu total (% b/b)
7,55 ±0,1
2
Kadar abu larut air (% b/b)
2,165 ±0,135
3
Kadar abu tidak larut asam (% b/b) 1,66 ±0,233
4
Kadar sari larut air (% b/b)
13,386 ±0,244
5
Kadar sari larut etanol (% b/b)
15,17 ±0,8
6
Penetapan kadar air (% v/b)
8,88 ±1,213
63
LAMPIRAN 4 PENAPISAN FITOKIMIA Tabel V. 3 Hasil Skrining Fitokimia Simplisia Daun Kersen (Muntingia calabura Linn) Hasil Pengamatan
Golongan
Ekstrak
Fraksi
Fraksi
Fraksi
Senyawa
Simplisia
Kental
n-heksana
etil asetat
air
Alkaloid
-
+
-
-
+
Flavonoid
+
+
+
+
+
Kuinon
-
+
-
+
-
Tanin
+
+
-
-
+
Polifenol
+
+
+
+
+
Saponin
+
+
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
-
Steroid dan Triterpenoid Monoterpenoid dan Seskuiterpenoid
Keterangan : (+) : Mengandung golongan senyawa tersebut (-) : Tidak mengandung golongan senyawa tersebut
64
LAMPIRAN 4 (LANJUTAN) SKRINING FITOKIMIA SIMPLISIA DAUN KERSEN
(1)
(4)
(2)
(3)
(5)
(6)
Gambar V. 9 Penapisan Fitokimia Simplisia Daun Kersen Keterangan : 1. Tanin (+) terlihat endapan putih 2. Saponin (+) timbul busa 3. Polifenol (+) terbentuk warna hitam 4. Monoseskuiterpena – Seskuiterpena (+) terbentuk warna-warna merahhitam 5. Flavonoid (+) timbul warna jingga pada lapisan amil alkohol 6. Steroid - Triterpenoid. (+) timbul warna-warna hijau
65
LAMPIRAN 4 (LANJUTAN)
SKRINING FITOKIMIA EKSTRAK DAUN KERSEN
(1)
(2)
(4)
(7)
(3)
(5)
(6)
(8)
Gambar V.10 Skrining Fitokimia Ekstrak Daun Kersen Keterangan : 1. Alkaloid (+) 2. Flavonoid (+) 3. Kuinon (+)
4. Polifenol (+) 5. Tanin (+) 6. Saponin (+)
7.
7. Steroid-Triterpenoid (+) 8. Monoterpenoid – seskuiterpenoid (+)
66
LAMPIRAN 4 (LANJUTAN)
SKRINING FITOKIMIA FRAKSI AIR DAUN KERSEN
(1)
(3)
(2)
(4)
(5)
Gambar V.11 Skrining Fitokimia Fraksi Air Daun Kersen Keterangan : 1. 2. 3. 4. 5.
Alkaloid (+) Flavonoid (+) Polifenol (+) Saponin (+) Tanin (+)
67
LAMPIRAN 4 (LANJUTAN)
SKRINING FITOKIMIA FRAKSI ETIL ASETAT DAUN KERSEN
(1)
(2)
(3)
(4) Gambar V.12 Skrining Fitokimia Fraksi Etil asetat Daun Kersen
Keterangan : 1. 2. 3. 4.
Flavonoid (+) Polifenol (+) Monoterpenoid-Seskuiterpenoid (+) Kuinon (+)
68
LAMPIRAN 4 (LANJUTAN)
b.
Skrining Fitokimia Fraksi n-heksana Daun Kersen
(1)
`
(3)
(2)
(4)
Gambar V.13 Skrining Fitokimia Fraksi n-heksana Daun Kersen Keterangan : (1) Steroid-triterpenoid (+) (2) Monoterpenoid-seskuiterpenoid (+) (3) Flavonoid (+) (4) Polifenol (+)
69
LAMPIRAN 5 UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN
PEMBUATAN BAKU PEMBANDING KUERSETIN 10 mg Kuersetin - Dilarutkan dalam labu takar 100 mL dengan metanol sampai tanda batas. Kuersetin 100µg/mL - Dipipet 5,0 mL - Dilarutkan kembali dengan metanol dalam labu takar 50 mL sampai tanda batas
Kuersetin 10µg/mL
2 µg/mL
4 µg/mL
6 µg/mL
8 µg/mL
10 µg/mL
70
LAMPIRAN 5 (LANJUTAN)
PEMBUATAN LARUTAN PEREAKSI DPPH 25,0mg DPPH - Dilarutkan dalam beakerglass dengan metanol sedikit - Kemudian dimasukan dalam labu ukur 50 mL - Digenapkan dengan metanol sampai tanda batas. - Dikocok sampai homogen.
DPPH 500µg/mL - Dipipet 30 mL - Dimasukan ke dalam labu ukur 500 mL - Ditambahkan metanol sampai tanda batas. - Kocok sampai homogen.
DPPH 30µg/mL
PENGUJIAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN 1,5 ml larutan uji atau sample (berbagai konsentrasi) - Ditambahkan 3,0 ml DPPH - Didiamkan selama 30 menit - Diukur serapan pada pajang gelombang maksimum
Nilai serapan masing-masing sample
71
LAMPIRAN 5 (LANJUTAN)
PENAPISAN AKTIVITAS PENANGKAPAN RADIKAL BEBAS DENGAN DPPH Tabel V.4 Hasil penapisan aktivitas penangkapan radikal bebas simplisia daun Kersen NO 1. 2. 3. 4.
SAMPEL Ekstrak Fraksi etil asetat Daun Fraksi n-heksana Fraksi air
HASIL + + + +
Keterangan : + = memberikan hasil warna kuning latar belakang ungu
72
LAMPIRAN 5 (LANJUTAN)
(1)
(2)
(3)
Gambar V. 14 Uji Kualitatif Antioksidan menggunakan DPPH Keterangan : 1. Fraksi air 2. Fraksi etil asetat 3. Fraksi n-heksana
73
LAMPIRAN 5 (LANJUTAN) SPEKTRUM SERAPAN DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)
Gambar V.15 Spektrum Serapan Maksimum DPPH 30 μg/ml Keterangan : Panjang gelombang makimum = 515,6 nm Absorban = 0,699
74
LAMPIRAN 5 (LANJUTAN)
Tabel V.5 Persentase Peredaman Ekstrak Daun Kersen terhadap DPPH EKSTRAK DAUN KERSEN Konsentrasi sampel (ppm)
Persentase Peredaman (%)
Absorban
2 4 8 10 12 14 16 18
43,63 49,64 59,66 63,52 70,1 73,25 76,11 82,98
0,394 0,352 0,282 0,255 0,209 0,187 0,167 0,119
90
Persen peredaman
80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Konsentrasi (µg/ml)
Gambar V.16 Kurva Regresi linier % Peredaman Ekstrak Daun Kersen Keterangan
: Persamaan regresi : Koefisien korelasi : EC50 :
y = 2,3786x + 39,886 0,996 4,252ppm
75
LAMPIRAN 5 (LANJUTAN)
Tabel V.6 Persentase Peredaman Fraksi Air Daun Kersen terhadap DPPH FRAKSI AIR DAUN KERSEN Konsentrasi sampel (ppm)
Persentase Peredaman (%)
Absorban
2 4 6 10 12 16
38,9 41,67 43,77 48,5 50,52 56,33
0,407 0,389 0,379 0,348 0,33 0,291
Persen peredaman
60 50 40 30 20 10 0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Konsentrasi (µg/ml)
Gambar V.17 Kurva Regresi linier % Peredaman Fraksi Air Daun Kersen Keteranngan : Persamaan regresi Koefisien korelasi : 0,9972 EC50
: y=1,212x+36,515 : 11,12ppm
76
LAMPIRAN 5 (LANJUTAN)
Tabel V.7 Persentase Peredaman Fraksi Etil Asetat Daun Kersen terhadap DPPH
FRAKSI ETIL ASETAT DAUN KERSEN Persentase Peredaman (%)
0,1 0,5 1 4 10 14
39,219 41,99 44,75 54,5 73,7 91,98
persen peredaman
Konsentrasi sampel (ppm)
Absorban 0,425 0,406 0,386 0,3185 0,184 0,056
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
konsentrasi (µg/ml)
Gambar V.18 Kurva Regresi linier % Peredaman Fraksi Etil Asetat Daun Kersen Keteranngan : Persamaan regresi Koefisien korelasi : 0,9976 EC50
:y=3,6163x+39,849 : 2,807ppm
77
LAMPIRAN 5 (LANJUTAN)
Tabel V.8 Persentase Peredaman Fraksi n-Heksana Daun Kersen terhadap DPPH
FRAKSI n-HEKSANA DAUN KERSEN Konsentrasi sampel (ppm)
Persentase Peredaman (%)
Absorban
2 4 8 16 24 32
43,48 44,58 46,77 51,98 58,02 64,3
0,395 0,387 0,372 0,336 0,293 0,249
70
persen peredaman
60 50 40 30 20 10 0 0
5
10
15
20
25
30
35
konsentrasi (µg/ml)
Gambar V.19 Kurva Regresi linier % Peredaman Fraksi n-Heksana Daun Kersen Keteranngan : Persamaan regresi Koefisien korelasi : 0,998 EC50
:y=0,0069x+0,4158 : 12,132 ppm
78
LAMPIRAN 5 (LANJUTAN) Tabel V.9 Persentase Peredaman Pembanding Kuersetin terhadap DPPH Ekstrak Etanol Kuersetin Konsentrasi (µg/ml) Absorban % peredaman 2 0,429 39,18 3 0,393 44,28 4 0,365 48,25 5 0,325 53,92 6 0,286 59,45 8 0,213 69,80 80
persen peredaman
70 60 50 40 30 20 10 0 0
2
4
6
8
10
Konsentrasi (µg/ml)
Gambar V.20 Kurva Regresi linier % Peredaman Isolat Kuersetin Keteranngan : Persamaan regresi :y = 5,119 x + 28,58 Koefisien korelasi : 0,998 EC50 : 4,184 ppm Tabel V.10 Konsentrasi EC50 Ekstrak dan Fraksi Daun Kersen serta Pembanding Jenis Sampel
Nilai EC50 (ppm)
Ekstrak Fraksi n-heksana Fraksi Etil asetat Fraksi Air Kuersetin
4,252 12,132 2.807 11,12 4,184
79
LAMPIRAN 6 EKSTRAKSI DAN FRAKSINASI
Simplisia kasar daun kersen Ditumbuk halus Dimaserasi menggunakan pelarut metanol :air (9:1) selama 6-12 jam Disaring Residu simplisia
Maserat I Dimaserasi kembali menggunakan pelarut metanol : air (1:1) selama 6-12 jam Disaring Maserat II
Maserat I
Disatukan Diuapkan hingga hampir semua metanolnya menguap Ekstrak Difraksinasi menggunakan n-heksana : air (1:1)
Fraksi Air
Fraksi n-heksana
Difraksinasi dengan Etilasetat (1:1)
Fraksi Air
Fraksi Etil Asetat
Gambar V.21 Bagan ekstraksi dan fraksinasi simplisia daun Kersen
80
LAMPIRAN 6 (LANJUTAN)
ISOLASI FRAKSI ETIL ASETAT Fraksi EtOAc Diukur aktivitas antioksidannya menggunakan metode DPPH Fraksi paling tinggi aktivitas antioksidan Dilakukan kromatografi kolom (fraksinasi) Fraksi-fraksi dimonitor dengan KLT Fraksi Dilakukan kromatografi preparatif Isolat Diuji kemurnian menggunakan KLT 2 Dimensi Isolat Murni Diidentifikasi dengan spektrofotometri UV-Visible Diidentifikasi dengan spektrofotometri Infra Merah Golongan senyawa antioksidan
Gambar V.22 Bagan Isolasi fraksi etil asetat
81
LAMPIRAN 7
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS FRAKSI ETIL ASETAT
2 1
(a)
(b)
(c)
Gambar V.23 KLT Fraksi Etil Asetat Keterangan : Pengembang: etil asetat : n- butanol : asam format (7:1:2). a. Flouresensi hijau pada UV 366 nm Rf 1 : 0,7 dan Rf 2: 0,8 b. Flouresensi hijau terang UV 366 nm dengan penampak bercak AlCl3 Rf 1 : 0,7 dan Rf 2: 0,8 c. Flouresensi hijau terang UV 366 nm setelah di uapi uap amonia Rf 1 : 0,7 dan Rf 2: 0,8
82
LAMPIRAN 8 PEMISAHAN FRAKSI ETIL ASETAT
Fraksi etil asetat Kromatografi kolom (dielusi dengan n-heksana:EtOAc dilanjutkan dengan EtOAc:metanol secara bergradien) 142 Fraksi (F1-F142) Dipantau dengan KLT (fluoresensi) Fraksi-fraksi disatukan menurut pola kromatogram yang sama Fraksi-fraksi disatukan menurut Fraksi A (F18-F24)
Fraksi B (F25-F33)
Fraksi C (F36-40)
Fraksi D (F41-F47)
Fraksi E (F48-F69)
Dipantau dengan KLT Fraksi-fraksi disatukan Fraksi I KLTP FraksiIsolat KLT 2 Dimensi Fraksi-fraksi Isolat murni Dikarakterisasi
Spektrofotometri UV-sinar tampak
Spektrofotometri inframerah
Gambar V.24 Bagan Isolasi Fraksi Etil Asetat
83
LAMPIRAN 9 KROMATOGRAFI KOLOM GRAVITASI
KOMPOSISI FASA GERAK KROMATOGRAFI KOLOM GRAVITASI
Tabel V.11 Komposisi Fasa Gerak Kromatografi Kolom Gravitasi n-Heksana (mL)
Etil Asetat (mL)
Metanol (mL)
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
84
LAMPIRAN 9 (LANJUTAN)
KLT Hasil Kromatografi Kolom Gravitasi
2 1
18 19 24
20 21 22 23 Fraksi A (a)
(b)
Gambar V.25. Hasil KLT Kromatografi Kolom Fraksi A
Keterangan : a. Pola kromatogram fraksi 18 – 24 dilihat pada UV 366 nm Rf 1 : 0,7 dan Rf 2: 0,8 b. Pemantauan aktivitas antioksidan fraksi dengan penyemprotan DPPH 0,2% kuning latar belakang ungu
85
LAMPIRAN 9 (LANJUTAN)
Hasil KLT Fraksi Kolom A
1 1 2 1
c d a b f e Gambar V.26 Hasil KLT Fraksi Kolom menggunakan beberapa pereaksi semprot
Keterangan : a. Visual Fraksi A b. Spot Flouresensi Hijau pada UV 366 nm Rf 1 0,8 dan Rf 2 0,7 c. Spot Flouresensi Hijau-kuning setelah diuapi dengan Uap Amonia pada UV 366 nm Rf 1 0,8 dan Rf 2 0,7 d. Spot Hitam Peredaman pada UV 254 nm Rf 1 0,8 dan Rf 2 0,7 e. Spot Hitam Penampakan Visual dengan setelah disemprot dengan Pereaksi Semprot FeCl3 Rf 1 0,8 dan Rf 2 0,7 f. Spot Flouresensi Hijau setelah disemprot dengan Pereaksi AlCl3 pada UV 366 nm Rf 1 0,8 dan Rf 2 0,7
86
LAMPIRAN 10 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF FRAKSI KOLOM A
a b Gambar V.27 KLTP Fraksi A Hasil Kromatografi Kolom
Keterangan : a. Pita Flouresensi Hijau pada UV 366 nm b. Peredaman UV 254 nm
87
LAMPIRAN 11 KLT ISOLAT
a
b
c
d
e
f
g
Gambar V.28 Hasil KLT Isolat menggunakan beberapa pereaksi semprot
Keterangan : a. Spot Flouresensi Hijau pada UV 366 nm b. Spot Flouresensi Hijau Terang setelah diuapi dengan amonia dibawah UV 366 nm c. Spot Flouresensi Kuning pada UV 366 nm dengan penampak bercak AlCl3 d. Peredaman pada UV 254 nm e. Spot Hitam secara visual dengan pereaksi semprot FeCl3 f. Spot Warna Lembayung secara visual dengan pereaksi semprot Vanilin HCl g. Spot Warna Kuning latar belakang Ungu dengan pereaksi DPPH 0,2%
88
LAMPIRAN 12 KLT ISOLAT
a
b
Gambar V.29 Hasil KLT Isolat dengan dua pengembang yang berbeda
Keterangan : a. Flouresensi Hijau pada UV 366 nm Pengembang etil asetat : n-butanol (3:1) Rf 0,4 b. Flouresensi Hijau pada UV 366 nm Pengembang etil asetat : asam format (1:1) Rf 0,37
89
LAMPIRAN 12 (LANJUTAN)
Hasil KLT 2 Dimensi
2 1 (a)
(b)
Gambar V.30 Hasil KLT 2 Dimensi menggunakan eluen pertama Etil Asetat : n-butanol (3:1) dan pengembang kedua etil asetat : asam format (1:1) UV 254 nm Keterangan:
a. Flouresensi Hijau pada UV 366 nm b. Penampakan pada Sinar UV 254 nm
90
LAMPIRAN 13 SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET-SINAR TAMPAK
Serapan (Abs.)
224,8
275
Panjang gelombang (nm)
Gambar V.31 Spektrum isolat dalam MeOH Tabel V.12 Pengukuran Spektrum Serapan Isolat dalam Metanol
Pita I II
Panjang Gelombang Isolat dalam Metanol (nm) 275 224,8
Serapan (A)
Jenis Flavonoid
0,547 0,259
flavanon
91
LAMPIRAN 13
Serapan (Abs.)
(LANJUTAN)
Panjang gelombang (nm)
Gambar V.32 Spektrum MeOH, MeOH/NaOH, dan MeOH/NaOH setelah 5 menit
Keterangan: = Spektrum isolat dalam metanol = Spektrum isolat dalam metanol dengan penambahan natrium hidroksida = Spektrum isolat dalam metanol dengan penambahan natrium hidroksida setelah 5 menit.
Tabel V.13 Pengukuran Spektrum Serapan Isolat Dalam Metanol dengan Penambahan Natrium Hidroksida 2 M Panjang gelombang (nm) Panjang gelombang Penambahan Penambahan isolat natrium natrium dalam hidroksida hidroksida metanol 2M 2 M setelah (nm) 5 menit
275
335
335
Pergeseran panjang gelombang (nm) Penambahan Penambahan natrium natrium hidroksida hidroksida 2M 2 M setelah 5 menit Tidak ada perubahan, tetapi Batokromik intensitas naik 60 seiring bertambahnya waktu
Petunjuk penafsiran
Gugus OH pada atom C nomor 7
92
LAMPIRAN 13
Serapan (Abs.)
(LANJUTAN)
Panjang gelombang (nm)
Gambar V.33 Spektrum MeOH dan MeOH/AlCl3 Keterangan: = Spektrum isolat dalam metanol = Spektrum isolat dalam metanol dengan penambahan alumunium klorida
Tabel V.14 Pengukuran Spektrum Serapan Isolat Dalam Metanol dengan Penambahan Alumunium Klorida Panjang gelombang isolat dalam metanol (nm)
Panjang gelombang dengan penambahan alumunium klorida (nm)
Pergeseran panjang gelombang dengan penambahan alumunium klorida (nm)
275
279,4
Batokromik 4,4 nm
224,8
224,8
Tidak terjadi pergeseran
Petunjuk penafsiran Tidak dapat ditafsirkan Gugus OH pada atom C nomor 5 dan gugus prenil pada atom C nomor 6 (pada Flavanon, tidak dapat ditafsirkan
93
LAMPIRAN 13
Serapan (Abs.)
(LANJUTAN)
Panjang gelombang (nm)
Gambar V.34 Spektrum MeOH dan AlCl3/HCl
Keterangan: = Spektrum isolat dalam metanol = Spektrum isolat dalam metanol dengan penambahan alumunium klorida dan asam klorida Tabel V.15 Pengukuran Spektrum Serapan Isolat Dalam Metanol dengan Penambahan Alumunium Klorida dan Asam Klorida
Panjang gelombang isolat dalam metanol (nm)
Panjang gelombang dengan penambahan alumunium klorida dan asam klorida (nm)
Pergeseran panjang gelombang dengan penambahan alumunium klorida dan asam klorida (nm)
Petunjuk penafsiran
275
278,2
3,2
Tidak dapat ditafsirkan
94
LAMPIRAN 13
Serapan (Abs.)
(LANJUTAN)
Panjang gelombang (nm)
Gambar V.35 Spektrum MeOH dan NaOAc Keterangan: = Spektrum isolat dalam metanol = Spektrum isolat dalam metanol dengan penambahan natrium asetat Tabel V.16 Pengukuran Spektrum Serapan Isolat dalam Metanol dengan Penambahan Natrium Asetat Panjang gelombang isolat dalam metanol (nm)
Panjang gelombang dengan penambahan natrium asetat (nm)
Pergeseran panjang gelombang dengan penambahan natrium asetat (nm)
Petunjuk penafsiran
275
266,3
Hipsokromik 8,7
Tidak dapat ditafsirkan
95
LAMPIRAN 13
Serapan (Abs.)
(LANJUTAN)
Panjang gelombang (nm)
Gambar V.36 Spektrum MeOH dan NaOAc/H3BO3 Keterangan: = Spektrum isolat dalam metanol = Spektrum isolat dalam metanol dengan penambahan natrium asetat dan asam borat
Tabel V.17 Pengukuran Spektrum Serapan Isolat dalam Metanol dengan Natrium Asetat dan Asam Borat
Panjang gelombang isolat dalam metanol (nm)
275,3
Panjang gelombang dengan penambahan natrium asetat dan asam borat (nm)
264,8
Penambahan
Pergeseran panjang gelombang dengan penambahan natrium asetat dan asam borat (nm)
Petunjuk penafsiran
Hipsokromik 10,5
Orto dihidroksi pada cincin A (6,7 atau 7,8) ditafsirkan
96
LAMPIRAN 14 SPEKTROFOTOMETRI INFRAMERAH
C-C (aromatis)
C-H (alkil) OH (broad)
C-O-C C-H (oop)
Gambar V.37 Hasil spektrofotometri inframerah
Tabel V.18 Interpretasi Bilangan Gelombang untuk Gugus Fungsi Hasil Pengukuran menggunakan Spektrofotometri Inframerah Gugus Fungsi
Bilangan Gelombang (cm-1)
O-H
3394,86 2929,03 2868,27 1598,00 1462,11 1383,02 1250,89 1045,46 786,03
C-H C=C (cincin) C-O-C (Ar-O dan R-O) C-H
97
LAMPIRAN 15 CONTOH PERHITUNGAN
A.
Rendemen Ekstrak Ekstrak metanol-air
Rendemen ekstrak kental rata-rata = 20,915±1,887% b/b Rendemen Fraksi Fraksi Normal-heksana 2,349/14,17 = 16,579 % b/b Fraksi Etil Asetat 6,986//14,17 = 49,301% b/b Fraksi Air 4,817/14,17 = 34% b/b
B.
Kadar Abu Total a.
Kadar abu total
b.
Kadar abu total
c.
Kadar abu total
98
d
Kadar abu total
Rata-rata kadar abu total = 7,55±0,1% b/b
C.
Kadar Abu Larut Air a.
Kadar abu larut air
= 5,43% b/b
b.
Kadar abu larut air = 5,24% b/b
Rata-rata kadar abu larut air = 5,335±0,134% b/b D.
Kadar Abu Tidak Larut Asam a.
Kadar abu tidak larut asam
= 1,83% b/b b.
Kadar abu tidak larut asam = 1,5% b/b
Rata-rata kadar abu tidak larut asam = 1,665±0,23% b/b
99
LAMPIRAN 15 (LANJUTAN)
E.
Kadar Sari Larut Air (Simplisia)
Kadar Sari Larut Air = Berat Ekstrak x Volume Pelarut Berat Simplisia
x 100%
Vol. Filtrat yang diambil
Kadar Sari Larut Air I = 0,17 g x 100mL x 100% = 13,6% 5g
25mL
Kadar Sari Larut Air II= 0,164 g x 100mL x 100% = 13,12% 5g
25mL
Kadar Sari Larut Air II= 0,168 g x 100mL x 100% = 13,44% 5g
25mL
Kadar Sari Larut Air rata-rata = 13,38 ± 0,244 %
Penetapan Kadar Sari Larut Etanol (Simplisia) Kadar sari larut etanol = Berat ekstrak x Volume pelarut x 100% Berat simplisia
Vol. Filtrat yang diambil
Kadar Sari Larut Etanol I = 0,198 g x 100mL x 100% = 15,91% 5g
25mL
Kadar Sari Larut Etanol II = 0,179 g x 100mL x 100% = 14,32% 5g
25mL
Kadar Sari Larut Etanol II = 0,191 g x 100mL x 100% = 15,28% 5g
25mL
Kadar Sari Larut Air rata-rata = 15,17 ± 0,8%
100
LAMPIRAN 15 (LANJUTAN) Penetapan Kadar Air Dengan Cara Destilasi
Kadar Air = Volume Air (mL) x 100% Berat Ekstrak Kadar Air Ι
= 0,4 mL x 100% 5g = 8% v/b
Kadar Air II
= 0,52 mL x 100% 5 g = 10,4 % v/b
Kadar Air ΙII
= 0,4 mL x 100% 5g = 8% v/b
Kadar Air IV
= 0,5 mL x 100% 5 g = 10 % v/b
Kadar Air V
= 0,4 mL x 100% 5g = 8% v/b
Kadar Air Rata-rata = 8,88 ± 1,213
101
LAMPIRAN 15 (LANJUTAN)
Perhitungan Kuantitatif Daya Antioksidan 1-
Absorban Sampel
X 100%
Absorban DPPH
1-
0,394
X 100% = 43,63%
0,698 Perhitungan EC50 Y=bx+a Y=2,3786x + 39,886 50 = 2,3786x + 39,886 X = 4,252 ppm
102
LAMPIRAN 16 DAFTAR PEREAKSI DAN LARUTAN PERCOBAAN
Air suling. Air murni yang diperoleh dengan penyulingan. Aluminium Klorida. Larutan aluminium klorida P 1% b/v dalam etanol (95%) P. Amil alkohol. Isoamil alkohol P; Isopentil alkohol P; C5H11OH; bm 88,15; murni pereaksi. Amonia encer. diencerkan 375 ml amonia pekat P dengan air secukupnya hingga 1.000 ml, mengandung lebih kurang 10% NH3. Asam borat. H3BO3 murni pereaksi. Asam klorida pekat. Larutan HCl murni pereaksi, mengandung tidak kurang dari 35,0% dan tidak lebih dari 38,0% HCl. Asam klorida 2 N. Larutan asam klorida P 7,293% b/v. Besi (III) klorida. FeCl3.6H2O murni pereaksi. Dragendorff. Dicampurkan 20 ml larutan bismuth nitrat P 40% b/v, didiamkan sampai memisah sempurna. Diambil larutan jernih dan diencerkan dengan air secukpnya hingga 100 ml. Etil asetat. CH3.CO.OC2H5 murni pereaksi, mengandung tidak kurang dari 98,0% C4H8O2. Gelatin 1% b/v. Dilarutkan 1 gram gelatin P dengan air secukupnya hingga 100 ml. Kalium hidroksida 5% b/v. secukupnya hingga 100 ml.
Dilarutkan 5 g kalium hidroksida dengan air
Mayer Dicampurkan 60 mL larutan raksa(II)klorida P 2,266% b/v dan 10 mL larutan kalium iodida P 50% b/v, ditambahkan air secukupnya hingga 100 mL. Lieberman Bourchard Dicampurkan 5 bagian volume asam sulfat P dengan 50 bagian volume etanol 95% P. Ditambahkan hati-hati 5 bagian volume asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut, didinginkan. Magnesium serbuk Mg murni pereaksi, mengandung tidak kurang dari 95,0% Mg. Vanilin sulfat Dilarutkan 10 g vanilin P dengan asam sulfat pekat secukupnya hingga 100 mL.
103
CURRICULUM VITAE PERSONAL INFORMATIONS Full Name Place of Birth Date of Birth Gender Religion Marital Status Nationality Mailing Address
: Nenden Nurhasanah : Bandung : May 6th, 1990 : Female : Islam : Single : Indonesian : Jalan Senam VII No. 10 Arcamanik – Bandung 40293 : +6281931367378 :
[email protected]
Mobile Phone E-mail FORMAL EDUCATION Years 20082012
Name of School General Achmad Yani University (UNJANI)
Place/City
Subject/Mayor
Education
GPA
Cimahi
Pharmacy (Bachelors Degree)
College
3.34 / 4 (144 credits)
Senior High School Junior High School Elementary School
-
Kindergarten
-
20042007 20012004 19952001
SMAN 23
Bandung
-
SMPN 14
Bandung
-
SDN Griba 27/II
Bandung
-
19931995
TK Multazam
Bandung
-
-
ORGANIZATIONAL EXPERIENCES
Organization HIMAFARSI UNJANI KSR UNJANI UNISEF (UNITED ENGLISH FORUM) UNJANI
Position Chairman of the Division of Health Member Secretary
Date (from-to) 2008-2011 2008-2009 2009-2011
104
LANGUAGE SKILLS
Bahasa Indonesia English
: Excellent in speaking, reading and writing : Good in speaking, reading and writing
COMPUTER SKILLS
Windows 95/98/2007/XP/Vista/7 Internet
