SCIENTIA VOL. 4 NO. 1, FEBRUARI 2014
ISOLASI METABOLIT SEKUNDER DAN UJI AKTIVITAS LARVASIDA EKSTRAK ETANOL DAUN SIRSAK (Annona muricata Linn) TERHADAP LARVA NYAMUK Aedes aegypti Enda Mora, Musyirna Rahmah Nasution, Pinni Maya Nita Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau ABSTRACT The isolation of secondary metabolites and the test of the larvacide activity of ethanol extract sirsak (Annona muricata L) leaves against the mosquito’s larva of Aedes aegypti had been conducted. The testing of larvacide activity of ethanol extract was done by the curve method with the concentrations of 1000, 500, 200, 100 µg/mL. LC50 values obtained was 117.46 µg / mL, which means that the extract could be categorized as active as larvacide. The isolate from ethanol extract was a pure compound A, that gave positive reaction to the Liebermann-Burchard reagent, indicated presence of terpenoid compound. This compound characterized by using UV and IR spectrophotometry. The Larvacide activity assays of the pure compound A using concentrations of 200, 100, 50, and 10 µg/mL indicated that this compound was not active as larvacide (LC50 values of >200 µg/ mL). Keywords : Annona muricata Linn extract, larvacide, Annona muricata isolate PENDAHULUAN Salah satu tanaman yang dapat dimanfaatkan sebagai obat adalah sirsak (Annona muricata L). Sirsak merupakan tanaman yang banyak terdapat di Indonesia. Selain buahnya yang dapat dimakan, bagian lain dari pohon sirsak seperti kulit batang, daun, biji dan akar dapat dimanfaatkan untuk mengobati penyakit bisul, kejang-kejang, ambeien, sakit pinggang, sakit kandung kemih, diare pada bayi, serta sebagai larvasida, insektisida, antimikroba dan lain-lain. (Kardinan, 2003). Penyakit demam berdarah dengue (DBD) sampai saat ini masih merupakan masalah kesehatan masyarakat yang serius di Indonesia. Penyakit DBD ini belum ditemukan obat antiviral yang spesifik dan belum ada vaksin antidengue yang efektif dan komersial, sehingga wajar kasus dan kematian akibat DBD di Indonesia meningkat setiap tahun. Berdasarkan data dari Dinas Kesehatan Provinsi Riau, penyakit DBD termasuk kasus penyakit terbesar yang menempati urutan ke-14 dalam 15 kasus penyakit terbesar pada tahun 2010. Aedes aegypti merupakan vektor dari penyakit DBD. salah satu upaya pengendalian penyakit DBD adalah dengan pemberantasan vektornya menggunakan metode larvasida ISSN : 2087-5045
menggunakan insektisida nabati. Salah satu contoh tanaman yang termasuk insektisida nabati adalah sirsak. Senyawa-senyawa bioaktif dari daun sirsak, selain toksik terhadap serangga, juga tidak berbahaya bagi lingkungan. Dalam penelitian sebelumnya ekstrak biji sirsak dapat meningkatkan kematian larva Culex sp berdasarkan peningkatan dosis (Sudjari dan Hadiyanto, 2010). Pada penelitian lain, ekstrak metanol daun sirsak dapat digunakan sebagai pengendali serangga penggerek batang jagung (Ostrinia furnacalis G) (Tenrirawe dan Pabbage, 2007). Berdasarkan paparan diatas, tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi senyawa yang terkandung di dalam ekstrak etanol daun sirsak dan karakterisasinya serta menguji aktivitas larvasida terhadap larva nyamuk Aedes aegypti. Beberapa penelitian tentang uji aktivitas tanaman sirsak diantaranya adalah ekstrak etanol daun sirsak memiliki aktivitas antiinflamasi pada dosis 200 mg/kgBB dan 400 mg/kgBB pada hewan percobaan dengan berkurangnya volume udem setelah 3-4 jam setelah penyuntikan karagen (Desousa et al, 2010). Ekstrak air biji sirsak menunjukkan efek antibakteri terhadap S. aureus dan V. cholera, tetapi ekstrak etanolnya tidak memiliki efek terhadap antibakteri (Viera et al, 2010). Isolasi 17
SCIENTIA VOL. 4 NO. 1, FEBRUARI 2014
5 senyawa asetogenin dari fraksinasi biji sirsak yaitu cis-anonacin, cis-anonacine-10-one, cisgoniothalamicin, arianacin dan javoricin. Ketiga senyawa pertama merupakan asetogenin monotetrahidrofuran cincin cis yang pertama dilaporkan. Senyawa cis anonacin adalah senyawa sitotoksik yang selektif untuk sel adenokarsinoma kolon (HT-29) (Rieser et al, 1996, Liaw, CC, 2002). Ekstrak biji sirsak dapat meningkatkan kematian larva Culex sp berdasarkan peningkatan dosis (Sudjari dan Hadiyanto, 2010). Ekstrak metanol daun sirsak dapat digunakan sebagai pengendali serangga penggerek batang jagung (Ostrinia furnacalis G) (Tenrirawe dan Pabbage, 2007). METODOLOGI PENELITI Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat destilasi, satu unit rotary evaporator (Eyela®), lumpang dan stamfer, blender, neraca analitik, kolom kromatografi, chamber, lampu UV, vial, pipa kapiler, alat penentu titik leleh Melting point apparatus, plat KLT GF254 Merck®, spektrofotometer UV, spektrofotometer IR dan peralatan gelas yang umum digunakan di laboratorium kimia. Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah daun sirsak segar, larva nyamuk Aedes aegypti, Abate®, alkohol 96%, n-heksana, etil asetat, metanol, aquadest, amoniak, asam asetat glasial, kloroform, dimetilsulfoksida (DMSO), logam magnesium, larutan FeCl3, HCl 1%, H2SO4 2N, pereaksi Liebermann-Burchard, pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorff, dan silika gel 60 GF254.
Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder Profil kandungan kimia daun sirsak diperiksa dengan KLT menggunakan eluen nheksana : etil asetat (2 : 1) dan terlihat adanya 5 noda yang terpisah dengan baik. Ekstrak yang akan dipisahkan sebanyak 4 g dilakukan preadsorpsi dan dimasukkan dalam kolom. Selanjutnya pengelusian dilakukan menggunakan metoda Step Gradient Polarity (SGP), dimulai dari pelarut non polar (nheksana) dilanjutkan dengan komposisi yang semi polar (dengan penambahan etil asetat) hingga pelarut polar (metanol). Hasil fraksinasi yang keluar ditampung dalam vial sebanyak 578 vial, kemudian dimonitor dengan KLT. Vial-vial dengan Rf yang sama pada vial nomor 106-113 digabung, dimonitor kembali dengan KLT hingga didapat pola senyawa dengan 1 noktah. Senyawa ini direkristalisasi dan terhadap kristal yang diperoleh dilakukan karakterisasi. Karakterisasi Senyawa Hasil Isolasi Karakterisasi senyawa hasil isolasi meliputi (Harbone, 1987), Pemeriksaan organoleptis, Sifat fisika (kelarutan dan titik leleh) dan fisikokimia (UV dan IR). (Silverstein, M.R., 1986). Uji Aktivitas Larvasida Ekstrak Etanol Daun Sirsak dan Senyawa Hasil Isolasi Pembiakan larva Aedes aegypti dalam wadah yang gelap dan ditempat yang bersih. Pembuatan larutan uji dengan konsentrasi 200, 100, 50 dan 10µg/mL di dalam vial. Larva Aedes aegypti masukkan kedalam vial yang berisi setiap larutan uji sebanyak 10 ekor.
Prosedur Penelitian a. Pembuatan Ekstrak Daun Sirsak Penelitian ini dimulai dari pengambilan sampel di kota Pekanbaru, daun sirsak (Annona muricata L). segar sebanyak 1,2 kg terlebih dahulu dibersihkan, kemudian dikeringanginkan tanpa sinar matahari langsung. Sampel yang telah dirajang halus dimaserasi dengan menggunakan pelarut etanol 96% selama 3x5 hari. Maserat disaring kemudian filtratnya dipekatkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental etanol daun sirsak. ISSN : 2087-5045
Amati setelah 24 jam, kemudian dihitung berapa jumlah larva yang mati. Masing-masing pengujian dilakukan 3 kali pengulangan Hitung nilai LC50nya
Gambar
1.
Skema Kerja Uji Aktivitas Larvasida Zat uji dilarutkan dengan dimetilsulfoksida 18
SCIENTIA VOL. 4 NO. 1, FEBRUARI 2014
(DMSO) dan ditambahkan air. Kontrol positif digunakan Abate® dan kontrol negatif digunakan DMSO. Uji Aktivitas Larvasida Larva nyamuk Aedes aegypti dimasukkan kedalam tiap vial yang berisi larutan uji sesuai rancangan dosis, masing-masing berisi 10 ekor. Setelah 24 jam, diamati dan dihitung berapa jumlah larva yang mati. Selanjutnya dilakukan analisa data.
murni A ini dilakukan uji KLTdan untuk memastikan bahwa senyawa ini benar-benar murni dengan pengujian titik leleh dan didapatkan titik lelehnya 135o – 136oC. Senyawa murni A dikarakterisasi secara organoleptis berbentuk kristal jarum yang bewarna putih. Berdasarkan kelarutannya, senyawa ini mudah larut dalam etil asetat, tidak larut dalam nheksana dan sukar larut dalam metanol. Senyawa murni A diberi pereaksi warna Lieberman Burchard terjadi warna merah muda sehingga dapat diasumsikan bahwa senyawa murni A tersebut termasuk ke dalam golongan terpenoid.
HASIL DAN PEMBAHASAN Sampel segar daun sirsak (Annona muricata L) sebanyak 1,2 kg yang diekstraksi dengan menggunakan pelarut etanol 96% diperoleh ekstrak kental etanol 27,3 gram dengan rendemen 2,28%. Ekstrak kemudian diuji aktivitas larvasidanya dengan 4 konsentrasi sentase kematian larva semakin tinggi dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak. LC50 ekstrak dihitung berdasarkan persamaan regresi yang diperoleh dari kurva nilai probit dan log konsentrasi (Meyer et al, 1982). Dari kurva diperoleh persamaan regresi y = 1,949 + 1,474x (r = 0,986). Tabel 1. Aktivitas larvasida ekstrak etanol daun sirsak Konsent (µg/ml) Ekstrak
Jumlah larva tiap vial
1000 500 200 100
10 10 10 10
Jumlah larva yang mati Vial 1 2 3
Ratarata
9 10 9 9,33 8 8 7 7,67 7 7 5 6,33 5 4 5 4,67 LC50 = 117,46 µg/mL
Pemeriksaan spektrofotometri UV senyawa murni A menunjukkan adanya serapan maksimum yaitu pada 220,00 nm dengan absorban 0,34600.
Persen kematian
93,3 76,7 63,3 46,7
Suatu ekstrak dikatakan aktif sebagai larvasida bila nilai LC50 < 500 µg/ml (Meyer et al, 1982) oleh karena itu ekstrak daun sirsak dapat dikatakan aktif larvasida karena memiliki LC50 Ekstrak etanol daun sirsak dipisahkan dengan kromatografi kolom sebanyak 4 g menggunakan silika gel sebagai fase diamnya. Setelah dilakukan rekristalisasi didapatkan senyawa murni A sebanyak 30 mg. Senyawa ISSN : 2087-5045
A B Gambar 2. A= KLT senyawa murni A B= KLT senyawa murni A + LB
Gambar 3. Spektrum UV senyawa murni A Pada spektrum IR pita serapan terdapat didaerah bilangan gelombang 3433,29 cm-1 dan 3269,34 cm-1 berasal dari regang OH, untuk pita yang muncul pada bilangan gelombang 3026,31 19
SCIENTIA VOL. 4 NO. 1, FEBRUARI 2014
- 2870,08 cm-1 menunjukkan adanya regang CH alifatis. Untuk pita yang muncul pada bilangan gelombang 1732,08 – 1639,49 cm-1 menunjukkan adanya regang gugus C=O, sedangkan regang gugus C=C terlihat pada bilangan gelombang 1595,13 - 1448,54 cm-1. Bilangan gelombang 1377,17 cm-1 menunjukkan adanya –CH3 (pada serapan tekuk)
Gambar 4. Spektrum infra merah senyawa murni A Berdasarkan hasil spektrofotometri UV yang menunjukkan adanya serapan maksimum pada panjang gelombang 220 nm diasumsikan bahwa pada serapan tersebut terdapat gugus ausokrom OH dimana ausokrom ini terletak pada panjang gelombang 210-230 nm yang diperkuat dengan hasil analisis spektroskopi IR dimana pada bilangan gelombang 3433,29 cm-1
dan 3269,34 cm-1 terdapat regang OH (Silverstein, M.R., 1986). Adanya ikatan rangkap C=C pada bilangan gelombang 1595,13 - 1448,54 cm-1 juga merupakan ciri senyawa terpenoid yang memiliki ikatan rangkap C=C yang tidak terkonjugasi. Adanya vibrasi tekuk – CH3 yang mengidentifikasikan adanya gugus gem dimetil sebagai ciri khas senyawa terpenoid pada bilangan gelombang 1377,17 cm-1. Berdasarkan data UV dan IR senyawa ini diduga sebagai senyawa terpenoid yang memiliki gugus hidroksil (OH), karbon ikatan rangkap (C=C) dan gem dimetil. Selanjutnya senyawa murni A yang didapat di uji aktivitas aktivitas larvasida dengan menggunakan metoda kurva. Untuk pengujian senyawa murni A, konsentrasi yang digunakan adalah 200, 100, 50 dan 10 µg/mL. Aktivitas larvasida senyawa murni A daun sirsak dapat diketahui berdasarkan jumlah larva nyamuk Aedes aegypti yang mati dan dihitung dengan analisis probit untuk mengetahui nilai LC50 nya. Suatu senyawa murni dikatakan aktif sebagai larvasida bila nilai LC50 < 200 µg/mL (Meyer et al, 1982). Konsentrasi uji yang digunakan dibuat berdasarkan batas maksimum nilai LC50 suatu senyawa murni sehingga konsentrasi larutan uji dimulai dari 200 µg/mL. Hasil persentase kematian larva yang diperoleh dari senyawa murni A dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2. Aktivitas larvasida Senyawa murni A Jumlah larva yang mati Konsent Jumlah larva (µg/ml) vial tiap vial Senyawa A 1 2 3 200 10 5 4 4 100 10 4 4 4 50 10 2 2 1 10 10 1 2 1 LC50 = 350,75 µg/mL Berdasarkan data tersebut tidak didapat konsentrasi yang dapat mematikan 50% hewan percobaan. Tetapi berdasarkan kurva kalibrasi dengan hubungan log konsentrsai dengan nilai probit dapat diketahui nilai LC50 senyawa murni A dengan persamaan regresi yang didapat y = 2,992 + 0,789x dan nilai koefisien korelasinya r = 0,911. Hasil perhitungan nilai LC50 yang diperoleh 350,75 dan dapat disimpulkan ISSN : 2087-5045
Rata-rata 4,33 4 1,67 1,33
Persen kematian 43,3 40 16,7 13,3
bahwa senyawa murni A tidak aktif sebagai larvasida. Perbedaan aktivitas larvasida yang dihasilkan dari ekstrak dan senyawa murni hasil isolasi mungkin dikarenakan pada ekstrak masih mengandung gabungan senyawa-senyawa yang belum terpisah sesuai dengan kandungan kimia ekstrak tersebut seperti alkaloid, terpenoid, fenolik dan saponin sehingga memiliki aktivitas 20
SCIENTIA VOL. 4 NO. 1, FEBRUARI 2014
yang lebih bagus dari pada senyawa murni yang diperoleh dari hasil pemisahan. Kemungkinan lain adalah adanya yang bersifat larvasida namun tidak bisa dipisahkan dengan metode pemisahan yang digunakan.
Viera G.H., Mourão J.A., Angelo A.M., Costa R.A., and Vieira R.H., 2010, Antibacterial effect (in vitro) of Moringa oleifera and Annona muricata against Gram positive and Gram negative bacteria, Rev Inst Med Trop Sao Paulo, Vol.52, No. 3, Hal:129132.
DAFTAR PUSTAKA Desousa J.M., Gondim M.G.J.L., and Lofego A.C., 2010, Antinociceptive and AntiImflammatory Activities of the Ethanol Exstract of Annona muricata L. Leave in Animal Models, International journal of molecular sciences, Vol. 11, No. 5, Hal. 2067-2078. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia Penentuan Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Edisi Ke-2, Terjemahan K. Padmawinata dan I. Soediro, Penerbit ITB, Bandung. Kardinan, A., 2003, Tanaman Pengusir dan Pembasmi Nyamuk, Agromedia Pustaka, Jakarta. Meyer, B.N.R Ferrigni, J.E Putnam L, B Jacobsen, D,E, Nicholas, and J L, Mc, Laughin, 1982, ”Brine Shrimp : A convenient General Bioassay For Active Plant Constituent”, J. of Medical Plant Medica , Vol. 45, No. 5, Hal 31-34. Rieser M.J., Gu Z.M., Fang X.P., Zeng L., Wood K.V., and Laughlin J.L., 1996, Five novel mono-tetrahydrofuran ring acetogenins from the seeds of Annona muricata, J. Natural product, Vol. 59, No. 2, Hal. 100-108. Silverstein, M.R., 1986, Penyidikan Spektrofotometrik Senyawa Organik, Edisi IV, Terjemahan Hartomo, Erlangga, Jakarta. Sudjari, S., dan Hadiyanto, B., 2010, Efek Ekstrak Biji Sirsak (Annona muricata L) sebagai Larvasida Culex sp, Jurnal Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang, Vol. 2, Hal 34-41. Tenrirawe, A., dan Pabbage, M.S., 2007, Pengendalian Penggerek Batang Jagung (Ostrina furnacalis G) dengan Ekstrak Daun Sirsak (Annona muricata L), Prosiding Seminar Ilmiah dan Pertemuan Tahunan PEI dan PFI XVII Komda SulSel. ISSN : 2087-5045
21
