ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) DAR1 BUAH MATANG YANG BERPOTENSI MENGHASILKAN ANTIMIKROBIA
Skripsi untuk memenuhi sebagian persyaratan mencapai derajat Sarjana S-1
Program Studi Biologi
diajukan oleh : Ida Fitriyani 05640007
Kepada PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SUNAN KALIJAGA YOGYAKARTA 2010
ii
iii
HALAMAN MOTTO
Bukankah Kami telah melapangkan untukmu dadamu? Dan Kami telah menghilangkan darimu bebanmu, yang memberatkan punggungmu? Dan Kami tinggikan bagmu sebutan (nama)mu. Karena sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan. Maka apabila kamu telah selesai (dari suatu urusan), kerjakanlah dengan sungguh-sungguh (urusan) yang lain, dan hanya kepada Tuhan-mulah hendaknya kamu berharap. (Al-Insyirah : 1-8)
.............. Jangan berduka cita terhadap apa yang luput dari kamu, dan supaya kamu jangan terlalu gembira terhadap apa yang diberikan-Nya padamu. Dan Allah tidak menyukai setiap orang yang sombong lagi membanggakan diri. (Al hadiid : 23)
“Kekayaan termahal adalah kecerdasan, kehancuran terbesar adalah kebodohan, keliaran paling besar adalah kesombongan, prestasi yang terbaik adalah kebaikan akhlak”
iv
PERSEMBAHAN
Kupersembahan kepadaMu Ya Rabb, Terima kasih ini sebagai amal ibadahku, Dan sesungguhnya shalatku, hidupku dan Matiku semuanya bagi Allah, Rabb semesta alam
Kupersembahkan karya kecil ini kepada: Bapak dan ibuku (Hamzah HS. Dan Alm. Sulastri), curahan kasih sayang kalian membentuk pribadi sepertiku, sehingga mengerti arti kehidupan, jasa kalian tak terhitung. Maafkan telah banyak merepotkan. Kakak-kakakku (sri Fatmawati, Siti Fajariyah, dan Nurhayati). Kasih sayang dan dorongan kalian membangkitkan semangat dan mengajarkan arti kebesamaan. Dan kepada hazli Hidafi tercinta dengan doa, dorongan semangat, kesabaran dan kasih sayang membuatku bersemangat menyelesaikan tugas ini.
Kepada almameterku Tercinta Prodi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Sunan Kalijaga Yogyakarta Semoga skripsi ini bermanfaat.
v
vi
KATA PENGANTAR
ﺑﺴﻢ ﷲ اﻟﺮ ﺣﻤﻦ اﻟﺮ ﺣﻴﻢ اﻟﺤﻤﺪ ﷲ اﻟﺬي أﻧﻌﻤﻨﺎ ﺑﻨﻌﻤﺔ اﻹﻳﻤﺎن و اﻹﺳﻼم اﺷﻬﺪ ان ﻻاﻟﻪ اﻻ ﷲ و اﺷﻬﺪ ان ﻣﺤﻤﺪا رﺳﻮل ﷲ و اﻟﺼﻼة و اﻟﺴﻼم ﻋﻠﻲ أﺷﺮف اﻷﻧﺒﻴﺎء واﻟﻤﺮ ﺳﻠﻴﻦ .ﺳﻴﺪﻧﺎ ﺣﻤﺤﺪ و ﻋﻠﻲ اﻟﻪ و ﺻﺤﺒﻪ أﺟﻤﻌﻴﻦ أﻣﺎ ﺑﻌﺪ Alhamdulillah, puji syukur penulis panjatkan kepada kehadirat Allah SWT atas rahmat, hidayah, dan karunia-Nya sehingga pelaksanaan dan penyusunan skripsi ini berjalan dengan lancar. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi
Balai
Laboratorium
Kesehatan
(BLK)
Yogyakarta
dan
Laboratorium Mikrobiologi Universitas Islam Negeri Sunan Kalijaga. Skripsi ini disusun guna memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Sunan Kalijaga. Selama pelaksanaan penelitian, baik pada saat persiapan, pelaksanaan penelitian, hingga penyusunan skripsi ini, banyak pihak yang memberikan kontribusi bagi kebaikan penyusunan skripsi ini. Untuk itu dengan segala kerendahan hati, penulis mengucapkan terimakasih kepada : 1. Dra. Maizer Said Nahdi, M.Si selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Sunan Kalijaga Yogyakarta. 2. Arifah Khusnuryani, M.Si selaku Kaprodi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Sunan Kalijaga Yogyakarta. 3. Lela Susilawati, M. Si selaku Dosen Pembimbing Utama Skripsi yang telah memberikan
banyak
masukan
serta
vii
bantuan
kepada
penulis
untuk
kesempurnaan skripsi ini dan kebaikan beliau tidak bisa penulis ceritakan hanya dalam sehari mungkin membutuhkan berlembar-lembar kertas untuk mengungkapkannya. 4. Lela Susilawati, M. Si, Anna Rahmawati, M. Si dan Arifah Khusnuryani, M. Si, atas luangan waktu yang Ibu berikan untuk menjadi penguji pada ujian skripsi penulis ini. Terima kasih atas segala masukan, saran dan koreksinya. 5. Drg. H.M. Taufiq.A. K, M. Kes. selaku Kepala Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta. 6. Bapak Jumakir, Bapak Budi, Ibu Darwani, dan Ibu Atika yang telah memberikan bimbingan dalam pelaksanaan penelitian skripsi penulis di Balai Laboratorium Kesehatan. 7. Jumailatus Shalihah, S. Si selaku Kepala Laboratorium Universitas Islam Negeri Sunan Kalijaga yang telah memberikan izin atas penggunaan fasilitas laboratorium untuk melakukan penelitian. 8. Ayahanda Hamzah HS. dan (Alm.) Ibunda Tercinta Sulastri, atas segala pengorbanan, do’a yang tak henti-hentinya dan telah membimbing penulis dengan sabar, memberikan kasih sayang, serta cinta yang tulus untuk anakmu. 9. Kakakku Sri Fatmawati, Siti Fajriyah, dan Nurhayati, atas dukungannya untuk menyelesaikan skripsi ini baik secara moril maupun materiil. 10. Adekku Dina dan Bibi Suriyah atas dukungan dan perhatiannya. 11. Keluarga besar di Bali, Jogja, dan Trenggalek atas do’a dan motivasinya. 12. Keponakanku Kiki dan Caca, atas canda dan tawa yang selalu menjadi penghibur hati setiap saat.
viii
13. Untuk Hazli Hidafi atas segala pengertian, semangat, dan dukungan moril kepada penulis. 14. Laboran laboratorium Mikrobiologi Universitas Islam Negeri Sunan Kalijaga yang banyak membantu dalam penelitian ini. 15. Iin Mariyani atas bantuannya menemani penulis ketika penelitian, jasamu takkan pernah kulupakan. 16. Teman-teman angkatan 2005 Prodi Biologi teruslah berjuang dan berkarya, jangan pernah menyerah tetaplah semangat menuntut ilmu pengetahuan. Jangan lupakan persahabatan yang telah terjalin selama ini kawan. Kalian akan tetap ada dalam sanubariku I love you all. 17. Zaenal Arifin beserta teman-teman di rumah singgah atas tumpangan dan hiburannya di sela-sela kepenatan dan kegilaannya. Semoga pertemanan ini akan terjalin terus dimanapun kita berada. 18. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, atas segala bantuan baik berupa do’a, tenaga, materi, selama penelitian dan penulisan skripsi. Akhir kata kritik dan saran yang sifatnya membangun sangat penulis harapkan untuk kesempurnaan skripsi ini. Semoga karya ini bermanfaat dalam pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi demi kesejahteraan umat manusia. Yogyakarta,
Mei 2010
Penulis
ix
DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ..................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN SKRIPSI ....................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iii HALAMAN MOTTO ................................................................................... iv HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................. v HALAMAN PERNYATAAN ...................................................................... vi KATA PENGANTAR ................................................................................... vii DAFTAR ISI ….……………………………………………………………. x DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………… xiii DAFTAR TABEL ………………………………………………………….. xiv DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………….. xv ABSTRAK ………………………………………………………………… xvi I.
PENDAHULUAN …………………………………………………….
1
A. B. C. D. E. F.
Latar Belakang ……………………………………………………. Identifikasi Masalah ………………………...…………………… Permasalahan ……………………………………………………… Tujuan Penelitian ………………………………………………….. Manfaat Penelitian ………………………………………………… Batasan Operasional/Istilah .............................................................
1 5 6 6 6 7
II. TINJAUAN PUSTAKA ……………………………………………….
7
A. Penelitian Terdahulu ……………………………………………... B. Landasan Teori …………………………………………………… 1. Buah Matang Sebagai Sumber Isolat BAL ..………………….. a. Buah Sirsak/Nangka Londo ............................................... b. Buah Mangga Arumanis ..................................................... 2. Bakteri Asam Laktat (BAL)………….……………………….. a. Pengertian Bakteri Asam Laktat (BAL)…………………. b. Genus BAL ………………………………………………. 1) Genus Lactobacillus …………………………….…… 2) Genus Pediococcus …………………………………… 3) Genus Leuconostoc …………………………………… 4) Genus Streptococcus dan Lactococcus ……………….. 5) Genus Enterococcus ………………………………… 6) Genus Weissella …………………………………….....
x
7 15 15 15 17 20 20 21 21 22 22 23 24 24
7) Genus Carnobacterium ………………………………
24
c. Manfaat BAL …………………………………………….. 1) Bidang Pangan …………………………………..…….. 2) Bidang Kesehatan ………………………………….….. 3. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat (BAL) ..............
25 25 25 26
III. METODE PENELITIAN ...................................................................... 29 A. B. C. D. E. F.
Waktu dan Tempat .......................................................................... Pengambilan Sampel ....................................................................... Isolasi Bakteri Asam Laktat (BAL) dari Buah Matang .................. Pengenalan Koloni BAL ................................................................ Pemurnian Isolat dan Uji Konfirmasi BAL ................................... Seleksi Isolat BAL Penghasil Antimikrobia ................................... 1) Pengujian Aktivitas Substansi Antimikrobia ............................. G. Karakterisasi dan Identifikasi BAL Terpilih .................................. 1) Karakterisasi Berdasarkan Sifat Fenotipik ................................. a. Pengamatan Makroskopis ................................................... Morfologi Koloni ................................................................ b. Pengamatan Mikroskopis .................................................... 1) Morfologi Sel ................................................................ a) Pengecatan Gram .................................................... b) Pengecatan Endospora. …....................................... c) Uji Motilitas …....................................................... c. Pengujian Sifat Biokimiawi dan Fisiologis ……………..... 1) Uji Katalase .................................................................... 2) Uji Fermentasi Karbohidrat ........................................... 3) Uji Tipe Fermentasi ........................................................ 4) Uji Pertumbuhan pada Kadar NaCl berbeda ................. 5) Uji Pengaruh Suhu …………………………………… 6) Uji Pengaruh pH............................................................ H. Identifikasi Isolat BAL Tingkat Genus (Generic AsSIgnment) dengan Metode Profile Matching .………………………….......... I. Klasifikasi Fenetik dengan Metode Numerical Taxonomy .......... 1. Koleksi Data ............................................................................... 2. Perhitungan Nilai Similaritas .................................................... 3. Konstruksi Dendogram …..........................................................
xi
29 29 29 30 31 31 31 32 34 34 34 34 34 34 35 35 36 36 36 36 37 38 38 39 39 39 39 40
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………………
41
A. Hasil ........................................................................................................ 1. Isolasi Bakteri Asam Laktat (BAL) dari Buah Matang ..................... 2. Seleksi Isolat BAL penghasil Antimikrobia ...................................... 3. Karakterisasi Fenotipik Isolat BAL Terpilih ..................................... a) Morfologi Koloni .......................................................................... b) Morfologi Sel ................................................................................ c) Pengujian Sifat Biokimiawi dan Fisiologis ................................... 4. Identifikasi Isolat BAL Tingkat Genus (Generic Assignment) dengan Metode Profile Matching ................................................... 5. Klasifikasi Fenetik dengan Metode Numerical Taxonomy ................
41 41 41 44 44 44 44
B. Pembahasan ............................................................................................
53
V. Kesimpulan dan Saran ..........................................................................
60
1. Kesimpulan ........................................................................................ 2. Saran ..................................................................................................
60 60
Daftar Pustaka ……………………………………………………..………..
61
Lampiran .......................................................................................................
67
xii
48 49
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1.
Gambar 2. Gambar 3.
Gambar 4.
Halaman Pengujian antimikrobia pada 11 isolat menggunakan Paper disc Assay (a, b, c) uji kultur dan (d, e) uji supernatan medium .................................................................................. 43 Morfologi sel isolat BAL umur 48 jam (a) isolat SIg; (b) isolat SIj, (c) isolat MAa; dan (d) isolat MAb ................................ 46 Dendogram yang menunjukkan hubungan antara BAL terpilih dengan type strain berdasarkan indeks similaritas menggunakan cara Simple Matching Coefficient (SSM) ......... 51 Model skematik pembentukan pori oleh antimikrobia pada membran sel target …………………………………………. 58
xiii
DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Tabel 2. Tabel 3. Tabel 4. Tabel 5. Tabel 6. Tabel 7. Tabel 8. Tabel 9.
Komposisi kimia buah sirsak/nangka londo per 100 g ......... Komposisi kimia buah mangga arumanis per 100 g .................. Unit karakter fenotipik yang diujikan ...................................... Isolat BAL yang diperoleh dari 2 macam buah matang …...… Diameter zona jernih (mm) penghasilan antimikrobia ............. Karakter fenotipik BAL terpilih dan strain acuan ................... Identifikasi tingkat genus (Generic Assignment) dengan metode profile matching ......................................................... Uji fenotipik isolat BAL terpilih dan type strain................... Matriks similaritas Simple Matching Coefficient (SSM) antar isolat BAL berdasarkan uji fenotipiknya terhadap 33 unit karakter …………………………….......................……........
xiv
16 19 33 41 42 47 49 50
51
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Lampiran 2.
Foto Penelitian .................................................................. Komposisi medium MRS agar (De Man, Rogosa, Sharpe)
67 68
Lampiran 3. Lampiran 4. Lampiran 5.
Komposisi medium Nutrient Broth (NB) .............................. Komposisi medium Nutrient Agar (NA) .............................. Komposisi medium Pepton Glukosa Yeast Extract (PGY) cair ………………………………………………………… Data 33 karakter hasil test unit karakter (t = 33) terhadap 4 isolat BAL terpilih setelah diolah dengan program PFE (Programmer File Editor) .................................................... Penentuan indeks similaritas Simple Matching Coefficient dengan program MVSP (Multivariate Statistical Package) Plus Version 2.0 …………………………………………… Analisis klaster berdasarkan matriks similaritas Simple Matching Coefficient ............................................................
69 69
Lampiran 6.
Lampiran 7.
Lampiran 8.
xv
70
71
72 73
Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat (BAL) Penghasil Antimikrobia dari Buah Matang Ida Fitriyani NIM. 05640007 ABSTRAK Buah diduga merupakan salah satu habitat alami bakteri, termasuk bakteri asam laktat (BAL). Hal ini disebabkan buah mengandung berbagai komposisi kimia yang diperlukan sebagai substrat bagi BAL. Penelitian ini dilakukan untuk memperoleh isolat BAL yang diisolasi dari buah sirsak dan mangga matang, memperoleh isolat BAL unggul yang menghasilkan antimikrobia, dan menentukan genus isolat BAL unggul dengan metode profile matching. BAL diisolasi dari buah matang menggunakan metode pour plate dan selanjutnya dipurifikasi dengan metode streak plate. Karakter fenotipik isolat yang diuji meliputi morfologi koloni, morfologi sel, karakter biokimiawi, dan karakter fisiologis. Isolat BAL yang diperoleh selanjutnya diseleksi berdasarkan kemampuannya menghasilkan antimikrobia dengan menggunakan bakteri indikator Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 35218, dan digunakan PAF 11 sebagai kontrol positif. pengujian aktivitas substansi antimikrobia dilakukan menggunakan metode Paper disc Assay. Klasifikasi isolat BAL dilakukan berdasarkan karakter fenotipiknya menggunakan software program identifikasi yaitu MVSP (Multivariate Stastical Package, Version 2.0) dengan algoritma pengklasteran yang digunakan adalah Average linkage atau UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages). Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh 33 isolat tetapi setelah diuji konfirmasi 11 isolat diantaranya diketahui sebagai BAL. Tujuh isolat diketahui dapat menghambat bakteri indikator baik perlakuan supernatan maupun kulturnya. Isolat SIg, SIj, MAa, dan MAb merupakan isolat BAL terpilih dengan diameter zona hambat besar berkisar antara 1,5 – 2 mm. Berdasarkan profile matching, ke-4 isolat terpilih diduga kuat sebagai anggota genus Lactobacillus. Berdasarkan konsep taksospesies, 3 isolat diantaranya yaitu SIg, MAa, dan MAb diduga sebagai spesies L. fermentum. Kata kunci: Bakteri Asam Laktat (BAL), Antimikrobia, Buah Matang, Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi
xvi
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Bakteri asam laktat (BAL) merupakan kekayaan mikrobia yang banyak tersebar di alam Indonesia. Koleksi BAL di berbagai laboratorium di Indonesia masih terbatas. Pengkajian BAL dari lingkungan alam Indonesia dilakukan untuk meningkatkan koleksi isolat tersebut1. BAL dapat diisolasi dari berbagai sumber alam maupun selama proses fermentasi beberapa makanan, dan dengan lingkungan yang berbeda diperkirakan akan diperoleh isolat BAL yang sangat bervariasi2. BAL juga banyak ditemukan pada bahan pangan yang lain diantaranya sayuran, buah-buahan, serta produk daging. Peranan BAL pada bahan pangan ini ternyata lebih banyak yang menguntungkan dibandingkan dengan yang merugikan. BAL yang aktif dalam fermentasi makanan, akan memberikan daya simpan (keawetan) produk yang lebih lama dibandingkan dengan bahan dasarnya. Keawetan ini disebabkan oleh asam laktat, khususnya maupun asam-asam yang lain yang diproduksi oleh BAL selama fermentasi dapat menekan pertumbuhan bakteri pembusuk maupun patogen. Disamping asam yang dihasilkan ternyata sejumlah spesies BAL juga mampu menghasilkan berbagai komponen yang
1
Misgiyarta & Widowati, S. Seleksi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat (BAL) Indigenous. 2002. Prosiding Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman. 2 Rahayu, E. S., et al, Isolasi Bakteri Asam Laktat dan Karakterisasi Agensia yang Berpotensi sebagai Biosafety Makanan Indonesia, Laporan Penelitian UGM Yogyakarta, 1995.
1
2
memiliki sifat antagonis terhadap bakteri lain, diantaranya hidrogen peroksida, diasetil, dan bakteriosin3. Menurut Alakomi et al. (2000), asam laktat yang diproduksi oleh kultur starter BAL dapat berfungsi sebagai antimikrobia alami. Asam laktat mampu menghambat pertumbuhan berbagai tipe bakteri pembusuk dan patogen termasuk spesies Gram negatif dalam famili Enterobacteriaceae dan Pseudomonadaceae atau yang termasuk dalam kelompok bakteri Gram positif seperti L. monocytogenes, Mycobacterium spp, S. aureus, C. perfringens, dan B. cereus4. Substansi antimikrobia adalah bahan pengawet yang berfungsi untuk menghambat kerusakan pangan akibat aktivitas mikrobia patogen. Mikrobia patogen dapat ditemukan di mana saja, di tanah, air, udara, tanaman, binatang, dan bahan pangan. Mikrobia patogen yang berpengaruh terhadap kerusakan pangan adalah Eschericia coli dan Staphylococcus aureus. Kedua mikrobia tersebut merupakan patogen indikator kualitas produk pangan. Mikroba patogen dapat terbawa sejak bahan pangan masih hidup di ladang, kolam, atau kandang ternak5. Buah dapat tercemar oleh mikrobia patogen yang berasal dari air yang tercemar limbah, tanah, atau kotoran hewan yang digunakan sebagai pupuk. Tingkat cemaran akan meningkat pada bagian tanaman yang ada di dalam tanah atau dekat dengan tanah. Air irigasi yang tercemar Shigella sp., Salmonella sp., E. coli, dan Vibrio cholerae dapat mencemari buah. Selain itu, bakteri Bacillus sp., 3
Rahayu, E.S. & S. Margino. BAL : Isolasi dan Identifikasi. Materi Workshop, Diselenggarakan di PAU Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta 13-14 Juni 1997, hal 1 4
Cotter & Hill, . Surviving the acid test: responses of Gram-positive bacteria to low pH. Microbiology Moleculer Biology 67 : 429-453, 2003. 5
Anonim. http://www.smallcrab.com/makanan-dan-gizi/652-bahaya-biologis-pada-bahan-pangan. Diakses 11 Juni 2010.
3
Clostridium sp., dan Listeria monocytogenes dapat mencemari buah melalui tanah6. BAL disebut juga food grade microorganisms atau dikenal dengan Generally Recognized As Safe (GRAS) yaitu mikrobia yang tidak beresiko terhadap kesehatan. Dengan demikian BAL dikatakan aman terutama dalam bahan pangan karena sifatnya tidak menghasilkan racun bahkan beberapa jenis diantaranya berguna bagi kesehatan. BAL bermanfaat juga untuk peningkatan kualitas higienis dan keamanan pangan melalui penghambatan secara alami terhadap flora berbahaya yang bersifat patogen7. Penggunaan bahan pengawet terutama pada bahan pangan dengan metode biologis yang dikenal dengan nama biopreservatif mulai digunakan, yaitu dengan memanfaatkan mikrobia atau hasil metabolitnya sebagai agensia antimikrobia. Faktor utama biopreservatif ini ialah pada pemilihan prosedur yang benar dimana karakteristik dari produk makanan yang akan diawetkan dan karakteristik dari mikrobia
yang
akan
digunakan
sebagai
bahan
pengawetnya
harus
dipertimbangkan, disamping keamanan produk pangan yang diawetkan. BAL mampu memproduksi asam laktat sebagai hasil pemecahan karbohidrat, hidrogen peroksida dan bakteriosin. Dengan terbentuknya zat antimikrobia dan asam maka dapat digunakan sebagai pengawet makanan dikarenakan mampu memproduksi asam organik, menurunkan pH lingkungannya 6
Anonim. http://www.smallcrab.com/makanan-dan-gizi/652-bahaya-biologis-pada-bahan-pangan. Diakses 11 Juni 2010. 7
Daeschel MA.1989. & Schillinger U & Lucke FK .1990. cit. Kusmiati & Malik .2002. Aktivitas Bakteriosin dari Bakteri Leuconostoc esenteroides pbac1 pada Berbagai Media. Makara Kesehatan, 6, 2002.
4
dan mengeksresikan senyawa seperti H2O2, diasetil, CO2, asetaldehid, d-isomer asam amino dan bakteriosin yang mampu menghambat mikrobia patogen seperti Eschericia coli dan Staphylococcus aureus. BAL efektif dalam menghambat bakteri patogen dan pembusuk dipengaruhi oleh kepadatan, strain BAL, dan komposisi media. Selain itu, produk substansi penghambat dari BAL dipengaruhi oleh media pertumbuhan, pH, dan temperatur lingkungan8. Kebutuhan manusia akan pangan semakin meningkat sehingga diperlukan adanya pemeliharaan kualitas makanan baik dari segi teknik mengawetkan makanan hingga menggunakan mikrobia tertentu yang memilki kemampuan untuk menghasilkan antimikrobia yang berpotensi sebagai bahan pengawet makanan secara alami, disamping itu dapat menghambat mikrobia patogen. Isolasi BAL dari lingkungan alam telah banyak dilakukan pada berbagai produk pangan, namun penelitian BAL yang bersumber dari buah-buahan terutama buah sirsak dan mangga matang belum banyak ditemukan. Padahal tanaman buah diduga merupakan sumber untuk mendapatkan BAL yang potensial terutama kandungan karbohidrat sederhana dan asam organiknya yang tinggi. Selain itu, pemanfaatan buah sirsak dan mangga matang pada penelitian ini dikarenakan kemelimpahannya di alam sehingga diperlukan pengkajian lebih lanjut terhadap buah tersebut baik untuk mengetahui keanekaragaman maupun kemampuan isolat indigenous dalam menghasilkan antimikrobia yang selanjutnya (jangka panjang) komponen ini dapat dimanfaatkan sebagai agensia pengawet bahan makanan (biopreservasi) terutama pada buah dan produk olahannya.
8
Campbell & Mitchell, Biologi, Edisi kelima jilid 1. Jakarta : Erlangga, 2002. hal 102
5
Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh isolat BAL unggul dari buah sirsak
dan
mangga
matang
yang
mampu
menghasilkan
antimikrobia,
mengkarakterisasi dan mengidentifikasi isolat BAL unggul secara fenotipik sehingga dapat menentukan genusnya.
B.
Identifikasi Masalah BAL merupakan kekayaan mikrobia yang banyak tersebar di alam
Indonesia. BAL banyak ditemukan pada makanan, daging yang difermentasi, adonan asam, fermentasi sayuran, buah-buahan, silase, minuman, pada tanaman, saluran pembuangan, jalur genital, jalur intestinal maupun respiratori pada manusia dan hewan. Salah satu potensi BAL adalah mampu memproduksi substansi antimikrobia, seperti asam organik, diasetil, dan bakteriosin. BAL berperan penting dalam makanan dan minuman, pengawetan makanan dengan fermentasi asam laktat merupakan perubahan makanan dan minuman menjadi produk lain yang lebih awet. Banyak bahan makanan dan minuman yang diawetkan dengan fermentasi asam laktat, seperti buah, daging, dan sayuran. Sumber isolat BAL berasal dari buah sirsak dan mangga matang, karena buah diduga merupakan salah satu habitat yang baik bagi BAL.
6
C. Permasalahan Berdasarkan latar belakang, permasalahan yang akan diteliti adalah : 1. Apakah isolat kelompok BAL dapt diperoleh dari buah sirsak dan mangga matang? 2. Apakah isolat BAL yang berhasil diisolasi dari sirsak dan mangga matang memiliki kemampuan menghasilkan antimikrobia? 3. Termasuk genus apakah isolat BAL unggul penghasil antimikrobia berdasarkan uji fenotipiknya menggunakan metode profile matching?
D. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk : 1.
Memperoleh isolat BAL dari buah sirsak dan mangga matang.
2.
Memperoleh isolat BAL unggul yang menghasilkan antimikrobia.
3.
Menentukan genus isolat BAL unggul dengan metode profile matching.
E. Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat bagi : 1. Pendidikan Dapat menambah wawasan ilmu pengetahuan di bidang mikrobiologi pangan khususnya tentang Bakteri Asam Laktat (BAL) dari buah matang yang mampu menghasilkan antimikrobia.
7
2. Peneliti a)
Memperoleh pengalaman tentang teknik isolasi dan karakterisasi bakteri khususnya BAL penghasil antimikrobia dari beberapa buah matang.
b)
Memberikan informasi ilmiah mengenai keanekaragaman BAL yang beasal dari buah matang serta kemampuannya dalam menghasilkan antimikrobia.
F. Batasan Operasional/Istilah Batasan istilah dalam penelitian ini dimaksudkan untuk menyamakan pandangan mengenai beberapa istilah utama yang digunakan dalam judul penelitian. Adapun batasan istilah yang digunakan adalah : 1. Isolasi adalah pemisahan sampel mikrobia menjadi sel-sel individu yang kemudian berkembang membentuk koloni. 2. Karakterisasi adalah suatu cara atau proses untuk mengamati dan melakukan pengukuran bagian bakteri yang dijadikan sebagai karakter khusus dari bakteri tersebut. 3. Identifikasi Bakteri adalah identifikasi yang didasarkan pada karakter fenotipik, meliputi karakter morfologi, karakter fisiologis dan biokimiawi. 4. BAL secara umum merupakan kelompok bakteri gram positif, tidak membentuk spora, berbentuk bulat atau batang, non motil, katalase negatif,
8
dan mampu menghasilkan asam laktat. Sumber energi utama adalah karbohidrat yang dapat difermentasi. 5. Buah matang yaitu buah yang bena-benar sudah masak pohon. Tingkat kematangan buah diukur dengan aroma (flavor), karakteristik warna, dan bentuk buah sudah padat penuh terutama pada bagian ujung. 6. Antimikrobia merupakan kemampuan suatu zat antimikrobia untuk menghambat atau mematikan pertumbuhan mikrobia patogen yang disebabkan oleh asam organik yang dihasilkan oleh BAL.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. HASIL 1. Isolasi BAL dari Buah Matang
Berdasarkan isolasi bakteri dari buah sirsak dan mangga matang diperoleh sebanyak 33 isolat bakteri diantaranya 29 isolat bakteri untuk sirsak dan dari buah mangga arumanis sebanyak 4 isolat bakteri. Namun, berdasarkan uji konfirmasi hanya diperoleh 11 isolat yang merupakan isolat BAL (Tabel 4). Tabel 4. Isolat BAL yang diperoleh dari 2 macam buah matang
Kode Isolat
Sumber Isolat
SIa Sib Sic SIe SIf SIg SIh SIj MAa MAb Mac
Sirsak Sirsak Sirsak Sirsak Sirsak Sirsak Sirsak Sirsak Mangga Mangga Mangga
Karakteristik Penciri Bakteri Asam Laktat Sifat Gram Katalase Endospora Bentuk sel Positif Negatif Negatif Batang Positif Negatif Negatif Batang Positif Negatif Negatif Batang Positif Negatif Negatif Batang Positif Negatif Negatif Batang Positif Negatif Negatif Batang Positif Negatif Negatif Batang Positif Negatif Negatif Batang Positif Negatif Negatif Batang Positif Negatif Negatif Batang Positif Negatif Negatif Batang
Berdasarkan Tabel 4, tampak bahwa isolat BAL yang diisolasi dari sampel buah sirsak mempunyai jumlah terbanyak yaitu 8 isolat dan dari buah mangga arumanis sebanyak 3 isolat.
41
42
2. Seleksi Isolat BAL Penghasil Antimikrobia
Sebelas isolat yang diperoleh,
selanjutnya diseleksi berdasarkan
kemampuannya menghasilkan antimikrobia menggunakan metode Paper disc Assay. Berdasarkan hasil penelitian, menunjukkan adanya pembentukan zona jernih yang menginterpretasikan bahwa isolat tersebut menghasilkan senyawa antimikrobia. Perlakuan supernatan medium dari isolat BAL menunjukkan adanya penghambatan terhadap bakteri indikator E. coli ATCC 35218, tetapi tidak mampu menghambat bakteri indikator S. aureus ATCC 25923. Sedangkan pada perlakuan kultur isolat uji, dari 11 isolat yang diuji, 7 diantaranya mampu menghambat bakteri indikator E. coli ATCC 35218 dan S. aureus ATCC 25923. Isolat SIa, SIe, SIf, dan SIh diketahui tidak menghasilkan antimikrobia. Kultur 4 isolat BAL yaitu SIg, SIj, MAa, dan MAb dan 2 isolat yaitu SIb dan SIc, diketahui mampu menghambat bakteri indikator berturut-turut E. coli ATCC 35218 dan S. aureus ATCC 25923. Adapun hasil dari uji supernatan medium 11 isolat BAL, 4 diantaranya mampu menghambat E. coli ATCC 35218 dengan diameter zona jernih yang terbentuk berbeda (Tabel 5). Tabel 5. Diameter zona jernih (mm) penghasilan antimikrobia Kode SIa SIb SIc SIe SIf SIg SIh SIj MAa MAb MAc
Kultur (mm) E. coli S. aureus ATCC 35218 ATCC 25923 1 1,4 2 1,5 0,8 1,8 -
PAF 11 (Kontrol Positif) (mm) 1 1 1,5 1,5 1,5 1 -
Supernatan (mm) E. coli S. aureus ATCC 35218 ATCC 25923 2 1,3 1,6 0.8 -
PAF 11 (Kontrol Positif) (mm) 1 1 0,9 0,9 0,9 1
43
Berdasarkan Tabel 5, tampak bahwa isolat SIg, SIj, MAa, dan MAb membentuk diameter zona jernih paling besar yaitu 2 mm, 1,5 mm, 1,6 mm, dan 1,8 mm. Dengan demikian ke-4 isolat BAL ini terpilih untuk diidentifikasi lebih lanjut. Adapun PAF 11 sebagai kontrol positif menunjukkan penghambatan terhadap indikator. Adapun gambar hasil pengujian antimikrobia disajikan pada Gambar 1.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Gambar 1. Pengujian antimikrobia pada 11 isolat menggunakan Paper disc Assay (a, b, c) uji kultur isolat dan (d, e) uji supernatant medium.
44
3. Karakterisasi Fenotipik Isolat BAL Terpilih
Empat (4) isolat BAL terpilih yaitu SIg, SIj, MAa, dan MAb yang memiliki aktivitas penghambatan tertinggi dikarakterisasi berdasarkan sifat fenotipiknya. Adapun isolat Lactobacillus fermentum FNCC 0104 dan L. plantarum FNCC 0026 digunakan sebagai type strain acuan (Tabel 6). a) Morfologi Koloni
Keempat isolat BAL terpilih yaitu SIg, SIj, MAa, dan MAb mempunyai karakter morfologi koloni yang hampir sama yaitu bentuk koloni circulair dan warna koloni krem. Begitu pula halnya dengan 2 isolat type strain acuan. b) Morfologi Sel
Keempat isolat terpilih yaitu SIg, SIj, MAa, dan MAb mempunyai karakter morfologi sel yang sama yaitu bentuk sel batang, gram positif, tidak motil, tidak membentuk endospora, dan susunan selnya membentuk rantai (Gambar 2). c) Pengujian Sifat Biokimiawi dan Fisiologis
Hasil uji biokimiawi menunjukkan bahwa isolat SIg, SIj, MAa, dan MAb, tidak mampu menghasilkan enzim katalase. Uji kemampuan fermentasi karbohidrat berupa pembentukan asam dan gas dari berbagai sumber karbon menunjukkan hasil yang bervariasi antara keempat isolat (Tabel 6). Semua isolat baik isolat acuan maupun isolat uji mampu memfermentasi glukosa menghasilkan asam dan gas.
45
Uji fisiologis yang meliputi pengaruh variasi pH, suhu, dan kadar NaCl terhadap pertumbuhan isolat memperlihatkan adanya variasi diantara keempat isolat. Begitu pula halnya dengan 2 strain acuan. Isolat SIg mampu tumbuh pada pH 4,5 sedangkan isolat SIj, MAa, dan MAb tidak mampu tumbuh. Semua isolat mampu tumbuh pada pH 8.0 sampai dengan pH 9,0 dan tidak tumbuh pada pH 3,0 dan pH 4,0. Pertumbuhan pada suhu yang berbeda cukup bervariasi diantara keempat isolat, suhu 37°C dapat dikatakan sebagai suhu optimal pertumbuhan BAL. Pada kadar NaCl 5%, 6,5%, 10% dan 18% tampak bahwa 4 isolat BAL terpilih tidak
dapat
tumbuh, sedangkan
pertumbuhannya pada kadar NaCl 5% dan 6,5%.
2
strain
acuan
menunjukkan
46
(a)
(c)
(b)
(d)
Gambar 2. Morfologi sel isolat BAL umur 48 jam perbesaran (40x10) (a) isolat SIg; (b) isolat isolat SIj; (c) isolat MAa; dan (d) isolat MAb
47
Tabel 6. Karakter fenotipik BAL terpilih dan strain acuan. Kode Isolat (OTU) Pengamatan
SIg
SIj
MAa
MAb
L. fermentum FNCC 0104
L. plantarum FNCC 0026
Bentuk koloni
Circulair
Circulair
Circulair
Circulair
Circulair
Circulair
Warna koloni
Krem
Krem
Krem
Krem
Krem
Krem
Batang
Batang
Batang
Batang
Batang
Batang
A. Morfologi Koloni
B. Morfologi Sel Bentuk sel Reaksi Gram
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Motilitas
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Endospora
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Susunan sel
Rantai
Rantai
Rantai
Rantai
Rantai
Rantai
C. Karakter Biokimiawi Katalase Tipe Fermentasi
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Heteroferm.
Heteroferm.
Heteroferm.
Heteroferm.
Heteroferm.
Heteroferm.
Pembentukan asam : Sukrosa
+
+
+
+
+
+
Mannitol
-
+
-
-
-
-
Glukosa
+
+
+
+
-
-
Laktosa
-
-
-
-
+
+
Maltosa
+
+
+
-
-
-
Pembentukan gas : Sukrosa
-
-
-
-
-
-
Mannitol
-
-
-
-
-
-
Glukosa
+
+
+
+
+
-
Laktosa
-
-
-
-
-
-
Maltosa
-
-
-
-
-
-
37°C
+
+
+
+
+
+
45°C
-
+
+
-
+
+
50°C
-
-
-
-
+
+
D. Uji Fisiologis Pertumbuhan pada suhu :
48
Tabel 6. Karakter fenotipik isolat BAL terpilih dan strain acuan (Lanjutan) Kode Isolat (OTU) Pengamatan
SIg
SIj
MAa
MAb
L. fermentum FNCC 0104
L. plantarum FNCC 0026
3,0
-
-
-
-
+
+
3,5
-
-
-
-
+
+
4,0
-
-
-
-
+
+
4,5
+
-
-
-
+
+
8,0
+
+
+
+
+
+
8,5
+
+
+
+
+
+
9,0
+
+
+
+
+
+
Pertumbuhan pada NaCl : 5%
-
-
-
-
+
+
6,5%
-
-
-
-
+
+
10%
-
-
-
-
-
-
18%
-
-
-
-
-
-
Pertumbuhan pada pH :
4. Identifikasi Isolat BAL Tingkat Genus (Generic Assignment) dengan Metode Profile Matching
Isolat BAL potensial yang menghasilkan antimikrobia selanjutnya diidentifikasi berdasarkan karakter fenotipiknya dengan metode Profile Matching yang menunjukkan bahwa berdasarkan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994), isolat terpilih SIg, SIj, MAa, dan MAb memiliki karakter yang mirip dengan karakter yang dimiliki anggota genus Lactobacillus (Tabel 7).
49
Tabel 7. Identifikasi tingkat genus (Generic Assignment) dengan metode profile matching Karakteristik
Lactobacillus
SIg
SIj
MAa
MAb
+
+
+
+
+
2. Susunan sel
Rantai
Rantai
Rantai
Rantai
Rantai
3. Reaksi gram
+
+
+
+
+
4. Endospora
-
-
-
-
-
5. Katalase
-
-
-
-
-
6. Motilitas
-
-
-
-
-
Homo/heteroferm.
Heteroferm.
Heteroferm.
Heteroferm.
Heteroferm.
+/+/-
-
+
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1. Bentuk sel batang
7. Tipe fermentasi : homo/heteroferm. 8. Pertumbuhan pada suhu 45°C 9. Pertumbuhan pada pH 4,5 10. Pertumbuhan pada % NaCl 6,5% 11. Pertumbuhan pada % NaCl 18%
+/+/-
Keempat isolat terpilih yaitu SIg, SIj, MAa, dan MAb memiliki karakter fenotipik antara lain bentuk sel batang, membentuk rantai, reaksi gram positif, tidak motil, tidak membentuk endospora, katalase negatif, tipe fermentasi heterofermentatif, pertumbuhan pada pH 4,5 positif/negatif, pertumbuhan pada suhu 45°C positif/negatif, dan tidak dapat tumbuh pada 6,5-18% NaCl, sehingga diduga kuat merupakan anggota genus Lactobacillus.
E. Klasifikasi Fenetik dengan Metode Numerical Taxonomy
Hasil karakter fenotipik 4 isolat BAL terpilih dan 2 type strain selanjutnya disusun dalam matriks nxt (Tabel 8).
50
Tabel 8. Uji fenotipik isolat BAL terpilih dan type strain Karakter Fenotipik (t)
Kode isolat (OTU) (n) L. fermentum FNCC 0104
SIg
SIj
MAa
MAb
+ + + + + +
+ + + + + +
+ + + + + +
+ + + + + +
+ + + + + +
+ + + + + +
Sukrosa
+
+
+
+
-
-
Mannitol
-
+
-
-
-
-
Glukosa
+
+
+
+
+
+
Laktosa
-
-
-
-
-
-
Maltosa
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Bentuk Koloni : Circulair Warna koloni : Krem Bentuk sel : Batang Susunan sel : Rantai Gram Positif Motilitas Endospora Katalase Heterofermentatif
L. plantarum FNCC 0026
Penghasilan asam :
Penghasilan gas : Sukrosa Mannitol
-
-
-
-
-
-
Glukosa
+
+
+
+
+
-
Laktosa
-
-
-
-
-
-
Maltosa
-
-
-
-
-
-
Pertumuhan pada suhu : 37°C
+
+
+
+
+
+
45°C
-
+
+
-
+
+
50°C
-
-
-
-
+
+
3,0
-
-
-
-
+
+
3,5
-
-
-
-
+
+
4,0
-
-
-
-
+
+
4,5
+
-
-
-
+
+
8,0
+
+
+
+
+
+
8,5
+
+
+
+
+
+
9,0
+
+
+
+
+
+
Pertumbuhan pada % NaCl : 5% 6,5% 10% 18%
-
-
-
-
+ + -
+ + -
Pertumbuhan pada pH:
51
Berdasarkan data dari uji fenotipik, kemudian dilakukan penghitungan nilai similaritas antar isolat (Tabel 8). Tabel 9. Matriks Similaritas Simple Matching Coefficient (SSM) antar isolat bakteri asam laktat berdasarkan uji fenotipiknya terhadap 33 unit karakter SIg
SIj
MAa
MAb
L. fermentum FNCC 0104
SIg
100
SIj
90,9
100
MAa
93,9
97,0
100
MAb L. fermentum FNCC 0104
93,9
90,9
93,9
72,7
69,7
72,7
72,7
100
L. plantarum FNCC 0026
69,7
66,7
69,7
69,7
97,0
L. plantarum FNCC 0026
100 100
Berdasarkan nilai matriks similaritas tersebut kemudian dilakukan konstruksi dendogram dengan menggunakan algoritma Average linkage atau UPGMA (Gambar 3).
Gambar 3. Dendogram yang menunjukkan hubungan antar BAL terpilih dengan type strain berdasarkan indeks similaritas menggunakan cara Simple Matching Coefficient (SSM)
52
Berdasarkan Tabel 9, tampak bahwa isolat SIj dan MAa memiliki kemiripan 97%. Isolat SIg, MAa, dan MAb memiliki indeks similaritas dengan type strain L. fermentum FNCC 0104 sebesar 72,7%, dengan demikian berdasarkan konsep taksospesies yang menyatakan bahwa beberapa strain mikrobia dikelompokkan dalam satu spesies yang sama apabila memiliki indeks similaritas ≥ 70% maka isolat SIg, MAa, dan MAb diduga kuat merupakan anggota genus Lactobacillus dengan jenis L. fermentum. Tiga isolat dari 4 isolat BAL terpilih diduga merupakan spesies L. fermentum sedangkan isolat SIj memiliki kemiripan yang rendah dengan 2 type strain sehingga belum dapat diketahui spesiesnya.
53
B. PEMBAHASAN
Hasil isolasi menunjukkan bahwa dari buah sirsak diperoleh jumlah isolat terbanyak dibandingkan buah mangga. Hal ini disebabkan pada buah sirsak terdapat kandungan karbohidrat yang lebih tinggi sebesar 16,3 gr dibandingkan dengan buah mangga sebesar 11,9 gr. Karbohidrat merupakan sumber karbon dan energi untuk substrat pertumbuhan. Karbohidrat merupakan polisakarida, yang kemudian dihidrolisis menjadi monosakarida (Glukosa). Menurut Ray dan Daeschel (1992), mikrobia akan berkembangbiak dengan cepat menjadi populasi yang besar pada substrat yang membusuk dan mengandung cukup gula. Selanjutnya glukosa dihidrolisis lebih lanjut melalui jalur glikolisis atau Emden-Meyerhof-Parnas (EMP). Glikolisis adalah pemecahan glukosa menjadi piruvat atau asam laktat. Glikolisis merupakan lintasan utama pemakaian glukosa, terjadi dalam sitosol semua sel bakteri dengan tujuan untuk menghasilkan energi (ATP). Glikolisis dapat terjadi pada suasana aerobik maupun anaerobik. Pada suasana aerobik dapat menghasilkan 6 atau 8 ATP dan 2 molekul asam piruvat per molekul glukosa, Apabila glikolisis terjadi dalam suasana anaerobik maka akan menghasilkan 2 ATP dan 2 molekul asam laktat60. Kelompok BAL selain menghasilkan asam laktat secara homofermentatif juga secara heterofermentatif. BAL homofermentatif memfermentasikan glukosa melalui jalur glikolisis atau Emden-Meyerhof-Parnas (EMP) menghasilkan asam laktat kurang lebih 85% dari glukosa. BAL heterofermentatif menghasilkan asam
60
Atlas, Principles of Microbiology, Second Edition, Wm. C. Brown Published : USA, 1997.
54
laktat melalui jalur fosfoketolase atau Hexose Monophosphate Shunt (HMS) dan menghasilkan asam laktat kurang lebih 50% dan produk lainnya berupa etanol, asam asetat, CO2, dan hidrogen peroksida. Perbedaan dua jalur metabolisme ini didasarkan pada enzim yang dimiliki masing-masing golongan. Pada jalur glikolisis (EMP) enzim yang terlibat adalah 1,6 - diphosphate aldolase sedangkan pada jalur fosfoketolase (HMS) enzim yang terlibat adalan phosphoketolase61. Beberapa anggota spesies BAL telah dilaporkan berhasil diisolasi dari buah dan tanaman. Ray dan Daeschel (1992), menyatakan kebanyakan mikrobia fermentatif seperti BAL dapat dengan mudah diisolasi dari tanaman. Menurut Daeschel (1989) BAL dapat memproduksi antimikrobia yang dapat menghambat bakteri patogen dan pembusuk seperti Staphylococcus aureus, Eschericia coli, dan Listeria monocytogenes. Dengan demikian BAL banyak dimanfaatkan sebagai biopreservasi62. Berdasarkan hasil pengujian, menunjukkan adanya aktivitas antimikrobia BAL terhadap bakteri indikator yaitu S. aureus ATCC 25923 dan E. coli ATCC 35218. Pengujian aktivitas antimikrobia terhadap bakteri patogen dilakukan pada supernatan medium BAL dan kulturnya. Pengujian dengan dua perlakuan tersebut bertujuan untuk mengetahui asal penghambatan apakah berasal dari hasil metabolismenya atau dari selnya. Kultur BAL yang memberikan zona jernih adalah kultur yang memiliki daya antagonistik terhadap bakteri yang diuji,
61
Rahayu, E.S. & S. Margino. BAL : Isolasi dan Identifikasi. Materi Workshop, Diselenggarakan di PAU Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta 13-14 Juni 1997.
62
Suardana, I. W., et al.,. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Cairan Rumen Sapi Bali sebagai Kandidat Biopreservatif . 2007. Jurnal Veteriner. 8 : 155 – 159
55
sedangkan supernatan yang memberikan zona jernih diduga merupakan supernatan BAL penghasil antimikrobia selain asam. Besar kecilnya zona jernih yang muncul setara dengan besar besar kecilnya aktivitas antimikrobia yang terdapat pada kultur atau supernatan mediumnya63. Menurut Ardiansyah (2007) penghambatan mikrobia oleh senyawa antimikrobia dapat disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain gangguan pada senyawa penyusun dinding sel, peningkatan permeabilitas membran sel yang dapat menyebabkan kehilangan komponen penyusun sel, menginaktivasi enzim, dan destruksi atau kerusakan fungsi material genetik. Menurut Pelczar & Chan (1986) Bakteri Gram positif cenderung lebih sensitif terhadap komponen antibakteri. Hal ini disebabkan oleh struktur dinding sel bakteri Gram positif lebih sederhana sehingga memudahkan senyawa antibakteri untuk masuk ke dalam sel dan menemukan sasaran untuk bekerja, sedangkan struktur dinding sel bakteri Gram negatif lebih kompleks dan berlapis tiga, yaitu lapisan luar berupa lipoprotein, lapisan tengah yang berupa peptidoglikan dan lapisan dalam lipopolisakarida. Pada penelitian ini, antimikrobia dari BAL kurang sensitif terhadap kelompok bakteri gram positif dikarenakan pada dinding selnya terdiri dari lapisan mukokompleks yang tebal. Mukokompleks tersusun oleh peptidoglikan dan pada dinding selnya terdapat asam teikoat yang berfungsi sebagai reseptor permukaan sel sensitif. Menurut Haskard et al, (2001) Walaupun lapisan peptidoglikan pada bakteri gram positif ini cukup tebal, namun peristiwa 63
Rahayu, E. S., Bakrteri Asam Laktat dalam Fermentasi dan Pengawetan Makanan, Seminar Nasional Industri Pangan, 2000.
56
pemutusan ikatan oleh asam akan menurunkan ketebalan, melonggarkan ikatan silang antar komponen dan pada akhirnya akan memperbesar ukuran lubang. Kondisi yang terjadi pada dinding sel memungkinkan antimikrobia untuk terikat pada dinding sel dan plasma membran dengan suatu mekanisme pengikatan tertentu. Pada penelitian ini aktivitas antimikrobia dari BAL lebih sensitif terhadap E. coli ATCC 35218 yaitu kelompok gram negatif, hal ini dimungkinkan karena adanya perbedaan kepekaan pada bakteri gram positif dan bakteri gram negatif terhadap senyawa antimikrobia. Mekanisme penghambatan pertumbuhan sel bakteri Gram negatif oleh asam laktat menurut Alakomi et al. (2000) terutama dengan menyebabkan sublethal injury pada sel bakteri, injury tersebut dapat juga merusak lapisan lipopolisakarida (LPS) pada permukaan membran sel, sehingga permeabilitas membran luar sel menjadi terganggu. Dengan rusaknya membran luar sel, maka kondisi asam pada lingkungan sel dapat masuk ke dalam sel sehingga merusak aktivitas intraselular yang pada akhirnya dapat mematikan sel. Menurut Lunggani (2007) asam yang terlalu tinggi akan mengakibatkan LPS lisis dan memacu terjadinya lubang pada dinding selnya. Antimikrobia bisa masuk ke dalam sel dan kontak dengan membran sitoplasma sehingga mempengaruhi sintesis energi dan permeabilitas dinding sel yang akhirnya menyebabkan kematian pada bakteri64. Menurut Ray (1996), pada umumnya mekanisme penghambatan antimikrobia (bakteriosin) terjadi melalui destabilisasi membran sitoplasma 64
Soetarto et al., 1999; Brock & Madigan, 1980 and Ray, 1996.
57
mempengaruhi
sintesis
energi
dan
permeabilitas
dinding
sel
akhirnya
menyebabkan lisisnya sel. Pembentukan pori pada membran sel merangsang permeabilitas membran yang dapat mengganggu keseimbangan ADP/ATP intraseluler akibat kebocoran fosfat inorganik (Martinez et al, 2000), mengurangi daya gerak proton dan jumlah kation bivalensi (Mg2+ atau Ca2+) menyebabkan penetralan muatan negatif fosfolipid, dan penurunan cairan membran, memungkinkan perembesan ion (K+ dan Mg2+), asam amino (asam glutamat dan lisin) dan ATP65. Daya gerak proton (Proton Motive Force = PMF) merupakan gradien elektrokimia membran sitoplasma yang mengatur sintesis dan penimbunan ATP. Kegagalan PMF menyebabkan kemtian sel melalui penghentian semua reaksi yang membutuhkan energi. Menurut
Moll
et
al,
(1999)
Antimikrobia
(bakteriosin)
dalam
pembentukan pori harus berinteraksi dengan membran sitoplasma sel target. Lipid membran sitoplasma yang bermuatan negatif merupakan reseptor utama antimikrobia (bakteriosin) dalam proses pembentukan pori. Interaksi elektrostatik antimikrobia
(bakteriosin)
yang
bermuatan
positif
yang
bersifat
hidrofobik66dengan gugus fosfat bermuatan negatif pada membran sel target merupakan tahap awal pengikatan antimikrobia (bakteriosin) dengan membran target. Bagian hidrofobik bakteriosin masuk ke dalam membran membentuk pori. Konduktivitas dan stabilitas pori pada bakteriosin (lantibiotik) ditingkatkan 65
Oscarriz & Pissabaro, Classification and Mode of Action of Membrane-active Bactericons Produced by Gram-Positive Bacteria. International Bacteriology 4 : 13-15. 2001
66
Cleveland, et al., Bacteriocins : Safe, Natural Antimicrobials for Food Preservation. International Journal Food Microbiology 71 : 1-20. 2001
58
melalui pengikatan molekul (molecule docking) sedangkan antimikrobia (bakteriosin) kelas II, reseptor membran target bekerja terhadap spesifikasi tertentu67. Gambar 4 menunjukkan model skematik pembentukan pori oleh antimikrobia (bakteriosin) pada membran sel target68.
67
Chen & Hoover, Bacteriocins and Their Food Application. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 2 : 82-100. 2003
68
Paul D. Cotter, Colin Hill & R. Paul Ross. Mode Of Action Of Lactic Acid Bacteria Bacteriocins.http://www.nature.com/nrmicro/journal/v3/n10/images/nrmicro1273-f2.gif. Diakses 11 Juni 2010
59
Hasil identifikasi menunjukkan bahwa 11 isolat diidentifikasi sebagai BAL dengan karakter penciri gram positif, non motil, non endospora, dan katalase negatif . Berdasarkan hasil identifikasi isolat BAL tingkat genus dengan metode profile matching diketahui bahwa isolat SIg, SIj, MAa, dan MAb termasuk dalam anggota genus Lactobacillus. Berdasarkan konsep taksospesies, strain mikrobia yang mengelompok
dalam satu spesies yang sama apabila memiliki indeks similaritas ≥ 70%. Isolat SIg, MAa, dan MAb diduga kuat merupakan anggota genus Lactobacillus dengan jenis L. fermentum sedangkan isolat SIj memiliki kemiripan yang rendah dengan 2 type strain sehingga belum dapat diketahui spesiesnya.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa : 1. Diperoleh 33 isolat yang berhasil diisolasi dari buah mangga dan sirsak, 11 isolat diantaranya diidentifikasi sebagai BAL. 2. Isolat SIg, SIj, MAa, dan MAb membentuk diameter zona jernih paling besar. 3. Isolat terpilih yaitu SIg, SIj, MAa, dan MAb, diidentifikasi sebagai anggota genus Lactobacillus. 4. Berdasarkan konsep taksospesies, isolat SIg, MAa, dan MAb diduga kuat sebagai jenis L. fermentum.
B. Saran
Kemampuan isolat-isolat hasil penelitian ini dalam hal pengawetan produk makanan belum diketahui sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai karakterisasi jenis antimikrobia yang dihasilkan dan penerapannya dalam mengawetkan produk makanan khususnya buah dan produk asal buah.
60
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2005. Sirsak. Jakarta : Badan Pendayagunaan dan Pemasyarakatan Teknologi. . 2007. Khasiat Buah-buahan dan Sayuran. http://bluejack.binus.ac.id/042/viewtopic.php?t=494. Diakses 18 Agustus 2009. . 2009a. Sirsak (Annona muricata Linn). http://www.iptek.net.id/ind/teknologi_pangan/index.php?mnu=2&id=171. Diakses 11 September 2009. . 2009b. Teknologi Pengolahan Sari Buah Mangga. http://www.mangga.info/content/teknologi-pengolahan-sari-buah-mangga. Diakses 24 Agustus 2009. . 2009c. Mangga Arumanis 143. http://www.iptek.net.id/ind/teknologi_pangan/index.php?mnu=2&id=103. Diakses 11 September 2009. .2010. Bahaya Biologis pada Bahan Makanan. http://www.smallcrab.com/makanan-dan-gizi/652-bahaya-biologis-padabahan-pangan. Diakses 11 Juni 2010. Alakomi, H. L, Skytta, Saarela, Mattila-Sandholm, Latva-Kala, & Helander. 2000. Lactic acid permeabilizes Gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane. Applied and Environmental Microbiology 66 : 2001-2005 Antara, N. S., I. N. Dibia & W. R. Aryanta. 2009. Karakteristik Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Susu Kuda Bima. Agritech, 29. 2009. Ashari, S. 2004. Biologi Reproduksi Tanaman Buah-Buahan Komersial. Malang : Bayumedia Publishing. Ardiansyah. 2007. Antimikroba dari Tumbuhan. http ://www.beritaiptek.com. Diakses 9 Juni 2010. Atlas, R. M. 1997. Principles of Microbiology, Second Edition. Wm. C. Brown Published : USA. Bachrudin, Z., Astuti, & Y.S. Dewi. 2000. Isolasi dan Seleksi mikroba Penghasil Laktat dan Aplikasinya pada Fermentasi Limbah Industri Tahu. Prosiding Seminar Nasional Industri Enzim dan Bioteknologi.
61
62
Bastian, Februadi, A.B. Tawali & A. Laga. 2004. Mempelajari Pengaruh Suhu Penyimpanan Terhadap Mutu Buah Apel Varietas Red Delicious (Malus sylvetris). Seminar Hasil Penelitian, pada hari Rabu, 29 Desember 2004. di laboratorium Rekayasa Pangan Jurusan Teknologi Pertanian Unhas. Biswas, S.R., P. Ray, M. C. Johnson & B. Ray. 1991. Influence of Growth Condition on The Production of a Bacteriocin, Pediocin AcH by Pediococcus acidilactici H. Applied and Environmental Microbiology, 57 : 1265-1267. Brock, T.D. & Madigan, M.T. 1980. Biology of Microorganism. Prentice Hall Englewood Cliffs, New Jersey. Brown, A. E., 2005. Benson’s Microbiological Applications complete version : Labotarory Manual In General Microbiology, Ninth Edition. McGraw-Hill Companies, Inc., 1211 Avenue of the Americas, New York, NY 10020. Chen, H. & D. G. Hoover. 2003. Bacteriocins and Their Food Application. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 2 : 82-100. Choi, H.J., C. I. Cheigh, S. B. Kim, J. C. Lee, D. W. Lee, S. W. Choi, J. M. Park & Y. R. Pyun. 2002. Weissella kimchii sp. nov., a novel lactic acid bacterium from kimchi. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52 : 507-511. Cintas, L.M., M. P. Casaus. C. Herranz, I. F. Nes. & P. E. Hernández. 2001. Review: Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Food Science and Technology International, 7 : 281-305. Cleveland, J., T. J. Montville, I.F. Nes & M. L. Chikindas. 2001. Bacteriocins : Safe, Natural Antimicrobials for Food Preservation. International Journal Food Microbiology 71 : 1-20. Cotter, P.D,, & Hill, C. 2003. Surviving the acid test: responses of Gram-positive bacteria to low pH. Microbiology Moleculer Biology 67 : 429-453 Daeschel, M.A.1989. Antimicrobial Substance from Lactic Acid Bacteria for Use as Food Preservation. Journal Food Technology, 43 : 148-155. Djaafar, T.F., E.S.Rahayu, D. Wibowo & S. Sudarmadji. 1996. Substansi Antimikrobia Bakteri Asam Laktat yang diisolasi dari Makanan Hasil Fermentasi Tradisional Indonesia. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia. 6 : 1521.
63
Djaafar, T.F., E.S.Rahayu, D. Wibowo & S. Sudarmadji. 1996. Antimicrobial Substance Produce by Lactobacillus sp. TGR-2 Isolat from Growol. Indonesian Food and Nutrition Progress. Food and Nutrition Development and Research Center. Gadjah Mada University, Yogyakarta. Feliatra, I. Efendi, & E. Suryadi. 2004. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan Kerapu MAcan (Ephinephelus fuscogatus) dalam Upaya Efisiensi Pakan Ikan. Jurnal Natur Indonesia 6 : 75-80. Goldin, B. R. 1998. Health Benefit of Probiotic. Department of Family Medicine and Community Health, Boston. Hardy, K.G. 1975. Colicinogeny and Related Phenomena. Bacteriological Reviews, 39 : 464-515. Harley, J.P. 2005. Laboratory Exercises In Microbiology, Sixth Edition. McGrawHill Companies, Inc., 1211 Avenue of the Americas, New York, NY 10020. Haskard, C. A., Nezami, H., Kankanpaa, P. E. Salminen, S & Ahokas, J. T. 2001. Surface binding of Aflatoxin B1 by Lactic Acid Bacteria. Applied and Enviromental Microbiology, 67 : 3086 - 3091. Holt, J. G., N. R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley & S.T. Williams. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9th Edition. Williams and Wilkins. Baltimore. Juoetono, J. Soedarsono, S. Hartadi, S.Kabirun, Suhadi & Susanto. 1973. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Yogyakarta : Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM. Kandler, O. & N. Weiss. 1995. Bergey’s Manual : Systematic Bacteriology. The Williams and Wilkins Company, Baltimore, M.D. Kusmiati & Malik, A. 2002. Aktivitas Bakteriosin dari Bakteri Leuconostoc esenteroides pbac1 pada Berbagai Media. Makara Kesehatan, 6 .2002. Lay, B. W. 1994. Analisis Mikrobia di Laboratorium. Jakarta : PT Raja Grafindo Persada. Leveau, J.Y., M. Bovix and H. de Roissart. 1995. The Lactic Microflora. In Bourgeois, C. M. & J.Y. Leveau (eds.). Microbiological Control For Food and Agricultural Products. VCH Publishers, Inc. New York. Lücke, F.K. 1997. Fermented sausages. In: Microbiology of Fermented Foods. WOOD, J.B. (Ed.). Elsevier Applied Science, New York.
64
Lunggani, A.T. 2007. Kemampuan Bakteri Asam Laktat Dalam Menghambat Pertumbuhan dan Produksi Aflatoksin B2 Aspergilllus flavus. BIOMA, 9 : 45-51. Martinez. B., A. Rodriquez & J.E. Suarez. 2000. Lactococcin 972, Bacteriocin that Inhibits Septum Formation in Lactococci. Microbiology 146: 949-955. Misgiyarta & Widowati, S. 2002. Seleksi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat (BAL) Indigenous. Prosiding Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman. Misgiyarta & Widowati, S. 2002. Efektifitas Bakteri Asam Laktat (BAL) dalam Pembuatan Produk Fermentasi Berbasis Protein atau Susu Nabati. Prosiding Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman. Moll, G. N., W.N. Koning & A. J. M. Driessen. 1999. Bacteriocins : Mechanisms of Membrane Insertion and Pore Formation. Antonie Van Leeuwenhoek 76 : 185 : 198. Nugroho, D.A. & E.S. Rahayu. 2003. Ekstraksi dan Karakterisasi Bakteriosin yang Dihasilkan Oleh Leuconostoc mesentroides SM 22. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan, 14. 2003. Oscarriz, J.C. & A.G. Pissabaro. 2001. Classification and Mode of Action of Membrane-active Bactericons Produced by Gram-Positive Bacteria. International Bacteriology 4 : 13-15. Parente, E. & A. Ricciardi.1999. Production, Recovery, and Purification of Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria. Applied Microbiology Biotechnology, 52 : 628-638. Paul D. Cotter, Colin Hill & R. Paul Ross. 2010. Mode Of Action Of Lactic Acid BacteriaBacteriocins. Http://www.nature.com/nrmicro/journal/v3/n10/images/nrmicro1273-f2.gif. Diakses 11 Juni 2010. Pato, U. 2003. Potensi Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Dadih untuk Menurunkan Resiko Penyakit Kanker. Jurnal Natur Indonesia 5 : 162-166. Pelczar, M. J., & Chan E. C.S. 1986. Dasar-dasar mikrobiologi 2. Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia. Priest, F & B. Austin. 1993. Modern Bacterial Taxonomy. Second Edition. London :Chapman & Hall.
65
Prihatman, K. 2000. Mangga (Mangifera spp). Jakarta : Badan Pendayagunaan dan Pemasyarakatan Teknologi. Putri,
E. 2009. Sirsak (Annona muricata). . http://www.iptek.net.id/ind/teknologi_pangan/index.php?mnu=2&id=171. Diakses 11 September 2009.
Rahayu, E.S.,S. Sudarmadji, D. Wibowo, & T.F. Djaafar. 1995. Isolasi Bakteri Asam Laktat dan Karakterisasi Agensia yang Berpotensi sebagai “Biosafety” Makanan Indonesia. Laporan Penelitian dan Pengabdian Masyarakat. Pusat Antar Universitas. Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Rahayu, E.S. & S. Margino. 1997. BAL : Isolasi dan Identifikasi. Materi Workshop, Diselenggarakan di PAU Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta 13-14 Juni 1997. Rahayu, E. S., A. Ekasari, A.K. Wardani, & S. Margino. 1999. Skrining Bakteri Asam Laktat dari Daging dan Produk olahannya sebagai Penghasil Bakteriosin. Prosiding Seminar Nasional Pangan Yogyakarta, 14 September 1999. Rahayu, E. S. 2000. Bakteri Asam Laktat dalam Fermentasi dan Pengawetan Makanan. Seminar Nasional Industri Pangan. Ray, B. 1996. Fundamental Food Microbiology. CRC Press. Boca Raton, Florida. Ray, B. & M. Daeschel. 1992. Food Biopreservatives of Microbial Origin. CRC Press. Boca Raton, Florida. Sarkono. 2005. Isolasi, Seleksi, Karakterisasi, dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Penghasil Bakteriosin dari berbagai Buah Masak. Tesis. Sekolah Pascasarjana. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Seeley, H.W., P.J. Van Demark, & J.J. Lee. 2001. Microbes in Action. A Labotatory Manual of Microbiology, Fourth Edition. W.H. Freeman & Company. New York, pp. 225-266. Soetarto, A. E. S., T. T. Suharni, & S. Y. Nastiti. 1999. Handout Mikrobiologi I. Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Suardana, I. W., I. N. Suarsana, I. N. Sujaya, & K. G. Wiryawan. 2007. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Cairan Rumen Sapi Bali sebagai Kandidat Biopreservatif . Jurnal Veteriner. 8 : 155 – 159 Sukarmin. 2009. Teknik Penyerbukan pada Tanaman Sirsak. Buletin Teknik Pertanian, 14 : 9-11.
66
Suelarso, B. 1988. Budidaya Apel. Yogyakarta : Kanisius. Suwarno,W.B. 2008. Pemuliaan Tanaman Mangga. http://www.fp.unud.ac.id/biotek/wp-content/uploads/2009/02/pemuliaanmangga.pdf. Diakses 18 Agustus 2008 Syafi’ i, I. 2008. Mengenal Probiotik dan Manfaatnya Bagi Kesehatan. http://www.poltekkes-soepraoen.ac.id/?prm=artikel&var=detail&id=39. Diakses 28 Juli 2009. Tagg J.R., Dajani, & Wannamaker. 1976. Bacteriocins of Gram Positive Bacteria. Bacteriology Reviews, 40 : 722-756. Wahyudi, D. 2009. Isolasi, Karakterisasi, Purifikasi dan Aktivitas Antimikrobia dari Bacteriosin yang Diproduksi Oleh Bakteri Asam Laktat Terhadap Pertumbuhan Beberapa Bakteri Patogen dan Pembusuk Makanan. http://www.aaknasional.ac.id/berita.php?ct=2009-07-01%2012:28:20. Diakses 28 Juli 2009. Waluyo, L. 2008. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi. Malang : UMM Press.
67
Lampiran 1. Foto Penelitian
Isolasi BAL dari Buah Sirsak (Nangka Londo)
Isolasi BAL dari Buah Mangga Arumanis
68
Lampiran 2. komposisi medium MRS agar (De Man,Rogosa, Sharpe) Komposisi per liter : Peptone
……………………………………………………….. 10,0 g
’Lab-Lemco’ powder ………………………………………….
8.0 g
Yeast extract ……………………………………………………
4.0 g
Glucose
……………………………………………………….. 20.0 g
Sorbitan mono-oleate (tween 80) ……………………………….
1 ml
Dipotassium hydrogen phosphate ……………………………….
2.0 g
Sodium acetate 3H2O ..................................................................
5.0 g
Triammonium citrate ...................................................................
2.0 g
Magnesium sulphate 7H2O ............................................................
0.2 g
Manganese sulphte 4H2O .............................................................. 0.05 g Agar
........................................................................................... 10.0 g
Pembuatan : Seluruh komponen (62 gram) dimasukkan ke dalam 1 liter akuades, lalu dipanaskan hingga tercampur merata. pH diatur 6,2. masukkan dalam otol dan sterilisasi dengan autoklaf pada temperatur 121°C selama 15 menit.
69
Lampiran 3. Komposisi Medium Nutrient Broth (NB)
Komposisi per liter : ‘Lab-Lemco’ powder ………………………………………….10.0 g Peptone ………………………………………………………..10.0 g Sodium chloride ………………………………………………..5.0 g
Pembuatan : Tambahkan semua komponen (25 gram) ke dalam 1 liter aquades. Campurkan hingg merata, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.
Lampiran 4. Komposisi Medium Nutrient Agar (NA)
Komposisi per liter : ‘Lab-Lemco’ powder …………………………………………. 3.0 g Peptone ………………………………………………………… 5.0 g Agar …………. ………………………………………………..15.0 g
Pembuatan : Tambahkan semua komponen (23 gram) ke dalam 1 liter aquades. Campurkan hingg merata, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.
70
Lampiran 5. Komposisi Medium Peptone Glukosa Yeast Extract (PGY) cair
Komposisi per liter :
Peptone …………………………………………………….5.0 g Glucosa …………………………………………………..10.0 g Yeast Extract …………………………………………… 5.0 g Sodium azida …………………………..............................1.0 g
Pembuatan : Tambahkan semua komponen ke dalam 1 liter aquades. Campurkan hingg merata, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.
71
Lampiran 6. Data 33 karakter hasil test unit karakter (t=33) terhadap 4 isolat BAL terpilih setelah diolah dengan program PFE (Programmer File Editor)
*L 33 6 BAL BUAH SIg SIj MAa MAb L.fermentum L.plantarum A 1 1 1 1 1 1 B 1 1 1 1 1 1 C 1 1 1 1 1 1 D 1 1 1 1 1 1 E 1 1 1 1 1 1 F 0 0 0 0 0 0 G 0 0 0 0 0 0 H 0 0 0 0 0 0 I 1 1 1 1 1 1 J 1 1 1 1 0 0 K 0 1 0 0 0 0 L 1 1 1 1 1 1 M 0 0 0 0 0 0 N 1 1 1 0 0 0 O 0 0 0 0 0 0 P 0 0 0 0 0 0 Q 1 1 1 1 1 0 R 0 0 0 0 0 0 S 0 0 0 0 0 0 T 1 1 1 1 1 1 U 0 1 1 0 1 1 V 0 0 0 0 1 1 W 0 0 0 0 1 1 X 0 0 0 0 1 1 Y 0 0 0 0 1 1 Z 1 0 0 0 1 1 AA 1 1 1 1 1 1 AB 1 1 1 1 1 1 AC 1 1 1 1 1 1 AD 0 0 0 0 1 1 AE 0 0 0 0 1 1 AF 0 0 0 0 0 0 AG 0 0 0 0 0 0
72
Lampiran 7. Penentuan indeks similaritas Simple Matching Coefficient dengan program MVSP (Multivariate Statistical Package) Plus Version 2.0 ********************* ***** M V S P ***** ********************* Ver. 2.0a Date of analysis - April 23, 2010 Time of analysis - 7:03:15am Input file name - C:\MVSP\IDA.MVS Output file name - C:\MVSP\IDA.OUT SIMILARITY AND DISTANCE COEFFICIENTS ==================================== BAL BUAH File of 33 rows x 6 columns
SIMPLE MATCHING COEFFICIENT
SIg SIj MAa MAb L.fermen L.planta
SIg
SIj
MAa
1 0.909 0.939 0.939 0.727 0.697
0.909 1 0.970 0.909 0.697 0.667
0.939 0.970 1 0.939 0.727 0.697
Analysis finished at -
7:03:16am
MAb L.fermen L.planta 0.939 0.909 0.939 1 0.727 0.697
0.727 0.697 0.727 0.727 1 0.970
0.697 0.667 0.697 0.697 0.970 1
73
Lampiran 8. Analisis klaster berdasarkan matriks similaritas Simple Matching Coefficient ********************* ***** M V S P ***** ********************* Ver. 2.0a Date of analysis - April 23, 2010 Time of analysis - 7:04:13am Input file name - C:\MVSP\IDA.MVD Output file name - C:\MVSP\IDA.OT2 CLUSTER ANALYSIS ================ BAL BUAH - MATCH File of 6 rows x 6 columns
INPUT MATRIX
SIg SIj MAa MAb L.fermen L.planta
SIg
SIj
MAa
1 0.909 0.939 0.939 0.727 0.697
0.909 1 0.970 0.909 0.697 0.667
0.939 0.970 1 0.939 0.727 0.697
MAb L.fermen L.planta 0.939 0.909 0.939 1 0.727 0.697
0.727 0.697 0.727 0.727 1 0.970
0.697 0.667 0.697 0.697 0.970 1
UNWEIGHTED PAIR GROUP AVERAGE METHOD
NODE
GROUP 1
1 2 3 4 5
SIj L.fermen SIg NODE 3 NODE 4
GROUP 2 MAa L.planta MAb NODE 1 NODE 2
Analysis finished at -
7:04:13am
SIMILARITY 0.970 0.970 0.939 0.924 0.704
NUMBER OF OBJECTS IN FUSED GROUP 2 2 2 4 6
