Jurnal Kimia Mulawarman Volume 10 Nomor 2, Mei 2013 Kimia FMIPA Unmul
ISSN 1693-5616
ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA STEROID PADA FRAKSI N-HEKSANA DARI DAUN KUKANG (Lepisanthes amoena (HASSK.) LEENH.) ISOLATION AND CHARACTERIZATION STEROID COMPUND FROM N-HEXANA FRACTION KUKANG (Lepisanthes amoena (HASSK.) LEENH.) LEAVES M. Riza Agus Pramana dan Chairul Saleh Program Studi Kimia FMIPA Universitas Mulawarman Jalan Barong Tongkok No. 4 Kampus Gunung Kelua Samarinda, 75123 ABSTRACT Kukang (Lepisanthes amoena (Hassk) Leenh.) Leaves is one of the species that belonging to the Sapindaceae family. Traditionally used as drug ulcerate and skin care and also known it has potency of tironase inhibitor and antioxidant agent, but compound that contained in that plant was unknown. The purpose of this research was for isolating steroid compound of n-hexane fraction from Kukang (Lepisanthes amoena (Hassk) Leenh.) leaves and characterizing steroid compound with phytochemical screening, R f, melting point and IR spectrum. Extraction of 650 grams powder Kukang (Lepisanthes amoena (Hassk) Leenh.) leaves with methanol yielded 121,82 grams of crude methanol extract. The crude methanol extract was fractionated with n-hexane and obtained 2,32 grams of n-hexane fraction. Results of phytochemical screening showed that the n-hexane gave positive result for steroid compound. Separation of steroid compound in n-hexane fraction by column chromatography with silica gel 60 (70-230 mesh) which eluted using n-hexane : ethyl acetate (8 : 2) eluent based on Isocratic method and gave nine fractions. Phytochemical screening by Liebermann Burchard reagent showed F fraction contained steroid compound and have been crystalized needle. Purification by recrystallization of the F fraction gave the needle white crystal 10,2 mg with reterdation factor (Rf) n-hexane : CHCl3 (1 : 1) = 0,40 ; n-heksana : CHCl3 (3 : 7) = 0,50 CHCl3 (100%) = 0,71 ; n-hexane : EtOAc (3 : 7) = 0,82 ; EtOAc (100%) = 0,86. Isolated compound has melting point 143-144°C, IR λmax (cm-1): 960,48; 1056,92; 1380,94; 1461,94; 1639,38; 2866,02; 2935,46; 3433,06. Based on its physical and spectroscopic characterization, the isolated compound is supposed as sterol of steroid compound. Keywords: Lepisanthes amoena (Hassk) Leenh., Isolation, Steroid A. PENDAHULUAN Steroid merupakan salah satu golongan senyawa metabolit sekunder yang cukup penting dalam bidang medis. Beberapa jenis senyawa steroid yang digunakan dalam dunia obat-obatan antara lain estrogen merupakan jenis steroid hormon seks yang digunakan untuk kontrasepsi sebagai penghambat ovulasi, progestin merupakan steroid sintetik digunakan untuk mencegah keguguran dan uji kehamilan, glukokortikoid sebagai anti inflamasi, alergi, demam, leukemia dan hipertensi serta kardenolida merupakan steroid glikosida jantung digunakan sebagai obat diuretik dan penguat jantung (Doerge, 1982). Karena semakin meningkatnya kebutuhan akan obat-obatan steroid, maka perlu diupayakan pencarian bahan baku yang lebih banyak untuk mensintesis obat-obatan steroid dimasa yang akan datang. Suku Dayak di Kalimantan Timur sampai saat ini masih tetap mempertahankan tradisi dengan memanfaatkan tumbuhan di sekitarnya untuk pengobatan ataupun perawatan kesehatan. Salah satu tumbuhan yang bermanfaat dan berpotensi sebagai obat adalah Daun Kukang yang bernama Latin Lepisanthes amoena (Hassk) Leenh. Daun Kukang adalah famili dari Kimia FMIPA Unmul
Sapindaceae dan secara etnobotani, daun dari tumbuhan Kukang ini digunakan oleh suku Dayak Tunjung untuk mengobati bisul dan digunakan untuk perawatan kulit (skin care) (Setyowati, 2010). Penelitian ini didasarkan pada hasil penelitian Setyowati (2010), yang dilakukan terhadap tumbuhan obat tradisional yang sering digunakan oleh suku Dayak Tunjung Kalimantan Timur, dimana tercatat 47 jenis tumbuhan yang terdiri dari 27 suku dan 46 marga yang dapat dimanfaatkan sebagai tumbuhan obat, salah satu diantaranya adalah tumbuhan yang berasal dari suku Sapindaceae, yaitu Lepisanthes amoena (Hassk.) Leenh yang dikenal sebagai tumbuhan Kukang. Masyarakat Dayak setempat memanfaatkan daunnya sebagai obat bisul dan perawatan kulit dengan cara mengambil pucuk daunnya, lalu dipilin hingga berbusa kemudian dijadikan sebagai pencuci muka dan buahnya dapat pula dikonsumsi. Selain itu penelitian ini didasarkan juga oleh penelitian yang dilakukan oleh Batubara et al (2011) terhadap 45 jenis tumbuhan tradisional Indonesia yang dapat menghambat tirosinase dan berpotensi sebagai antioksidan, dimana salah satunya adalah tumbuhan 85
Riza Agus Pramana dan Chairul Saleh Kimia FMIPA Unmul
Kukang. Pada penelitian tersebut diketahui daun Kukang mempunyai nilai IC50 yang relatif kecil sehingga dapat berpotensi sebagai agen antioksidan. Penelitian ini dilakukan karena pada penelitanpenelitian tersebut di atas belum diketahui kandungan senyawa kimia yang terkandung dalam daun Kukang, khususnya dalam fraksi n-heksana karena daun Kukang mengandung beberapa senyawa metabolit sekunder yang dapat memberikan manfaat terhadap kesehatan masyarakat. Uji pendahuluan (skrining fitokimia) kandungan steroid dengan pereaksi LiebermannB. METODOLOGI PENELITIAN 2.1. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik, botol kaca gelap 2500 mL, batang pengaduk, tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet tetes, pompa vakum, rotary evaporator, corong pisah, lampu UV 254 nm dan 366 nm , statif, klem, Kromatografi Kolom, botol vial, plat Kromatografi Lapis Tipis (KLT) GF254, chamber KLT, melting point apparatus dan Spektrofotometer Inframerah Shimadzu 8400S. 2.2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah daun Kukang (Lepisanthes amoena (Hassk.) Leenh.), metanol, kloroform, n-heksana, etil asetat, H2SO4, CH3COOH anhidrat, akuades, aluminium foil, kertas saring Whatman no.42, silika gel 60 (70-230 mesh) dan plat KLT silika gel GF254. 2.3. Prosedur Penelitian Sampel daun Kukang (Lepisanthes amoena (Hassk.) Leenh.) yang telah dikeringkan dan dihaluskan C. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1. Ekstraksi dan Fraksinasi Senyawa Steroid Serbuk daun kukang kering sebanyak ± 650 gram diekstraksi dengan metode ekstraksi maserasi. Maserasi adalah salah satu metode pemisahan senyawa dengan cara perendaman dengan menggunakan pelarut organik pada temperatur ruangan. Proses maserasi sangat menguntungkan dalam isolasi senyawa bahan alam karena selain murah dan mudah dilakukan, metode ini sangat tepat digunakan untuk senyawa yang tidak tahan panas. Sampel dimaserasi dengan pelarut organik metanol, tujuannya untuk menarik senyawa-senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam sampel. Proses maserasi menyebabkan pelarut akan menembus dinding sel dan masuk kedalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif tersebut akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan di luar sel, maka larutan yang terpekat akan didesak keluar. Peristiwa tersebut akan berlangsung terus-menerus sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Sampel dimaserasi dengan pelarut metanol pada suhu ruang selama 3 x 24 jam sambil sesekali dikocok. Pelarut metanol digunakan sebagai pelarut awal karena metanol merupakan salah satu pelarut yang dapat melisiskan membran sel pada tanaman dan memeliki partikel yang kecil sehingga mampu menembus semua jaringan
86
Isolasi dan Karakterisasi
Burchard terhadap fraksi n-heksana daun Kukang diketahui bahwa fraksi n-heksana daun kukang positif mengandung steroid, namun isolasi steroid dari daun kukang belum dilaporkan. Oleh karena itu, melihat kegunaan tumbuhan kukang dalam pengobatan tradisional dan banyaknya kegunaan dari senyawa steroid, maka perlu dilakukan penelitian tentang “Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Steroid pada Fraksi n-Heksana dari Daun Kukang (Lepisanthes amoena (Hassk.) Leenh.)”
sebanyak 650 gram dimaserasi dengan metanol. Ekstrak metanol dipekatkan kemudian difraksinasi dengan menggunakan n-heksana dan masing-masing diuji streroid. Ekstrak fraksi n-heksana merupakan fraksi yang positif steroid kemudian dipisahkan dengan cara kromatografi kolom menggunakan fase diam siliaka gel dan dielusi secara isokratik menggunakan eluen nheksana : etil asetat (8 : 2). Semua fraksi yang diperoleh dari hasil kromatografi kolom dianalisis menggunakan kromatografi lapis tipis. Fraksi yang sama digabung berdasarkan pola noda yang sama dan masing-masing diuji stroid. Fraksi yang positif steroid (vial 91-115) menghasilkan kristal dan direkristalisasi dengan menggunakan n-heksana p.a dan etil asetat p.a sampai diperoleh steroid yang murni. Uji kemurnian dilakukan dengan menggunakan KLT dan penentuan titik leleh. Karakterisasi struktrur molekul dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer inframerah (IR).
tumbuhan untuk menarik semua senyawa aktif keluar. Metanol dapat melarutkan hampir semua senyawa organik, baik polar maupun non-polar, metanol mudah menguap sehingga mudah dipisahkan dari ekstrak (Waji RA, 2009). Ekstrak yang diperoleh dari hasil maserasi tersebut dilanjutkan ke proses pemekatan pelarut dengan bantuan rotary evaporator pada suhu 40°C sampai semua pelarut metanol menguap sehingga diperoleh ekstrak kasar metanol dari daun kukang berwarna cokelat tua sebanyak 121,82 gram. Evaporasi dilakukan pada suhu 35°-40°C untuk menghindari kerusakan senyawa metabolit sekunder karena beberapa senyawa metabolit sekunder mudah rusak pada suhu tinggi (Robinson, 1995). Selanjutnya setelah diperoleh ekstrak pekat metanol dilakukan tahap fraksinasi (partisi cair-cair) dengan menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat secara berturut-turut. Sebelum fraksinasi ekstrak kasar metanol dengan beberapa pelarut, sebanyak 50 gram ekstrak kasar metanol tersebut dilarutkan kembali dengan metanol. Kemudian ekstrak metanol difraksinasi dengan n-heksana terlebih dahulu dengan tujuan agar seluruh senyawa metabolit sekunder yang bersifat nonpolar akan terlarut dalam pelarut n-heksana. Fraksinasi ini akan menghasilkan fraksi n-heksana dan fraksi metanol, fraksi
Kimia FMIPA Unmul
Jurnal Kimia Mulawarman Volume 10 Nomor 2, Mei 2013 Kimia FMIPA Unmul
metanol dilanjutkan dengan fraksinasi menggunakan etil asetat hingga didapatkan tiga fraksi, yaitu fraksi nheksana, etil asetat dan fraksi metanol. Selanjutnya setiap fraksi dipekatkan dengan rotary evaporator. Tetapi dalam penelitian ini, hanya fraksi nheksana yang akan dilanjutkan ke tahap pemisahan dan pemurnian senyawa metabolit sekunder. Dipilihnya fraksi n-heksana dimaksudkan agar senyawa yang memiliki sifat cenderung non polar dalam sampel seperti senyawa triterpenoid dan steroid terekstrak di dalam fraksi tersebut sehingga akan mudah untuk dilakukan tahap isolasi. 3.2. Pemisahan dan Pemurnian Senyawa Steroid Pemisahan senyawa steroid pada tanaman kukang dilakukan dengan metode kolom kromatografi secara isokratik, yaitu dengan menggunakan metode kromatofrafi yang sama dari tahap awal hingga tahap akhir kromatografi kolom, dimana eluen yang digunakan didasarkan hasil uji KLT yang memberikan noda terbaik. Eluen n-heksana : etil asetat (8 : 2) memberikan pola pemisahan terbaik karena mampu memisahkan 5 buah noda yang terkandung pada fraksi n-heksana dengan jarak pemisahan cukup baik, sehingga dapat digunakan sebagai fase gerak dalam pemisahan menggunakan kromatografi kolom. Hal ini sesuai dengan sistem yang disarankan untuk pemisahan steroid yaitu n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 8 : 2 (Harborne, 1987) Proses pemisahan pada tahap isolasi ini dilakukan terhadap 2 gram fraksi n-heksana dengan menggunakan fase diam silika gel 60 (70-230 mesh) dengan panjang kolom 60cm, diameter 2,5cm menggunakan fase gerak n-heksana-etil asetat (8 : 2) lalu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang didasarnya telah diberi kapas dan didiamkan selama semalam untuk memadatkan silika di dalam kolom (Ratnasari, 2008). Setelah itu sampel dilarutkan dengan sedikit pelarut n-heksana-etil asetat (8 : 2) dan dimasukkan ke dalam kolom dan dielusi dengan metode Isokratik. Setiap fraksi ditampung 5 mL dan diperoleh sebanyak 250 vial. Vial-vial yang diperoleh dianginanginkan selama beberapa hari agar pekat dan mudah terdeteksi pada saat monitoring KLT. Tiap-tiap fraksi dianalisis secara kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase gerak n-heksana:etil asetat (8 : 2). Fraksi-fraksi dengan pola Rf yang sama digabungkan menjadi satu kemudian pelarutnya diuapkan. Dari 250 fraksi diperoleh 9 fraksi gabungan. Kemudian masing-masing fraksi gabungan diuji kembali dengan KLT dengan eluen n-heksana : etil asetat (8 : 2). Adapun kromatogram lapis tipis fraksi-fraksi yang diperoleh dikelompokkan dapat dilihat pada Gambar 4.2. Fraksi-fraksi yang menampakkan pola sama pada kromatogram lapis tipis digabungkan dan diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh 9 fraksi, yaitu fraksi A (1-13) seberat 193,6 mg, fraksi B (14-23) seberat 95,6 mg, fraksi C (24-39) seberat 34,7 mg, fraksi D (40-54) seberat 33,5 mg, fraksi E (55-90) seberat 95,5 mg, fraksi F (91-115) seberat 91,3 mg, fraksi G (116-
Kimia FMIPA Unmul
ISSN 1693-5616
133) seberat 52,2 mg, fraksi H (134-175) seberat 84,9 mg dan fraksi I (176-250) seberat 145,7 mg. Kesembilan fraksi dilakukan uji steroid. Dari kesembilan fraksi tersebut terdapat satu fraksi yang paling murni karena telah terbentuk kristal jarum yaitu fraksi F, oleh karena itu fraksi F dilanjutkan ke tahap pemurnian. Kemudian terhadap fraksi F dilakukan tahap rekristalisasi untuk memurnikan kristal fraksi F. Rekristalisasi dilakukan dengan cara terlebih dahulu kristal dicuci dengan pelarut n-heksana (p.a) lalu kristal yang telah bersih dari pengotor dilarutkan dengan etil asetat (p.a). Larutan yang diperoleh dipindahkan ke dalam vial baru dan ditaruh di dalam desikator sampai seluruh pelarut teruapkan dan terbentuk kristal kembali. Kristal yang diperoleh berupa keristal jarum berwarna putih seberat 10,2 mg. Kemudian terhadap fraksi tersebut dilakukan uji kemurnian dengan menggunakan kromatografi lapis tipis. 3.3. Karakterisasi Senyawa Steroid Isolat murni yang diperoleh dari fraksi n-heksana sebanyak 10 mg berupa kristal berwarna putih berbentuk jarum dengan titik leleh 147-148°C. Uji fitokimia dengan menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard memberikan warna hijau, menunjukkan bahwa isolat tersebut positif steroid. Hasil spektrum inframerah memperlihatkan bahwa senyawa yang diperoleh menunjukkan serapan melebar pada daerah bilangan gelombang ν 3433,06cm-1 yang diduga merupakan serapan ulur (stretching) dari gugus O-H (3230 – 3550cm-1). Dugaan ini diperkuat oleh munculnya serapan uluran C-OH siklik pada bilangan gelombang 1056,92cm-1 (1085-1030cm-1) (Socrates, 1994). Hasil analisa juga menunjukkan keberadaan serapan rentangan –CH alifatik dengan adanya serapan pada bilangan gelombang 2965,46cm-1 dan 2866,02cm-1, hal ini memberikan petunjuk kemungkinan adanya gugus metil (CH3) dan metilena (CH2). Dugaan ini diperkuat oleh adanya serapan pada daerah bilangan gelombang 1461,94cm-1 yang menunjukkan adanya tekukan pada CH dari CH2 dan pita serapan pada daerah bilangan gelombang 1380,94cm-1 yang menunjukkan adanya tekukkan pada C-H dari CH3 (Socrates, 1994). Pita serapan pada bilangan gelombang 1639,38cm-1 yang tajam menunjukkan adanya uluran C=C non konjugasi (1620-1680cm-1). Dugaan ini diperkuat dengan adanya serapan pada bilangan gelombang 3028,03cm-1 yang menunjukkan adanya uluran =C-H dan pada 960,48cm-1 yang menunjukkan adanya tekukan =C-H (1000-650) (Saleh, 2007). Dari hasil interpretasi spektrum infra merah di atas, maka disimpulkan bahwa senyawa isolat mengandung gugus hidroksil (OH), alkil (CH2 dan CH3), C-O alkohol sekunder dan alkena (C=C) tak terkonjugasi dan diduga senyawa steroid tersebut merupakan steroid yang termasuk golongan sterol (steroid alkohol) dikarenakan adanya gugus OH (alkohol sekunder) yang terdapat pada senyawa tersebut.
87
Riza Agus Pramana dan Chairul Saleh Kimia FMIPA Unmul
D. KESIMPULAN Senyawa steroid hasil isolasi dari fraksi n-heksana dari daun kukang (Lepisanthes amoena (Hassk.) Leenh.) dapat diisolasi melalui melalui proses maserasi, dilanjutkan dengan proses fraksinasi, lalu dilakukan proses pemisahan dan pemurnian melalui proses kromatografi kolom dan rekristalisasi sehingga diperoleh kristal berbentuk jarum berwarna putih sebanyak 10,2 mg. Dan brdasarkan hasik uji fitokimia dan hasil
Isolasi dan Karakterisasi
karakterisasi dengan menggunakan spektrofotometri inframerah menunjukkan adanya gugus : hidroksil (OH), alkil (CH2 dan CH3), C-O alkohol sekunder dan alkena (C=C) tak terkonjugasi sehingga diduga senyawa metabolit sekunder pada fraksi n-heksana dari daun Kukang (Lepisanthes amoena (Hassk.) Leenh.) merupakan senyawa steroid golongan sterol.
DAFTAR PUSTAKA 1. Batubara, I, Darusman,L.K, Mitsunaga, T, Rahminawagti, M, and Djauhari, E. 2010. Potency of Indonesian Medicinal Plant as Tyrosinase Inhibitor and Antioxidant Agent. Journal Of Biological Sciences.10 (2) : 138-144. 2. Cole, A.R.H. 1963. Application of Infrared Spectroscopy dalam Elucidation of Structures by Physical and Chemical Methods. Part I. Newyork: Interscience Publishers. 3. Doerge, F. 1982. Buku Teks Wilson Dan Gisvold Kimia Farmasi Dan Medicinal Organic. Semarang: Institut Keguruan Dan Ilmu Pendidikan Press. 4. Dono, S. 2011. Isolasi Senyawa Steroid dari Daun Sirih Hutan (Piper aduncum Linn). Skripsi Sarjana. Samarinda : Universitas Mulawarman Harbone,J. B. 1987. Metode Fitokimia. Bandung: ITB. 5. Marjang, Y. 1988. Isolasi Komponen Aktif Pada Tumbuhan Baluin (Brucia javanica L Meer) Yang Aktif Untuk Pembatasan Kelahiran. Laporan Penelitian. Departemen Pendidikan Dan Kebudayaan, Pusat Penelitian Universitas Andalas, Padang. 6. Saleh, C. 2007. Isolasi dan Penentuan Struktur Senyawa Steroid dari Akar Tumbuhan Cendana (Santalum album Linn). Desertasi. Medan: Universitas Sumatera Utara. 7. Setyowati, F. 2010. Etnofarmakologi dan Pemakaian Obat Suku Dayak Tunjung di Kalimantan Timur. Artikel. Media Litbang Kesehatan Volume XX no. 3 8. Socrates, G. 1994. Infrared Characteristic Group Frequencies Tables and Charts. Newyork: John Wiley and Sons.
88
Kimia FMIPA Unmul
Jurnal Kimia Mulawarman Volume 10 Nomor 2, Mei 2013 Kimia FMIPA Unmul
ISSN 1693-5616
LAMPIRAN
Gambar 1. Spektrum Inframerah Isolat Fraksi F No.
Bilangan Gelombang (cm-1) Pada Spektra Pada Pustaka
Bentuk Pita
Intensitas
1
3433,06
3550-3230
Melebar
Sedang
2 3 4 5 6 7
3028,03 2935,46 2866,02 1639,38 1461,94 1380,94
3100-3000
1680-1620 1480-1440 1385-1360
Tajam Tajam Tajam Tajam Tajam Tajam
Sedang Kuat Sedang Sedang Sedang Sedang
8
1056,92
1085-1030
Tajam
Sedang
9
960,48
1000-650
Tajam
Sedang
Kimia FMIPA Unmul
2950-2850
Penempatan Gugus Terkait ν O-H (ikatan hidrogen antarmolekul ν =C-H ν C-H (pada CH3) ν C-H (pada CH2) ν C=C non konjugasi γ C-H pada (CH2) γ C-H pada (CH3) ν C-OH (alkohol siklik sekunder) γ =C-H out of plane
89
