ISOLASI DAN KARAKTERISASI PROMOTER GEN AGAMOUS (TcAG) DARI KAKAO (Theobroma cacao L.)
NONI MARDIAN TRIZANA
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ISOLASI DAN KARAKTERISASI PROMOTER GEN AGAMOUS (TcAG) DARI KAKAO (Theobroma cacao L.)
NONI MARDIAN TRIZANA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ABSTRAK NONI MARDIAN TRIZANA. Isolasi dan Karakterisasi Promoter Gen AGAMOUS (TcAG) dari Kakao (Theobroma cacao L.). Dibimbing oleh SURYANI dan DJOKO SANTOSO. Kakao merupakan salah satu komoditas perkebunan yang penting bagi perekonomian nasional. Berbagai usaha telah dilakukan untuk meningkatkan produksi kakao. Salah satu usaha dalam bidang rekayasa genetik tersebut adalah penemuan promoter gen yang berperan penting pada pembungaan dan pembuahan. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi promoter gen reproduktif Theobroma cacao L. AGAMOUS (TcAG) dengan metode Thermal Asymmetric Interlaced Polymerase Chain Reaction (TAIL PCR) dan mendapatkan karakteristik dari promoter tersebut dengan program komputer online Softberry. Teknik TAIL PCR menggunakan primer reverse spesifik gen TcAG pada posisi +202 (TcAG+202) (5’-GGCCACGGCTAGAGAAGACAA-3’) dan pada posisi +67 (TcAG+67) (5’-ATCTCGATCTTTCCCCTTCCC-3’). Primer forward AP140 memberikan hasil yang terbaik yaitu sekuen genomik berukuran 1200 bp. Analisis Transcription Start Site Prediction (TSSP) pada program softberry dari ujung 5’ sekuen tersebut menunjukkan adanya tiga daerah promoter. Daerah tersebut yaitu pada posisi nukleotida 126 (TATA box pada posisi 93), pada posisi nukleotida 735 (TATA box pada posisi 702) dan pada posisi nukleotida 807 (TATA box pada posisi 774). TATA box pada posisi 774 diprediksi merupakan situs pengikatan polimerase RNA fungsional karena berada pada posisi paling dekat dengan situs awal transkripsi.
ABSTRACT NONI MARDIAN TRIZANA. Isolation and Characterization AGAMOUS Gene Promoter (TcAG) from Cocoa (Theobroma cacao L.). Under the direction of SURYANI dan DJOKO SANTOSO. Cocoa is one of the plantation commodities that is important to the national economy. Various efforts have been made to increase cocoa production. One such efforts in the field of genetic engineering discovery for the promoter of gene that has important role in flowering and fruiting. The aim of this research to isolate the promoter of reproductive gene AGAMOUS from Theobroma cacao L. (TcAG) using Thermal Asymmetric Interlaced Polymerase Chain Reaction (TAIL PCR) method and obtain the characteristics of the promoter using a computer program online Softberry. Technique of TAIL PCR using the reverse genespecific primers TcAG position +202 (TcAG+202) (5'GGCCACGGCTAGAGAAGACAA-3') and position +67 (TcAG+67) (5’ATCTCGATCTTTCCCCTTCCC-3'). Forward primer AP140 provided the best results are fragment genomic size of 1200 bp. Analysis of Transcription Start Site Prediction (TSSP) of softberry program from the 5' of the fragment has proven that it has three promoter regions. The regions which are nucleotide in position 126 (TATA box at position 93), nucleotide at position 735 (TATA box at position 702) and nucleotide at position 807 (TATA box at position 774). TATA box at position 774 is predicted to be the functional binding sites of RNA polymerase because it is in the position closest to the transcription start site.
Judul Skripsi Nama NIM
: Isolasi dan Karakterisasi Promoter Gen AGAMOUS (TcAG) dari Kakao (Theobroma cacao L.) : Noni Mardian Trizana : G84050132
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Djoko Santoso, M.Sc Anggota
Dr. Suryani, M.Sc Ketua
Diketahui
Dr. Ir. I Made Artika, M. App Sc Ketua Departemen Biokimia
Tanggal lulus:
PRAKATA Alhamdulillah segenap rasa syukur Penulis ucapkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, sehingga penelitian ini dapat diselesaikan. Shalawat beriring salam terus tercurahkan kepada suri tauladan kita yang mulia Rasulullah Muhammad SAW. Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Dr. Suryani, M.Sc dan Dr. Djoko Santoso, M.Sc selaku dosen pembimbing dalam pelaksanaan penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga Penulis sampaikan kepada keluarga, Ayah dan Ibu tercinta, yang telah memberi dukungan berupa do’a dan materil, teknisi di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia yang telah membantu pelaksanaan penelitian ini (teh Herti, teh Niyyah, teh Riana, teh Aan, teh Urip, teh Alin, teh Nina, teh Rini, mas Wahyu, mas Heri, mas Luthfi, mas Topan, mbak Zahra). Saran dan kritik diperlukan untuk pengembangan isi tulisan ini. Semoga tulisan ini dapat memberikan manfaat bagi yang memerlukannya.
Bogor, Maret 2010
Noni Mardian Trizana
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sawahlunto, 9 Maret 1988 sebagai anak sulung dari dari pasangan Slamet Sutrisno dan Supriyanti. Penulis memulai pendidikannya pada tahun 1993 di SDN 11 Kampung Surian, Kecamatan Barangin, Sawahlunto, Sumatera Barat dan lulus pada tahun 1999. Tahun 2002 penulis lulus dari SLTPN 02 Sawahlunto, yang kemudian melanjutkan ke SMU 01 Sawahlunto dan menyelesaikannya hingga tahun 2005. Tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur seleksi penerimaan mahasiswa baru (SPMB). Selama menjadi mahasiswa penulis pernah melakukan kegiatan praktik lapang di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia di Bogor selama periode Juli hingga Agustus 2008 dengan judul Produksi Glukoamilase dari Beberapa Isolat Fungi Menggunakan Media Induksi Singkong. Penulis juga aktif dalam kegiatan kemahasiswaan dan pernah menjadi pengurus Unit Kegiatan Mahasiswa (UKM) Badan Kerohanian Islam Mahasiswa (BKIM IPB) periode 2006/2007 sebagai staf Hubungan Muslimah (HUMAS) dan 2007/2008 sebagai staf Pembinaan dan Pengembangan Sumber Daya Manusia (PPSDM). Penulis ikut serta dalam kepanitiaan beberapa kegiatan antara lain Penyambutan Mahasiswa Baru dan Kongres Mahasiswa Islam Indonesia yang diselenggarakan oleh Badan Koordinasi Lembaga Dakwah Kampus (BKLDK) BKIM IPB pada tahun 2009 di Jakarta.
DAFTAR ISI Halaman
DAFTAR GAMBAR......................................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................
x
PENDAHULUAN..........................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.)……………………………. Gen AGAMOUS (TcAG)………………...………..……...………........ Promoter Gen……………………………………………………….. Thermal Asymmetric Interlaced Polymerase Chain Reaction (TAIL PCR)………………………………...………………………………. Aplikasi Bioinformatika…..................................................................
2 3
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat.................................................................................... Metode Penelitian.................................................................. .............
3 3
1 2 2
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Desain Primer Promoter Gen AGAMOUS (TcAG).………….. Hasil Isolasi DNA Total dari Daun Kakao………………...……….. Hasil Amplifikasi Promoter Gen AGAMOUS (TcAG)……………... Hasil Kloning Promoter Gen AGAMOUS (TcAG) dengan Vektor pGEM-T Easy....……...……...……................................................... Pengurutan DNA dan Analisis Sekuen Promoter TcAG.................... Hasil Kloning dengan Vektor ekspresi pCAMBIA 1303…………...
8 9 11
SIMPULAN DAN SARAN………………………………………………...
12
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………….
12
LAMPIRAN…………………………………………………………………
14
6 6 7
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Bunga kakao dan bagian-bagiannya, stamen (Sta), sepal (Se), petal (Pe), pistil (Pi) dan staminod (Std) (Hinsley 2009).………………….…...……..
1
2 Posisi promoter dalam suatu gen (Roger 2009).………….…….…………..
2
3 Hasil isolasi DNA kakao...............................................................................
6
4 Tiga proses TAIL PCR dengan menggunakan primer acak………………..
7
5 Vektor pGEM-T Easy (Promega 2009)…….………………………………
8
6 Hasil PCR koloni setelah dielektroforesis c : (AP125), d : (AP140) (koloni yang diisolasi plasmidnya menggunakan primer acak AP140)………….....
9
7 Hasil analisis TSSP untuk identifikasi promoter dari fragmen DNA ujung 5’ gen TcAG……………………………………………………………….... 10 8 Posisi TATA Box pada sekuen promoter TcAG…………..………………..
10
9 (a) Amplifikasi plasmid d8 menggunakan primer spesifik TcAGF dan TcAGR pada vektor pGEMT, (b) Amplifikasi menggunakan primer M13 (forward) dan primer spesifik TcAG (reverse pada vektor pCAMBIA 1303, (c) pCAMBIA 1303 yang dipotong oleh BamHI dan NotI………………………………………………………………………… 11
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1 Tahap penelitian…………………………………………………………….
15
2 Proses amplifikasi pada TAIL PCR………………………………………...
16
3 Vektor pCAMBIA 1303…………………………………………………….
17
4 Tampilan layar (print screen) dari output analisis penjajaran (BLAST) sekuen cDNA dari gen TcAG dengan sekuen acuan genomik GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)................................................................................
18
5 Sekuen homolog gen TcAG di GenBank…….……………………………..
19
6 Hasil pengurutan sekuen DNA (sequencing) promoter gen TcAG dari arah forward dan reverse……….……………………………………………….
20
7 Pengurutan sekuen DNA (sequencing) dari promoter gen TcAG…..............
21
8 Mekanisme pembungaan pada tanaman Arabidopsis……………...……….
22
1
PENDAHULUAN Kakao merupakan salah satu komoditas perkebunan yang penting bagi perekonomian nasional. Perkebunan kakao telah menyediakan lapangan kerja dan sumber pendapatan bagi sekitar 900 ribu kepala keluarga petani yang sebagian besar berada di Kawasan Timur Indonesia serta memberikan sumbangan devisa terbesar ketiga subsektor perkebunan setelah karet dan kelapa sawit dengan nilai sebesar US $ 701 juta. Produksi kakao dengan kategori kualitas sedang mempunyai nilai ekonomi sekitar Rp 4000/kgRp 5000/kg. Sedangkan kakao dengan kategori kualitas baik harganya bisa mencapai Rp 40000/kg (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao 2007). Kualitas kakao Indonesia masih tergolong rendah, meski secara kuantitas terjadi peningkatan. Saat ini Indonesia berada dalam urutan ketiga di dunia sebagai penghasil kakao setelah Pantai Gading dan Ghana. Produksi kakao Indonesia pada tahun 2005 yaitu 435 ribu ton/tahun (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao 2007). Kendala yang dialami Indonesia dalam produksi kakao yaitu serangan hama, kualitas dari buah kakao yang masih rendah, dan benih yang dipakai oleh petani kakao bukan merupakan benih unggul. Permasalahan lain pada produksi kakao yaitu pembungaan dan layu pentil. Salah satu usaha untuk memperbaiki produksi kakao secara pembungaan dilakukan melalui pendekatan biologi molekuler yaitu melalui penemuan gen-gen yang berperan penting pada pembungaan dan pembuahan. Gen-gen yang berperan tersebut antara lain LEAFY (LFY), APETALA1 (AP1), CAULIFLOWER (CAL), FRUITFULL (FUL), dan AGAMOUS (AG) (Dean & Simpson 2002). Gen pembungaan dari buah kakao memerlukan penelitian lebih lanjut diantaranya yaitu Theobroma cacao L. AGAMOUS (TcAG) yang berperan pada pembentukan stamen dan karpel dalam pembungaan dan pembuahan. Sehingga produksi bunga dan buah dapat dikontrol secara genetik yaitu melalui penemuan promoter gen AGAMOUS (TcAG). Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi promoter gen reproduktif TcAG dengan metode TAIL PCR dan memperoleh karakteristik dari promoter tersebut melalui program komputer online Softberry. Hipotesis dari penelitian adalah promoter gen TcAG pada kakao dapat diisolasi menggunakan metode Thermal Asymmetric Interlaced
Polymerase Chain Reaction (TAIL PCR) dengan kombinasi primer spesifik gen (reverse) dan primer acak (forward). Hasil penelitian diharapkan dapat meningkatkan produksi dan kualitas tanaman kakao dengan memanfaatkan promoter gen TcAG sebagai gen pengatur pembungaan (regulator).
TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.) Tanaman kakao (Theobroma cacao L.) merupakan tanaman dikotil dan termasuk ke dalam famili Sterculiaceae. Kakao merupakan tanaman yang kaulifloral, yaitu bunga dan buah dihasilkan pada ranting dan cabang yang tua serta tidak berdaun (Urquhart 1960). Tanaman ini mempunyai bunga yang berwarna merah muda sampai putih, hermafrodit, memiliki lima sepal, lima petal, 10 stamen dan ovari superior yang merupakan gabungan dari lima karpel (Tjasadiharja 1987). Bentuk bunga kakao dapat dilihat pada Gambar 1. Menurut Siregar et al. (2004) kelopak daun bunga kakao berwarna putih dan kadang-kadang makin ke ujung warna kelopak terlihat ungu kemerahan. Mahkota bunga bentuknya seperti cawan, mempunyai panjang 8-9 mm dan berwarna putih kekuningan atau putih kemerahan. Bunga kakao akan muncul secara bergerombol pada bantalan bunga. Bantalan bunga yaitu jaringan yang menebal pada ketiak bekas menempelnya tangkai daun. Waktu yang diperlukan dari munculnya bakal bunga sampai mekar yaitu 30 hari. Bila saat mekar bunga tidak mengalami penyerbukan maka bunga akan gugur (Tjasadiharja 1987).
Se
Sta
Std
Gambar
1
Pe
Pi
Bunga kakao dan bagianbagiannya, stamen (Sta), sepal (Se), petal (Pe), pistil (Pi) dan staminod (Std) (Hinsley 2009).
2
Buah kakao biasanya berisi 20-40 biji, kadang-kadang mencapai 50 biji. Setiap biji dilindungi oleh lapisan tipis. Bagian luar biji dari lapisan tipis tersebut berbentuk prisma selama masa pertumbuhan biji (Urquhart 1960). Gen AGAMOUS (TcAG) Pengembangan gen pada bunga dapat digambarkan dengan model ABC. Model ini mengkoordinasikan ekspresi dan fungsi dari gen menjadi transkripsi A, B dan C. Aktivitas transkripsi tipe A disandikan oleh gen APETALA1 (AP1) dan APETALA2 (AP2) yang mengontrol pembentukan sepal dan petal. Transkripsi tipe B yang disandikan oleh gen APETALA3 (AP3) dan APETALA1 (AP1) yang berperan mengontrol pembentukan petal dan stamen. Sedangkan transkripsi tipe C disandikan oleh gen AGAMOUS (AG) yang mengontrol perkembangan stamen dan karpel (Pinero & Couplan 1998). Gen TcAG merupakan keluarga dari gen MADS-Box yang diperlukan dalam pembentukan identitas bunga (Bao et al. 2004). Ekspresi gen yang berperan dalam mengontrol pembentukan stamen dan karpel ini dapat ditekan oleh gen lain yaitu gen BELLRINGER (BELL) sehingga pengaruh dari gen TcAG dalam pembentukan meristem bunga dan inflorensia menjadi terhambat (Bao et al. 2004). Chaidamsari (2005) melaporkan bahwa gen TcAG telah diekspresikan pada stamen dan ovari. Jenis gen kakao lain yang mengkode faktor transkripsi dari kelas MADS-Box yang mempengaruhi regulasi pembungaan dan pembentukan bunga yaitu Theobroma cacao L. APETALA1 (TcAP1). Gen TcAP1 diekspresikan pada bunga (sepal dan petal). Selain pada bunga, gen TcAG juga diekspresikan pada dinding buah kakao (Chaidamsari 2005). Promoter Gen Daerah promoter merupakan daerah awal terjadinya sintesis RNA. Proses sintesis RNA ini berlangsung hingga bagian akhir sekuen. Daerah promoter mempunyai urutan basa nukleotida yang tetap yaitu TATA-Box. TATA-Box merupakan bagian DNA yang banyak mengandung basa timina dan adenina. Posisi TATA-Box ini berada pada bagian hulu sekuen gen (upstream) dengan lokasi pada -10 bp dan -35 bp (Murray et al. 2003). Promoter mempunyai aktivitas spesifik pada jaringan yang spesifik. Salah satu aktivitas spesifik ini yaitu pengontrolan
ekspresi toksin pada jaringan (Chaidamsari 2005). Posisi promoter dalam suatu gen dapat dilihat pada Gambar 2. RNA polimerase
Utas pengkopian DNA Utas cDNA
Gambar 2 Posisi promoter dalam suatu gen (Roger 2009). Thermal Asymmetric Interlaced Polymerase Chain Reaction (TAIL PCR) Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode amplifikasi primer oligonukleotida yang dilakukan secara enzimatis untuk memperoleh sekuen DNA yang diinginkan. Sebelum melakukan proses PCR, sekuen tertentu yang mengapit sekuen DNA harus diketahui sehingga oligonukleotida spesifik dapat diperoleh. Sekuen yang mengapit ini dinamakan dengan primer (Eavier 1999). Menurut Clark dan Russel (2005), komponen-komponen untuk melakukan reaksi PCR yaitu DNA cetakan, primer PCR, enzim (Taq polimerase), dan nukleotida. Salah satu modifikasi metode PCR adalah TAIL PCR. Metode ini digunakan untuk mengisolasi sekuen target yang tidak diketahui sekuennya dari sampel. Keuntungan dari teknik ini adalah mudah dilakukan, efisien, dan spesifisitas gen hasil amplifikasi yang tinggi (Liu & Ning 1998). Menurut Michiels (2000) TAIL PCR dapat digunakan untuk mengisolasi promoter genom tanaman pada ukuran kurang dari 1 kb. Suhu berperan penting dalam proses amplifikasi. Kombinasi suhu annealing yang digunakan untuk primer spesifik adalah 65 °C atau 68 °C. Metode TAIL PCR ini menggunakan primer spesifik yang mempunyai suhu tinggi dan primer pendek (10 basa) atau arbitrary primer (AP) yang mempunyai suhu rendah (Michiels 2000). Selain suhu, hal penting yang harus diperhatikan adalah perancangan primer dan jumlah siklus reaksi (Liu & Ning 1998). Reaksi yang digunakan pada TAIL PCR meliputi tiga reaksi. Reaksi pertama merupakan siklus TAIL PCR yang
3
dikondisikan untuk menciptakan satu atau lebih penempelan (annealing) primer pendek (10 basa) pada sekuen target. Reaksi kedua merupakan proses amplifikasi. Amplifikasi sekuen pada TAIL PCR membantu untuk memperoleh spesifisitas sekuen genomik yang tinggi. Sedangkan reaksi ketiga merupakan eliminasi produk yang tidak spesifik (Michiels 2000). Aplikasi Bioinformatika Kemampuan untuk memahami dan memanipulasi kode genetik DNA didukung oleh teknologi informasi melalui perangkat keras (hardware) maupun lunak (Software) (Aprijani & Elfaizi 2004). Salah satu perangkat lunak tersebut dapat digunakan untuk desain primer yaitu Web primer (Utama 2003). Desain primer ini dirancang berdasarkan urutan nukleotida yang ada pada basis data. Pencarian basis data umumnya berdasarkan pada hasil penjajaran sekuen, baik sekuen DNA maupun protein. Sehingga diperoleh sekuen DNA atau protein dengan membandingkan hasil penjajaran tersebut. Basis data dari sekuen juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi homolog dari molekul baru. Fragmen DNA dikatakan homolog jika mempunyai persamaan urutan antar gen (Aprijani & Elfaizi 2004). Salah satu perangkat lunak pencari basis data yang paling berhasil dan menjadi standar adalah Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Program BLAST merupakan program penjajaran yang didesain untuk mengeksplorasi semua basis data sekuen yang diinginkan, baik itu berupa DNA atau protein. Program ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi hubungan diantara sekuen pada daerah tertentu yang memiliki kesamaan DNA atau protein (Aprijani & Elfaizi 2004). Homologi penjajaran BLAST tersedia di NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), di EMBL (http://www.ebi.ac.uk/blastall), dan di DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp). Selain itu juga ada FASTA yang dapat diakses di EMBL (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/index) (Utama 2003). Sedangkan untuk menganalisis promoter dapat digunakan program pada situs www.softberry.com (Chaidamsari 2005).
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah daun kakao segar, gel agarosa, ethidium bromida, loading dye, marker, bufer TBE,
nitrogen cair, dNTP, Taq polymerase recombinant invitrogen, kloroform : isoamil alkohol (24:1), NaCl 5 M, isopropanol, etanol 80%, ddH2O, vektor pGEM-T Easy, vektor pCAMBIA 1303, DNA T4 ligase, media LB padat, media LB cair, glukosa cair, E. coli XL-1 Blue, 100 mg/L ampisilin, 40 mg/L XGal, bufer GS1 (melarutkan gel), bufer w9 (washing buffer), TE buffer warm, RNase, 350 µL binding buffer, 500 µL wash buffer I, 700 µL wash buffer II, 30 µL elution buffer, dan 0,1 mM IPTG. Larutan bufer yang digunakan untuk isolasi DNA kakao yaitu bufer ekstraksi (0.1 M sodium sitrat, 0.35 M glukosa, 5 mM EDTA, 2% PVP, dan 0.5% β-Merkaptoetanol) dan bufer lisis (100 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 2.5% CTAB, 0.2% βMerkaptoetanol, 1% PVP, dan akuades). Sekuen primer yang digunakan yaitu primer spesifik gen (GSP) TcAG+202 dan TcAG+67, 10 basa primer atau arbitrary primer (AP) yaitu AP103, AP122, AP125 dan AP140, primer TcAGF, primer TcAGR, primer M13F, dan primer M13R. Alat-alat yang digunakan adalah cawan petri, gelas piala, tabung sentrifus, sentrifus Beckman Allegra 64R, sentrifus Eppendorf 5417R, tabung Eppendorf, lemari asam, pipet mikro, pipet tip, spektrofotometer UV-VIS Beckman, mortar, penangas air, autoklaf, pipet tetes, stirer, pipet Mohr, Erlenmeyer, oven, pH meter, alat elektroforesis (sisir, cetakan agar, bak elektroforesis, adaptor 100 Volt, dan UV T2201), speed vac, neraca analitik, incubator shaker, dan laminar air flow cabinet. Alat utama yang digunakan adalah PCR (Biometra T-Personal).
Metode Penelitian Pencarian Sekuen Genomik Homolog Gen TcAg Analisis homologi dari sekuen gen TcAG spesifik yang diperoleh dilakukan melalui pendekatan teknik bioinformatika dengan menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool nucleotide (BLASTN) yang dapat diakses pada situs www.ncbi.nlm.nih.gov. Perancangan Primer Sekuen gen TcAG dianalisis dengan program BLASTN untuk menentukan daerahdaerah terkonservasi. Daerah tersebut dipilih dalam perancangan sepasang primer yang berjarak 100-250 pb menggunakan program primer 3. Program ini dapat diakses pada situs
4
http://frodo.wi.mit.edu/. Perancangan primer dapat dilakukan dengan program komputer Gene Runner atau secara semi manual dengan parameter-parameter umum, yaitu nilai Tm diatas 62 °C, jumlah nukleotida 15-22, dan kandungan GC 50% atau lebih. Isolasi DNA Genomik Kakao Isolasi DNA kakao mengacu kepada metode Orozco-Castilo et al. (1994) yang dimodifikasi. Daun kakao sebanyak 1 g digerus hingga halus dengan nitrogen cair. Bufer ekstraksi ditambahkan sebanyak 60 mL pH 6 (0.1 M sodium sitrat, 0.35 M glukosa, 5 mM EDTA, 0.5% β-Merkaptoetanol, dan 2% PVP). Larutan daun kakao dan bufer ekstraksi diblender dan disaring dengan kasa steril kemudian disentrifugasi pada kecepatan 19621 g (15000 rpm), suhu 4 °C, selama 10 menit. Endapan diambil dan ditambahkan bufer lisis 10 mL (100 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 2.5% CTAB, 0.2% βMerkaptoetanol, 1% PVP, akuades). Campuran yang berada pada tabung sentrifugasi diinkubasi selama 1 jam pada suhu 60°C dan dihomogenasi setiap 15 menit kemudian diekstrak dengan kloroform : isoamil alkohol (24:1). Sampel selanjutnya dihomogenasi selama 10 menit dan disentrifugasi pada 19621 g (15000 rpm, 10 menit). Lapisan atas diambil dan dipindahkan ke dalam tabung sentifugasi 30 mL. Sampel ditambahkan NaCl 5 M dan isopropanol kemudian diinkubasi pada selama 1 jam dan disentrifugasi 19621 g (15000 rpm), selama 15 menit. Endapan dicuci 2 kali menggunakan etanol 80% dingin serta selama 10 menit. Sampel dilarutkan dalam 50 µL ddH2O. Kualitas DNA diuji dengan elektroforesis 1%. Sedangkan kuantitasnya ditentukan dengan Tabel 1 Kondisi pada TAIL PCR Reaksi No progam Nomor siklus PCR pertama 1 1 (TcAG+202) 2 5 3 1
PCR kedua (TcAG+67) PCR ketiga (TcAG+67)
4
15
5 6
1 12
5 7 5
1 30 1
spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Metode TAIL PCR Metode yang digunakan pada TAIL PCR yaitu modifikasi dari metode Liu dan Whittier (1995). Primer yang digunakan mempunyai Tm lebih tinggi dari 62 °C. Primer yang digunakan pada TAIL PCR pertama yaitu TcAG+202 dan pada TAIL PCR kedua adalah TcAG+67. Sedangkan untuk TAIL PCR yang ketiga digunakan primer yang sama pada primer kedua (TcAG+67) (Tabel 1). Reaksi TAIL PCR pertama yaitu 20 µL volume berisi 100 ng dari genomik DNA, 0.2 µM, primer spesifik gen (TcAG+202), 2.0 µM, 10 basa primer (AP), 200 µM dNTP, 0.2 U Taq polymerase. Reaksi TAIL PCR kedua yaitu primer spesifik gen (TcAG+67) yang dikombinasikan dengan DNA cetakan dari TAIL PCR kedua. Sedangkan TAIL PCR ketiga yaitu reamplifikasi dari primer spesifik gen (TcAG+67) menggunakan cetakan dari TAIL PCR kedua. Hasil TAIL PCR ketiga dielektroforesis kembali untuk proses elusi. Gel yang terdapat pita DNA kemudian dipotong dan dilarutkan dengan bufer GS1 dan diinkubasi pada suhu 50 °C selama 15 menit. Sampel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13362 g (12000 rpm) selama 2 menit. Sampel hasil sentrifugasi ditambahkan 500 µL bufer GS1 dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit. Kemudian sampel disentrifugasi dengan kecepatan 13362 g (12000 rpm) selama 2 menit dan ditambahkan dengan 700 µL bufer w9 dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Sampel disentrifugasi dengan
Parameter siklus 93 °C, 1 min; 95 °C, 1 min 94 °C, 30 s; 62 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min 94 °C, 30 s; 25 °C, 3 min; 72 °C hingga 3 min; kemudian 72 °C, 2.5 min 94 °C, 10 s; 68 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min; 94 °C, 10 s; 68 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min; 94 °C, 10 s; 29 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min 72 °C, 5 min 94 °C, 10 s; 64 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min; 94 °C, 10 s; 64 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min; 94 °C, 10 s; 29 °C, 1 min; 72 °C, 2.5 min 72 °C, 5 min 94 °C, 15 s; 29 °C, 30 s; 72 °C, 2 min 72 °C, 5 min 556
5
kecepatan 13362 g (12000 rpm) selama 2 menit dan dielusi dengan 50 µL TE buffer warm. Lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit dan disentrifugasi pada kecepatan 13362 g (12000 rpm) selama 3 menit. Hasil elusi diuji secara kualitatif dengan elektroforesis. Kloning Promoter Gen AGAMOUS (TcAG) dengan Vektor pGEM-T Easy Hasil amplifikasi yang telah dimurnikan dengan menggunakan kit invitrogen, disisipkan ke dalam vektor pGEM-T Easy (Promega) menggunakan T4 DNA ligase selama satu jam, pada suhu 37 °C. Vektor tersebut kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli XL-1 Blue yang telah dibuat kompeten. Campuran ligasi sebanyak 10 µL ditambahkan ke dalam 200 µL suspensi sel kompeten. Sel kemudian disebarkan di atas media LB padat agar yang mengandung 100 mg/L ampisilin, 40 mg/L X-Gal, dan 0,1 mM IPTG kemudian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 °C. Hasil transformasi dicirikan dengan tumbuhnya koloni biru dan putih. Koloni putih ini kemudian dilakukan PCR koloni. Proses PCR koloni diawali oleh pemecahan dinding sel dengan pemanasan pada suhu 96 °C selama 5 menit kemudian suhu turun menjadi 50°C dan berlangsung selama 1 menit 30 detik, suhu naik kembali menjadi 96 °C selama 1 menit 30 detik, selanjutnya pada suhu 45 °C, 1 menit 30 detik pada suhu 96 °C selama 1 menit dan 40 °C selama 1 menit. Setelah pemanasan pada proses lisis, campuran PCR (bufer lengkap, ddH2O, dNTPs, primer M13F, M13R dan Taq polimerase) ditambahkan pada setiap sampel. Proses PCR dilanjutkan kembali dengan suhu 94 °C selama 30 detik, 55 °C selama 1 menit dan selama 2 menit pada suhu 72 °C. Campuran PCR ini dilakukan sebanyak 30 siklus. Proses dilanjutkan pada suhu 72 °C selama 5 menit. Uji kualitatif dilakukan dengan elektroforesis. Koloni yang berwarna putih dipindahkan ke media LB agar dan sisanya dimasukkan ke dalam media LB cair yang mengandung ampisilin untuk dikulturkan kembali selama satu hari pada suhu 37 °C dan dinkubasi pada shaker dengan kecepatan 16.65 g (150 rpm). Setelah inkubasi selama satu hari, koloni ini kemudian diisolasi DNA plasmidnya. Isolasi DNA Plasmid Isolasi DNA plasmid
dilakukan
dengan menggunakan kit Rosche. Media kultur diinkubasi bergoyang pada 37 °C. Sebanyak 4 mL dari media kultur tersebut ditempatkan ke 2 tabung Eppendorf (masingmasing tabung sebanyak 2 mL). Sampel tersebut disentrifugasi pada kecepatan 5939 g (8000 rpm) pada suhu 25 °C selama 1 menit dan supernatannya dibuang. Pelet diresuspensikan dengan 250 µL dengan suspension buffer. Bufer lisis sebanyak 250 µL ditambahkan ke dalam sampel dan dibolakbalik sebanyak 6 kali. Sampel diinkubasi selama 5 menit dalam suhu ruang. Kemudian Binding buffer ditambahkan sebanyak 350 µL dan dibolak-balik sebanyak 6 kali. Sampel diinkubasi di dalam es selama 5 menit dan disentrifugasi selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke kolom dan disentrifugasi. Kemudian tambahkan larutan Wash buffer I, Wash buffer II, Elution buffer. Setiap penambahan larutan ini dilakukan sentrifugasi (13362 g/12000 rpm, suhu 25 °C, 1 menit). Uji kualitatif dilakukan dengan elektroforesis.
Pengurutan DNA dan Analisis Plasmid yang telah diisolasi kemudian dilakukan pengurutan sekuen DNA di Laboratorium Biologi Molekuler PT Charoen Pokphand Jakarta. Hasil pengurutan sekuen DNA ini dianalisis menggunakan program Transcription Start Site Prediction (TSSP) pada www.softberry.com.
Kloning dengan Vektor ekspresi pCAMBIA Konstruksi ekspresi gen TcAG dilakukan melalui proses ligasi promoter TcAG pada vektor pCAMBIA 1303. DNA untuk ligasi ini sebelumnya diamplifikasi dengan primer TcAGF (forward) dan primer TcAGR (reverse). Sekuen promoter hasil amplifikasi diligasikan ke dalam vektor pCAMBIA 1303. Campuran ligasi ditambahkan ke dalam 200 µL suspensi sel kompeten E. coli XL-1 Blue sebanyak 10 µL. Sel kemudian ditumbuhkan pada media LB padat agar yang mengandung kanamisin 25 ppm dan diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 °C. DNA plasmid hasil isolasi diverifikasi dengan dua cara yaitu pemotongan dengan enzim restriksi (BamHI dan NotI) dan amplifikasi menggunakan primer universal dan spesifik (M13F sebagai primer forward dan TcAGR sebagai primer reverse)
6
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Desain Primer Promoter Gen AGAMOUS (TcAG) Perancangan primer promoter TcAG dilakukan untuk memperoleh sekuen spesifik yang diinginkan. Proses ini diawali dengan penetapan daerah ekson pada sekuen TcAG yang dilakukan dengan analisis penjajaran antara cTcAG dengan sekuen yang terdapat pada GenBank. Hasil analisis penjajaran gen TcAG dengan sekuen genomik pada GenBank menunjukkan adanya homologi antara klon cDNA TcAG dengan referensi genomik pada daerah 98-286, dengan tingkat homologi yaitu antara 75 hingga 84%. Sekuen homolog kakao diperlukan untuk menentukan primer TcAG. Sekuen homolog ini diakses pada situs www.ncbi.nlm.nih.gov menggunakan program BLASTN. Primer TcAG untuk TAIL PCR dianalisis dengan program primer 3 pada situs www.frodo.wi.mit.edu (Wessensteiner 2004). Sebanyak empat pasang primer forward dan reverse ditampilkan pada program ini dan tidak menunjukkan hasil yang baik. Karakter dari primer tersebut masih menunjukkan Tm yang rendah dan terdapatnya dimer dan hairpin loop. Desain primer selanjutnya dilakukan secara manual melalui pencarian sekuen dan menganalisisnya melalui program gene runner untuk menentukan dimer dan hairpin loop serta karakter primer lainnya. Berdasarkan sekuen pada daerah homolog tersebut, dua primer spesifik (nested) digunakan dalam uji TAIL PCR untuk isolasi promoter TcAG. Kemudian primer spesifik tersebut digunakan untuk menetapkan sekuen DNA genomik di daerah ujung 5’ dari gen target. Perancangan primer menggunakan program gene runner diperoleh dua primer spesifik gen yaitu TcAG+202 dan TcAG+67. Sekuen primer gen spesifik ini digunakan sebagai primer reverse pada TAIL PCR. Sekuen primer spesifik pertama yang digunakan adalah TcAG+202 dengan urutan basa nukleotida 5’GGCCACGGCTAGAGAAGACAA-3’ yang mempunyai Tm : 68.7. Sekuen primer spesifik kedua yang digunakan adalah TcAG+67 dengan urutan basa nukleotida 5’ATCTCGATCTTTCCCCTTCCC-3’ yang mempunyai Tm 68.1. Primer acak atau arbitrary primer (AP) yang digunakan terdiri atas empat primer yaitu AP103, AP122, AP125 dan AP140 (Tabel 2). Primer acak ini digunakan berdasarkan penelitian isolasi promoter yang
telah berhasil dilakukan oleh Terauchi (2000) yang berfungsi sebagai primer forward pada proses TAIL PCR. Suhu annealing primer acak ini dirancang rendah, berbeda halnya dengan primer spesifik sebagai primer reverse yang mempunyai suhu annealing yang tinggi. Perbedaan suhu annealing ini dirancang untuk menghasilkan spesifisitas yang tinggi sehingga sekuen yang tidak diketahui dan ingin dicari dapat ditemukan (Terauchi 2000). Tabel 2 Primer acak yang digunakan (AP) AP103 (5’GGTGCTCCGT) AP122 (5’CGATGAGCCC) AP125 (5’ACGGTGCCTG) AP140 (5’CGCAGACCTC) Hasil Isolasi DNA Total dari Daun Kakao Isolasi DNA total daun kakao merupakan salah satu tahap yang penting dalam keberhasilan tahap selanjutnya. Pemilihan metode yang tepat harus dilakukan untuk mendapatkan hasil yang maksimal. Beberapa hal yang harus dipertimbangkan dalam pemilihan metode adalah jenis, jumlah dan umur dari sampel yang akan diisolasi (Tarigan 2008). Isolasi DNA total dilakukan untuk memperoleh sekuen DNA cetakan yang akan digunakan pada proses TAIL PCR. Kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi dilihat dari kemurnian dan konsentrasi DNA yang diperoleh. Setelah dilakukan dua kali isolasi diperoleh empat sampel yaitu DNA 1, DNA 2, DNA 3 dan DNA 4 yang masingmasing memiliki kemurnian DNA kakao 4.2, 2.4, 3.2, dan 1.9 dilihat pada kisaran absorbansi spektrofotometri 260/280. Berdasarkan nilai kemurnian ini diperoleh hasil terbaik yang ditunjukkan oleh DNA 4 yaitu 1.9 (Gambar 3). 12000 bp
Keterangan : M : marker 1 : DNA 1 2 : DNA 2 3 : DNA 3 4 : DNA 4
M
1
2
3
4
Gambar 3 Hasil isolasi DNA kakao.
7
Pemurnian DNA ini dilakukan dengan penambahan RNase. Kemurnian DNA yang baik dilihat dari nilai absorbansi 260/280 yang berada pada kisaran 1.8-2.0 (Sambrok et al. 1989). Visualisasi dari DNA dilihat dari sinar UV pada panjang 300 nm. Walau menunjukkan kemurnian yang berbeda pita hasil elektroforesis menunjukkan intensitas yang seragam. Analisis kualitatif pada elektroforesis dapat digunakan dengan dua cara yaitu melalui elektroforesis gel agarosa dan poliakrilamid. Sekuen DNA gel agarosa digunakan karena ukuran dari sampel yaitu lebih besar dari 200 kb. Kemurnian DNA kakao diuji pada elektroforesis dengan konsentrasi 1%. Secara umum agarosa 1% digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang mempunyai ukuran dari 600-10000 bp (Glick & Pasternak 2003).
Hasil Amplifikasi Promoter Gen Agamous (TcAG) Proses TAIL PCR dilakukan untuk memperoleh sekuen spesifik promoter TcAG. Proses TAIL PCR menggunakan primer spesifik gen (reverse) dan primer acak (forward) menghasilkan produk yang dapat dilihat pada Gambar 4. Sekuen primer acak AP 125 dan AP140 menghasilkan fragmen amplifikasi dengan pita yang lebih baik dan tebal yang berukuran sekitar 1200 bp. Sekuen primer AP125 dan AP140 juga memberikan hasil yang baik pada isolasi promoter yang dilakukan Terauchi (2000). Sekuen primer AP103 dan AP122 tidak dapat mengamplifikasi secara optimal sekuen promoter TcAG yang ditunjukkan oleh ukuran
pita yang kecil dan tipis. Primer ini memberikan banyak pemisahan pita dan tidak menunjukkan hasil amplifikasi yang baik dari ketebalan pita. Hal ini dikarenakan primer acak tersebut menempel tetapi tidak pada sekuen target sehingga menghasilkan produk yang tidak diinginkan. Sama halnya dengan isolasi promoter yang dilakukan Terauchi (2000) melaporkan bahwa primer AP103 dan AP122 memberikan hasil yang tidak sebaik AP 140 yaitu pita hasil amplifikasi promoter yang dihasilkan berukuran pendek. PCR pertama dikondisikan untuk menciptakan satu atau lebih penempelan (annealing) primer acak (forward) pada sekuen target. Primer spesifik gen (reverse) yang digunakan yaitu TcAG+202. Suhu annealing yang digunakan adalah 29 ˚C (Terauchi 2000). DNA cetakan yang digunakan adalah DNA kakao hasil dari isolasi DNA. Proses PCR kedua yaitu proses amplifikasi untuk memperoleh sekuen promoter TcAG yang spesifik. Primer spesifik (reverse) yang digunakan yaitu TcAG+67. Proses PCR kedua menggunakan DNA cetakan hasil amplifikasi dari PCR pertama yang diencerkan dengan ddH2O (1/50). Proses PCR ketiga merupakan eliminasi produk nonspesifik (reamplifikasi). Sekuen primer spesifik gen (reverse) yang digunakan yaitu TcAG+67. Proses PCR ketiga menggunakan DNA cetakan hasil amplifikasi dari PCR kedua yang diencerkan dengan ddH2O (1/10). Siklus ketiga ini dilakukan modifikasi menjadi 30 siklus reaksi, berbeda halnya dengan siklus pertama dan kedua yang tidak dilakukan modifikasi.
12000 bp
2000 bp 1650bp
1200 bp
AP103
AP122
AP125
AP140
Gambar 4 Tiga proses TAIL PCR dengan menggunakan primer acak.
8
Penambahan siklus ini dimaksudkan agar hasil amplifikasi menjadi maksimal dengan kemurnian produk PCR yang tinggi. Hasil TAIL PCR dianalisis secara kualitatif dengan menggunakan gel agarose 1.2%. Konsentrasi cetakan DNA kakao pada TAIL PCR adalah 100 ng/µL. Konsentrasi yang tinggi pada cetakan DNA menghasilkan produk PCR yang kurang baik. Karena cetakan yang terlalu banyak akan menyulitkan primer menempel. Sebaliknya konsentrasi yang rendah menyebabkan persaingan pada penempelan primer (Azizah 2008).
Hasil Kloning Promoter Gen AGAMOUS (TcAG) dengan Vektor pGEM-T Easy Hasil amplifikasi promoter TcAG diligasikan dengan vektor pGEM-T Easy untuk pengurutan sekuen DNA. Proses ini dimulai dengan kloning melalui tahapan ligasi, transformasi dan seleksi transforman. Hasil elusi dari amplifikasi promoter TcAG diligasi dengan vektor pGEM-T Easy. Proses ligasi dilakukan pada inkubasi 4 ºC selama semalam. Tahap ligasi ini dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu suhu, konsentrasi ion, sifat dari DNA (kohesif atau blunt), konsentrasi vektor DNA, dan konsentrasi fragmen DNA (insert). Penggunaan T4 ligase digunakan sebagai pengkatalisis dari ikatan fosfodiester diantara 3’ hidroksi dan 5’ fosfat dari dua nukleotida yang berdekatan.
Sehingga pemulihan kembali dari struktur berlangsung dari utas DNA (Rodriguez 1983). Hasil ligasi ditransformasi ke dalam sel kompeten E. coli XL-1 Blue. Proses transformasi dilakukan dengan kejut panas (heat shock) pada suhu 42 ºC selama 50 detik. DNA yang ditambahkan pada larutan transformasi yaitu kompleks resisten DNase dari hidroksi kalsium fosfat yang akan berikatan pada permukaan sel. Kompleks ini bisa diinsersi oleh sel pada kondisi suhu 42 ºC (Rodriguez 1983). Pendeteksian tansforman E. coli dilakukan dengan menumbuhkan pada media yang mengandung antibiotik ampisilin, IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) dan X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-Dgalaktopiranoside). Bahan IPTG digunakan sebagai penginduksi dari operon lacZ. Produk protein dari gen lacZ akan mengikat bagian promoter operator pada gen lacZ. Sehingga gen ini ditranslasikan dengan mengaktifkan enzim βgalaktosidase (Glick & Pasternak 2003). Vektor pGEM-T Easy (Gambar 5) mengandung gen lacZ dan ampisilin resisten untuk mengidentifikasi E. coli transforman. Ampisilin digunakan untuk menyeleksi agen yang mungkin tumbuh pada vektor kloning (Glick & Pasternak 2003). Pada media yang mengandung ampisilin, bakteri resisten dan sensitif ampisilin akan tumbuh sebagai koloni yang berbeda. Sel resisten akan kelihatan sebagai koloni yang besar dan dikelilingi oleh koloni satelit dengan berbagai ukuran (Rodriguez 1983).
Gambar 5 Vektor pGEM-T Easy (Promega 2009
9
Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC terdapat koloni putih dan koloni biru. Koloni putih adalah koloni yang mengalami penyisipan DNA promoter TcAG sehingga tidak mampu menghasilkan βgalaktosidase (warna koloni tetap berwarna putih). Adapun koloni biru adalah koloni non transforman yang tidak mengandung fragmen DNA promoter TcAG sehingga mampu menghasilkan β-galaktosidase pada gen lacZ. Enzim ini mampu mengubah molekul X-gal menjadi molekul berwarna biru pada koloni (Glick & Pasternak 2003). Koloni berwarna putih dengan diameter ± 1 mm merupakan koloni yang dipilih. Seleksi juga dilakukan pada koloni yang berwarna biru. Perubahan koloni berwarna putih menjadi koloni berwarna biru disebabkan pada pergeseran kerangka baca pada (frameshift) dari protein atau disebabkan oleh aktivitas eksonuklease yang memotong fragmen tersebut (Mangunwardoyo 2002). Koloni ini kemudian diisolasi DNA plasmidnya dan digunakan sebagai cetakan pada PCR koloni. Produk dari PCR koloni dianalisis kualitatif pada gel agarosa 1%. Koloni yang diamplifikasi dengan menggunakan primer acak (forward) AP 140 (diberi kode d8) memiliki ukuran 1400 bp (Gambar 6). Plasmid ini adalah plasmid yang membawa promoter TcAG. Ukuran pita d8 lebih besar 200 bp dari ukuran pita hasil TAIL PCR (1200 bp). Hal ini disebabkan karena pita d8 mendapat penambahan sekuen nukleotida yang berasal dari amplifikasi menggunakan primer M13 forward (M13F) dan M13 reverse (M13R). Plasmid yang membawa promoter TcAG ini digunakan untuk proses pengurutan sekuen DNA.
Pengurutan Promoter dan Analisis Sekuen Promoter TcAG Proses pengurutan DNA dilakukan untuk mendapatkan urutan basa hasil dari amplifikasi promoter TcAG dengan TAIL PCR yang diverifikasi dengan PCR koloni. Hasil yang diperoleh dari PCR koloni merupakan koloni dengan ukuran plasmid 1200 bp yang membawa promoter TcAG. Pengurutan sekuen DNA plasmid dilakukan dari arah forward dan arah reverse menggunakan primer M13F dan M13R. Prinsip dari pengurutan sekuen DNA yaitu proses dideoksinukleotida yang memerlukan primer. Primer ini digunakan untuk penentuan situs yang diinsersi yaitu situs promoter TcAG. Hasil pengurutan sekuen DNA diseparasi pada elektroforesis gel poliakrilamid. Hasil pembacaan ini dilakukan oleh program komputer berupa elektroferogram yang berwarna. Masingmasing warna menunjukkan salah satu basa (Glick & Pasternak 2003). Hasil pengurutan gen TcAG dianalisis untuk mengetahui posisi promoter. Posisi promoter TcAG dapat diketahui dari letak TATA Box pada sekuen. Hasil analisis TSSP (Gambar 7) ini menunjukkan adanya tiga daerah promoter yaitu posisi 126 (TATA Box pada posisi 93), posisi 735 (TATA Box pada posisi 702) dan posisi 807 (TATA Box pada posisi 774). TATA Box pada posisi 774 merupakan sekuen yang berada paling dekat dengan situs transkripsi yang ditunjukkan pada Gambar 8 (Sari 2008). Perhitungan posisi ini dimulai dari daerah hulu (ujung 5’) ke daerah hilir (ujung 3’) sekuen promoter gen TcAG.
1400bp
Gambar 6 Hasil PCR koloni setelah dielektroforesis c : (AP125), d : (AP140) (koloni yang diisolasi plasmidnya menggunakan primer acak AP140).
10
Length of sequence- 2658 Thresholds for TATA+ promoters - 0.02, for TATA-/enhancers -0.04 3 promoter/enhancer(s) are predicted Promoter Pos: 126 LDF- 0.11 TATA box at 93 21.87 Promoter Pos: 735 LDF- 0.05 TATA box at 702 19.61 Promoter Pos: 807 LDF- 0.04 TATA box at 774 18.50 Transcription factor binding sites/RegSite DB: for promoter at position - 126 16 (-) RSP00071 GACG 105 (-) RSP00096 GGTTT 17 (-) RSP00148 CGACG 110 (+) RSP00316 AACCAA 33 (-) RSP00438 GGCGGC 5 (+) RSP00466 actaCCGACatgagttccaaaaagc 41 (-) RSP00483 GCCGC for promoter at position - 735 715 (-) RSP00096 GGTTT 514 (+) RSP00161 WAAAG 502 (+) RSP00252 CACATG 570 (+) RSP00265 ACTTTA 526 (-) RSP00304 TTTTTTCC 519 (-) RSP00305 CCTTTT 563 (-) RSP00309 CACCTG 504 (+) RSP00327 CATGCA 681 (-) RSP00477 TTTAA 534 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca for promoter at position - 807 764 (-) RSP00096 GGTTT 570 (+) RSP00265 ACTTTA 586 (-) RSP00161 WAAAG 526 (-) RSP00304 TTTTTTCC 519 (-) RSP00305 CCTTTT 563 (-) RSP00309 CACCTG 743 (+) RSP00400 CGGTTG 746 (-) RSP00422 ACCGAC 754 (-) RSP00463 atttcatggCCGACctgcttttt 754 (-) RSP00464 acttgatggCCGACctctttttt 724 (-) RSP00469 GNGGTG 681 (-) RSP00477 TTTAA 765 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca Gambar 7 Hasil analisis TSSP untuk identifikasi promoter dari fragmen DNA ujung 5’ gen TcAG.
TATA 93
TATA 702
TATA 774
ATG------------------------------------
5’-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------3’ 126 735 situs transkripsi AG 807 Daerah Promoter TcAG Gambar 8 Posisi TATA Box pada sekuen promoter TcAG.
11
Hasil Kloning dengan Vektor ekspresi pCAMBIA 1303 Sekuen promoter TcAG yang terdapat pada vektor pGEM-T diamplifikasi dengan primer yang mengandung bagian enzim restriksi BamHI dan NotI menggunakan metode amplifikasi pada PCR. Sekuen primer tersebut yaitu primer TcAGF (forward) dengan urutan basa nukleotida 5’GCTTTAGGATCCATCTCGATCTTTCCCC TTCC-3’ dan memiliki Tm: 83.7. Primer kedua yang digunakan yaitu primer TcAGR (reverse) dengan urutan basa nukleotida 5’GCTAGCGGCCGCGATTGCTAACTGCGA AATAG-3’ dan memiliki Tm: 88.9. Hasil elektroforesis menunjukkan adanya pemisahan dua pita yaitu pita vektor dan sekuen promoter TcAG. Pita pertama yang posisinya berada di atas merupakan pita dari vektor pGEMT-Easy dan pita kedua di bawahnya menunjukkan sekuen promoter TcAG (Gambar 9a). Hasil amplifikasi ini dimurnikan dengan metode elusi dan diligasi menggunakan vektor ekspresi pCAMBIA 1303. Kemudian ditransformasi pada E. coli pada media yang mengandung kanamisin. Koloni yang dipilih memiliki diameter sekitar ± 1 mm. Koloni yang tersisip vektor pCAMBIA 1303, menghasilkan koloni yang seluruhnya berwarna putih. Vektor pCAMBIA 1303 dipilih karena mempunyai situs 35S promoter. Promoter ini telah digunakan pada tanaman model tembakau dan telah menunjukkan ekspresi gen dari T-DNA (Glick & Pasternak 2003). Sekuen promoter TcAG berhasil disisipkan pada vektor pCAMBIA 1303 yang
ditunjukkan dari hasil elektroforesis yaitu adanya pita sekuen promoter TcAG (Gambar 9b&c). Verifikasi terhadap sekuen promoter TcAG yang berhasil tersisip dilakukan dengan proses amplifikasi menggunakan primer M13F (forward) dan primer spesifik gen TcAGR (reverse). Ukuran amplifikasi ini adalah sekitar 1200 bp sesuai ukuran promoter gen TcAG (Gambar 9b). Sebagai pembanding maka dilakukan pemotongan dengan BamHI dan NotI terhadap pCAMBIA 1303 yang membawa gen penyandi kitinase. Berdasarkan Gambar 9c, ukuran pita sekuen promoter TcAG yang diperoleh adalah 1400 bp (penambahan 200 bp merupakan gen kitinase dari vektor pCAMBIA 1303). Sehingga hasil pemotongan dengan BamHI dan NotI menunjukkan bahwa promoter TcAG berhasil disisipkan pada vektor ekspresi pCAMBIA 1303.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Promoter gen TcAG pada tanaman kakao berhasil diisolasi melalui teknik TAIL PCR. Promoter gen TcAG yang diperoleh memiliki ukuran 1200 bp. Hasil analisis TSSP pada program softberry dari ujung 5’ dari sekuen promoter gen TcAG memprediksi adanya tiga daerah promoter yaitu pada posisi basa nukleotida 126, 735 dan 807. Posisi basa nukleotida 807 (TATA Box pada posisi 774) ini merupakan daerah yang dekat dengan situs transkripsi.
1400 bp 1200 bp
(a)
1200 bp
(b)
(c)
Gambar 9 (a) Amplifikasi plasmid d8 menggunakan primer spesifik TcAGF dan TcAGR pada vektor pGEMT, (b) Amplifikasi menggunakan primer M13 (forward) dan primer spesifik TcAG (reverse) pada vektor pCAMBIA 1303, (c) pCAMBIA 1303 yang dipotong oleh BamHI dan NotI.
12
Saran Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan melalui ekspresi promoter TcAG pada tanaman tembakau sebagai tanaman model dengan menggunakan reporter gen Gus (βglukoronidase).
UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih disampaikan kepada DIKTI melalui Program Perakitan Sistem Genetik Penyeleksi Bioregulator untuk Meningkatkan Produktivitas Tanaman Kakao yang telah membiayai kegiatan penelitian ini dan Ibu Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si yang telah menyediakan sumber gen pembungaan AGAMOUS.
DAFTAR PUSTAKA Aprijani
DA, Elfaizi MA. 2004. Bioinformatika: perkembangan, disiplin ilmu dan penerapannya di Indonesia. [terhubung berkala] http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html . [4 Apr 2009].
Azizah A. 2008. Perbandingan pola pita amplifikasi DNA daun, bunga, dan buah kelapa sawit normal dan abnormal. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bao X, Robert GF, Joshua ZL, Zhongci L. 2004. Repression of Agamous by Bellringer in floral and inflorescence meristems. The Plant Cell 16: 14781489. Chaidamsari T. 2005. Biotechnology for cocoa pod borer resistance in cocoa. [tesis]. Wageningen: Ph.D. thesis, Wageningen University. Clark DP, Russel. 2005. Molecular Biology : Understanding the Genetic Evolution. California: Elsevier. Dean C, Simpson GG. 2002. Recent advances in flowering time control research in Arabidopsis. Science 296: 285-289. Eavier.
1999. Principle of the PCR. [terhubung berkala]. http://users.ugent.be/ %7Eavierstr/. html. [3 Mar 2007].
Glick BR, Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and
Application of Recombinant DNA. Washington: ASM Pr. Hinsley SR. Theobroma cacao. [terhubung berkala]. http://www.malvaceae. info/Genera/Theobroma.html [4 Apr 2009]. Liu YG, Ning H. 1998. Efficient amplification of insert end sequences from bacterial artificial chromosome clones by Thermal Asymmetric Interlaced PCR. Plant Molecular Biology Reporter 16: 175-181. Liu
YG, Whittier RF. 1995. Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking. Genomics 25: 674-681.
Mangunwardoyo W. 2002. Tranformasi DNA fragmen kromosom Xanthomonas campestris ke dalam Eschericia coli. Markara Sains 6: 1-7. Michiels A, Tucker M, Ende WVD, Laere AV. 2003. Chromosomal walking of flanking regions from short known sequences in GC-rich plant genomic DNA. Plant Molecular Biology Reporter 21: 295-302. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Harpers Illustrated Biochemistry. North Amerika: McGraw-Hill. Orozo C, Chalmena KT, Wough B, Powell W. 1994. Detection of genetic diversity and selective gene introgenession in coffe using RAPD marker. Theor Appl Genet 87: 934-935. Pineiro M, Coupland G. 1998. The control of flowering time and floral identity in Arabidopsis. Plant physiol 117: 1-8. [PPKK] Pusat Penelitian Kopi dan Kakao. 2007. Mencari solusi atas kakao. [terhubung berkala]. http://www.iccri.net.html [4 Apr 2009]. Promega. 2009. Technical Manual. Woods Hollow Road: Promega. Rodriguez RL, Tait RC. 1983. Recombinant DNA Techniques: An Introduction. Menlo Park: The Benjamin.
13
Roger K. Molecular genetics. [terhubung berkala]. http://porpax.bio.miami. edu/150/gene/mol_gen.html. [4 Apr 2009]. Sari EC. 2008. Isolasi dan karakterisasi promoter gen ACC oksidase pisang ambon (Musa acuminata) [tesis]. Bandung: Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung. Sambrok J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning a Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. Siregar THS, Riyadi S, Nuraeni L. 2004. Budidaya, Pemasaran, dan Pengolahan Cokelat. Jakarta: Penebar Swadaya. Tarigan D. 2008. Isolasi dan kloning fragmen gen penyandi Aminocyclopropane Carboxylic Synthase (ACS) dari daun tanaman karet (Hevea brasilienis) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Terauchi R, Kahl G. 2000. Rapid isolation of promoter sequences by TAIL-PCR: the 5’ flanking regions of Pal and Pgi genes from yams (Dioscorea). Mol Gen Genet 263: 554-560. Tsajadiharja. 1987. Hubungan antara pertumbuhan pucuk, perkembangan buah serta tingkat kandungan asam indol asetat di dalam biji dan layu pentil kakao (Theobroma cacao L.). [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Urquhart DH. 1960. Longmans.
Cocoa.
Ghana:
Utama A. 2003. Aplikasi Bioinformatika dalam Virologi. [terhubung berkala]. http://www.komputasi.lipi.go.id.data/ 1014224403/data/1110939634.pdf.ht ml. [4 Apr 2009]. Weissensteiner T, Griffin H, Griffin A. 2004. PCR Technology. USA: CRC Pr.
14
LAMPIRAN
15
Lampiran 1 Tahap penelitian Pencarian Pencariansekuen sekuendasar dasar(cDNA) (cDNA)
Pencarian sekuen genomik homolog Pencarian sekuen genomik homolog Perancanganprimer primerDNA DNA Perancangan IsolasiDNA DNAdaun daunkakao kakao Isolasi Analisis kualitatifdan dankuantitatif kuantitatifDNA (spektrofotemeter dan elektroforesis) Analisis kuantitatif hasil isolasi (spektrofotometer dan elektroforesis) TAIL PCR (primary, secondary danketiga) tertiary) TAIL PCR (pertama, kedua, dan Elektroforesis Elektroforesis Kloning Kloning dengan dengan vektor vektor pGEM-T pGEM-T Easy Easy (ligasi, (ligasi, transformasi, transformasi, seleksi seleksi dan dan PCR PCR koloni) koloni)
Elektroforesis Elektroforesis
Pengurutan sekuen SekuenDNA DNA(sequencing) (sekuensing)dan analisis KloningModifikasi dengan vektor ekspresi pCAMBIA dan transformasi genetik 1303
16
Lampiran 2 Proses amplifikasi pada TAIL PCR
primer spesifik gen
primer acak
DNA cetakan
PCR pertama (primary PCR)
penempelan pada 25°C
penempelan pada 45°C
penempelan pada 65°C
produk produk spesifik produk non target produk non spesifik
PCR kedua (secondary PCR) produk spesifik non spesifik
PCR ketiga (tertiary PCR) spesifik Sumber : (Liu Yao Guang & Ning Huang 1998)
17
Lampiran 3 Vektor pCAMBIA 1303
18
Lampiran 4 Tampilan layar (print screen) dari output analisis penjajaran melalui BLASTN sekuen cDNA dari gen TcAG dengan sekuen acuan genomik GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)
19
Lampiran 5 Sekuen homolog gen TcAG di GenBank 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901
gataaatagacacctctcaactcttccccgctcccattttctgcatctctcttgatcagt tagcaatcatggtgtaccccaatgaatcatgtgagacctctccccagaagaaaatgggaa ggggaaagatcgagatcaagcggatcgaaaacacaacgaatcgtcaggttactttctgca aaaggcgcaatggactgctcaaaaaggcctatgagttatcagttctttgtgatgctgagg ttgctctgattgtcttctctagccgtggccgcctctatgagtatgctaataatagtgtca aagcaacaattgagaggtacaaaaaaacttgtgcagattcctccaatactgggtcagttt ctgaagctaatgctcagttctaccagcaagaagctgccaaactacgcgtgcaaattggga atttgcagaattcaaacaggcatatgctaggcgagtcactcagcgcattgcctatgaagg atcttagaagcttggagaatcgtttagagaaaggaattagcagaatccgttccaaaaaga atgagctgctgtttgcagaaattgagtatatgcagaagagggaaattgacttgcataaca ataaccaacttctccgagctaagatagctgagaatgagaggaagcagcagaacataaatt tgatgccaggagggtctaactttgagatcatgcattctcagccatttgactctcggaact actttcaagtcaatgcattacaacccgccaatcattacccccaccaggatcagatggccc ttcaattagtctaatattctggtggagtaagtgctacattctgctgtttctgttttagcg aagagcatcttagtattctgtcaggtgaaagctaccagtatcctgaaaatgctataaggc aggaattcaacttcccttaaatggaggactgtagtacct
Keterangan : sekuen primer spesifik (warna biru)
20
Lampiran 6 Hasil pengurutan sekuen DNA (sequencing) promoter gen TcAG dari arah forward dan reverse Forward ATTGTCACAGATCACTTCCTATAAAACCCTGCAACCAATACGCCTGCCAGCTTAGAGTTT GTCTCATACACAAGGTTTTTTTTCTTGGTTTGGAAAGATGAGATGTATGAGTTCTGTAAA CAAGGTGTTGAGAATTAAGCTAAGAGAAAAATGAGTGAGAGCAGATGCAGATCCAGCATA ATGAATGGTTTCTGCCGTATGTACAAGTAATAAAGGCTGCAAAACCACTGAGAAAAAACA ACAATTAGAAGGAAGAAGAGCATGGAGAAAAAGTGACCCATAACCTATCGTCCCACGAAC TTTCAAAGTAAAGAATATCTATGGCTGGTAAAATGAACCAAGATTTTTGGGTTTTGTTTC ATAGTTACAAACCCCTCCCCCCGCCCCTCTCTCTCTCTCTCTAATGCAATGCCCTCCCTC CATTCACATGCAAGAAAAAAGGGAAAAAAAAAAACTAATGGTTATGGGAGTCTGACCTTA CAGGTGATTCCAACTTTAACCTTTCTTTTGTCCTTCAGCTTAATATATACCCCCCTTAGA GAGGAAAACCAACGAATCTAGAAAAGATACTTTCTCGTATAAAACGGCGATATTACTGGT TAAAAGAGAAAACAAAGGGGCCTGTTCTTTAAAAAACCCTCCACCTCCCTCCATTCGCTC CCTGTCGGTTGGAGAAAAAGAAAAACCCAACCTTTGTCGCTATACACCCTCTTTTCCCGG GACCCAACGACACCTACTTTGTCCTTGGAAACTTCTACCGTCCAAGTCTTCCTCCAAGAA ATTTCGATTCCTTTCCAAGCAAAAAGCCTTGGGTTATTGTTTCAGGCAGCCAAGAAATCG CGACCGTTTTTTTTTTCAAAGGATTCCCCAGGTCCCAAAAATCAACCTT
Reverse GTGCCTTAGAATACTCAGCTATGCATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACC TGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTATTTTCTTCTGGGGAGAGGTCTCACATGATT CATTGGGGTACACCATGATTGCTAACTGCGAAATAGAAAAATACACGATAAACAATGATA TACATACATACATACATACCCCAAACGAACTTTTTTTCTTACTGAGGGGAAAACCCTTTT ACCACCTCTGTTATTTTGGCGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCACCCCCCCCCAAATTTTTTT CCGGGGGGGGGAAAAGACAGAACCCGGGAACAAAAACCCCCCCCCCACAGGAAGGAAAAA AAAAAAAAAAAATTTTGACCCCAAAGAGGTGAGCCATGAAATGATTAAAAGGACTATGTT TCACTTATAGATGACTACCTGCCAATGGAAAAAAAGGGAAGGGAGTATGATATTTAGGGA CGAACCAAAGGGGTTTGAGGTTTCCCCCCTTTTTTTCCCCCCAACCTGATCAAAAAAATG CAAAAAGGGACGGGAAAAATTAAAGGGTCTTTTTAAAAGTAAACCCCCCCTCTGATTTCC CTTTTAAAACCCCTATTTTCGCCTTTTAACAAAAAAAACTTTCCAAATTCCGGGGTTTCC CTCCAGGGGGGTTTATAAACGAAAGAAAAAAAAGTTAGTGGACCCTTGGGGCCACCCTCC CCATTTTTTTTCCCTTTCCCGGGGGGGGGGTTTTAAAAAAAAGGGGGGGGGGTTTAAAAA CAAATTTTTTCCCATTTTTTTAGGGGGAGGGGGTCCCCCCCCCTATTTTGGGGGCTTAAA AAAAAAAGGGCCCTTTTTTCGGGAACCCAAAAAAAAAAGGGGTTAAAAAAAAAACCGGGC CTTTTTTTTTTCCCCCCCACCGGGGGGGCCCTTTTAAA
Keterangan : sekuen berwarna hijau adalah sekuen promoter gen TcAG
21
Lampiran 7 Pengurutan sekuen DNA (sequencing) dari promoter gen TcAG GNTTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTATCT CGATCTTTCCCCTTCCCATTGTCACAGATCACTTCCTATAAAACCCTGCAACCAATACGC CTGCCAGCTTAGAGTTTGTCTCATACACAAGGTTTTTTTTCTTGGTTTGGAAAGATGAGA TGTATGAGTTCTGTAAACAAGGTGTTGAGAATTAAGCTAAGAGAAAAATGAGTGAGAGCA GATGCAGATCCAGCATAATGAATGGTTTCTGCCGTATGTACAAGTAATAAAGGCTGCAAA ACCACTGAGAAAAAACAACAATTAGAAGGAAGAAGAGCATGGAGAAAAAGTGACCCATAA CCTATCGTCCCACGAACTTTCAAAGTAAAGAATATCTATGGCTGGTAAAATGAACCAAGA TTTTTGGGTTTTGTTTCATAGTTACAAACCCCTCCCCCCGCCCCTCTCTCTCTCTCTCTA ATGCAATGCCCTCCCTCCATTCACATGCAAGAAAAAAGGGAAAAAAAAAAACTAATGGTT ATNGGAGTCTGACCTTACAGGTGATTCCNACTTTANCCTTTCTTTTGTCCTTCNGCTTNA TATATACCCCCCTTAGAGAGGAAAACCANCGAATCTAGAAAAGATACTNTCTCGTATAAA ACGNCGATATTANTGGTTAAAAGAGAAAACNNANGGGCCTGTTCTTTNAAAAACCCNNCA CCTCCCNCCNTTCGCTCCCTGTCGGTTGGAGAAAAAGAAAAACCCANCCTTTGTCGCTAT ACACCCTCNTTTCCCGGGACCCAACGANACCTACTTTGTCCNTGGAANNTTCTACCGTCC NAGNCTTCCNCCNAGNAATTTNGNTTCCNTNCCNAGCAAAAAGNNTTGNGTTNTTNTTNC NGNCAGCCAAGAANNCNNGNCNGTNNTTTTTTTCNANGNATNCCCCNGGNCCCNAAAANC ANCCNTTTTANAAGGGCCCCCCNGGNGGGGGGGAANAAAAAAANGCCCGGTTTTTNTTTT AACCCCTTTTTTTTTTGGGTTCCCGAAAAAANGGCCCNTTTTTNTTTAAGCCCCNAAANN ANNGGGGGGGACNNCCNNCCCNNAAAAAANTGGGAAAAAANTTGTTTTTAAANCCCCCCC CCNTTTTTTNAAANNCCCCCNCCCGGGANAGGNAAAAAAAATNGGNNGGGNGGCCCCNAG GGTCCNCTNNCNTTTTTTTCNTNCGTTNANNANCCCCCCTGGNGGGNANCCNNGGAATTT GGAAAGNTNTTTNTGTTAAAANGNGNAAATANGGGNTTNAAANNNGAAATCNGAGGGGGG GNTTACTTTTAAAAAGANCCTTTAANTTTNCCNGTCCCNTTTNGCATTTTTTTGATCAGG TTGGGGGGAAAAAAAGGGGGGAAACCTCNAACCCCTTTGGTTCGNCCCTNAATATCANAC TCCCTTCCCTTTTTTTCCATTGGCAGGTAGTCATNTATAAGTGAAACATAGTCCTTTTAA TCATTTCANGGCTCNCCTNTTTGGGGTCAANNNNNNNTTTTTTTTTTTTTNTTCCTNNCN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCTGNNNNTTNCCCCCCC CNNNAAAAAATTTGGNGGGGGGNGGGGGGGCNCCCCCCCCCNCNCCAAAATAACANAGGN GNNAAANGNNNNNNNNNNNCAGTNAGNANNAANNTNCGTTNGGGGTATGTATGTATGTAT GTATATCATTGTTTATCGTGTATTTTTCTATTTCGCAGTTAGCAATCATGGTGTACCCCA ATGAATCATGTGAGACCTCTCCCCAGAAGAAAATGGGAAGGGGAAAGATCGAGATCAAGC GGATCGAAAACACAACGAATCGTCAGGTTACTTTCTGCAAAAGGCGCAATGGACTGCTCA AAAAGGCCTATGAGTTATCAGTTCTTTGTGATGCTGAGGTTGCTCTGATTGTCTTCTCTA GCCGTGGCCGCCTCTATGAGTATGCTAATAATAGTGTCAAAGCAACAATTGAGAGGTACA AAAAAACTTGTGCAGATTCCTCCAATACTGGGTCAGTTTCTGAAGCTAATGCTCAGTTCT ACCAGCAAGAAGCTGCCAAACTACGCGTGCAAATTGGGAATTTGCAGAATTCAAACAGGC ATATGCTAGGCGAGTCACTCAGCGCATTGCCTATGAAGGATCTTAGAAGCTTGGAGAATC GTTTAGAGAAAGGAATTAGCAGAATCCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGCTGTTTGCAGAAA TTGAGTATATGCAGAAGAGGGAAATTGACTTGCATAACAATAACCAACTTCTCCGAGCTA AGATAGCTGAGAATGAGAGGAAGCAGCAGAACATAAATTTGATGCCAGGAGGGTCTAACT TTGAGATCATGCATTCTCAGCCATTTGACTCTCGGAACTACTTTCAAGTCAATGCATTAC AACCCGCCAATCATTACCCCCACCAGGATCAGATGGCCCTTCAATTAGTCTAATA Keterangan : sekuen promoter gen TcAG (warna hijau), sekuen primer spesifik (warna biru), dan sekuen vektor (warna merah).
22
Lampiran 8 Mekanisme pembungaan pada tanaman Arabidopsis
konservasi tidak baik pada gen
jalur periode cahaya pencahayaan
jalur musim semi
jalur asam giberalat
jalur integrasi
ekspresi promoter gen
ekspresi represor gen
Keterangan : AGL : AGAMOUS-Like
transisi pembungaan
pembungaan
konservasi baik pada gandum
23
