ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PADA JARINGAN LEMAK IMAGO BETINA ULAT SUTERA LIAR Attacus atlas (Lepidoptera: Saturniidae)
RAHMAD ARSY
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Identifikasi Bakteri pada Jaringan Lemak Imago Betina Ulat Sutera Liar Attacus Atlas (Lepidoptera: Saturniidae) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Januari 2015 Rahmad Arsy NIM B04100061
ABSTRAK RAHMAD ARSY. Isolasi dan Identifikasi Bakteri pada Jaringan Lemak Imago Betina Ulat Sutera Liar Attacus atlas (Lepidoptera: Saturniidae) Dibimbing oleh USAMAH AFIFF dan DAMIANA RITA EKASTUTI. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi bakteri yang hidup dalam jaringan lemak imago betina Attacus atlas yang dikumpulkan dari perkebunan teh PTPN VIII Pangleujar Kabupaten Purwakarta Provinsi Jawa Barat. Sampel diambil dari jaringan lemak dari 5 imago betina. Sampel ini dibiakkan dalam agar darah dan Mac Conkey Agar. Identifikasi bakteri didasarkan pada serangkaian tes yaitu, koloni dan morfologi individu, karakteristik pewarnaan Gram, dan tes biokimia standar. Ada 2 genus bakteri diidentifikasi: Aeromonas dan Bacillus. Spesies diidentifikasi seperti Aeromonas sp. dan Aeromonas schubertii. Aeromonas adalah genus yang paling umum yang ditemukan dalam jaringan lemak imago betina. Kata kunci: A. atlas, bakteri, jaringan lemak, imago
ABSTRACT RAHMAD ARSY. Isolation and Identification of Bacteria in Female Fat Body Imago Wild Silkworm Attacus atlas (Lepidoptera: Saturniidae) Supervised by USAMAH AFIFF and DAMIANA RITA EKASTUTI. The aim of this study was to identify the bacteria that lived in the fat body of female imagoes Attacus atlas which was collected from tea plantation PTPN VIII Pangleujar Purwakarta Regency West Java Province. Samples were taken from fat body of 5 female imagoes. These samples were cultured in the Blood Agar and Mac Conkey Agar. The identification of the bacteria were based on series of tests such as, colony and individual morphology, Gram stain characterisic, and standard biochemistry tests. There were 2 genus of bacteria were identified such as Aeromonas and Bacillus. The species were identified as Aeromonas sp and Aeromonas schubertii. Aeromonas is the most common genus which were found in the fat body of the female imagoes. Keywords: A. atlas, bacteria, fat body, imagoes
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PADA JARINGAN LEMAK IMAGO BETINA ULAT SUTERA LIAR Attacus atlas (Lepidoptera: Saturniidae)
RAHMAD ARSY
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
Judul Skripsi: Isolasi dan ldentifikasi Bakteri pada Jaringan Lemak Imago Betina Ulat Sutera Liar Attacus Atlas (Lepidoptera: Saturniidae) Nama
: Rahmad Arsy
NIM
: B04100061
Disetujui oleh
Drh Usamah Afiff, MSc
Dr Drh Damiana Rita Ekastuti, MS, AIF
Pembimbing I
Pembimbing I I
oleh
MS PhD APVet
Tanggal Lulus:
J 4 JAN 2015
PRAKATA Alhamdulillah segala puji bagi Allah SWT atas berkat, rahmat, dan hidayahNya penulis dapat menyelesaikan karya tulis ilmiah yang berjudul Isolasi dan Identifikasi Bakteri pada Jaringan Lemak Imago Betina Ulat Sutera Liar Attacus Atlas (Lepidoptera: Saturniidae). Skripsi ini merupakan prasyarat kelulusan jenjang sarjana di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor Dengan segala syukur dan berbahagia, penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada: 1. Drh Usamah Afiff, MSc dan Dr Drh Damiana Rita Ekastut, MS, AIF selaku dosen pembimbing yang selalu mengarahkan penulis dengan penuh kesabaran sehingga tulisan ini dapat terselesaikan; 2. Dr Drh Eko Sugeng Pribadi, MS selaku dosen pembimbing akademik yang selalu memberikan motivasi dan arahan selama penulis menjadi mahasiswa di FKH IPB; 3. Bapak Nursam dan Bapak Ismet yang telah membantu menyediakan bahan penelitian; 4. Keluarga tercinta, papa R.A Syarkawi, mama Zubaidah, serta kakak dan adik-adikku tersayang yang senantiasa memberikan rasa cinta dan kasih sayang serta dukungan secara moril dan materiil selama penulis melalui jenjang sarjana; 5. Teman-teman satu penelitian Muhammad Fajar dan Andra Adi Esnawan yang memberikan masukan dan semangat; 6. Sahabat-sahabat terlemes Acromion FKH 47 Agvinta Nilam W, Nafisatul Ulfa, Dini Nurwahyuni, Kukuh Syirotol Ichsan, Novan Eko Kurniawan, Gamma Prajnia, Tri Apriyadi Hidayat, Intan Pandini RM, Moh. Zenal Abidin M, dan teman-teman lain yang selalu memberikan semangat; 7. Drh Mira Fatmawati, MSi yang senantiasa memberikan motivasi dan masukan.
Bogor, Januari 2015 Rahmad Arsy
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
Manfaat Penelitian
1
TINJAUAN PUSTAKA
2
METODE
4
Tempat dan Waktu Penelitian
4
Alat dan Bahan
4
Metode Penelitian
5
Pengambilan dan Pemeliharaan Kokon
5
Pengambilan Sampel
5
Isolasi Bakteri
5
Identifikasi Bakteri
5
Analisis Data HASIL DAN PEMBAHASAN
7 7
Isolasi Bakteri
7
Identifikasi Bakteri
9
KESIMPULAN DAN SARAN
11
Kesimpulan
11
Saran
11
DAFTAR PUSTAKA
12
RIWAYAT HIDUP
14
DAFTAR TABEL 1 2 3 4
Identifikasi bakteri pada ulat sutera Bombyx mori yang sakit Koloni bakteri yang tumbuh pada media agar darah dan MCA Hasil pengamatan mikroskopis bakteri yang tumbuh pada media TSA Hasil uji Indol, TSIA, Oksidase, Urea, dan Sitrat Bakteri Gram Negatif
4 8 8 11
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6 7
Distribusi Attacus atlas Diagram alir identifikasi bakteri Gram Negatif Diagram alir identifikasi bakteri Gram Positif Koloni bakteri yang terbentuk pada media MCA dan agar darah (A) Pewarnaan Gram Negatif dan (B) Positif, perbesaran 100X Hasil Uji Indol dan Oksidase Hasil Uji Karbohidrat, Urea, dan Sitrat
2 6 7 8 9 10 10
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Indonesia merupakan salah satu negara yang memiliki keanekaragaman hayati yang melimpah. Salah satunya adalah serangga penghasil serat sutra yaitu Attacus atlas. A.atlas merupakan serangga asli Indonesia yang mengalami metamorfosis sempurna yaitu telur, larva, pupa, dan imago. A.atlas hidup sepanjang tahun dan tidak pada musim-musim tertentu saja. Benang sutra yang dihasilkan A.atlas memiliki keunggulan seperti warna benang coklat, lebih mengkilat, sehingga mempunyai harga jual yang lebih tinggi. Benang sutera ini digunakan sebagai bahan utama dalam dunia mode karena memiliki nilai eksklusivitas yang tinggi sebagai rancangan adibusana. Permintaan benang sutera yang tinggi merupakan masalah yang besar bagi Indonesia karena jumlah produksi benang sutera di Indonesia masih terbatas. Hal tersebut dikarenakan budidaya ulat sutera masih belum banyak dikembangkan. Beberapa daerah telah mencoba untuk membudidayakan ulat sutera A.atlas seperti Yogyakarta, Sukabumi, dan Purwakarta. Saat ini benang sutera A.atlas diperoleh dari kokon sutera liar yang diambil di alam dalam jumlah yang besar sehingga mengancam populasinya. Perilaku ulat sutera sangat dipengaruhi oleh perubahan cuaca, terutama oleh suhu dan kelembaban. Perubahan tersebut menyebabkan ulat sutera mudah terserang oleh agen penyakit. Menurut Solihin et al. (2010), larva A. atlas dapat diserang oleh jamur Aspergillus sp. dan bakteri Bacillus thuringiensis. Penyakit yang menyerang A. atlas yang dapat menghambat perkembangan ulat sutera ini belum banyak dilaporkan. Jaringan lemak digunakan pada penelitian ini karena jaringan lemak merupakan cadangan energi dan berfungsi untuk pematangan telur. Apabila pada jaringan lemak terdapat bakteri berbahaya, maka memungkinkan telur terinfeksi bakteri. Hal tersebut yang melandasi penelitian ini dilakukan.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui bakteri yang terdapat pada jaringan lemak imago ulat sutera liar A. atlas di kawasan kebun teh Purwakarta.
Manfaat Penelitian Penelitian ini bermanfaat untuk memberikan informasi mengenai bakteri yang bersifat flora normal atau pun bersifat patogen yang terdapat pada jaringan lemak imago ulat sutera liar A. atlas.
2
TINJAUAN PUSTAKA Klasifikasi Attacus atlas Ulat sutera adalah serangga yang masuk ke dalam Ordo Lepidoptera, yang mencakup semua jenis kupu dan ngengat. Menurut Peigler (1989), klasifikasi A. atlas sebagai berikut: Kingdom Filum Kelas Ordo Famili Genus Spesies
: Animalia : Arthopoda : Insekta : Lepidoptera : Saturniidae : Attacus (Linnaeus) : Attacus atlas (Linnaeus)
Distribusi Geografis Attacus atlas Ulat sutera dapat digolongkan ke dalam familia Bombycidae, Saturnidae, dan Thaumeto pocidae. Ulat sutera Bombyx mori dari familia Bombycidae, dan ulat sutera A.atlas dari familia Saturniidae. Penyebaran A.atlas di daerah tropis sangat luas, mulai dari daerah Himalaya, China bagian Selatan, Srilanka, Myanmar, Asia tenggara, dan Australia bagian Utara. Perbedaan iklim dan letak geografis mengakibatkan terbentuknya berbagai macam spesies dan ras Attacus (Peigler 1989).
Gambar 1 Distribusi Attacus atlas (Peigler 1989)
Siklus Hidup Attacus atlas Ulat sutera adalah serangga yang mengalami metamorfosa sempurna yang berarti bahwa setiap generasi melewati 4 stadium, yaitu telur, larva, pupa, dan
3
imago. Kisaran waktu daur hidupnya berbeda-beda sesuai tanaman inangnya (Solihin et al. 2010). Selama metamorfosa, stadium larva adalah satu-satunya masa ulat makan, fase ini merupakan masa yang sangat penting untuk sintesis protein sutera dan pembentukan telur. Telur dihasilkan imago betina yang kawin maupun tidak kawin. Telur A. atlas di alam diletakkan berkelompok di bawah permukaan daun atau cabang-cabang pohon tanaman inang (Kalshoven 1981). Telur akan menetas menjadi larva dalam 6–10 hari. Tahap larva A. atlas terdiri atas enam tahapan instar. Larva instar I memiliki ciri-ciri panjang tubuh ratarata 0.5 cm, warna kepala cokelat kehitaman dan warna tubuh kuning kecokelatan (Zebua et al. 1997). Larva instar II memiliki panjang tubuh 1–1.5 cm (Awan 2007). Bagian kepala berwarna cokelat agak terang sedangkan pada bagian belakang abdomen terdapat bercak merah. Permukaan tubuh dilindungi serbuk putih (Peigler 1989). Panjang tubuh larva pada instar III mencapai 2–2.5 cm, kepala berwarna cokelat agak terang dan terdapat bercak merah pada bagian belakang tubuh (Awan 2007). Larva instar IV mempunyai ukuran tubuh 2.5–3 cm, kepala berwarna putih kehijauan cerah, dan bercak berwarna cokelat tua yang merata di seluruh tubuh. Selain itu, seluruh permukaan tubuh ditutupi serbuk putih yang semakin menebal (Awan 2007). Larva yang telah mencapai instar ini lebih aktif dan mengkonsumsi pakan lebih banyak. Instar V terlihat pertambahan yang sangat terlihat nyata karena pada instar ini aktivitas makan semakin meningkat. Panjang tubuh larva dapat mencapai 6.5–8 cm. Bagian kepala ikut mengalami perubahan ukuran dan berwarna hijau muda. Tubuh ditutupi dengan serbuk putih (Awan 2007). Instar terakhir yaitu pada instar VI. Ukuran tubuhnya mencapai 8–10 cm, berwarna hijau tua hingga hijau kehitaman. Tubuh larva terlihat sangat besar, gemuk, dan kokoh serta serbuk putih mulai menghilang. Larva akan mengeluarkan cairan sutera yang digunakan untuk membentuk serat-serat sutera kokon (Awan 2007). Pupasi adalah terbentuknya pupa setelah stadium larva. Pupa berwarna cokelat kehitaman dan terlindung dalam suatu kokon (Triplehorn dan Johnson 2005). Kokon A. atlas terbentuk dari serat atau filamen sutera yang berasal dari kelenjar sutera (Solihin et al. 2010) atau modifikasi kelenjar-kelenjar air liur yang bermuara pada labium (Triplehorn dan Johnson 2005). Perbedaan antara pupa jantan dan betina pada ukuran dan penutupan antena. Pada pupa jantan penutupan antena 1/2 dari panjang antena, sedangkan betina penutupan antena 1/4–1/3 dari panjang antena (Peigler 1989). Imago akan keluar dari kokon setelah 24 hari (Mulyani 2008). Perbedaan antara imago jantan dan betina dapat dibedakan dari ukuran tubuh, bentang sayap dan tipe antena. Tubuh imago jantan lebih kecil dari betina dengan warna lebih cokelat kekuningan. Bentangan sayap imago jantan 15–22 cm sedangkan sayap imago betina 16.5–24 cm (Awan 2007). Antena jantan lebih besar dibandingkan betina dan memiliki warna cokelat kekuningan. Panjang dari antena jantan 25–30 mm dan lebar 10–13 mm. Sementara pada betina panjang antena berukuran 17–21 mm dan 3 mm. Fungsi antena pada imago jantan antara lain untuk mendeteksi feromon yang dikeluarkan imago betina sebagai isyarat kimia untuk melakukan kopulasi. Imago betina akan mengeluarkan feromon dari ujung abdomen untuk menarik jantan yang selanjutnya akan melakukan perkawinan. Perkawinan akan berlangsung selama sehari penuh (Peigler 1989).
4
Jaringan Lemak Ulat Sutera Selama metamorfosis, jaringan lemak ulat sutera mengalami perubahan. Jaringan lemak imago berasal dari beberapa sel lemak larva yang bertahan pada masa pupa atau kepompong. Jaringan lemak pada fase pupa berbeda antara betina dan jantan. Jaringan lemak lebih banyak ditemukan pada pupa betina dibandingkan pupa jantan. Sebagian besar sel lemak pupa betina dimanfaatkan untuk pematangan sel telur, sementara sebagian besar sel lemak pupa jantan dimanfaatkan sebagai cadangan energi untuk bertahan hidup (Tajima 1978).
Bakteri pada Ulat Sutera Beberapa jenis bakteri yang dapat menyebabkan penyakit pada ulat sutera Bombyx mori telah dilaporkan. Menurut Sakthivel et al. (2012), bakteri yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari ulat sutera Bombyx mori yang sakit dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Identifikasi bakteri pada ulat sutera Bombyx mori yang sakit (Sakthivel et al. 2012). No 1 2 3 4 5 6 7
Bakteri Bacillus subtilis Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas fluorescence Bacillus cereus Klebsiella cloacae
METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2014 sampai dengan Juli 2014. Pemeliharaan imago ulat sutera liar A. atlas dilakukan di Laboratorium Metabolisme Divisi Fisiologi Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Identifikasi bakteri dilakukan di Laboratorium Riset Mikrobiologi Divisi Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan adalah kandang kasa ukuran 50 cm x 50 cm x 50 cm, cawan petri, lemari pendingin, alat bedah minor berupa gunting, scalpel, dan
5
pinset, botol 5 ml, ose, needle, gelas objek, tabung reaksi, cawan petri, pipet, rak tabung reaksi, pembakar Bunsen, mikroskop cahaya, spidol, label nama, inkubator, dan camera digital. Bahan-bahan yang digunakan adalah jaringan lemak imago betina ulat sutera liar A. atlas sebanyak 5 ekor yang diambil di bagian toraks, akuades steril, media untuk mengisolasi seperti agar darah, Mac Conkey Agar (MCA), dan Trypticasein Soy Agar (TSA), media untuk mengidentifikasi bakteri seperti Triple Sugar Iron Agar (TSIA), indol, kaldu gula-gula (glukosa, sukrosa, manitol, maltosa, dan laktosa), zat warna Gram (kristal violet, lugol, aseton alkohol, safranin), dan alkohol 70%.
Metode Penelitian Pengambilan dan Pemeliharaan Kokon Kokon ulat sutera A. atlas diambil dari perkebunan teh PTPN VIII Pangleujar kabupaten Purwakarta provinsi Jawa Barat. Kokon disimpan dalam kandang kasa berukuran 50 cm x 50 cm x 50 cm. Pemisahan antara kokon betina dan jantan dengan cara kulit kokon digunting untuk melihat bakal imago jantan dan betina ulat sutera A. atlas. Pupa yang memiliki antena yang besar akan menjadi imago jantan sedangkan pupa yang memiliki antena kecil akan menjadi imago betina. Pengambilan Sampel Imago betina dimasukkan ke dalam freezer selama 60 menit sampai imago mati. Kemudian imago dinekropsi dengan menggunakan seperangkat alat bedah minor steril berupa pinset, scalpel, dan gunting. Bagian yang akan dinekropsi disterilkan dahulu dengan alkohol 70 %. Setelah itu, dilakukan pengambilan jaringan lemak menggunakan pinset dan dimasukkan ke dalam botol kaca yang berisi akuades steril 2 ml. Sampel diambil dari 5 ekor imago ulat sutera liar A. atlas di bagian toraks. Isolasi Bakteri Sampel diambil dengan menggunakan ose dan dibiakkan ke dalam media agar darah dan MCA dengan goresan T dan diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator dengan suhu 37 oC. Setelah 24 jam, koloni terpisah dari bakteri yang tumbuh pada media agar darah dan MCA dicatat ciri koloninya. Setiap koloni yang tumbuh berbeda sepanjang goresan dibiakkan ke dalam agar miring TSA dan dilakukan pelabelan untuk setiap koloni. Biakan agar miring TSA diinkubasi selama 24 jam menggunakan inkubator dengan suhu 37 oC. Identifikasi Bakteri Koloni yang tumbuh pada media TSA diwarnai dengan pewarnaan Gram untuk dilihat morfologi, sifat Gram, dan kemurniannya. Menurut Lay (1994), preparat ulas ditetesi dengan larutan kristal violet dan didiamkan kurang lebih 60 detik. Preparat dibilas dengan akuades. Setelah dicuci, preparat ditetesi larutan lugol selama 60 detik dan dibilas dengan akuades hingga bersih. Preparat diberi larutan pemucat berupa aseton alkohol kurang lebih 15 detik dan dibilas kembali dengan akuades hingga bersih. Preparat ditetesi larutan safranin kurang lebih 15– 20 detik dan dibilas kembali dengan akuades hingga bersih. Setelah itu, preparat
6
dikeringkan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran objektif 100x yang sebelumnya ditetesi minyak emersi. Hasil pewarnaan Gram, bakteri Gram positif berwarna ungu sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah. Apabila terdapat koloni bakteri yang belum murni, maka dilakukan kembali isolasi pada agar darah maupun MCA dengan goresan T. Apabila hasil dari pewarnaan Gram kurang meyakinkan, maka dilakukan uji KOH 3% untuk menentukan sifat Gram bakteri. Bakteri Gram negatif akan memberikan hasil adanya masa gelatin yang membentuk benang-benang halus saat diangkat menggunakan ose. Secara ringkas alur identifikasi bakteri Gram Positif dan negatif dapat dilihat pada Gambar 2 dan 3. Identifikasi akhir mengacu pada Jang et al. (1976), Barrow dan Feltham (1993), dan Bergey dan Breed (1994), seperti tampak pada Gambar 2 dan 3. Bakteri Gram Negatif
Batang
kokus
(+)
(-)
Nonenterobacteri aceae
Enterobacteriacea e
Pseudomonas Aeromonas Vibrio
Neisseria
MacConkey Agar
Laktosa Negatif TSIA Indol Sitrat MRVP Fermentasi Karbohidrat
Laktosa Positif TSIA Indol Sitrat MRVP Fermentasi Karbohidrat
Gambar 2 Diagram alir identifikasi bakteri Gram Negatif Sumber: Bergey dan Breed 1994; Lay 1994
7
Gambar 3 Diagram alir identifikasi bakteri Gram Positif Sumber: Bergey dan Breed 1994; Lay 1994
Analisis Data Analisis data dengan menggunakan metode deskriptif.
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Bakteri Terdapat tiga koloni bakteri yang tumbuh pada media agar darah dan MCA (Tabel 2). Koloni bakteri yang didapatkan pada media agar darah berukuran sedang, berbentuk bulat, permukaan kasar, tidak mengkilat, tepi tidak rata, elevasi cembung, berwarna krem ,dan hemolisis β. Satu koloni bakteri yang terbentuk pada
8
media MCA berukuran sedang, berbentuk bulat, permukaan halus, mengkilat, tepi tidak rata, elevasi cembung, dan berwarna merah. Sedangkan satu koloni bakteri yang lain berukuran sedang, berbentuk bulat, permukaan halus, mengkilat, tepi tidak rata, elevasi cembung, dan berwarna pink. Menurut Lay (1994), warna koloni yang yang sama dengan media menunjukkan koloni tersebut tidak memfermentasikan laktosa dan biasanya bersifat patogen. Tabel 2 Koloni bakteri yang tumbuh pada media agar darah dan MCA Media Karakteristik Ukuran Bentuk Permukaan Aspek Tepi Elevasi Warna Hemolisis
Agar darah Koloni 1 Sedang Bulat Kasar Tidak Mengkilat Rata Cembung Krem β
MCA Koloni 2 Sedang Bulat Halus Mengkilat Rata Cembung Merah
MCA Koloni 3 Sedang Bulat Halus Mengkilat Rata Cembung Pink
Gambar 4 Koloni bakteri yang terbentuk pada media MCA dan agar darah
Koloni bakteri terpisah yang didapatkan dibiakkan ke dalam media TSA. Media ini merupakan media pertumbuhan bakteri yang umum digunakan dan mengandung nutrisi untuk menjaga bakteri tetap tumbuh. Koloni bakteri yang tumbuh pada media TSA diuji dengan pewarnaan Gram untuk melihat sifat Gram dan morfologinya. Koloni 2 dan koloni 3 yang diwarnai dengan pewarnaan Gram memiliki karakteristik berbentuk batang, susunan tunggal, berwarna merah, dan termasuk ke dalam Gram negatif. Koloni 1 yang diwarnai memiliki karakteristik berbentuk batang, susunan berantai, berwarna ungu, berspora, dan termasuk ke dalam Gram positif. Hasil pewarnaan Gram dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Hasil pengamatan mikroskopis bakteri yang tumbuh pada media TSA Karakteristik Morfologi Susunan Warna Spora Gram
Koloni 1 Batang Rantai Ungu Berspora Positif
Koloni 2 Batang Tunggal Merah Tidak berspora Negatif
Koloni 3 Batang Tunggal Merah Tidak berspora Negatif
9
A
B
Gambar 5 (A) Pewarnaan Gram Negatif dan (B) Positif, perbesaran 100X
Identifikasi bakteri Berdasarkan hasil pengamatan makroskopik dan mikroskopik, koloni 1 merupakan bakteri yang termasuk ke dalam genus Bacillus. Hal tersebut ditunjukkan dengan hasil pewarnaan Gram yang memiliki karakteristik berbentuk batang, susunan berantai, memiiki spora, berwarna ungu, dan bersifat Gram positif. Menurut Lay (1994), genus Bacillus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, dan memiliki spora. Terdapatnya spora, letak spora, dan ukuran spora dapat digunakan untuk mengidentifikasi genus Bacillus (Pelzar dan Chan 1986). Menurut Sakthivel et al. (2012), bakteri yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi yang dapat menyebabkan penyakit pada larva ulat sutera Bombyx mori adalah Bacillus subtilis, B. cereus, Escherichia coli, Streptococcus pneumonia, dan Staphylococcus aureus. Bakteri yang paling banyak menginfeksi larva Bombyx mori adalah Streptococcus sp, Bacillus cereus, B. thuringiensis, B. bombyseptieus, dan Staphylococcus aureus (Kundu 2014). Hal tersebut memungkinkan Bacillus sp yang terdapat pada jaringan lemak imago betina A. atlas bisa berasal dari lingkungan yang tercemar oleh Bacillus sp selama fase larva. Koloni bakteri Gram negatif diuji dengan menggunakan media oksidase, indol, TSIA, urea, dan sitrat. Pengujian koloni bakteri dengan media TSIA untuk membedakan genus bakteri dalam famili Enterobacteriaceae dan Nonenterobacteriaceae. Pengujian koloni 2 dan koloni 3 didapatkan hasil asam pada slant dan butt, menghasilkan gas dan tidak menghasilkan H2S yang berarti bakteri tersebut dapat memfermentasikan glukosa dan laktosa. Berdasarkan hasil uji TSIA tersebut, koloni bakteri mengarah ke genus Aeromonas, Eschericia, Erwinia, Serratia, Klebsiella, dan Proteus (Jang et al. 1976) dan (Lay 1994).
10
Koloni bakteri tersebut diuji lanjut dengan menggunakan media indol, sitrat, urea, dan karbohidrat untuk mengetahui genusnya. Pada koloni 2 uji indol menghasilkan hasil positif dan non motil. Pada koloni 3 uji indol didapatkan hasil uji negatif dan non motil. Pengujuian dengan menggunakan media sitrat dan oksidase didapatkan hasil uji positif untuk koloni 2 sedangkan utuk koloni 3 hasil uji oksidase positif dan uji sitrat didapatkan hasil uji negatif. Uji urea dan uji VP didapatkan hasil uji negatif untuk koloni 2 dan koloni 3.
Gambar 6 Hasil Uji Indol dan Oksidase Pengujian dengan menggunakan media karbohidrat pada koloni 2 didapatkan hasil uji positif untuk glukosa, sukrosa, maltosa, dan manitol, hasil uji negatif untuk laktosa. Hal tersebut menunjukkan bahwa bakteri tersebut dapat memfermentasikan karbohidrat berupa glukosa, sukrosa, maltosa, dan manitol sebagai sumber karbon. Akan tetapi bakteri tersebut tidak dapat memfermentasikan laktosa sebagai sumber karbon. Pada koloni 3 didapatkan hasil uji positif untuk glukosa, laktosa, sukrosa, maltosa, dan manitol.
Gambar 7 Hasil Uji Karbohidrat, Urea, dan Sitrat
Berdasarkan hasil uji diatas, koloni 2 dan koloni 3 termasuk kedalam genus Aeromonas. Menurut Abbot et al. (2003), spesies anggota Aeromonas (A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, A. veronii, dan A. veronii bv. sobria) semuanya memberikan hasil positif untuk uji indol. Aeromonas schubertii memiliki hasil uji indol negatif (Awan et al. 2005). Selain itu menurut Awan et al. (2005), spesies Aeromonas yang memiliki hasil uji sitrat negatif adalah A. schubertii dan A. jandaei. Menurut Jayavignesh et al. (2011), Aeromonas hydrophila memiliki kemampuan untuk memfermentasi laktosa. Aeromonas hydrophila dan Aeromonas sobria tidak memiliki kemampuan untuk memfermentasi laktosa (Erdem et al. 2012). Hasil uji dapat dilihat seperti yang tertulis pada Tabel 4.
11
Tabel 4 Hasil uji Indol, TSIA, Oksidase, Urea, dan Sitrat bakteri gram negatif Karakteristik Indol Motilitas TSIA
Slant Butt Gas H2S
Oksidase Urea Sitrat VP Glukosa Laktosa Sukrosa Karbohidrat Maltosa Manitol Hasil Identifikasi
Koloni 2 + Asam Asam + + + + + + + Aeromonas sp
Koloni 3 Asam Asam + + + + + + + Aeromonas schubertii
Menurut Anand et al.(2010), Aeromonas sp merupakan bakteri flora normal yang hidup pada saluran pencernaan larva ulat sutera Bombyx mori yang memakan daun murbei. Bakteri tersebut memiliki kemampuan untuk mendegradasi polisakarida yang terdapat pada daun murbei. Aeromonas sp yang ditemukan pada jaringan lemak imago betina A. atlas diduga berasal dari fase larva yang bertahan sampai fase imago. Aeromonas hydrophila dan A. schubertii dapat ditemukan di berbagai lingkungan perairan seperti air tanah, air permukaan, air payau, air laut, dan air limbah (EPA 2006) termasuk di air kolam ikan (Wulandari 2012). Menurut BKIPM (2011), Aeromonas sp banyak ditemukan pada sumber air yang berada di Purwakarta. Bakteri ini biasanya patogenik pada hewan seperti ikan, reptil, dan jarang pada mamalia (Quinn et al. 2002).
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Bakteri yang berhasil diidentifikasi pada jaringan lemak imago betina Attacus atlas adalah genus Aeromonas yang terdiri dari dua spesies yaitu Aeromonas sp dan Aeromonas schubertii. Kedua spesies tersebut merupakan bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram Positif yang berhasil diidentifikasi merupakan bakteri genus Bacillus.
Saran Perlu dilakukan uji lebih lanjut untuk mengidentifikasi bakteri sampai tingkat spesies dengan memperbanyak jenis uji biokimiawi dan atau menggunakan polymerase chain reaction (PCR). Selain itu perlu penelitian lain untuk
12
mengidentifikasi mikroorganisme selain bakteri yang hidup pada jaringan lemak imago betina ulat sutera Attacus atlas.
DAFTAR PUSTAKA Abbot SL, Sharon W, Cheung KW, Janda JM. 2003. The genus aeromonas: biochemical characteristics, atypical reaction, and phenotypic identification schemes. J Clin Microbiol. 41(6): 2348. Anand AAP, Vennison SJ, Sankar SG, Prabhu DIG, Vasan PT, Raghuraman T, Geoffrey CJ, Vendan SE. 2010. Isolation and characterization of bacteria from the gut of Bombyx mori that degrade cellulose, xylan, pectin, and starch and their impact on digestion. Journal of Insect Science 10:107. Awan A. 2007. Domestikasi ulat sutera liar A. atlas (Lepidoptera: Saturniidae) dalam usaha meningkatkan persuteraan nasional [Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Awan BM, Ahmed MM, Barii A, Saad AM. 2005. Biochemical characterization of the aeromonas species isolated from food and environtment. Pak J Physiol: 1(1–2). Barrow GI, Feltham RKA, editor. 1993. Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria. Ed ke-3. UK [kota tidak diketahui]: Cambridge Univ Pr. Bergey DH, Breed RS. 1994. Identification flow charts Bergey’s manual of determinative bacteriology [Internet]. Diunduh pada [2014 1 Sep]. Tersedia pada: http://www.uiweb.uidaho.edu/micro_biology/250/IDFlowcharts.pdf. [BKIPM] Balai Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanaan Hasil Perikanan. 2011. Stasiun karantina ikan pengendalian mutu dan keamanan hasil perikanan kelas II Cirebon. [Internet]. Diunduh pada [2014 11 Nov]. Tersedia pada: http://www.bkipm.kkp.go.id/bkipm/profil/upt/37.0/Stasiun%20Karantina %20Ikan%20Kelas%20II%20Cirebon.html. [EPA] Environmental Protection Agency. 2006. Aeromonas: Human Health Criteria Document. Health and Ecological Criteria Division Office of Science and Technology Office of Water. Wahington (USA): Environmental Protection Agency. Erdem B, Kariptas E, Cil E, Isik I. 2011. Biochemical identifications and numerical taxonomy of Aeromonas sp. isolated from food sample in Turkey. Turk J Biol 35. 463–472. Jang SS, Biberstein EL, Hirsh DC. 1976. A Manual of Veterinary Clinical Bacteriology and Micology. Davis (US): Univ California. Jayavignesh V, Kannan KK, Bath AD. 2011. Biochemial Characterization and Citotoxicity of the Aeromonas hydrophila Isolated from Catfish. CODEN (USA) AASRC9ISSN 0975–508x. Kalshoven LGE. 1981. Pests of Crops in Indonesia. Jakarta (ID): PT Ichtiar Baru- Van Hoeve.
13
Kundu S. 2014. Silk Biomaterials for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. India (IND): Woodhead Publishing. Lay BW. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta (ID): Raja Grafindo Persada. Mulyani N. 2008. Biologi A. atlas L. (Lepidoptera: Saturniidae) dengan pakan daun kaliki (Ricinus communis L.) dan jarak pagar (Jatropha curcas L.) [Tesis]. Bogor (ID): IPB. Peigler RS. 1989. A Revision of The Indo-Australian Genus Attacus. California (USA): The Lepidoptera Research Fondation, Inc. Pelzar MJ, ECS Chan. 1986. Microbiology. New York (USA): MC Graw Hill Book Company. Quinn PJ, Markey BK, Carter ME, Donnelly WJ, Leonard FC. 2002. Veterinary Microbiology and Microbial Disease. London (GB): Blackwell Science. Sakthivel S, Angaleswari C, Mahalingam PU. 2012. Isolation and identification of bacteria responsible for flacherie in silkworms. Adv Appl Sci Res 3:4066–4068. Solihin DD, Fuah AM, Ekastuti DR, Siregar HCH, Wiyawan KG, Setyono DD, Mansjoer SS, Nenni BN. 2010. Budidaya Ulat Sutera Alam A. atlas. Bogor (ID): Penebar Swadya. Tajima Y. 1978. The silkworm, an important Laboratory Tool. Tokyo (JPN): Koddansha. Triplehorn CA, Johnson NF. 2005. Borror and Delong’s Introduction to the study of Insect. 7thEdition, Melbourne. Wulandari R. 2012. Deteksi Gen Virulen dan Uji Patogenitas Bakteri Aeromonas hydrophila Isolat Air Sukabumi pada Ikan Gurami (Osphronemus gourami). [Skripsi]. Bandung (ID): Jurusan Pendidikan Biologi FMIPA. Universitas Pendidikan Indonesia. Zebua TU, Situmorang J, Nugroho W. 1997. Daur hidup (Attacus atlas L.) dengan pemberian pakan daun dadap (Erythrina lithosperma Miq.) di Laboratorium. Biota 2: 67–72.
14
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Palembang pada tanggal 29 Mei 1993, anak dari pasangan Bapak R.A Syarkawi dan Ibu Zubaidah. Pendidikan formal penulis sampai dengan tingkat SMA diselesaikan di Pagaralam, yaitu SDN 5 Pagaralam, SMPN 1 Pagaralam, dan SMAN 1 Pagaralam. Penulis lulus dari SMA dan pada tahun yang sama diterima di jurusan kedokteran hewan melalui jalur USMI. Selama menjadi mahasiswa IPB, penulis bergabung dalam organisasi mahasiswa. Adapun organisasi yang diikuti yaitu himpunan Minat dan Profesi Satwa Liar sebagai anggota (2011–2014) dan beberapa kepanitiaan kegiatan kampus FKH IPB.
