IPARI MIKROORGANIZMUSOK ALKALMAZÁSA ÉS TÖRZSJAVÍTÁSUK DR. MARÁZ ANNA E. TANÁR BUDAPESTI CORVINUS EGYETEM, MIKROBIOLÓGIA ÉS BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK 2004/2005. TANÉV
ÚJ HATÓANYAGOT TERMELŐ MIKRÓBATÖRZS ÉS ELJÁRÁS KIFEJLESZTÉSE Mikróba törzs izolálása
↓ Tenyészet szelektálása
↓ Fermentációs eljárás kidolgozása
↓ Termékek kinyerése
↓ Nyers preparátum
termék screenelés
termék(ek) tisztítása, izolálása, karakterizálása
↓ Fermentációs eljárás optimalizálása
↓
Kémiai szerkezet meghatározása (módosítása)
↓ Toxikológiai vizsgálat
↓ Hatósági engedélyeztetés
↓ Piackutatás
↓ TERMELÉS
MIKROORGANIZMUS TÖRZSEK SZŰRÉSE (SCREENING) Ipari jelentõségű mikróba törzsek izolálása: Fő jellemzők: 1. Tiszta tenyészet legyen (vírus- és fágmentesség) 2. Lehetőleg ivaros és ivartalan szaporító képletekkel is rendelkezzen 3. Jó szaporodási képességgel rendelkezzen 4. Lehetőleg csak a kívánt anyagot termelje 5. Ne termeljen toxikus anyagokat 6. Minél jobban védve legyen a fertőzésekkel szemben (savas pH-nál jól szaporodjon, más mikroorganizmusokat gátló metabolitikat termeljen) 7. Törzsjavítási módszerek alkalmazhatók legyenek (minimum mutagén kezelés) 8. Hosszú ideig tartósítható legyen. Izolálási és törzsfenntarási módszerek 1. Izolálás: Közvetlenül a talajból - talajszuszpenzió higításával - grádiens lemez alkalmazásával - differenciál centrifugálással Jellemző élőhelyekről Törzsgyűjteményekből 2. Szelektív dúsítás - talaj kezelése (szárítás, hőkezelés, szűrés, detergensekkel, oldószerekkel való kezelés) - szelektív gátlóanyagokkal való kezelés (antibiotikumok, antimetabolitok alkalmazása) - speciális tápanyagok (szén-, nitrogénforrás) alkalmazása - hőmérséklet, pH, levegőztetés szabályozása 3. Tenyészetek tartósítása - talaj víztelenítése - ferdeeagaros tenyészetek paraffin olajjal való leöntése - szilikagéles tartósítás - liofilezés - fagyasztás (-80 oC-on) - folyékony nitrogénben való tárolás (-196 oC)
TÖRZSNEMESÍTÉS 1. Szelekció 2. Mutáció 3. Rekombináció A/ Természetes - baktériumoknál:
- gombáknál:
konjugáció transzformáció transzdukció ivaros keresztezés paraszexuális (ivartalan) keresztezés
B/ Meterséges: protoplaszt fúzió rekombináns DNS technika (molekuláris klónozás)
TÖRZSNEMESÍTÉS MUTÁCIÓVAL 1. Spontán mutánsok izolálása 2. Mutánsok indukálása A/ Kismutációk indukálása: kis mutagén dózis (> 50% túlélőből) B/ Nagymutációk indukálása nagy mutagén dózis (20% alatti túlélőből)
KÜLÖNBÖZŐ MUTÁNS TÍPUSOK IPARI MIKROORGANIZMUSOK ESETÉBEN ORGANIZMUS
ALKALMAZOTT MUTAGÉN
MUTÁCIÓ TÍPUSA
TERMÉK
Aspergillus niger
UV- és röntgensugárzás
citromsav
Hansenula anomala
UV-sugárzás
Regulációs: citromsav termelés növekedése Regulációs: antranilsavrezisztencia Adenin auxotrófia
Micrococcus glutamicus Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum Brevibacterium ammoniagenes
MNNG (N-metil-N’-nitro-Nnitrozo-guanidin) MNNG Regulációs: 5-(aminoetil)-cisztein rezisztencia UV-sugárzás Homoszerin auxotrófia Spontáns mutáció
Regulációs: 6-merkaptoguaninrezisztencia
triptofán Inozin-monofoszfát lizin lizin inozin
A Penicillim chrysogenum "Wisconsin" törzsének fejlesztése mutációval
S: spontán mutáció; X: röntgensugárzás: UV: UV sugárzás (UV I: 275 nm, UV II: 253 nm); NM: nitrogén-mustár; NG: nitrozo-guanidin; DEB: diepoxi-bután
Replika módszer auxotróf mutánsok izolálásához
A génsebészet mérföldkövei ·
Teljes gén in vitro szintézise
·
Restrikciós endonukleázok felfedezése
·
Reverz transzkriptáz felfedezése
1972
·
Az első rekombináns DNS molekula létrehozása
1973
·
Plazmid vektorok alkalmazása génklónozásra
1975
·
Southern blotting (lenyomat) módszer kifejlesztése DNS
1970
molekulák specifikus kimutatásához molekuláris hibridizációval 1976
·
Az első prenatális diagnózis megvalósítása gén-specifikus próba segítségével
1977
·
Gyors DNS szekvenáló módszer kidolgozása
·
Szomatosztatin hormon előállítása rekombináns DNS (rDNS) technikával
1978
·
Humán genomiális klóntár létrehozása
1979
·
Inzulin előállítása rDNS technikával
1982
·
Génsebészeti úton (E. coli-val) előállított humán inzulin kereskedelmi forgalomba hozatala
1985
·
Patkány növekedési hormon génjének átvitele egér petesejtbe
·
Glifozát gyomírtószerrel szemben rezisztens (transzgénikus) dohány előállítása
1988
·
A polimeráz láncreakció (PCR) technika kidolgozása
·
Az első genetikailag stabil transzgénikus haszonnövény (szója) előállítása
· 1989
A génpuska kifejlesztése DNS bevitelre
Genetikailag módosított vírus (baculovirus) szabadföldi kibocsátása a vírusrezisztencia növelése céljából
1991
·
Humán proteineket (pl. hemoglobint) termelő transzgénikus malacok és kecskék kifejlesztése
A molekuláris klónozás lépései i/ A klónozáshoz használt DNS izolálása, fragmentálása restrikciós endonukleázokkal ii/
A
DNS
fragmentum
beépítése
a
klónozó
vektorba:
rekombináns DNS molekula in vitro előállítása iii/ A rekombináns DNS bejuttatása a gazdasejtbe iv/ A rekombináns DNS-t tartalmazó klón kimutatása, izolálása
a
A leggyakrabban használt restrikciós endonukleázok és specifikus felismerési és hasítási helyeik A restrikciós endonukleáz jelölése Bam HI
Termelő mikroba
Hasítási hely
Bacillus amyloliquefaciens H
Bcl I
Bacillus caldolyticus
Eco RI
Escherichia coli R
Eco RII
Escherichia coli R
Hae III
Hemophilus aegyptius
Hin dIII
Hemophilus influenzae d
Pst I
Providencia stuartii
¯ 5 -G-G-A-T-C-C-3, 3,-C-C-T-A-G-G-5, ¯ 5,-T-G-A-T-C-A-3, 3,-A-C-T-A-G-T-5, ¯ , 5 -G-A-A-T-T-C-3, 3,-C-T-T-A-A-G-5, ¯ 5,-C-C-T-G-G-3, 3,-G-G-A-C-C-5, ¯ , 5 -G-G-C-C-3, 3,-C-C-G-G-5, ¯ 5,-A-A-G-C-T-T-3, 3,-T-T-C-G-A-A-5, ¯ , 5 -C-T-G-C-A-G-3, 3,-G-A-C-G-T-C-5,
Sau 3A
Staphylococcus aureus
¯ 5,-G-A-T-C-3, 3,-C-T-A-G-5,
Sal I
Streptomyces albus
¯ 5 -G-T-C-G-A-C-3, 3,-C-A-G-C-T-G-5, -
,
,
Gyógyászati célra előállított heterológ humán fehérjék Fehérje
Funkció
Rekombináns gazda
epidermis növekedési faktor
sebek gyógyulása
Saccharomyces cerevisae
folliculus stimuláló hormon
meddőség gyógyítása
inzulin
diabetes gyógyítása
E. coli és Saccharomyces cerevisae
relaxin
szüléskönnyítő
E. coli
somatotropin
törpeség gyógyítása
E. coli
somatostatin
acromegalia gyógyítása
Saccharomyces cerevisae
calcitonin
csontgyengeség gyógyítása
Saccharomyces cerevisae
erythropoetin
vérszegénység gyógyítása
VIII véralvadási faktor
hemophilia (vérzékenység) gyógyítása
E. coli
plazminogén aktivátor
véralvadás gátló
E. coli
interleukin-2
rákellenes hatás
E. coli
tumor nekrózis faktor
rák gyógyítása
a-interferon
vírus- és rák- (leukémia-) ellenes hatás
E. coli
b-interferon
sclerosis multiplex gyógyítása, AIDS
E. coli
ellenes hatás g- interferon
rákellenes hatás, reuma gyógyítása
E. coli
lizozim
gyulladásgátló
Saccharomyces cerevisae
a-amiláz
keményítő lebontása
Saccharomyces cerevisae
Fehérje mérnökség útján módosított proteinek A módosított tulajdonság
Eljárás
Glükóz izomeráz hőstabilitásának növelése
a 253-as argininnek lizinre való kicserélése
Biopeszticid hatás kifejtése a …..vedlését szabályozó
a hormon módosítása a LacZ gén inszerciójával
hormon módosításával a-antitripszin oxidációval szembeni rezisztenciájának
metioninnak valinra való kicserélése
növelése a hirudin hatékonyságának növelése
a 47-es aszparaginnak lizinre vagy argininre való kicserélése
A génsebészet gyakorlati alkalmazása 1.
Mikróbás fermentációk ·
erjedésipari géntechnológiailag módosított élesztőtörzsek
·
enzimtermelés (pl. rekombináns kimozin, b-glükanáz, celluláz, xilanáz)
2.
Vírusellenes vakcinák termelése ·
Vírus köpenyfehérjét kódoló gén klónozása, antigen termeltetés baktériummal vagy élesztőgombával (pl. kanyaró, veszettség, hepatitis B vírusok).
3.
Emlős proteinek termelése ·
vérfehérjék termeltetése (pl. véralvadást elősegítő faktorok, véralvadékot oldó proteinek)
·
emberi hormonok termelése (sárgatest stimuláló hormon, insulin, méh relaxin)
·
immunitást növelő fehérjék termelése (interferonok, lizozim, tumor nekrózis factor)
4.
Transzgénikus növények előállítása ·
Bt. (Bacillus thuringiensis) rovarölő toxint termelő növények előállítása (pl. gyapot)
·
vírusellenálló növények előállítása virus köpenyfehérje gén klónozásával
·
lassan érő (nem puhuló) Favr savr paradicsom előállítása
5.
Transzgénikus állatok előállítása ·
Gyógyászati jelentőségű fehérjék termeltetése állatokkal (pl. antitripszin kiválasztása juh tejbn, véralvadékot oldó fehérje termeltetése kecskében)
6.
Géntechnológiailag módosított mikroorganizmusok felhasználása a
környezeti biotechnológiában ·
klórozott növényvédőszereket (pl. 2,4,5-T) bontó enzimek génjeinek klónozása
·
halogénezett aromás vegyületek (pl. klórbenzén), egyéb aromas vegyületek (anilinek, toluene), szénhidrátok bontása génklónozással
7.
Génterápia ·
Öröklődő betegségek kezelése génsebészeti eszközökkel
ENZIMTERMELÉS MIKROORGANIZMUSOKKAL DR. MARÁZ ANNA E. TANÁR BUDAPESTI CORVINUS EGYETEM, MIKROBIOLÓGIA ÉS BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK 2004/2005. TANÉV
Enzimek ipari előállítása mikroorganizmusokkal Enzim neve
AMILÁZOK
α amilázok
Bacillus subtilis Bac. amyloliquefaciens Bac. licheniformis Aspergillus oryzae
glükoamilázok
Aspergillus niger Asp. awamori Rhizopus niveus
pullulanázok
Aerobacter aerogenes Pseudomonas amylodermatosa
β-amilázok
Bacillus polymixa Bac. cereus Rhizopus japonicus
GLUKÓZIZOMERÁZOK Alkalikus proteázok
PROTEÁZOK
Neutrális proteázok Savanyú proteázok Oltóenzim (rennin)
PEKTINÁZOK LIPÁZOK
Termelő mikroorganizmus
Bacillus coagulans Streptomyces sp. Arthrobacter sp Bac. licheniformis B. amyloliquefaciens Streptococcus fradiae Bac. subtilis Pseudomonas aeruginosa Aspergillus oryzae Aspergillus niger Asp. awamori Mucor miehei Mucor pusillus Endothia parasitica Aspergillus niger Asp. wentii Rhizopus sp. Aspergillus spp. Mucor spp. Rhizopus sp. Candida sp
MIKRÓBÁKKAL TÖRTÉNŐ ENZIMELŐÁLLÍTÁS ELŐNYEI 1. Gyors növekedés, ipari körülmények között jó tenyészthetőség 2. Olcsó növekedési szubsztrátumok alkalmazhatósága (természetes táptalajok, mezőgazdasági melléktermékek) 3. Nagyszámú mikróbafaj és törzy sokféle enzimet termel, amei törzsjavítással tovább fokozható, illetve növelhető 4. Nem mikrobiális enzimek génjei mikróbákban klónozhatók, génsebészeti úton expressziójuk javítható
ENZIMELŐÁLLÍTÁS LÉPÉSEI 1. Megfelelő enzimet termelő törzs szelektálása · Szelektív táptalaj alkalmazása pl. amiláz - keményítő proteáz - kazein . 2. Izolált mikróba jellemzése, rendszertani besorolása (legalább nemzetség szintig), lehetőleg GRAS - biztonságosnak elfogadott legyen) 3. Mikróbák elszaporítása – környezeti feltételek optimalizálása, léptéknövelés 4. Enzimek kinyerése, tisztítása, minősítése
ENZIMTERMELŐ MIKROORGANIZMUSOK TÖRZSNEMESÍTÉSE 1. Törzsnemesítés szempontjai: · ne termeljen káros anyagcsere termékeket (pl. antibiotikum, mikotoxin) · ipari szinten gazdaságos legyen · enzim minősége .megfelelő legyen (szennyező enzim minimális legyen) 2. Módszerek: · mutáció · rekombináció · in vitro rekombináns DNS technika 3. Termelő törzs tartósítása:
· élő tenyészetként (átoltások során termelés csökkenhet) · liofilezés · mélyhűtve (-70, -80 oC-on, glicerinnel keverve) folyékony nitrogénben (krioprotektív anyag alkalmazása)
Proteázkészítmények jellemzői
Mikróba
Enzim
Optimális
Optimális
Elhasított
Hőmérséklet
pH
kötések
(oC)
száma
Asp. saitoi
Savas proteáz
45
2,4-4,0
9
Asp. oryzae
Neutrális proteáz
45
4,5-7,0
9
Asp. oryzae
Alkalikus proteáz
45
8,0-9,0
5
Mucor miehei
Tejalvasztó
55
-
2
proteáz (rennin) Bac. Subtilis
Neutrális proteáz
50
5,0-7,5
6
Bac. licheniformis
Alkalikus proteáz
55
8,0-9,0
7
Lipázkészítmények jellemzői
Mikróba
Enzim
Optimális
Optimális
Maximális
Hőmérséklet
pH
hidrolízis
(oC)
fok
Asp. niger
Lipáz 1
40
5,0-5,5
90
Asp. niger
Lipáz 2
40
6,5
70
Rhizopus sp.
lipáz
40
6,5-7,0
80
Mucor miehei
lipáz
40
7,8-8,2
94
Candida sp.
lipáz
37
5,5-6,5
90
