Hmotnostní spektrometrie (2) 380 360 340
7) 0.67 12 ( CC A 1 by_ rigs VDG 57 _HC a b do Chu 12_ 0 0 71 1 43 55
%
69
41 28
29 32 27
0
320 300 280
85 83 81 67
97
111
95
99 93
79
67 54
183
197
165 155 7 53 125 127 13 1 180 113
211
225
260 240
220
200
160
105
140 120
100 80
60 40
20
Josef Chudoba
Využití MS - kvalitativní analýza Electron Impact ionizace (EI + 70 eV) Databáze spekter GC/MS LC/MS MS/MS experimenty
Využití MS - kvantitativní analýza Kalibrace technikou s vnitřním standardem
Úprava vzorků pro MS analýzy SPE, SPME, extrakce …….
Speciální aplikace MS ICP-MS, Isotope Ratio MS, pyr-GC/MS, Ion Mobility MS
Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Ionty vznikají interakcí molekuly s proudem elektronů o definované energii (70 eV) Molekulový ion – lichý počet počet elektronů
Ionizační energie (IE) – energie nutná k odtržení elektronu z molekuly
Neutrální molekula – sudý počet elektronů
Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Molekulový ion informace o hmotnosti popř. chemickém složení látky, ion s lichým počtem elektronů, jeho m/z nejvyšší v MS spektru (mimo ionty izotopických příspěvků a pozadí); v MS spektru existují také nižší fragmenty s m/z molekulového iontu zmenšenou o logickou ztrátu neutrálních molekul a fragmentů
Povolené ztráty m/z
Zakázané ztráty m/z 4 - 14, 21 - 25 Jsou-li přítomny tyto fragmenty v MS spektru , sledovaný ion určitě není molekulární.
15 CH318 H2O 28 C2H4 nebo CO 35 Cl 36 HCl
Podle intenzity izotopických fragmentů lze poznat přítomnost Cl, Br, lze zjistit počet atomů uhlíku fragmentu
R+DB musí být celé číslo
(R+DB = C -1/2 H + 1/2N +1)
Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Fragmentace molekulového iontu a dalších vzniklých iontů Homolytické štěpení
Heterolytické štěpení
Přesmyky
Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Fragmentace EI+ 70 eV 120 – 91 = 29
Ztráta neutrální částice (molekuly nebo radikálu)
z rozdílů hmot píků se získají tzv. neutrální ztráty vypovídají o struktuře molekuly
Běžné neutrální ztráty EI+ (70 eV) ionizace
Série nízkých iontů (1) - EI+ (70 eV) ionizace
Série nízkých iontů (2) - EI+ (70 eV) ionizace
EI + 70 eV: MS spektra - alkany
n-dekan C4H9+ C3H7+ inkrement CH2
C5H11+ C6H13+ C7H15+
C8H17+
EI+ 70 eV: MS spektra alkanů (2) n-alkan
iso-alkan iso-C8
n-C8
iso-C8 n-C22
EI+ 70 eV:MS spektra alkenů a cykloalkanů alken
alkylcyklopentan
alkylcyklohexan
MS spektra alkenů jsou podobná cykloalkánům
EI+70 eV: MS spektra aromátů alkylsubstituované benzeny chudší fragmentace stabilní arom. kruh, fragmenty z alkylu • nejintenzivnější píky 91 / 92 (tropilium) molekulový ion (toluen 92, xyleny 106, triMeBenzeny 120, atd.) butylbenzen benzen
M+ 78
78
100
50
0
10 20 (mainlib) Benzene
51
39
26
15
30
74
63
40
50
60
M+ 134
70
80
90
EI+ 70 eV: MS spektra polyaromátů
51_PAH_EPAstandMixk_2
Magnet EI+ TIC 4.77e4
benzo(a)antracen
benzo(k)fluoranthen
benzo(b)fluoranthen
100
Benzo(a)pyren
51_PAH_EPAstandMixk_2 1915 (19.343) Cm (1914:1918-(1918+1910))
%
100
Magnet EI+ 9.41e3
252
M+ = 252
51_PAH_EPAstandMixk_2 1855 (18.737) Cm (1855:1856-(1856+1854))
Magnet EI+ 1.66e3
252
%
100
0 18.20
Time 18.40
18.60
18.80
19.00
19.20
19.40
19.60
19.80
20.00
20.20
20.40
250 126+ 125 113 124 127 112 123 135
253
%
M /2 = 126
0
43
50 51 62 63
50
60
68
74 75
70
77 84
80
87 88 99 100
90
100
110
120
130
147
140
150
150
158
161
160
173 174 175
170
180
207 211 222 187 198 200
190
200
210
224 225
220
248 237 239
230
240
250
254
m/z 260
253 250
Benzo(b)fluoranthen 248
126
0
43 44 54 55 57
50
60
65 69 73 74 81
70
80
87
93 96100
90
100
125 113 124 112 123
110
120
127
130
130
143
140
147
151
150
155 165 170 177
160
170
180
186
198 200 206 213 223
190
200
210
224
220
230
240
M+ = 252 254
225 235 237
250
m/z 260
geometrické izomery PAU prakticky nelze rozlišit pomocí MS intenzivní molekulový iont M+ (m/z ; z=1) + 2x nabitý mol. iont (m/z ; z=2) POZOR !!! nejedná se o fragment!!!
EI+ 70 eV:MS spektra alkoholů 1-hexadecanol
m/z 31
1-hexadecen
Alkoholy – podobná spektra jako alkeny, lze je rozlišit podle iontu m/z 31 (alkeny nemají), mají navíc velmi malý molekulový ion, nebo úplně chybí
EI+70 eV: MS spektrum - aromatický alkohol benzylalkohol
molekulový ion inkrement OH
inkrement CH2OH
m/z 109 M+1 izotop 13C
fenyl+ tropylium+
EI+70 eV: MS spektrum – dusíkaté látky - amíny 86
100
Triethylamin N
50 58
30
101 44 15 18
0
32
10 20 (mainlib) Triethylamine
56
52
30
40
72
50
60
84
70
80
90
100
Anilin
100
110
93
NH 2
50
66
0
39 41
28 31
15
10 20 (mainlib) Aniline
30
52
40
63
50
78
74
60
70
86
80
90
100
EI+70 eV: MS spektrum – dusíkaté látky nitrosloučeniny 2,4,6 - trinitrotoluen
210
100
O
O
N
N
O
O
50
30 39 15
0
O
O 134
76
51
N
89
63
105
10 30 50 70 90 (mainlib) Benzene, 2-methyl-1,3,5-trinitro-
110
120 130
149
180
164
150
193 227
170
190
210
230
46
100 30
O
RDX plastická trhavina M = 222 Da
O
N O
N N
N
O
50 N 42
56
71 0
120
75 83
102
112
128 133
N 148
O
O 205
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 (mainlib) 1,3,5-Triazine, hexahydro-1,3,5-trinitro-
EI+ 70 eV: Knihovny MS spekter Univerzální komerční databáze National Institute of. Standards and Techn
NIST 05
John Wiley & Sons
Wiley Registry 8th Ed.
Pallisade MS
Pallisade Complete
190 825 spekter (163 198 sloučenin) 399 383 spekter > 600 000 spekter
Oborové komerční databáze John Wiley & Sons
Biomarkes
John Wiley & Sons
Steroids
1110 spekter 2979 spekter
Oborové free-ware databáze American Academy of Forensic Science (AAFS) “Comprehensive drug LIbrary “(http://www.ualberta.ca/~gjones/mslib.htm) The Int. Association of Forensic Toxicologosts (TIAFT) “Derivatives of Drugs “(http://www.tiaft.org/main/mslib.html)
EI+ 70 eV: Knihovny MS spekter – počítačové vyhledávání Změřené MS spektrum je porovnáváno s databázovými spektry podle různých algoritmů PBM - Probability Based Matching (McLafferty & Stauffer) – rok 1976 Dot Product (Finnigan/INCOS) – rok 1978 Mass Spectral Tree Search (Mistrik) – od roku 2000 (pro MS/MS experimenty, LC/MS aplikace) Weighted Dot Product (Stein) – od r. 1993 algoritmus součástí NIST SEARCH programu Forward search – porovnává všechny píky spektra, nejvíce podobná spektra přiřadí Reverse search – nebere v úvahu všechny píky měřeného spektra, píky, které se neshodují s přířazeným databázovým spektrem ignoruje
EI+70 eV: Identifikace podle databázových MS spekter Výsledkem porovnání měřeného MS spektra s databázovými je několik spekter (HITů) - o kvalitě knihovního nálezu vypovídá tzv. MATCH factor (0-999) – vyšší hodnota – lepší shoda
EI+70 eV: Identifikace podle databázových MS spekter Vysoký MATCH faktor nemusí vždy znamenat správný výsledek !!!
Podobné látky mohou mít odlišná MS spektra, ale … 130
100
N
73 Si
50
0
47
59 59
91 65
91
147
105 114 102
132
163
179 188
163 147
204 206
294
220 280
179 N
50
44
Si
O
Si
Si
O
73 116 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 S ilanamine, N,1,1,1-tetramethyl-N-[1-methyl-2-phenyl-2-[(trimethyls ilyl)oxy]ethyl]-, [S -(R *,R *)]N-Methylphenylethanolamine, bis (trimethyls ilyl)-
100
EI+70 eV: Identifikace podle databázových MS spekter Vysoký MATCH faktor nemusí vždy znamenat správný výsledek !!!
Ale odlišné látky mohou mít i podobná MS spektra 43
100
55 83
70
97
50
29 111
27 0
125
65
15 32
125
27
140 139
154 153
168
196
168
196
111
29 50
97 69
41 100 10
20
30
40
55 50 60 1-T etradecene
83
70
80
90
100
110
120
130
140
150 160 170 180 Cyclotetradecane
190
200
210
GC/MS: pomoc při identifikaci Kovatsův retenční index (RI) RI = 100n + 100[log(tx) − log(tn)] / [log(tn+1) − log(tn)] n-C16
n-C17
n-C15
17_V14_1 100
tn
n-C14
n … počet atomů uhlíku n-alkánu před sloučeninou X
Magnet EI+ TIC 7.25e5
n-C18
tn+1
tn … retenční čas n-alkánu před sloučeninou X
tx %
tn+1 … retenční čas n-alkánu za sloučeninou X tx … retenční čas sloučeniny X
0 11.00
log .. přirozený logaritmus
Time 11.50
12.00
12.50
13.00
13.50
14.00
14.50
15.00
Hodnoty RI jsou dostupné pro celou řadu látek a podmínek – fáze GC kolony (nepolární vs polární), teplotní program separace atd. http://webbook.nist.gov/chemistry/ NIST 05 MS knihovna
GC-MS: Derivatizace málo těkavých analytů
- zlepší tvar píků polárních látek - OH, -COOH, - NH2 atd. - zlepší těkavost málo těkavých analytů -ACYLACE -ALKYLACE, ESTERIFIKACE SILYLACE
http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/analyticalreagents/derivatization-reagents.html
GC-MS •GC-MS spojení plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie •první komerční přístroje – polovina 60. let 20. století – LKB (Švédsko)
– spojení GC s náplňovými kolonami s magnetickým typem spektrometru •70.léta 20. Století – první bench-top instrumenty – kvadrupoly –
Hewlett-Packard, Finnigan
Zdroj: Agilent Technologies
GC-MS
První GC-MS - náplňové kolony – velký průtok nosného plynu (10 – 40 ml/min) – MS spektrometr (vakuum) – nutný restriktor – tryskový (JET) separátor (dělí tok nosného plynu bez ztráty vzorku) Dnes kapilární GC kolony (malý průtok nosného plynu – do 2 ml/min) není nutný restriktor
Dnešní výrobci GC-MS přístrojů Agilent Technologies Thermo Electron Corporation Perkin Elmer, Varian, Shimadzu, Waters a další….
Cena GC-MS zákl. konfigurace : kvadrupol, zdroj EI+ ionizace, GC chromatograf, split/splitless nástřik, SW – cca 2 mil. Kč
GC: MS vs FID detektor
MS detektor
FID detektor
+ identifikace sloučenin podle MS spektra
+ nižší pořizovací náklady, malý rozměr
+ vysoká citlivost prakticky pro
+ vyšší dynamický rozsah
všechny typy sloučenin
+ prakticky univerzální detektor + TIC záznam blízky FID záznamu dat
- při aplikacích kvantitativní analýzy obvykle nutná technika vnitřního standardu (použití izotopicky zančeného (deuterovaného) standardu
- odlišná odezva pro různé uhlovodíky - vyšší pořizovací náklady a náklady na údržbu
+ prakticky univerzální odezva pro uhlovodíky – využití při kvantitativní analýze
+ použití náplňových i PLOT kolon + jako nosný plyn lze i N2
- více provozních plynů (nosný plyn, H2, vzduch) - detekce pouze sloučenin obsahující CH vazbu
LC/MS: kvalitativní analýza Sprejové ionizační techniky poskytují pseudomolekulové ionty resp. adukty molekulového iontu s některými kationty (pozitivní režim) nebo anionty (negativní režim). Často vznikají při ionizaci i oligomery sloučenin nebo v ESI vícenásobně nabité ionty. Pozitivní režim
Negativní režim
M + 1 (H+)
M - 1 ( - H+)
Možné adukty
Možné adukty
M + 23 (Na+)
M + 22 (Na+ -H)
M + 39 (K+)
M + 45 (COOH-)
M + 32 (CH3OH)
M + 59 (CH3COO-)
M + 41 (CH3CN)
M + 58 (NaCl) M + 41 (CH3CN)
LC/MS: kvalitativní analýza Vícenásobně nabité ionty Velké molekuly (ESI) – série iontů – nestejné rozdíly mezi m/z – příklad koňský myoglobin (M = 16951 Da) Určení náboje a celkové hmotnosti molekuly: m1 a m2 .. m/z dvojice sousedních iontů, n1 a n2 jejich náboj (z), X adukt k molekulovému iontu m1 = [M+n1X]/n1 m2 = [M+n2X]/n2 n2 = (m1-X)/(m2-m1) m1 = 1413, m2 = 1542, odhad X = 1 n2 = 10.94 , Mcalc = 16951 Da m1 = 1305, m2 = 1413, odhad X = 1 n2 = 12.07, Mcalc = 16944 Da
Vícenásobně nabité ionty
LC/MS: kvalitativní analýza
malé molekuly – příklad dvounásobně nabitý ion – poloviční rozdíl u m/z mezi izotopy CalixMB20_1 #20 RT: 0.54 AV: 1 NL: 1.72E6 T: FTMS + p ESI Full ms [500.00-3800.00] 1240.2731 z=2 100 1240.7747 z=2 90
CalixMB20_1 #20 RT: 0.54 AV: 1 NL: 4.74E4 T: FTMS + p ESI Full ms [500.00-3800.00] 2479.5364 z=1 100
[M+2H]2+ CH3
Relative Abundance
60
CH3
CH3 1241.2762 z=2
50
O
40
OH O
OH O
O
O
O H
H 1241.7780 z=2
30
O
1240.6763 z=?
20 10
1239.5
1240.0
1240.5
O
O
O
NH
NH
NH
2478.5283 z=1
70
NH
60 50
2481.5388 z=1
40 30
2482.5435 z=1
N
N
20
1242.2793 z=2
1240.8738 z=?
1240.1433 z=?
0
z=1
80
Relative Abundance
H3C
CH3
H3C
70 1239.7716 z=2
2480.5383 z=1
90
z=2
80
1241.9204 z=?
CalixMB20_1 RT: 0.54 1241.0 1241.5 #201242.0 1242.5 AV: 1 NL: 1.72E6 T:m/zFTMS + p ESI Full ms [500.00-3800.00] 1240.2731 z=2 100 995.5652 z=1 90
HN
O
NH
O
2480.8804 z=?
2479.8606 z=?
2479.0459 z=?
10 0 2478
2479
2480
2481
2482
m/z
HO HO
O
C156 H204 N8 O18
CH3 H3 C
CH3
70 Relative Abundance
2483
O
80
∆ 0,5 Da
2483.5493 z=1
2482.2180 z=?
∆ 1 Da
M = 2477,5292 Da
60 50
[M+H]+ = 2478,5372 Da
40 1296.2485 z=2
30 20 10
684.2023 z=1
915.6678 z=1
1104.7693 z=?
1463.9445 z=2
0 600
800
1000
1200
1400
1600 m/z
1800
2000
2200
[M+H]+
2479.5364 z=1
1727.0635 2006.4622 2213.8513 z=2 z=2 z=?
2400
2600
kvalitativní analýza – kombinace více ionizačních technik H
S V 2 1 4 1 _ 2 # 6 R T : 0 .3 5 A V : 1 N L : 2 .6 4 E 7 T : F TM S + p A P C I c o ro na F ull m s [4 2 0 .0 0 -1 5 0 0 .0 0 ] 5 5 5 .1 1 9 6 100
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
O
O
90 O
O
O Cl
80
O
O
O
70 Relative Abundance
O
O
60
APCI+
50 F F
40
F F
F
F
F
30
[M+H] +
F
F
5 2 3 .0 9 3 8
F F F
F
20 6 7 5 .1 4 1 2
1 2 4 5 .3 5 8 8
10 5 7 7 .5 1 9 0
7 1 7 .1 0 7 1
8 3 7 .1 2 8 6
0 500
600
700
800
9 5 7 .1 4 9 8 1 0 0 5 .3 1 6 1 1 1 2 5 .3 3 7 6
900 m /z
1000
1100
1 2 7 7 .3 8 5 1 1200
1300
kvalitativní analýza – kombinace více ionizačních technik H
ESI+ S V 2 1 4 1 _ 1 # 3 R T : 0 .1 1 A V : 1 N L : 6 .7 1 E 4 T : F T M S + p E S I F u ll m s [4 0 0 .0 0 - 1 5 0 0 .0 0 ] 4 6 7 .1 0 1 9 z= 1 100 O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
O
O
90
H
O
O Cl O
80
O O
O
Relative Abundance
70
O
60
6 8 5 .4 3 5 5 z= 1
50
F F
30
0 400
F
F
F
F
5 4 1 .1 2 0 7 z= 1
[M+Na] +
F
F F F F
F
9 7 8 .7 6 7 3 z= 1
20 10
F
9 5 0 .7 3 6 0 z= 1
40
6 1 5 .1 3 9 5 z= 1
600
7 7 7 .2 2 9 1 z= ?
9 0 6 .7 0 9 7 z= 1
800
1 2 6 7 .3 4 0 0 z= 1
1 1 1 4 .9 2 9 0 z= 1 1000
1 4 4 3 .9 5 9 7 z= ?
1200
1400
m /z
kvalitativní analýza – kombinace více ionizačních technik EI+ 70 eV
H
O
O
O
O
O Cl O
O O
O O
F F F F
F
F
F
F
F F F F
F
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
LC/MS/MS: kvalitativní analýza Lze měřit jen s IT, QqQ, nebo hybridními MS spektrometry (Q-TOF,IT-Orbitrap) 1.Separátor výběr iontu -> „definované rozbití” iontu v kolizní cele -> analýza produktů 2. analyzátorem SV2141_2 #18 RT: 2.77 AV: 1 NL: 5.66E3 F: FTMS + p APCI corona Full ms2
[email protected] [340.00-1500.00] 523.0939 100 90
APCI pos MS spektrum
SV2141_2 #19 RT: 2.79 AV: 1 NL: 1.73E7 F: FTMS + p APCI corona Full ms [420.00-1500.00] 555.1196 100
MS2 -MS/MS z [M+H]+
80 70
80
[M+H]+
70 60 50
H
60
1245.3583
H
H
H
H
50 40 30
H
H
H
H
H
H
H
H
40
20
957.1501
30
10 20 675.1410
479.4822 10
577.5189
717.1070
0 500
600
700
957.1494 837.1282 891.4597 989.1754 800
900 m/z
1000
1100
1200
452.3420
577.8984 643.1150
902.5043 726.7733
847.3182
1205.6310
1032.2964
1277.3850
0
1245.3583 1213.2241 1125.3373 1277.3846
500
600
700
800
900 m/z
1000
1100
1200
1300
O
O
1300
SV2141_2 #47 RT: 8.42 AV: 1 NL: 4.41E4 F: FTMS + p APCI corona Full ms3
[email protected] [email protected] [140.00-1500.00] 523.0939 100
O
O
O Cl O
90 80
O O
O
70 Relative Abundance
Relative Abundance
Relative Abundance
90
O 60 50
MS3 - MS/MS z m/z 523
40 30 20
F
289.2163
10
F 444.7758
353.1791
643.1158 719.8121
1245.3589 957.1498
F 1479.2357
1065.1304
400
600
800 m/z
1000
1200
F F
F
0 200
F
1400
F
F F F F
LC/MS: pomoc při identifikaci
F
UV-VIS spektrum
ESI, APCI – detekce pouze polárních sloučenin HPLC do série před MS lze zapojit UV-VIS detektor
UV-DAD detektor UV-DAD detekce
MS detekce
ESI+ MS spektrum
LC/MS/MS: kvalitativní analýza
Aby se rozdělily jen podle m/z muselo by být R = 740 000 SV2141_2 (0.000) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C15H32N5O6Cl2 100
448.1730
C15H31N5O6Cl2 + H m/z 448,1730
Scan ES+ 4.68e12
%
450.1730
449.1730 451.1730
452.1652
0 SV2141_2 (0.185) Cu (0.10); Is (1.00,1.00) C24H27NO6Na
Scan ES+ 7.50e12
448.1736
C24H27NO6 + Na m/z 448,1736
%
100
449.1736
450.1814
0
mass 448
449
450
451
452
453
454
Zdroj: Shimadzu LCMS-IT-TOF brochure
MS: Kvantitativní analýza CÍL:
1. Potvrzení, že jde skutečně o sledovaný analyt 2. Zjištění jeho koncentrace ve vzorku
Ad 1: většinou se jedná o chromatografické analýzy (GC/MS resp. LC/MS) – znám retenční čas (RT) EI+ 70 eV: TIC režim (menší citlivost) – pro identifikaci k dispozici celé MS spektrum SIM režim (vyšší citlivost) – vždy je lépe snímat alespoň dva charakteristické ionty (identifikaci může potvrdit poměr jejich odezev) ESI, APCI: MRM (Multiple Reaction Monitoring) – MS/MS technika – 1 analyzátor SIM (výběr iontu) – 2. analyzátor kolize – 3. analyzátor SIM (více iontů, sleduje se poměr odezvy)
LC/MS/MS: Kvantitativní analýza Příklad využití MRM Izotopicky označený standard – stejné retenční chování, jiná molekulová hmotnost – používá se jako vnitřní standard (Internal Standard – IS)
Kvalitativní informace: retenční čas a přítomnost dceřinného iontu (m/z) popř. poměr ploch píků stop více dceřiných iontů Kvantitativní informace: plocha píků dceřinného popř. dceřiných iontů (m/z) pro analyt a vniřní standard
Zdroj: Agilent technologies 5989-9665 App. Note
MS: Kvantitativní analýza Kalibrační přímka Vnitřní standard (Plocha Ais)
A/Ais
Analyt (Plocha A)
c .. Koncentrace
A/Ais = RRF . c/cis
RRF .. Relativní odezvový faktor
c/cis
Směrnice přímky je RRF
Kalibrace s použitím vnitřního standardu Přítomnost vnitřního standardu snižuje vliv kolísání odezvy MS detektoru, u GC chybu při nástřiku atd., jako vnitřní standard lze použít i podobnou sloučeninu ne izotopicky značenou
MS: Kvantitativní analýza Signál (signal)
Kalibrační rozsah split 1:60 1ul 50mg/ml 21_V13aro_1
A/Ais
1: Magnet EI+ 134 2.56e3
5.43
100
%
Šum (noise)
5.57
0
Time 5.30
5.35
5.40
5.45
5.50
5.55
5.60
5.65
5.70
5.75
LOD ~ 3 x (Anoise/Ais) / RRF c/cis
Mez detekce (Limit of Detection - LOD)
LOQ ~ 10 x (Anoise/Ais) / RRF
Mez stanovitelnosti (LOQ - Limit of Quantification)
MS: Kvantitativní analýza – citlivost MS spektrometrů Specifikace výrobce: pro konkrétní sloučeninu a podmínky – udává se poměrem signál/šum pro absolutní detekované množství sloučeniny – zpravidla se jedná o množství v řádu pikogramů (pg = 10-12g) nebo femtogramů (fg = 10-15g) C10F8 GC/MS: splitless nástřik: 1 pg oktafluorunaftalenu (OFN) – SIM režim m/z 272 - S/N > X LC/MS/MS: FIA: ESI+ 100 fg reserpine MRM: m/z 609 ->m/z 397 a 447 S/N > X
C33H40N2O9
Nejmenší absolutní detekované množství : SIM (MRM): řádově fg-pg TIC (Full Scan): řádově pg-ng Maximální abs. detekované množství: dané dynamickým rozsahem cca 3-5 řádů tzn. SIM (MRM) ng ;TIC (Full Scan) mg vždy však záleží na typu sloučeniny – odezva MS detektoru není univerzální
MS: Kvantitativní analýza – citlivost MS spektrometrů
Předúprava vzorků Cíl: zjednodušení matrice vzorku (odstranění interferujících sloučenin) zakoncentrování analytu ve vzorku změna rozpouštědla např. voda není vhodná pro GC/MS analýzu
Způsoby předúpravy: filtrace centrifugace zakoncentrování odpařením extrakce (rozpouštědlová, Soxhlet) SPE (Solid Phase Extraction) Purge and Trap SPME (Solid Phase Microextraction)
Pro těkavé sloučeniny (VOC)
Předúprava vzorků: SPE – Solid Phase Extraction Vzorek (analyt s matricí) je nanesen na kondiciovanou vrstvu sorbentu. Matrice je oddělena a zakoncentrovaný analyt je eluován malým objemem vhodného rozpouštědla. Normální uspořádání fází Polární sorbent, nepolární rozpouštědlo Reverzní uspořádání fází Nepolární sorbent, polární rozpouštědlo Iontová výměna pro iontové sloučeniny
Předúprava vzorků: SPME (Solid Phase Microextraction) Slouží pro zakoncentrování a analýzu těkavých sloučenin z plynných matricí nebo těkavých a semitěkavých sloučenin z vody
Vlákno: polymerní sorbent na nosiči: Carboxen 75 µm/ Polydimethylsiloxan (PDMS) 85 µm těkavé látky Mw 30 – 225 Da PDMS 100 µm
těkavé látky Mw 60 – 275 Da
PDMS 30 µm
semitěkavé nepolární
Polyakrylát (PA) 85 µm
semitěkavé polární
Kompatibilita s vodnou matricí
Předúprava vzorků: Purge and Trap (P-T) Slouží pro zakoncentrování a analýzu těkavých sloučenin z vody Vzorek je vystripován z vody proudem plynu (dusík, He) a organické látky jsou sorbovány na sorbent
Sorbent je desorbován, organické látky zakoncentrovány a přeneseny na GC kolonu
Praktické aplikace hmotnostní spektrometrie normované metody – různé oblasti – vodní hospodářství potravinářství Toxikologie – testování metabolitů drog v moči, krvi, vlasech atd. Medicinální diagnostika – farmakokinetické studie léčiv Forenzní analýza – požářiště, celníci – např.ropné produkty Průmyslové aplikace – testování kvality – zahraniční normy např. ASTM (American Society for Testing Materials) Výzkum, vývoj
Aplikace hmotnostní spektrometrie ČSN normy např. ČSN ISO 24293 Jakost vod - Stanovení jednotlivých izomerů nonylfenolu - Metoda extrakce tuhou fází (SPE) a plynové chromatografie/hmotnostní spektrometrie (GC/MS) ČSN EN ISO 18856 Jakost vod - Stanovení vybraných ftalátů plynovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií ČSN EN ISO 17294-1 Jakost vod - Použití hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) - Část 1: Všeobecné směrnice ČSN EN ISO 17294-2 Jakost vod - Použití hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) - Část 2: Stanovení 62 prvků ČSN EN 15662 Potraviny rostlinného původu - Stanovení reziduí pesticidů s použitím GC-MS a/nebo LC-MS/MS po extrakci acetonitrilem/separaci a předčištění pomocí disperzní SPE - Metoda QuEChERS
Aplikace hmotnostní spektrometrie – toxikologie (1) Marihuana (THC) – detekce metabolitů v moči – hlavní metabolit 11-nor-9-carboxy-∆9-tetrahydrocannabinol (∆9-carboxy-THC)
immuno-assay testy – když jsou pozitivní – potvrzení pomocí GC/MS nebo LC/MS/MS v toxikologické laboratoři
Aplikace hmotnostní spektrometrie – toxikologie (2) GC/MS – SPE + nutná derivatizace – úprava vzorku na TriMethylSilyl- těkavější deriváty
Zdroj: Restek
Aplikace hmotnostní spektrometrie – toxikologie (2) LC/MS/MS – pouze SPE, kratší časy analýz
Zdroj: Restek
ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie) Stopová analýza prvků (kovů)
ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie) Způsob dávkování vzorku: Kapalina: tvorba aerosolu Pevné látky: Laserová ablace
ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie) ICP torch – tvorba iontů
ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie)
ICP-MS video http://www.youtube.com/watch?v=MQqtV2oiC6U ICP video 2012 http://www.youtube.com/watch?v=XTG--dofakE
Laserová ablace ICP-MS
Obsah kovů v ostatcích lidských zubů
ISOTOPE RATIO MASS SPECTROMETRY Využití v geologii, archeologii, kriminalistice Organická látka je katalyticky spálena na CO2 (CuO/Pt~ 800°C), voda je odstraněna přes NAFION membránu a CO2 je detekován pomocí MS (obvykle dva detektory jeden na 13 CO2 m/z 45 a druhý na 12 CO2 m/z 44) Standartní ref. látka – CaCO3 Pee Dee Belemnite (PDB) – rozkladem CO2 s poměrem pPDB =13C/12C = 0,01123 δ 13C = 1000 * (pvzorek – pPDB)/pPDB
CO2 výdech lidi Evropa
CO2 výdech lidi USA
Fosilní paliva
Methan atmosféra
Fosilní paliva
CO2 atmosféra
PDB
GC/Isotope Ratio-MS Cholesterol izolován z lidských kostí 50 lidí z doby okolo 1000 n.l žíjících na anglickém pobřeží Analyzován přes GC pak katalyticky spálen na CO2 a sledován obsah izotopů 13C/12C pomocí MS Cholesterol původem z pozemských živočichů
Cholesterol původem z mořských živočichů
Převzato z Anal.Chem. 1996 (68), 4402 R.Scott, R.P.Evershead
Pyrolyzní GC/MS (Py-GC/MS) Vzorek je před GC/MS analýzou zpyrolyzován (teplotně štěpen v atmosféře inertního plynu (neoxidující atmosféra) – výsledkem je tvorba lehčích produktů, které lze detekovat pomocí GC/MS Odporová spirála ohřeje vzorek až na 1400 oC
Vzniklé rozkladné produkty jsou nosnýým plynem transportovány vyhřívanou kapilárou do plynového chromatografu
Pyrolyzní GC/MS (Py-GC/MS) Pyrolýza polyethylenu (PE) … 700 oC
alken Alkadien/ alken
alkan
Pyrolyzní GC/MS (Py-GC/MS)
