Ionkromatográfia ( (IC: Ion Chromatography) g p y) Ionok elválasztása: eltérő sebességgel haladnak át egy megfelelően megválasztott oszlopon Ioncserélő gyanták 1971: „forced flow chromatography”: N2 gáz +UV-Vis spektrofotometria: Fe(III) elválasztása HPLC fejlődése megteremtette a műszeres hátteret az IC fejlesztéséhez hiányoztak a detektorok (klasszikus HPLC detektorok nem alkalmasak) 1975: vezetőképesség-mérésen alapuló detektálás: modern IC
elválasztásért felelős oszlop szulfonált polisztirol-DVB p 0,02 , mmol/gg kicsinyy ioncserekapacitás: „elnyomó elnyomó” oszlop nagy ioncserekapacitás
Ionkromatográf: g f Dionex Co.
Kationokra: spektrofotometriás meghatározások léteztek korábban is Anionokra kicsiny koncentrációban (ppm) nem volt analitikai módszer
Ionkromatográfia (IC: Ion Chromatography) elválasztás: álló- és mozgófázis közötti ioncsere-egyensúlyon alapul szervetlen és szerves ionok elválasztására Minta halmazállapota: folyadék ¾nagyhatékonyságú analitikai módszer ¾kvalitatív & kvantitatív információk ¾összetett minták analízise ¾a mintát alkotó komponensek szétválasztása
Mozgófázisa: folyadék Állófázisa: ioncserélő technikai kivitelezés: oszlop (kiszorításos), elúciós analízis
Ionkromatográf felépítése: hasonló a HPLC-hez
Elúciós analízis leggyakrabban alkalmazott technika
jel
integgrális detekktor
1. nem szorbeálódó eluens folyamatos átáramoltatása 2. minta bevitele 3. elúció A detektort elérő mintakomponens(ek)
B
felgyülemlett mennyiségét méri.
A
Minta: A & B A: kevésbé kötődik
tA
tB diffferenciáliss detektor
Analitikai információ: 9minőségi: t (retenciós idő) 9mennyiségi: csúcs területe
idő
jel
•az állófázisra jjuttatott minta mennyisége y g igen g kicsinyy „elhanyagolható” az eluenséhez képest •nincs szükség regenerálásra
Pillanatnyi különbséget mérnek az áthaladó eluens összetételében.
idő
Állófázis: •térhálósított műgyanta (pl: polisztirol-divinilbenzol kopolimer) vázon i ioncserélő élő ffunkciós k ió csoportok t k •módosított szilikagél
Ioncserélők: •erős •gyenge
Ioncserélők: •kationcserélők •anioncserélők erős kation: -SO SO3H (szulfonsav) gyenge kation: -COOH
erős anion: kvaterner aminocsoport gyenge anion: primer aminocsoport
Kationcserélő: n RSO3H + Mn+
(RSO3)nMn+ + n H+
anioncserélő: n RN(CH3)3OH + An-
[RN(CH3)3]nA + n OH-
Ionok megkötődése függ: ¾méret ¾töltés ¾hőmérséklet ¾ionerősség ¾pH Állófázis: pórusos gyanták: diffúzió: csúcs kiszélesedés y g növelése: felületi pporózus réteg: g éles csúcsok ((kicsiny y minta kapacitás) p ) hatékonyság Mozgófázis: Kationok elválasztása: erős sav híg (vizes) oldata Anionok elválasztása: erős bázis híg (vizes) oldata Detektor: vezetőképesség p g mérés eluens: nagy a vezetőképessége: nagy háttérjel szupresszor oszlop: vezetőképesség „elnyomó”
kompetíció p a H+ ((OH-) és a Mn+ (An-) között az ioncserélő helyeken
Kationcserélő analitikai oszlop: nagykapacitású anioncserélő szupresszor Analízis: Kationcserélő:
(KCl meghatározás acidi-alkalimetriásan)
n RSO3H + Mn+
((RSO SO3)nMn+ + n H+
Elnyomás: H+ semlegesítése (eluens + minta) n RN(CH3)3OH + An- + nH+
[RN(CH3)3]nA + n H2O
An-: az eluens anionja az eluens anionja megkötődik és vele ekvivalens mennyiségű hidroxidion kerül az oldatba lecserélődik az analitikai oszlopon elválasztott kation ellenionja is: ekvivalens mennyiségű OH- jut az oldatba vezetőképesség mérés & kationok eluens tároló
pumpa
ionelnyomó kolonna
adagoló detektor
analitikai kolonna PC ionelnyomásos IC
anionok elválasztása: kationcserélő szupresszor p Szupresszor oszlop: regenerálást igényel csúcs kiszélesedét okoz – hatékonyság csökkenés Gyenge y g savak anionja j nem meghatározhatók: g savas forma kicsiny vezetőképesség-változást eredményez
Kicsiny ioncserekapacitású oszlopok megjelenése: nem szupresszált rendszerek
Anioncserélő: TÖLTET-E TÖLTET E- + A-
TÖLTET-A TÖLTET A- + E-
nem szupresszált rendszer (nincs szupresszor oszlop): kicsiny vezetőképességű mozgófázis alkalmazása eluens tároló
adagoló
pumpa detektor
Mozgófázis: •benzoesav •ftálsav ftálsav •borkősav •citromsav
PC
analitikai kolonna
egykolonnás gy (nem ( szupresszált) p ) IC
Detektor: •vezetőképesség mérés •UV-Vis UV Vis
1980’
Töltetek fejlődése: j hatékonyság y g növekedés: folyamatosa y növekvő számú alkalmazás töltettel szemben támasztott követelmények: •lehető legnagyobb tányérszám •töltet/eluens töltet/eluens rendszer: gyors egyensúly (kinetikus csúcs kiszélesedés minimalizálása) •retenciós idők: se túl nagy, se túl kicsi •töltet/eluens rendszer: detektorral kapcsolható legyen
Oszlop anyaga: •saválló acél •PEEK PEEK (poli(éter (poli(éter-éter-keton)) éter keton))
Oszlop méretei: átmérő: 1-8 mm Töltet: hossz: 3-30 cm polisztirol-DVB kopolimer módosított szilikagél cellulóz alapú p
Az oszlop
szerves polimer-alapú töltetek: kevésbé nyomástűrő (keresztkötések számával javítható) duzzadnak: szerves oldószer csak kisebb koncentrációban alkalmazható pH stabilitás: 1< pH < 14 szilikagél: z g ppH: 3-8 kicsiny (µm) szemcsék (HPLC)
különböző méretű pórusok: mikro & makro
pellikuláris llik lá i töltet: öl az állófázis porózus külső héjat alkot egy áthatolhatatlan szemcse felületén
Kationcserélő
HO3S
HO3S
HO3S
ki i iioncserekapacitás: kicsiny k itá felületi f lül ti módosítás ód ítá
SO3H
Anioncserélő
CH2N+ R3
CH2N+ R3
R3+NCH2
ki i ioncserekapacitás: kicsiny i k i á felületi f lül i módosítás ód í á
CH2N+ R3
OH
Módosított szilikagél
OH SiO2
OH OH OH
H = A + B/u + C * u H [mm]
A van Deemter egyenlet általános ábrázolása
C*u
Hmin
B/u A u
szabálytalanabb töltet: nagyobb áramlási egyenlőtlenségek kisebb szemcseméret: kisebb egyenlőtlenségek
u [cm/s]
Mintaadagolás 11. a mintát pillanatszerűen kell bejuttatni az eluensbe 2. keveredjen el az eluenssel (OLDHATÓSÁG) g 10-50 µ µl ((nincs térfogatváltozás) g ) minta térfogata: mikroliterfecskendő:
A bevitt minta térfogatát az adagolón elhelyezett hurok („loop”) térfogata határozza meg.
hatutas bemérő szelep
alternáló mozgást végző, kis dugattyú-térfogatú pumpa ( i (reciprocating i pump))
pulzálás: jelentősen csökkenthető: ikerfej alkalmazása (fáziseltolás) V
térfogat: 10-100 10 100 µl továbbított folyadék mennyisége: korlátlan áramlási sebesség változtatása: •löket lök t hossz h •dugattyú sebessége
idő
DETEKTOROK Az eluenst alkotó ionok jelenlétében képesnek kell lennie, a minta ionjainak mérésére. •csak a mintát alkotó komponensekre ad válaszjelet •csak az eluenst alkotó komponensekre ad válaszjelet (indirekt detektálás) El Eluens megválasztása: ál tá minél i él kisebb ki bb detektorjel d t kt j l
Detektorok Kolonna: időben (térben) elválasztja az egyes alkotókat Az adott komponens az eluenssel (vivőgázzal) együtt beáramlik a detektorba. mennyiségi analízis: a detektor által előállított jel arányos az anyag koncentrációjával vagy időegység alatt bejutott mennyiségével univerzális: minden molekulára ad jelet szelektív: bizonyos vegyülettípusokra ad jelet specifikus: f k csak k bi bizonyos molekulákra l k l k add jelet j l destruktív nem destruktív dinamikus tartomány: az a koncentráció tartomány amelyben a koncentráció változása detektorjel változást eredményez lineáris tartomány: T= mc (eltérés < 5 %) érzékenység: m (egységnyi koncentrációváltozás hatására bekövetkező jelváltozás) kimutatási határ: az a koncentráció, melynek mérésénél a detektor válaszjele egyértelműen megkülönböztethető a háttértől (LOD) meghatározási határ: az a legkisebb koncentráció, amely megfelelő precizitással és pontossággal meghatározható (LOQ)
UV-Vis spektrofotométer Alkalmazható: UV-Vis tartományban elnyel az adott komponens
Lambeert-Beer: Aλ = ελ c l
mérő ág
„fényosztó” (splitter)
I0
rés
cella (küvetta)
I
I0 fényforrás y
I0 referencia f i ág á
monokromátor Fényforrás: UV: deutérium lámpa Vis: volfrám lámpa
Detektor: fotodióda
D E T E K T O R
A = lg I0/I
Cella: kvarc küvetta l 5 10 mm l=5-10
Diódasoros detektor DAD (Dioda Array Detector) polikromátor
fényforrás
lencse
cella (küvetta) diódasor diód
Előny: különböző hullámhosszúságon mért elnyelések egyidejű mérése spektrum felvétele: minőségi információ
Fluoreszcencia mérésen alapuló detektor fluoreszkáló anyagok detektálása monokromátor rés é
cella ((küvetta))
fényforrás monokromátor
Detektor: D k a kibocsátott fényt méri pl. festékanyagok
Vezetőképesség mérésen alapuló detektor V tőké Vezetőképesség: é G [Siemens] [Si ] 1/R Ha egy gy elektrolit oldatba két azonos méretű,, sík felületű,, párhuzamos p elektródlapp (pl. (p Ptlap) merül, amelyek felületének nagysága A, a köztük levő távolság pedig l, akkor az így kapott vezetőképességi cellára igaz, hogy
K=A/l: cellaállandó (geometria) κ: fajlagos f jl (specifikus) ( ifik ) vezetőképesség: őké é megadja dj a két, ké egységnyi é i (1 cm2) felületű, f lül ű egymástól á ól egységnyi távolságra (1 cm-re) levő elektród között levő elektrolitoldat vezetőképességét oldatok ld k vezetőképessége: őké é additív ddi í tulajdonság l jd á Függ: ¾ionok minőségétől (mozgékonyság) ¾i k számától ¾ionok á ától (koncentráció) (k t á ió)
Semleges molekulák: nem detektálhatók
Elv: 2 elektród El l kt ód ((acél) él) elhelyezve lh l az áramlási á lá i cellában lláb megfelelő feszültség: áram folyik Áramerősség: töltés méret, töltés, méret koncentráció, koncentráció oldószer, oldószer hőmérséklet Egyenfeszültség: elektrolízis veszélye Váltakozó feszültség: 100-10 100 10 kHz, kHz U= U 20 V
„Érintkezés mentes” cella
Detektor: vezetőképesség változása: 2 %/oC zaj csökkentése
The detector works without direct contact of the electrode l t d with ith the th eluent l t or sample. l The Th sensor is i based on two metal tubes that are placed around a fused silica capillary with a detection gap of approximately pp y 1.5 mm ((Figure g 4.2). ) The conductivityy sensor is based on two metal tubes that act as cylindrical capacitors. The electrodes may be placed around any nonconducting tubing such as fused silica, ili PEEK or Teflon. PEEK, T fl D d volume Dead l off the th connecting tubing is minimized and an extremely low dead volume cell can be manufactured. A high g oscillatingg frequency q y of 40–100 kHz is applied to one of the electrodes. A signal is produced on the other electrode as soon as an analyte zone with a different conductivity compared to the background passes through th h the th detection d t ti gap. An A amplifier lifi andd rectifier are connected to the second electrode to measure resistance between the two electrodes. To p associated with each isolate the two capacitors electrode, a thin piece of copper is placed between the electrodes and grounded.
Egyéb detektorok: •potenciometria potenciometria •amperometria •atomabszorpció •ICP •tömegspektrometria Termosztát: oszlop: ioncsere: hőmérséklet függés
eltérés a HPLC-től: •Ionokat mérünk (HPLC is) •Ioncserélő oszlopokat használ (HPLC is)
ALKALMAZÁSOK: Klinikai Gyógyszeripari Élelmiszeripari Környezetvédelmi
Ionpárkromatográfia: C18 HPLC oszlopp + mintát alkotó ionokkal ellentétes töltésű ionok hozzáadása HILIC fázis: Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography
SiO2
CH3 + CH2-N-CH2-CH2-CH2-SO-3 CH3
Kapilláris elektroforézis elektroforézis: l k f é i valamely l l vezetőő kö közegben b (ál (általában láb víz) í ) elektromos l k erőtér őé hatására a töltéssel rendelkező részecskék elmozdulnak elektroforetikus elválasztás: az elválasztandó komponensek adott elektromos tér hatására kialakuló eltérő migrációs sebességén alapul elektroozmotikus áramlás: (electroosmotic flow, EOF) a folyadék elektromos tér hatására valamely töltéssel bíró felület mentén kialakuló elmozdulása
κ=GK
Λm =
κ: fajlagos vezetőképesség [S cm-1] G: vezetőképesség [S] K: cellaállandó [[cm-1]
κ c
moláris fajlagos vezetőképességet (Λm) Kohlrausch első törvénye
Λm = λ + λ +
−
λλ+:: a kation moláris fajlagos vezetőképessége [cm2Ω-1mol-1] λ-: az anion moláris fajlagos vezetőképessége [cm2Ω-1mol-1]
Λ m = Λ 0 − kc1 / 2
Kohlrausch második törvénye: erős elektrolitok
Λ0: végtelen híg oldat moláris fajlagos vezetőképessége [cm2Ω-1mol-1] c: elektrolit koncentrációja [M] k: állandó [M-1/2] ion vándorlását végtelen híg elektrolitoldatban Fe: elektromos l kt erőő zi: az i komponens töltésszáma e: az elemi töltés E: az elektromos térerősség [V·cm-11]
Fe=zi·e·E
súrlódás miatt
Fs=k·η·vi0
k: állandó [cm] η: az oldat viszkozitása [Pa·s] vi0: az i komponens vándorlási sebessége a végtelen híg oldatban
Stokes-törvény: k=6πr
Fe=F Fs
0
vi =
ri az i ion hidrodinamikai sugara
zi e E 6πηri
A vándorlási sebesség egyenesen arányos a térerősséggel.
vi µi = E zi e µi = 6πη ηri
mozgékonyság híg oldat, gömb alakú részecske
valóság: iont körülvevő ionok gátolják a mozgását (elektrosztatikus kölcsönhatások)
µ
eff i
=
qeff 6πη ηR
µieff: effektív elektroforetikus mozgékonyság qeff: az ion effektív töltése R: az ion teljes sugara
az elektroforetikus mozgékonyság függ: ¾az ion töltésétől (lehet pozitív ill. negatív töltésének előjelétől függően) ¾sugarától ¾alakjától ¾szolvatáltságának mértékétől ¾a közeg viszkozitásától ¾pH-jától, ¾i ¾ionerősségtől ő é től ¾hőmérséklettől
üveg felület & víz: szilanol csoportok pH > 22,5: 5: deprotonált forma: pozitív töltéseket vonzanak: negatív elektród (katód) felé mozognak: folyamatos áramlás (dugószerű áramlási profil)
PC D
E
K
E
D
P
„outlet”
P V
„inlet”
A kapilláris elektroforetikus készülék sematikus rajza E: elektród; K: kapilláris; D: detektor, detektor P: puffertartó edény; PC: személyi számítógép; V: tápegység
E L E K T R O F E R O G R A M
kation semleges molekula anion i
µa: látszólagos mozgékonyság µe: effektív mozgékonyság µEOF: elektroozmotikus áramlás
µa = µe + µEOF
Alapeset: bemenet: + kimenet: kation: komigrál anion: i kontramigrál k t i ál
D katód (-)
EOF
anód (+)
vk va outlet
V
inlet
D anódd (+) ( )
EOF vk
k d (-) katód ()
va outlet
V
inlet Fordított polaritás: bemenet: kimenet: +
A kapilláris követelmények: •kémiailag és elektromosan inert •hajlékony j y •kellően szilárd •megfizethető •ne nyeljen el az UV-Vis tartományban
kvarc kapilláris (poliimid bevonattal)
25 µm - 100 µm 10 – 100 cm bevonatos kapillárisok: polimerek, PVA, teflon Kondícionálás: üvegfelület helyreállítása (NaOH)
A detektor ¾megfelelő érzékenység ¾kimutatási határ ¾kicsiny zajjal ¾nagy linearitási tartománnyal ¾gyors válaszidővel Többféle mérési elv UV-Vis f fluoreszcencia vezetőképesség MS UV-Vis: egyszerű, olcsó, széleskörben alkalmazható
UV-Vis
Lambert-Beer: A=εcl háttérelektrolit elnyelése eln elése
fényút hosszának növelése
fluoreszcencia
A tápegység U=5-30 kV I 3 300 µA I=3-300 A
A feszültség változtatásának hatása: növelve a kapillárisra kapcsolt feszültséget: •nő a térerősségg •nő az EOF célszerű nagyobb •csökkennek a migrációs idők feszültségen dolgozni •élesebb csúcsokat kapunk növelve a kapillárisra kapcsolt feszültséget: fes ültséget: •nő az áramerősség egyre több hő szabadul fel (Joule-hő) (Joule hő) •egyre •kiszélesednek a csúcsok •csúsznak a migrációs idők
célszerű kisebb feszültségen dolgozni
I
U
Mintabevitel hidrodinamikai injektálás: nyomás alkalmazása
elektrokinetikus injektálás: feszültség alkalmazása
elektroforetikus mozgékonyságtól függ
pufferekkel szemben támasztott követelmények: •nagy pufferkapacitás a kiválasztott pH-tartományban •kis ki elnyelés l lé a ddetektálás t ktálá hullámhosszán h llá h á •kis mozgékonyság az áramtermelés minimalizálása érdekében Pufferkoncentráció C ökk té Csökkentése
Nö lé Növelése
↓
áram, Joule-hő termelődés
↑
↓
hőáramlás okozta zónaszélesedés
↑
↑
elektroozmotikus áramlás
↓
↓
meghatározás időtartama
↑
↑
adszorpció a kapilláris falán
↓
pH: szilanolcsoportok protonáltsága (felületi töltésállapot) minta i t disszociációja di iá iój
Áramlási profil
EOF
lamináris áramlás
áramlás l hajtóereje h j j a kapilláris k ill i belsejében b l j b mindenütt i d azonos lamináris áramlási profilból eredő zónakiszélesedés a kapilláris elektroforézisnél elhanyagolható
Szelektivitás: •puffer minősége, koncentrációja p •pH Előnyök Elő ök •rövid analízis idő nagy felbontóképesség (N: 105-106) •nagy •kicsiny oldószerfelhasználás •egyszerű gy mintaelőkészítés Hátrányok: Há á k •kisebb érzékenység kevésbé robusztus (reprodukálhatósági problémák) •kevésbé
ALKALMAZÁSOK: Á bármi, ami befér a kapillárisba
Klinikai G ó Gyógyszeripari Élelmiszeripari Kö Környezetvédelmi éd l i
Minőségi analízis Alapja: a retenciós idő a minta komponenseinek minőségétől függ A legegyszerűbb módszer: a retenciós idők (pontosabban a redukált retenciós idők) összehasonlítása ismert vegyületek retenciós idejével jel
relatív retenció (rx,r): a kísérleti körülmények különbözőségéből származó eltéréseket kompenzálja egy kiválasztott (r) anyagra vonatkoztatott redukált retenciós idő hányadosaként y adnak meg: '
rx ,r tx
idő
t Rx = ' t Rr
jel
tr
tx
idő
Mennyiségi értékelés a kromatogramon levő csúcsok területe (magassága) arányos a mintakomponensek mennyiségével, ill. koncentrációjával. Detektor: a komponensek vagy az eluens fizikai vagy kémiai tulajdonságainak mérése
1. kalibrációs módszer 2. addíciós módszer 3. belső standard módszer
jel
A kalibrációs módszer
c1
T1
T = mc T: csúcs területe c: koncentráció (anyagmennyiség) m: arányossági tényező (érzékenység) 1. független standard (kalibráló) oldatok
T
idő j jel
c2
T2
ismeretlen oldat: Tx
T3 Tx T2
idő jel
T1
c3
T3
m c1
c2
c
c
x
3
c idő
jel
Standard addíció
T1,x 1 x= Tx+T1 T1=T1,x-Tx T2,x 2 x= Tx+T2 T2=T2,x-Tx
T
cx
Tx
idő j jel
cx+ c1
T1, x
T2 idő
T1
jel
Tx
c2 + cx
T2, 2 x
cx
c1
c 2
c idő
Belső standard: relatív terület meghatározása g a mintán belüli referencia ¾rögzített (meghatározott és állandó) koncentrációban (mennyiségben) a mintához hozzáadjuk a referencia anyagot ¾a referencia anyag csúcsára vonatkoztatjuk a meghatározni kívánt csúcsok területét Előnyök: az analízis során fellépő hibák egy részét küszöböli ki: adagolás d lá érzékenység változása
Analitikai információ: minőségi: i ő é i retenciós t ió (migrációs) ( i á ió ) idő retenciós (migrációs) idő függ: alkalmazott körülmények: •mozgófázis •anyagi minőség •áramlási sebesség ' •állófázis t Rx rx ,r = ' •minőség i őé t Rr •hossz •hőmérséklet hőmérséklet •pH, ionerősség •stb minőségi információ: UV-Vis: spektrum Növekvő igények: új detektorok alkalmazása, fejlesztése Tömegspektrométer
Tömegspektrometria (MS)
Nobel-díj: 1922 1989 1922, 1989, 2002
Alapelve: a gázállapotú ionizált molekulákat, molekulákat ezek töredékeit (un. (un fragmenseit) vagy bizonyos esetekben az atomokból képződött ionokat tömegük alapján szétválasztja, majd mennyiségileg meghatározza 1. mintabevitel és a minta gázállapotba hozása 2. ionizáció és bizonyos esetekben fragmentáció 3 a keletkezett ionok töltésegységre jutó tömegük szerinti elválasztása 3. 4. a szétválasztott, különböző tömegű ionok mennyiségének meghatározása
A készülék felépítése: vezérlő- és adatfeldolgozó rendszer mintabevitel
ionforrás
analizátor
vákuumrendszer
detektor
A vákuumrendszer 1 az ionforrásban 1. i f á b megfelelő f l lő hhatékonysággal ék á l elő lő állí állíthatók h ók legyenek l k az ionok i k 2. megfelelő hosszúságú szabad úthosszat kell biztosítani: az ionforrásban képződött ionok ütközés nélkül eljuthassanak a detektorba kb. 10-3 Pa kétlépcsős nyomáscsökkentés: 1. elővákuum: néhány torr 2. nagyvákuum: 10-3 Pa vákuumszivattyú: 1. atmoszférikus nyomásról képes közvetlenül gázt elszívni (rotációs szivattyúk) 2. működéséhez un. elővákuum megteremtése szükséges (diffúziós szivattyúk)
Olajrotációs pumpa
előnye: kicsiny háttérzaj
Előny: Kicsiny Ki i molekula l k l tö tömegű ű eluens l (pl. ( l H2) is hatékonyan eltávolítható
Ionizációs módszerek lehetővé teszik a különféle halmazállapotú, igen eltérő tulajdonságokkal bíró anyagféleségek ionizációját
Elektronionizáció (electron impact ionization, EI) legáltalánosabban alkalmazott ionizációs technika
EI
1: mintabevezető nyílás; 2: ionvisszaverő lemez (repeller); 3: izzószál; 4: elektronbevezető nyílás; 5 és 6: iongyorsító rés; 7: belépő nyílás; 8: ionképződés helye; y 9: anód ∆U=5-100 V
EI
oC
T≈ 200 p ≈ 10-8-10 10-9 atm elektronok
U energia
molekula
gerjesztett molekula elektron emisszió molekulaion
fragmens g ionok
fragmentáció: elektronok energiája (gyorsító feszültség: 70 eV) minőségi azonosítás (ujjlenyomat) általában : egyszeres pozitív ionok képződnek negatív ionok: nagy elektronegativitású atomok vannak jelen a molekulában
Kémiai ionizáció (CI) a mintát az elektronforrásba történő belépése előtt un. „reagens” „reagens gázzal hígítják nem a vizsgálandó minta lép közvetlen kölcsönhatásba az elektronokkal, hanem a hígító gáz molekulái mintát alkotó komponensek: szekunder ionizáció RH e
RH+ + M
RH+ MH+ + R
primer-ion képződés CH4 + e– = CH4+ + 2e– (CH3+) szekunder-ion k d i képződés ké ődé CH4+ + CH4 = CH5+ + CH3 (CH3+ + CH4 = C2H5+ + H2)
protontranszfer a) proton transzfer CH5+ + MH = CH4 + MH2+ b) hidrogén absztrakció CH3+ + MH = CH4 + M+ (C2H5+ + MH = C2H6 + M+) c)) töltésátvitel CH4+ + MH = CH4 + MH+
Kémiai ionizáció (CI) Reagens gáz: R á •metán •i-bután •ammónia Ionizáció: a hígító gáz minőségétől függően [M+H]+, [M-H]-, [M+NH4]+ Előnyök: •egyszerűsíti a tömegspektrumot •molekulaion tömegét adja meg
Atmoszférikus nyomású ionizációs technikák (atmoszférikus nyomáson működnek) minta
T
elpárologtatás
ionizálás
kapcsolt technikák: HPLC-MS
•termikus ionizáció •elektromos elektromos tér okozta ionizáció •ionütközés okozta ionizáció •gyors atom ütközési
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization ((MALDI)) MINTA + mátrix (ionizációt segíti)
grid g
Gas phase ions
hν laser
T a r g e t
+
+
+ +
+ +
+
+
+
+ + +
+ +
+ + +
+
+
+ +
Uacc
+
+
source
+
“Time-of fligth” tube
Analizátorok az ionok tömeg/töltés szerinti elválasztása Jellemzése: 1. maximális tömegszám: amelynek vizsgálatára még alkalmas az adott analizátor 2. transzmisszió: a detektort elérő és az ionforrásban keletkezett ionok hányadosa 3 felbontás: 3. f lb tá az analizátor li át mekkora kk tömegkülönbséggel tö külö b é l tud t d elválasztani l ál t i két iont i t
•szektor típusú •kvadrupól •ioncsapdás •repülési idő analizátor
Szektor típusú analizátorok Ionok elválasztása: Mágneses tér vagy a gyorsító feszültség változtatása mágnes ionnyaláb
Fc = mv2/r
½ mv2 = zeU v=
ionforrás á Lorentz-erő FL = zevB
E= q qU=zeU z Ekin= ½ mv2
2 zeU m
detektor
FL= Fc
mv2/r= zevB
mv 2 r= zevB r = mv/(zeB) = (m/z) (v/eB)
Elektrosztatikus analizátor
egyszeres fókuszálás: felbontása korlátozott
kétszeres fókuszálás: mágneses + elektromos fókuszálás: jobb felbontás
Kvadrupólus analizátorok olcsó, egyszerűen kezelhető, stabilis, reprodukálható tömegspektrumot eredményező analizátor
1: ionizáló elektronsugár; 2: az analizátor által kiszűrt ionok útja 3: az analizátor által átengedett ionok útja; 4: detektor
egymással szemben elhelyezkedő rudakat elektromosan összekötve azokra egyenés váltóáramot kapcsolva kvadrupoláris változó elektromos tér alakul ki az ionok oszcilláló mozgást g végezve g haladnak át oszcilláció amplitúdója függ: •ion töltése •ion tömege •alkalmazott feszültségek Ioncsapdás analizátor: (IonTrap) módosított kvadrupólus analizátor „tárolni tudja az ionokat”
Repülési idő analizátorok azonos kinetikus energiájú ionok sebessége vákuumban, külső elektromos vagy mágneses teret nem tartalmazó közegben, tömegük négyzetgyökével fordítva arányos ionforrás
U
Ionok (egyenlő mozgási energia)
Kisebb tömegű ion: nagyobb sebesség
repülési cső (tér mentes)
v=
2 zeU U m
Tandem MS MS/MS
Q/Q/Q (TRIPPLE QUAD) Q/TOF TOF/TOF
Tandem „in space”: QQQ, QTOF „in time”: IT
szerkezetvizsgálat minőségi azonosítás
MSn
Detektorok az analizátor által elválasztott, adott idő alatt becsapódott ionok számát határozza meg pontdetektor: az ionok egymást követően érik el a detektor ugyanazon pontját Csak olyan analizátorral alkalmazható együtt, amely képes az ionokat időben elválasztani egymástól: pl. kvadrupólus
Elektronsokszorozó: 1. a fókuszált ionnyaláb egy un. konverziós dinódába ütközve onnan elektronokat lök ki 2. kilökődött elektronokat megfelelő feszültséggel gyorsítjuk 3. újabb és újabb felülettel ütköztetve megsokszorozott elektronáramot kapunk fotokonverziós detektorok: a becsapódó ionok hatására kilökődött elektronokat szcintillátor segítségével fotonokká alakítjuk, majd a kibocsátott fotonokat f t l kt fotoelektronsokszorozóval k ó l elektromos l kt jellé j llé alakítjuk l kítj k jobb hatásfok, hosszabb élettartam és kisebb karbantartási igény
Sordetektor: egymástól térben elválasztott ionok egyidőben érik el a kilépőrésnél elhelyezett detektor sort drága: magasabb árfekvésű készülékekben alkalmazzák (TOF, (TOF szektor)
Kapcsolt technikák valós minták: komplex, sokkomponensű rendszerek
A pontos t és é megbízható bí h tó minőségi i ő é i és é mennyiségi i é i analízis lí i elképzelhetetlen lké lh t tl a mintát i tát alkotó komponensek elválasztása nélkül. elválasztástechnikai eljárás alkalmazása szükséges
A hagyományos kromatográfiás technikák azonban még tökéletes szeparáció esetén é sem kínálnak kí ál k abszolút b lú biztonságos bi á minőségi i ő é i azonosítást. íá minőségi információ: csak az adott komponens retenciós viselkedése a manapság megkövetelt megbízható és reprodukálható meghatározások indokolják a tömegspektrometria és az elválasztástechnikai módszerek kombinálását
A következő feltételeknek kell teljesülnie ahhoz, hogy a két, meglehetősen eltérő kö ül é k között körülmények kö ö működő űködő módszert ód kkapcsolni l i tudjuk dj k egymáshoz: áh
•A kombináció ne vezessen kromatográfiás hatékonyság csökkenéshez. •A kromatográfból a tömegspektrométerbe történő bevezetés során a minta alkotóiban nem kontrollált kémiai átalakulás ne menjen végbe. végbe •A minta megfelelő mennyisége bejusson és ionizálódjon a tömegspektrométerben. •A kromatográfot és az MS-t összekapcsoló un. interfész ne növelje számottevően a hátté jt háttérzajt. •Az interfész legyen egyszerű felépítésű, könnyen használható, tisztítható és karbantartható valamint lehetőség szerint olcsó. •Az interfész legyen kompatibilis valamennyi kromatográfiás körülménnyel (pl. vivőgázok, oldószerek, áramlási sebesség, pH, hőmérséklet, stb.). •Az interfész ne korlátozza az MS nyújtotta y j lehetőségeket g (p (pl. ionizáció, vákuum, felbontóképesség, stb.). •Az interfész alkalmazásával nyert eredmények reprodukálhatók legyenek.
HPLCMS Atmoszférikus nyomású ionizációs technikák ESI (ElectroSpray Ionization)
N b l díj Nobel-díj
ESI az oldatbeli ionok gázfázisba juttatása
COULOMB FISSION
ION EVAPORATION
APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) nem szükséges ionok jelenléte az oldatban elektromos kisülés: szekunder ionizáció
CEMS
Interface: •jet-szeparátor j p •membrán alkalmazása
GCMS
kicsiny átmérőjű (d ≤ 0,25 mm) kapilláris oszlopok elterjedése: i t f interface nélküli, élküli közvetlen kö tl csatlakoztatás tl k t tá EI
1. anyamolekula gerjesztődik 2. ionizálódik 3. ffragmentáció g
fragmentáció: •kötéshasadás •a molekulát alkotó atomok átrendeződése
tömegspektrum: m/z függvényében ábrázolt beütésszám molcsúcs: molekulaion csúcsa báziscsúcs: legintenzívebb vonal leányion: molekulaionból képződő ion unokaion: leányionokból képződő ion
relatív intenzitás m/z = 15 Ir ≈ 95
CH4
m/z = 16 Ir = 100
m/z = 14 Ir ≈ 20 m/z = 17 Ir = 1,1 11
m/z
Fontosabb elemek izotópeloszlása Elem 1 H 2 H 10 B 11 B 12 C 13 C 14 N 15 N
% 99,985 , 0,015 20 80 98,892 1,108 99 63 99,63 0,37
Elem 16 O 17 O 18 O 32 S 33 S 34 S 35 Cl 37 Cl
% 99,76 , 0,037 0,204 95 00 95,00 0,76 4,22 75 77 75,77 24,23
Elem 79 Br 81 Br
A elem: F, P, I A+1 elem: C, N, B A+2 elem: Cl, Cl Br, Br S S, O
% 50,69 , 49,31
A+1
A C elméleti spektruma 12.00 0.9 0.8 0.7 Abund dance
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 10.0
13.00 10.5
11.0
11.5
12.0
12.5 m/z
13.0
13.5
14.0
14.5
15.0
A C10 elméleti spektruma 120.00 0.8 0.7
Abunda ance
0.6 0.5
10 x 1 1,1% 1% = 11%
0.4 0.3 0.2 121.00
0.1
122 00 123.01 122.00 123 01 124.01 124 01 125.01 125 01 126.02 126 02 127.02 127 02 128.02 128 02 129.03 129 03
0.0 118
120
122
124
126 m/z
128
130
132
A C100 elméleti spektruma 1201.00 0.35
1200.00
0.30 0.25 Abund dance
1202.00
0.20 0.15 0.10
1203.01
0.05 1204.01 1206 02 1208.02 1206.02 1208 02 1210.03 1210 03 1212.04 1212 04 1215.05 1215 05 1217.05 1217 05 1219.06 1219 06 1221.07 1221 07
0.00 1200
1205
1210 m/z
1215
1220
A C1000 elméleti spektruma 12011.03
0.12
12009 03 12009.03
0.11
12012.04
0.10
12013.04
12008.02
0.09 0.08
12014.04
Abu undance
0.07
12007.02
0.06
12015.05
0.05 0.04 0.03
12006.02
12016.05 12017 05 12017.05
12005 01 12005.01
0.02 0.01
12018.06 12019.06 12021.07 12027.09 12032.10 12038.12 12044.14 12049.16
12004.01
0.00 12000
12010
12020
12030 m/z
12040
12050
Br
A+2 78.92
1 Br: 2 csúcs : 50-50%
80.91
0.50 0.45 0.40 0.35 Abundance
0.30 0.25 0 20 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 77
78
79
80 m/z
81
82
2Br 2 Br: 3 csúcs : 25-50-25% 159.83 0.45 0.40 0 35 0.35 Abu undance
0.30 157.84
0.25
161.83
0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 156
157
158
159
160 m/z
161
162
163
3Br 3 Br: 4 csúcs : 12,5-37,5-37,5-12,5% , , , , 238.75
240.75
0.35 0.30
Abund dance
0.25 0.20 0.15
236.76
242.75
0 10 0.10 0.05 0.00 235
236
237
238
239
240 m/z
241
242
243
244
Izotópeloszlás számítása 1 Br: 2 csúcs : 50-50% 2 Br: 3 csúcs : 25 25-50-25% 50 25% 3 Br: 4 csúcs : 12,5-37,5-37,5-12,5% (a+b)2 = a2 + 2ab + b2 (a+b)3 = a3 + 3a2b + 3ab2 + b3
(a+b)n 1 11 121 1331 14641
hexán: C6H14
homológ sorozatok: 14 tömegkülönbséggel
Szénhidrogénekből képződő fragmensek CnH2n+1 C 1 2 3 4 5 6
képlet CH3 C 2H 5 C 3H 7 C 4H 9 C5H11 C6H13
tömeg 15 29 43 57 71 85
CnH2n molekulaionból C képlet tömeg 1 CH2 14 2 C 2H 4 28 3 C 3H 6 42 4 C 4H 8 56 5 C5H10 70 6 C6H12 84
CnH2n-1 (CnH2n+1)+ ionból C képlet tömeg 1 CH 13 2 C 2H 3 27 3 C 3H 5 41 4 C 4H 7 55 5 C 5H 9 69 6 C6H11 83
3-Pentanol C5H12O M = 88,15
Néhány gyakoribb neutrális vesztés Tömeg 1 2 14 15 18 26 27
Atomcsoport H H2 CH2 CH3 H 2O C 2H 2 HCN
28 29 31 32 33 44 45
CO CHO OCH3 SH H 2S CO2 COOH
Vegyülettípus aldehidek aromások szénhidrogének szénhidrogének alkoholok,aldehidek, ketonok aromás szénhidrogének aromás aminok N-heterociklusos vegyületek aldehidek, ketonok, fenolok aromás aldehidek, aldehidek fenolok metoxi-vegyületek tiolok savak, savanhidridek, észterek karbonsavak
relatív intenzitás
C6H6
m/z = 78 Ir = 100
m/z = 77 m/z = 76 Ir ≈ 15 Ir ≈ 5
m/z = 79 Ir = 6,6 66
m/z
naftalin: C10H8
MS SPEKTRUM ÉRTELMEZÉSE spektrum-könyvtár: szoftverek (meg kell venni) gyors
gondolkozás: szabályok ismerete (meg kell tanulni)
IONIZÁCIÓ??? Á Ó
1. 2. 3. 4 4. 5. 6. 7.
báziscsúcs (normalizálás) molcsúcs izotópvonalak c atomok száma összegképlet reális vesztések keresése SZERKEZETI KÉPLET
molcsúcs: legnagyobb tömeg kivéve: •izotóp vonal •szennyezés y •nem jelenik meg
