INSEMINAČNÍ DÁVKA - TENTOKRÁT JAKO PROSTŘEDEK K OPLODNĚNÍ PLEMENICE Základním cílem chovatele by měla být březí plemenice po co nejkvalitnějším býkovi. Většina autorů se shoduje, že březost plemenic je za standardních podmínek ovlivněna faktory vnějšího prostředí (96%), plemenicí (3%). Jen 1 % tvoří sperma plemeníka. Přesto se budeme v tomto článku věnovat právě inseminačním dávkám. Volným překladem Vás seznámíme s řadou pro praxi zajímavých závěrů různých autorů. Uváděné poznatky pochází především z práce autorské skupiny DeJarnett, Nebel, Marshall, nazvané "Understanding Estimates of AI Sire Fertility" od Select Sires. Dále ze sborníků amerických vědeckých konferencí nazvaných "Technical Conference on Artificial Insemination and Reproduction". Věříme, že tento článek uspokojí poptávku dotazů z oblasti, o které se téměř nepíše. Smyslem článku je, aby jste s nakoupenými dávkami dosahovali co nejuspokojivějších výsledků v zabřezávání. Ekonomika stáda je ovlivněna zabřezáváním plemenic z celé řady pohledů. Mezi krátkodobé faktory patří např. náklady inseminace na jednu zabřezlou plemenici. Z dlouhodobého hlediska jde především o obrat stáda. Je-li zabřezávání uspokojivé, může si chovatel dovolit dražší a tedy obvykle kvalitnější genetický materiál. Pokud je zabřezávání špatné, šetří se i na kvalitě inseminovaných býků. To přináší zpětně zpomalení genetického pokroku stáda. To platí i pro přirozenou plemenitbu. Sebelepší býk na doskakování není z pohledu šlechtění stáda nic víc, než neplnohodnotná záplata za kvalitnější prověřené býky. V praxi stoupá intenzita používání sexovaného spermatu. Předpokladem jeho použití je stabilně dobrá reprodukce u jalovic. Motivací k jeho použití by měla být především snaha o zisk co největšího počtu jalovic pro obrat stáda (případně pro prodej). Pokud je motivací k jeho použití jen dohánění špatné reprodukce u krav, pak je nutné si uvědomit, že skupina býků, kteří jsou plemenářskými firmami vybráni pro produkci sexovaného spermatu, není genetickou kvalitou rovnocenná kvalitě nabídky normálního spermatu. Za daného stupně vývoje a ceny, ovlivněné dosud používanou metodou sexace, se totiž produkce sexovaných ID zatím netýká nejlepších býků plemenářských firem. Stejně tak, pokud chovateli někdo nabízí tzv. zaručeně nadprůměrně zabřezávající sperma (s např. dvojnásobným počtem spermií apod.), jde o v podstatě komerční fintu. Jejím rubem je fakt, že se jedná o geneticky jen průměrné či dokonce podprůměrné býky. Závěrem úvodu si zopakujme, že sperma býka ovlivňuje vaší březost z cca 1%.
Ve světě i u nás existují různá, většinou málo objektivní hodnocení plodnosti býků. Snížená objektivita těchto hodnocení vyplývá především ze skutečnosti, že rozhodující roli při zabřezávání plemenic hrají podmínky vnějšího prostředí. Počet hodnocených inseminací je přitom u většiny nabízených býků malý (tzn. nedostatečná spolehlivost PH). Výjimkou jsou většinou jen doprověření býci. Reprodukce stáda skrývá i z pohledu stanovení OPH řadu dalších záludností. Jako příklad lze uvézt např. embryonální mortalitu. Sperma býka bylo v pořádku a zabřezlo, ale býk si stejně do svého hodnocení žádné "plus" za březost či prověření potomka v budoucnu nepřipíše. Věnujme se dále již jen "ikoně" INSEMINAČNÍ DÁVKA. Její vliv na celkovou reprodukci je, jak již bylo řečeno malý, protože o úspěchu rozhodují především faktory mimo dosah pejety (zdravotní stav stáda, laktační stres, výživa, faktory managementu atd.). Cílem snad všech plemenářských firem je produkce pejet s dostatečnou oplozovací schopností. Jinak by firma na trhu rychle skončila. V případech, kdy se ale ID po opuštění stanice býků v průběhu dalších přesunů, překládání, skladování, přípravy na inseminaci apod. poškodí, může být jejich vliv na výslednou březost konkrétního stáda zcela zásadní.
SLOŽENÍ INSEMINAČNÍ DÁVKY, JEJÍ OPLOZOVACÍ KVALITA, PŮLENÍ APOD. Zjednodušeně řečeno, z pohledu zabřezávání, se sperma skládá z kompenzovatelné (KF) a nekompenzovatelné (NF) frakce (Salisbury a Vandemark, 1961, Saacke, 1998). Podíl obou částí se u jednotlivých býků liší. Přidáváním (KF) složky lze u některých býků částečně o něco zvyšovat oplozovací schopnost. Nejedná se však o lineární závislost, takže s dalším zvyšováním (KF) frakce již dalšího zlepšení nedosáhneme. Naopak přidávání složky (NF) nemá na oplozovací schopnost pejety téměř žádný vliv. Lze to vysvětlit i jinak - laboratoř v USA stanoví na podkladě matematického modelu u každého býka a každého ejakulátu takové složení (počet spermií atd.), aby byl bezpečně splněn předpoklad dosažení dostatečné oplozovací schopnosti. Této "garanční" hranice kvality dosahují různí býci s různým složením semene. Pokud bychom tedy chtěli zvyšovat předpoklad zabřezávání, lze toho u některých býků dosáhnout dalším zvýšením (KF) složky spermatu. Že jen u některých, je ze dvou důvodů. Prvním je kvalita spermatu ne u všech býků a ejakulátů lze tohoto efektu dosáhnout. Druhým důvodem je ekonomika - plýtvat spermiemi nad jejich nezbytně nutnou hranici lze jen u býků, u nichž poptávka zaostává za nabídkou. Ukažme si výše popsané na následujícím grafu. Graf 1 - variabilita složení spermatu ve vztahu k dosažitelnému zabřezávání
Býk A produkuje sperma s vysokým podílem kompenzovatelné frakce (KF). S přidáváním vyššího počtu spermií zprvu rychle roste jeho schopnost oplození, až k bodu dosažitelné horní hranice březosti. Býci B a C produkují sperma s nižším podílem frakce (KF), ale přesto lze dalším zvyšováním počtu jejich spermií ještě i u nich dosáhnout uvedené horní hranice. Jejich ID ale potřebuje více spermií, nežli ID býka A. U býka D je již podíl (KF) frakce ve spermatu nižší. Dalším přidáváním spermií sice ještě také roste oplozovací schopnost, ale úrovně býků A, B a C nemůže nikdy dosáhnout. Ve spermatu býka E převažuje frakce (NF). Ani při maximálním zvyšování spermií v jeho ID nedosáhneme uspokojivého zabřezávání. Sperma býků A, B a C má obdobný předpoklad oplozovací schopnosti, ale býku A k tomu stačí méně spermií. Sperma býka D má menší oplozovací schopnost než býků A,B a C. Pokud ale jde o geneticky výborného býka, není důvod jej neprodávat. Sperma býka E je již tak špatné, že bude z běžné produkce vyřazen, bez ohledu na jeho genetickou kvalitu. Laboratoře detailně analyzují každý skok každého býka a data ukládají. Pro každého plemeníka existuje trendový diagram parametrů jeho ejakulátu. Tzn., že ani počet spermií v pejetě konkrétního býka není celý život stejný, ale je upravován podle potřeby tak, aby vždy splňoval požadované parametry. Velmi propracovaný je i systém kontroly již vyrobených dávek na stanicích. U každého skoku je prováděn m.j. test motility po rozmrazení, a to u pevně stanoveného počtu náhodně vybraných dávek. Obecně vzato, býci mléčných plemen produkují v průměru kvalitnější sperma, než býci masných plemen, mladší býci než starší atd. Stejně tak platí, že býci s podprůměrnou kvalitou semene dosahují podprůměrného zabřezávání, bez ohledu na počet spermií v ID. Naopak, býci s nadprůměrnou kvalitou semene, dosahují nadprůměrného zabřezávání i pokud je počet spermií v jejich ID na spodní hranici (vždy ale 2 - 5x vyšší, než je limit pro předpoklad dosažení horní hranice oplozovací schopnosti). Variabilita motility po rozmrazení je poměrně malá, protože do oběhu je puštěno jen sperma, jehož laboratorní test motility po rozmrazení je v pořádku. Propracovaný systém kontroly spermatu a vyřazování podprůměrných ejakulátů býků po dobu sedmdesáti let, jsou současně pozitivní selekcí na oplozovací schopnost býků.
Úspěšnost inseminace ovlivňuje ekonomiku malých i velkých farem u nás i v cizině.
MATEMATICKÁ LOGIKA DOSAŽITELNÉHO ZABŘEZÁVÁNÍ Zabřezávání, z pohledu jedné inseminační dávky, lze charakterizovat jako binomickou funkci. To je taková funkce, kdy lze dosáhnout jen dvou možných výsledků. Plemenice po inseminaci je buď březí, nebo jalová. Nic mezi tím. Pokud by bylo zabřezávání závislé jen na inseminační dávce, mohli bychom ho přirovnat k "házení jednou mincí". Při dostatečném počtu opakování bychom dostali 50% pannu, 50 % lva. Úspěch inseminace, ale závisí na celé řadě faktorů. Pokud bychom brali v úvahu 4 faktory (kvalita semene, reprodukční stav plemenice, časování říje, kvalita zacházení se spermatem) a považovali je za zcela rovnocenné (což ale nejsou), můžeme situaci přirovnat k "házení 4 mincí". V tomto případě máme už 16 variant, jak může každý hod skončit. Každou variantu s pravděpodobností pouze 6.25%. PRAVDĚPODOBNOST
INSEMINAČNÍ DÁVKA
STAV PLEMENICE
ČASOVÁNÍ ŘÍJE
ZACHÁZENÍ S ID
%+
6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 6.25% 100%
+ + + + + + + + 50% +
+ + + + + -
+ + + + +
+ + + + -
+ + + 50% +
+
100 75 75 75 75 50 50 50 50 50 50 25 25 25 25 0 50% +
+
+ + 50% +
+ + + 50% +
Jak vidno, dosáhnout nadprůměrného podílů plusových faktorů (prvních pět řádku) lze jen s pravděpodobností 31.25%. Ač je to příklad zjednodušený, podobné je to i s reprodukcí. Na následujícím grafu vidíme teoretickou frekvenci úspěšnosti opakovaného použití deseti stoprocentně kvalitních inseminačních dávek ve stádě s březostí pohybující se dlouhodobě na úrovni 30%.
Z grafu je patrné, že ačkoliv i nyní bude březost deseti použitých dávek okolo 30%, v některých případech může být březost až 60%, stejně jako ale i např. 0%. Vyšší březosti stáda přitom nelze dosáhnout změnami spermatu, ale jen zlepšením některého z dalších uvedených faktorů. Smyslem uvedeného příkladu je zdůraznit, že naprostá většina rozdílů v zabřezávání různých býků v praxi jde na úkor jiných faktorů, než jakým je oplozovací kvalita jejich inseminační dávky. Matematické modely používané při výpočtu OPH jsou propracované, poměrně přesné a zvažující řadu faktorů. Data do nich vkládaná jsou ale často nepřesná či dokonce mylná. PH pro vlastní plodnost je přitom většinou postavena na "non-return" testu (březosti po inseminacích plemenic). Tato PH má u mladých býků (testace) jen malou spolehlivost. Plodnost navíc patří mezi vlastnosti s nižší dědivostí. Důvodů je celá řada, většina z nich je v praxi nepostřehnutelná. Patří sem např. chyby při evidenci a detekci březosti či kvůli průkaznosti původu nebo embryonální mortalitě. I u spermatu stejného býka je zabřezávání ve stádech s různou úrovní užitkovostí, managementu apod. rapidně odlišné. Stáda se liší např. systémem vyhledávání říje, způsobem zabezpečení inseminace a vyhledáváním její optimální doby. Roli hraje, zda jde sperma na jalovice či krávy, na špičkové plemenice či přebíhalky, zda jde o inseminaci celými dávkami či půlkami apod. Svoji roli hraje i osoba inseminátora. Její výsledky, co do manuální zručnosti, jsou sice modelem výpočtu PH do jisté míry jako efekt standardizovány. Nelze už ale zohlednit další faktor lidského uvažování. Roli přitom někdy hraje zda jde o sperma vlastní či konkurence, věrohodnost nahlášené říje, reprodukční charakteristika plemenice atd. Čím spíše existují v okamžiku inseminace pochybnosti, tím spíše je použito levnější či "cizí" sperma. Selektivní lidské uvažování při volbě spermatu, rozhodnutí o jeho půlení apod. platí i pro faktor plemenice - např. při zvážení, zda v předchozích cyklech zabřezávala výborně či naopak špatně. Vzhledem k binomické povaze inseminace, přes všechny výše uvedené či ještě neuvedené faktory, existují bohužel jen 2 možnosti - BŘEZOST či JALOVOST plemenice…
INSEMINACE PO PŘIROZENÉ ŘÍJI, SYNCHRONIZACI A V RŮZNÝCH FÁZÍCH ŘÍJE S intenzivním a poměrně dobře zvládnutým rozšířením programů synchronizace, se často opakuje otázka: "liší se jednotliví býci v zabřezávání po přirozené či indukované říji" ? Zjednodušená odpověď sice zní ANO, ale mnohem důležitější je pochopit kdy a proč. Dosud neexistuje žádná odborná práce, která by dostatečně spolehlivě došla k závěru, že pořadí zabřezávání skupiny býků po přirozené říji se statisticky významně liší od pořadí stejné skupiny býků inseminované po synchronizaci. Zato je známým faktem, že pokud chce chovatel získat tele po pouze průměrně či dokonce podprůměrně zabřezávajícím býkovi, může k tomu být právě synchronizace říje nejjistější cestou. Macmillian a Watson (1975) se zabývali zabřezáváním skupiny býků, ve vztahu k různým fázím říje. Pokud došlo k inseminaci hned na počátku říje, březost býků s nadprůměrným zabřezáváním to nijak neovlivnilo. Zato u skupin průměrně a podprůměrně zabřezávajících býků to mělo významný negativní efekt na jejich březost. Při inseminaci v optimální fázi říje se pak výsledky průměrně a podprůměrně zabřezávajících skupin býků blížily nadprůměrně zabřezávající skupině. To naznačuje, že zabřezávání může do určité míry záviset i na délce životnosti spermií po rozmrazení (inseminaci). Faktor životnosti spermií je při postupech časování říje částečně minimalizován. Platí, že zatímco při synchronizaci se odchylky v zabřezávání býků minimalizují, při inseminaci po přirozené říji mohou být mezi jednotlivými býky patrnější rozdíly. To ukazuje i graf 3 (viz. dále).
Do každé inseminační dávky je tedy dávkováno v průměru 2 - 5x více spermií, než kolik je laboratorně stanovená hranice předpokladu pro horní hranici oplozovací schopnosti. Konkrétní počet spermií se ale u každého býka pochopitelně liší. U býků s nejvyšší poptávkou je rezerva řekněme spíše jen dvojnásobná, u býků s malou poptávkou klidně i pětinásobná. Jako příklad lze uvézt např. Omana. Při jeho ceně a obrovském převisu poptávky nad nabídkou je počet spermií v jeho ID na spodní hranici uvedeného rozpětí. Ačkoliv se jeho spermiemi neplýtvá, býk velmi dobře zabřezává. Výše uvedené informace pak mají hodnotu i pro praxi. Pokud budeme půlit inseminační dávky býka, který patří mezi nadprůměrné v zabřezávání a u nějž lze očekávat vzhledem k poptávce spíše 5x vyšší počet spermií, může to vyjít bez problémů. U býků s průměrným zabřezáváním či vysokou poptávkou riskujeme více. Menší počet spermií u nich může souviset se slabším zabřezáváním při půlení. Půlené sperma býka s podprůměrným zabřezáváním nebude pravděpodobně zabřezávat téměř vůbec. Negativní dopady půlení dávek na březost jsou teoreticky navíc tím menší, čím příznivější jsou ve stádě z pohledu reprodukce faktory vnějšího prostředí (viz. Roční období), čím spíše jdou půlené dávky jen na jalovice, pokud býk patří mezi ty všeobecně nejlépe zabřezávající atd.
ZACHÁZENÍ S PEJETAMI - KOLIK MÍNUS JE PRO PEJETU DOSTATEČNĚ MÍNUS ? Nejedná-li se při práci s kontejnerem o vyjmutí pejety pouze za účelem přípravy k inseminaci, kdykoliv manipulujeme s inseminačními dávkami (dále jen ID) mimo bezpečnou zónu kontejneru, hrozí riziko snížení oplozovací hodnoty spermatu. Před každým překládáním, přepočítáváním, přerovnáváním či manipulaci s dávkami bychom si měli položit otázku, zda je to opravdu nutné. Již při příjmu ID do kontejneru je potřeba dávky ukládat podle takového systému, aby byl počet dalších manipulací s nimi co nejmenší. S tím souvisí i systém evidence lokalizace uložených ID v kontejneru. Přesto se pochopitelně nelze zcela vyhnout manipulaci s uloženými dávkami. Pak je potřeba mít na paměti, ve kterém okamžiku manipulace může dojít k počátku poškození - v důsledku nechtěné iniciace procesu rozmražení. Tento okamžik je spojený s posunem teploty nahoru, v důsledku překročení bezpečné zóny par tekutého dusíku, v návaznosti na následovné opětovné ponoření pejety zpět do plnohodnotného tekutého dusíku. Tedy rychlého posunu teploty opět dolu. Tento pokles teploty totiž nekopíruje metodicky určenou křivku postupného zchlazování a zmrazování pří výrobě ID. Okamžik nastartování procesu nechtěného posunu teploty nahoru závisí nejen na místě překročení bezpečné chladové zóny, ale i na době expozice (vystavení dávky teplotě startující rozmrazovací proces). Klasický kontejner obsahuje obvykle tekutý dusík. Mezi ním a bezpečnostním uzávěrem v hrdle kontejneru jsou páry tekutého dusíku. Teplota otevřeného kontejneru v celém pásmu par není konsistentní, ale směrem k hrdlu kontejneru postupně stoupá. Místo, které je považováno za hranici - kde je teplota z pohledu ID ještě dostatečná a bezpečná - se nazývá anglicky "FROST LINE". Jedná se o místo uvnitř zóny, ve které je ID již nad hladinou tekutého dusíku, pouze v jeho parách. Pod hranicí "FROST LINE" je sperma ještě beze změn. Nad ní již hrozí riziko nastartování procesu ohřevu. Toto riziko je úměrně vzdálenosti od "FROST LINE", době expozice, ale i působení dalších faktorů vnějšího prostředí. Zatímco hranice OROSENÍ vnitřního povrchu hrdla kontejneru je dobře viditelná, přesnou hranici "FROST LINE" nelze pouhým okem přesně určit. Jde tedy o z pohledu praxe špatně využitelný pojem. Zjednodušeně řečeno platí, že čím níže v orosené zóně se spermatem manipulujeme, tím lépe.
A. TEPLOTA V ZÓNĚ OROSENÍ Laboratorní měření prokázala, že teplota v zóně vnitřního orosení parami dusíku kolísá mezi -40oC a -120oC. Kolísání teploty závisí nejen na vzdálenosti od hladiny tekutého dusíku či na vzdálenosti od hrdla otevřeného kontejneru, ale liší se u jednotlivých kontejnerů i v závislosti na šířce a délce hrdla. Dále pak kolísá obecně, v závislosti na teplotních podmínkách v místě, kde se kontejner nachází.
B. ZÓNA NEBEZPEČÍ NASTAROVÁNÍ PROCESU ROZMRAZOVÁNÍ A BEZPEČNÉHO ULOŽENÍ Řada autorů se shoduje, že tuto zónu lze charakterizovat teplotou -80oC až -100oC. Další autoři mluví přímo o hraniční teplotě -100oC. Zóna bezpečného uložení je pak většinou autorů definována teplotou -100oC a nižší. Řada autorů uvádí - jako pro manipulaci s ID zcela bezpečnou zónu - zónu s teplotou -130oC a více. K práci v takovéto zóně je ale pochopitelně potřeba příslušného vybavení (délka pinzety apod.), nelze si vystačit s prsty ruky. Proč právě teplota -130oC ? Závislost mezi zvyšující se teplotou v zóně orosení a mírou snížení oplozovací schopnosti inseminační dávky dokumentoval např. Elliot (1978). Ve své práci porovnával motilitu ID skladovaných v různých teplotách zóny orosení. Sperma skladované v teplotě -196oC vykazovalo lepší motilitu po rozmrazení než sperma skladované v teplotě -103oC a výrazně lepší motilitu než sperma skladované při 78oC (viz. graf 4).
GRAF 4 - motilita po rozmrazení v závislosti na teplotě a délce skladování
Proč právě -132oC ? Při této a nižší teplotě je všechna voda v kontejneru v krystalickém stavu. V průběhu postupného zmrazování při výrobě inseminačních dávek se formují krystaly vody v takové velikosti a formě, že jejich vliv na poškození buněk spermatu je minimalizován. Naopak, krystaly vody vznikající opětovných zmrazením, při nedodržení křivky rychlosti poklesu teploty v čase, se svojí strukturou liší a mají vliv na poškození spermií a jejich motilitu po rozmrazení. Navíc, při teplotě skladování -130oC a níže, je obal pejety zvenčí pokryt optimální vrstvou krystalů LN2. Ta krátkodobě brání nastartování procesu rozmražení, při časově omezené manipulaci s ID mimo bezpečnou zónu v kontejneru.
C. VZDÁLENOST OD HRDLA KONTEJNERU Nejčastěji udávanou, pro manipulaci s ID bezpečnou hloubkou v hrdle kontejneru, je 12 cm, kde se teplota pohybuje okolo -130oC . V případě, kdy se dostáváme nad tuto hranici, je potřeba zkrátit pobyt ID v této zóně na absolutní minimum času. I v hloubce hrdla okolo dvanácti cm ještě teplota kolísá mezi minus 160 až minus 130 stupňů celsia, v závislosti na typu kontejneru (šířka hrdla atd.). Odpar v hrdle je tím větší a vzestup teploty nad -130oC o to rychlejší, čím je hrdlo širší a kratší (viz. graf 5). GRAF 5 - teplota ve vztahu k hloubce hrdla kontejneru
D. MANIPULACE S GOBLETAMI V praxi inseminujících osob se běžně setkáváme s následujícím postupem. Gobleta (např. za účelem práce v ní) či jen samotná pejeta (např. za účelem přečtení označení) se vyjme nad bezpečnou zónu a probíhá přepočítání dávek, přečtení označení na gobletě či na ID apod. Přitom je snaha zkrátit dobu pobytu mimo bezpečnou zónu na minimum. Není-li úkon dokončen, práce nad bezpečnou zónou se přeruší a gobleta či ID se zase na určitý čas ponoří zpět do kontejneru, s cílem dosáhnout opět původní teploty před začátkem pokračování práce. Splňuje tento postup svůj účel ? Pravděpodobně ne tak, jak je očekáváno. Velmi záleží na tom, zda je hladina LN2 v kontejneru dostatečně vysoká či zda převažují jen páry. Berndtson (1976) zjistil, že efekt ponoření zpět do bezpečné zóny kontejneru na dobu jedné minuty se liší v závislosti na stupni naplnění kontejneru dusíkem. Je-li hladina dusíku v kontejneru nízká a převažují-li páry, nedosáhneme původní teploty před začátkem úkonu, ale gobletu pouze ochladíme o cca 30 - 40 stupňů. Čím déle pracujeme v oblasti nad bezpečnou zónou, tím delší doba je potřeba k dosažení původního stavu v pouze parách a tím na v průměru vyšší průměrnou teplotu opětovně ponořené goblety (ID), se dostaneme. To dokumentuje i následující graf 6. GRAF 6 - efekt zpětného ponoření do plného a poloprázdného kontejneru
E. PŘÍZNAKY MASKOVANÉHO POŠKOZENÍ Senger (1980) zjistil v rámci dvouleté studie v praxi farem a inseminačních techniků, že počet případů, kdy došlo nedopatřením v důsledku úniku či odparu dusíku k vyschnutí kontejneru, se blížil k 5%. Což je poměrně hodně. V lepším případě jsou ID zlikvidovány, v horším opětovně amatérsky "zmrazeny" v dusíku a znovu "uvedeny do praxe". Jejich oplozovací schopnost je ale už nulová. Jde jen o to, do jaké míry se maskovaný karambol podaří majiteli dávek a plemenic odhalit.
Při procesu rozmrazení dochází nejprve k ohřátí ID a následně k jejímu orosení zvenčí. Při "amatérském" způsobu opětovného zmrazení již kompletně rozmrzlých pejet zůstává obal pejety v kontejneru obalen ledem. Inseminační dávka je na povrchu "namrzlá". Jednotlivé dávky v gobletě jsou navzájem často přimrzlé a špatně se vyjímají z goblety. Pokud došlo k částečnému poškození pejety delší expozicí v nebezpečné zóně, nese pejeta následující stopy: nesymetrické, kruhové (cylindrické) praskliny, výduť či puchýřek ve středu ID, podélně prasklá pejeta, paprskovité praskliny. U ještě nezmrazené či již rozmražené ID dochází v pejetě v čase k sedimentaci spermií, neboli k jejich usazování v dolní polovině. Tomu lze předejít při sofistikovaném postupu výroby ID technologií IMV, ale těžko při opětovném zmrazení dávek v kontejneru v důsledku karambolu. Sedimentaci spermií v jedné polovině amatérsky zmrazené ID lze považovat za další důkaz karambolu (viz. Graf 7). GRAF 7 -sedimentace spermií v čase
F. KONTROLA STAVU DUSÍKU Objeví-li se po otevření kontejneru pára dusíku, je to často považováno za důkaz, že sperma je v pořádku. Nemusí tomu tak ale být. Dusík se odpařuje pozvolna a ještě i při vzestupu teploty v kontejneru až na -50oC se bude z hrdla odpařovat pára v takové intenzitě, že můžeme kontejner omylem považovat za dostatečně naplněný. Sperma uvnitř je však již nezvratně ve fázi procesu rozmrazení a tudíž trvale poškozeno, či dokonce zničeno. Hladinu dusíku v kontejneru je nutno měřit (plastická měrka apod.) a nikoliv spoléhat jen na vizuální důkaz ve formě páry.
G. "SABOTÁŽ", INSEMINACE POŠKOZENÉHO SPERMATU Lze výše uvedeným postupem poškodit sperma, aniž by se to zjistilo? Poškodit samozřejmě ano. U kompletně rozmrazených a následně amatérsky zmrazených dávek nesou pejety výše popsané stopy karambolu. Jde tedy spíše o to, zda na to majitel plemenic přijde. Pokud je inseminující osoba seriozní, při prvním zjištění poškození pejet zastaví jejich inseminaci a situaci řeší. Na některé následky poškození obsahu kontejneru lze uzavřít i pojištění. Pokud inseminující osoba zjistí poškození obsahu svého kontejneru a rozhodne se poškozené či zničené dávky i tak inseminovat, má majitel plemenic šanci to zjistit, jen pokud je pravidelně a aktivně přítomen inseminaci svých plemenic. Pokud majitel plemenic nebývá přítomen inseminaci, bývá alespoň dobrým zvykem zanechat u karty inseminované plemenice použitou ID. To hned z několika důvodů. Inseminující osoba se částečně kryje před případným nařčením. Chovatel má relativní důkaz, čím byla plemenice inseminována. U ID, které byly i přes jejich poškození inseminovány, bývá na pejetě řada poškození vidět.
H. SENZITIVITA "PŮLEK" x "ČTVRTEK", VLIV RŮZNĚ DLOUHÉ DOBY EXPOZICE Berndson (1976) provedl řadu experimentů odolnosti inseminační dávky vůči různě dlouhé expozici rozmrazující teploty. Jednotlivé ID byly vystavovány různě dlouhé době expozice teploty mimo dusík, s následným opětovným ponořením pod jeho hladinu (k opakovanému zchlazování). U všech ID byla následně posuzována motilita po rozmrazení. Ukázalo se, že sperma v "půlkách" je rezistentnější vůči poškození motility než ve "čtvrtkách" (viz. Graf 8). GRAF 8 - rezistence "půlek" a "čtvrtek" vůči různé délce expozice
V dalším experimentu byla porovnávána rezistence jednotlivých dávek oproti dávkám uvnitř naplněné goblety. Pejety umístěné uvnitř ostatních v naplněné gobletě vykazovaly výrazně vyšší rezistenci vůči expozici venkovní teplotě, nežli pejety umístěné na kraji goblety či než samotné pejety. Jinak řečeno, pokud poškodíme neodborným zacházením celou gobletu se spermatem, míra poškození jednotlivých ID v ní se může značně lišit. Relativně nejvyšší šanci uchovat si svoji kvalitu mají dávky v prostředku goblety (chráněny ostatními), nejhůře na tom jsou pejety na okraji goblety. Oplozovací schopnost jednotlivých ID v gobletě se pak může dost značně lišit (viz. Graf 9).
GRAF 9 - rezistence pejet uvnitř naplněné goblety a na okraji goblety (ve skupině x samotné)
Konečně, v posledním experimentu, byla nejprve hodnocena motilita v závislosti na délce expozice ve stabilních laboratorních podmínkách (graf 10). K rapidnímu poklesu motility dochází po ohřevu trvajícím 30 a více vteřin. GRAF 10 - motilita v závislosti na délce expozice v laboratorních podmínkách)
Posléze pak došlo k posouzení motility i u ID, které byly v laboratorních podmínkách vystaveny opakovaně krátkodobé expozici teploty mimo standardní podmínky kontejneru (5x na dobu 10 vteřin či 3x na dobu 15 vteřin či 2x na dobu 30 vteřin či 2x 45 vteřin či 2x 60 vteřin). Mezi jednotlivými opakováními expozic byl interval 60 vteřin. Výsledky ukazuje graf 11. K rapidnímu poklesu motility opět dochází již po 30 a více vteřinách (graf 11).
GRAF 11 - motilita v závislosti na různých délkách expozice a počtech opakování
I. JAK RYCHLE STOUPÁ TEPLOTA INSEMINAČNÍ DÁVKY ? Saacke (1978) prováděl měření rychlosti ohřevu inseminační dávky. Z grafu 12 vyplývá, že ID se z výrobní teploty ohřeje na hraniční teplotu -130oC již za méně než 10 vteřin. Tuto časovou hodnotu je důležité mít na paměti při práci v laboratoři i v praxi. Po cca deseti vteřinách již začíná proces rozmrazení ID, který se stoupající délkou expozice a počtem opakování, znamená nevratné poškození motility ID. GRAF 12 - ohřev ID v závislosti na délce expozice
J. VZTAH POČTU SPERMIÍ K ZABŘEZÁVÁNÍ V praxi se vyskytují případy, kdy je chovatel přesvědčován k odběru ID konkrétního býka argumentací, že jeho ID obsahují vyšší (dvojnásobný apod.) počet spermií. A proto "výborně" zabřezává…. Nebo je zákazníkovi nabízeno, že mu budou dodány ID býků dle jeho volby s vyšším počtem spermií, což by mělo přinést lepší zabřezávání. Jde o pravdu, polopravdu či lež ? V podstatě o vše dohromady. O pravdu jde z pohledu, že firma skutečně může chovateli vyrobit ID s např. dvojnásobným počtem spermií. Zvláště u průměrných, bezcenných býků, o které není z genetického pohledu zájem, tomu nic nebrání. Polopravdou je, že přidáním spermií do ID můžeme dosáhnout zlepšení zabřezávání. K tomu si zopakujme známá fakta o možnostech přístupu k výrobě ID (viz. začátek článku). Jednotliví býci se liší počtem spermií, které jsou potřeba k dosažení teoretické hranice horní oplozovací schopnosti. Samotný počet spermií v ID je tedy ve vztahu k oplozovací schopnosti býka velmi zjednodušeným kritériem. Kvalita spermatu nezávisí jen na počtu spermií, ale i na dalších parametrech ejakulátu (poměru frakcí KF a NF, kvalita akrozomu atd.). Existují býci, kteří mají při menším počtu spermií v pejetě lepší březost, nežli jiní býci při vysokém počtu spermií. Stejně tak se liší kvalita ejakulátu stejného býka v čase. S tím, že obvykle s věkem mírně klesá a kolísá i v krátkém časovém údobí, v závislostech na různých faktorech (zdraví býka, počet jeho skoků v čase, kondice, teplotní podmínky, výživa apod.). Každý ejakulát každého býka je proto vždy analyzován sérií laboratorních posouzení. Jejich cílem je určit optimální složení ID z pohledu oplozovací schopnosti po rozmrazení. Podle výsledku analýz a komerční hodnoty býka pak počítač doporučí, kolik by měly jeho ID z daného dne a skoku obsahovat spermií. K dosažení optimální, horní hranice oplozovací schopnosti, potřebují různí býci různý počet spermií. To lze vysledovat i z grafu 13 nizozemského autora Den Daase (1992). GRAF 13 - vztah mezi počtem spermií v ID a zabřezáváním
Býk A dosahuje vysokých oplozovacích hodnot již při relativně malém počtu spermií. Od určité hranice (cca 4 mil. spermií) u něj již žádným dalším přidáváním spermií do dávky plodnost výrazně nezvýšíme. U býka B se zprvu plodnost zvyšuje s růstem počtu spermií téměř lineárně. Od hranice cca 10 mil. spermií už jeho plodnost dále nijak podstatně neroste. U býka C se sice zvyšuje plodnost rovněž téměř lineárně s počtem spermií, ale jeho oplozovací schopnost je i při 15 mil. spermií nízká. Podle uvedeného vzorového příkladu bude mít nejlepší předpoklad zabřezávání býk B. Bude k tomu ale potřebovat cca 10 mil. spermií. Býk A na tom nebude o mnoho hůře, stačí mu k tomu ale jen 4 mil. spermií. Býk C bude nejspíše vyřazen z plemenitby, protože k výrobě dávek s dostatečnou oplozovací schopností by u něj bylo potřeba cca 20 mil. spermií na dávku. Nyní se na příklad podívejme z pohledu prodejnosti. Předpokládejme, že objem ejakulátu je u všech 3 býků obdobný. Mají-li býci A a B dostatečnou genetickou kvalitu (PH), nebrání nic jejich prodeji. Býk A bude mít oproti býkovi B nepatně nižší oplozovací schopnost, ale produkce spermatu u něj bude ekonomicky daleko efektivnější. Na odchylky ve výsledné plodnosti obou býků v terénu budou mít mnohem větší vliv podmínky vnějšího prostředí (kvalita zacházení s ID, inseminace, vliv plemenice apod.), nežli nepatrný rozdíl v jejich oplozovací schopnosti. Býk C má pravděpodobně smůlu, protože produkce jeho ID není rentabilní. Jen pokud se jedná o geneticky vynikajícího býka, přistoupí se k produkci ID. Ta bude v jeho případě ze všech tří býků nejméně rentabilní a jeho plodnost nebude i tak valná. Výborná genetika a špatné parametry spermatu znamenají rovněž automaticky vyšší cenu za sperma. Nyní se na tyto 3 býky podívejme z pohledu "tvrzení" o jejich zvýšené plodnosti přidáním dvojnásobného množství spermií. U býka A žádného dalšího efektu přidáním spermií nedosáhneme. V jeho případě by tedy takové tvrzení bylo lží. U býka B sice lze přidáním dvojnásobného počtu spermií mírně zvyšovat oplozovací schopnost, ale efekt v plodnosti bude jen malý. Navíc si tento postup můžeme dovolit jen u geneticky průměrných a podprůměrných býků. U nadprůměrného býka bychom prodělávali dvojnásobný počet spermií znamená o polovinu menší produkci jeho ID. Zbývá býk C. Firma bude jeho sperma produkovat, jen pokud je geneticky výborný. Už k dosažení alespoň průměrné březosti ale bude nutno dávkovat takové množství spermií, že si nějaké další zvyšování (natož dvojnásobné) nebude firma moci dovolit. Takže v postatě jde z pohledu uvedeného o nesmysl. V dnešním komerčním prostředí to možná její šiřitel bude nejspíše považovat za "chytrou" komerční fintu. Přidávat spermie ale lze jen u geneticky průměrných a podprůměrných býků, kteří navíc současně vykazují, už tak jako tak, nadprůměrnou plodnost. Závěr je jako vždy na chovateli. Je na něm, zda si "nechá věšet bulíky na nos", zda nabídku využije proto, že se bude snažit vzhledem ke svým chovatelským kvalitám udělat "kompromis mezi genetickou kvalitou a březostí" či zda prodejce s takovým tvrzením" vyžene".
ZÁVĚREM: Existují podprůměrní, průměrní a nadprůměrní inseminátoři, chovatelé i prodejci. Křivka náhodného rozdělení mluví pro praxi jasně. Varianta, že se sejdou v podniku všichni tři nadprůměrní, je málo frekventovaným ideálem, který je žádoucí. Varianta, kdy se sejdou tři podprůměrní, by měla vézt k jejich postupné eliminaci z praxe, ač to tak, díky různým stabilizačním dotacím či nedostatečnému konkurenčnímu prostředí, vždy není. Chybu uděláme každý, jde o to si ji uvědomit a opakovat co nejméně. Pokusme se společně posunout hranici průměru v oblasti reprodukce našich stád aspoň o malý kousek nahoru. V příštím, srpnovém katalogu přineseme další informace z workshopů REPRODUKCE 2008, pořádaných v květnu letošního roku, včetně překladu americké metodiky přípravy pejet k inseminaci.
