INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO 4 )

INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO4)

Oleh RHENI HAFIDIANA F34102016

2006 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

Inhibisi Aktivitas Invertase pada Sukrosa dengan Menggunakan Tembaga Sulfat (CuSO4) Ringkasan Sukrosa (glucose-1,2 fructose) merupakan pemanis yang banyak dikonsumsi dalam kehidupan manusia. Gula biasanya diartikan sebagai sukrosa untuk penggunaan komersial. Sumber sukrosa umumnya didapatkan dari nira, seperti nira tebu, nira kelapa, nira siwalan maupun dari bit. Kandungan sukrosa dalam masing-masing nira tersebut berbeda, yaitu nira tebu mengandung 14 - 20% sukrosa, nira kelapa mengandung 15 - 20% sukrosa dan nira siwalan mengandung 10 - 15% sukrosa. Degradasi sukrosa merupakan hal yang harus dihindari pada industri gula karena mempersulit proses kristalisasi. Hal ini disebabkan oleh hidrolisis sukrosa menjadi gula invert, disebut juga gula pereduksi (glukosa dan fruktosa) atau senyawa turunan lainnya pada produk-produk gula seperti sukrosa, merupakan penyebab menurunnya kualitas produk tersebut. Inhibisi aktivitas enzim telah dilakukan dengan mengkombinasikan suhu dan tekanan tinggi, namun mempengaruhi kualitas produk. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu, pH, konsentrasi enzim konsentrasi substrat, serta adanya inhibitor. Inhibitor dapat berupa bahan alami, seperti kentang, tomat dan tembakau. Akan tetapi, selain mengandung inhibitor, bahan tersebut masih mengandung bahan lain, sehingga perlu pemurnian. Kation Cu (II) dalam bentuk garam logam CuCl2 talah diteliti dapat menghambat aktivitas invertase. Terdapat garam Cu (II) lainnya, yaitu CuSO4. Aktivitas invertase dengan penambahan garam logam CuSO4 pada kondisi konsentrasi, konsentrasi substrat, pH, suhu dan lama pemanasan yang berbeda perlu diteliti, sehingga diketahui kemampuan inhibisi garam logam tersebut. Selain itu, dapat diketahui model kinetika inhibisi yang penting untuk keperluan rekayasa proses. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan hubungan perubahan pH, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, suhu inkubasi dan lama pemanasan dengan adanya penambahan CuSO4 terhadap degradasi sukrosa. Penelitian ini juga bertujuan untuk menentukan parameter kinetika laju degradasi (KM dan Vmaks) sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4. Keseluruhan pengujian menggunakan metode pengukuran gula pereduksi yang dihasilkan akibat hidrolisis sukrosa menggunakan DNS (dinitro salicylic acid). Pengaruh perubahan faktor pada setiap taraf ditentukan dengan menggunakan analisis sidik ragam (Anova) dan uji lanjut Duncan. Model dan parameter kinetika inhibisi yang paling sesuai ditentukan dengan menggunakan software SigmaPlot. Inhibisi oleh CuSO4 terhadap invertase dipengaruhi oleh perubahan konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan. Pada rasio konsentrasi invertase terhadap sukrosa 1 : 5000 dan pH larutan invertase 4.5, CuSO4 0.75-1.25 mM berperan sebagai aktivator invertase, sedangkan mulai konsentrasi 2.5 mM berperan sebagai inhibitor. Konsentrasi CuSO4 0.125 mM memberikan inhibisi tertinggi (95.1%) pada suhu 60°C, pH larutan invertase 4.5, rasio invertase terhadap sukrosa 1 : 2500. Aktivitas invertase sangat rendah pada

2

pH 3 dan pH 7 ke atas serta turun signifikan hingga 20 detik pemanasan. Inhibisi oleh CuSO4 0.125 mM terjadi pada lama pemanasan 0 – 10 detik. Kinetika inhibisi laju degradasi sukrosa oleh CuSO4 yang dilakukan pada pH 7 dengan tiga titik suhu (40°C, 50°C, 60°C) menghasilkan nilai KM dan Vmaks yang berbeda. Kecepatan reaksi meningkat dengan kenaikan suhu. Model kinetika inhibisi invertase oleh CuSO4 berbeda pada setiap suhu yang diujikan. Model inhibisi oleh CuSO4 pada suhu 40°C adalah mixed (partial), dengan nilai KM 8.6 g/l, Vmaks 288.4 µM/menit turun menjadi 64.1 µM/menit, Ki 0.5817 mM, α 75.1, β 3.1. Model inhibisi oleh CuSO4 pada suhu 50°C juga mixed (partial) dengan nilai KM 21.1 g/l, Vmaks 356.6 µM/menit turun menjadi 69.02 µM/menit, Ki 2.873e-9 mM, α 1201.3, β 232.5. Model inhibisi pada suhu 60°C bersifat kompetitif (full), dengan nilai KM 3555e+6 g/l naik menjadi 4.622e+6 g/l, Vmaks 1.732e+7 µM/menit, Ki 11.4 mM.

3

Inhibition on Invertase Activity in Sucrose Using Copper Sulphate (CuSO4) Summary Sucrose (glucose-1,2 fructose) is the most commonly used as sweetener for human consumption. In commercial usage, the term “sugar” usually refers to sucrose. There are a number of sugar’s sources, such as sugarcane, coconut-palm juice, fan-palm juice and sugar beets which content of sucrose are different. Sugarcane contains 14-20% sucrose, coconut-palm juice contains 15-20% sucrose, while 10-15% in fan-palm juice. Sucrose is widely used in industry for various purpose, but the degradation of sucrose is easily occured. Sucrose is converted into invert sugar, called reducing sugar or other derived compounds in many sugar products can cause decreasing quality of sugar. Enzyme inhibition is done by combining the temperature and high pressure, but it’s influence the quality of the product. Enzyme activity was influenced by temperature, pH value, enzyme concentration, substrate concentration, and presence of inhibitors. Inhibitors can be found natural sources, such as potato, tomato, and tobacco. Besides containing inhibitor, they still contain other ingredients, therefore purification is needed. Cu (II) cation as CuCl2 metal salt is known as element which can inhibit the activity of invertase. There are another Cu (II) as metal salt, it is CuSO4. The activity of invertase with addition of CuSO4 in different enzyme concentration, substrate concentration, pH, temperature and heat treatment should be learn, in order to recognize the inhibition capability of CuSO4. Besides that, the inhibition kinetic model can be figured out, which is needed for process engineering. The objective of this research is to obtain the influence of substrate concentration, enzyme concentration, pH value, incubation temperature and heat treatment with present of CuSO4 concerning to sucrose degradation. Besides that, it was also to determine the inhibition kinetic parameter (KM and Vmaks) of the rate of sucrose degradation with addition of CuSO4. The whole research uses the reducing sugar measurement method, as a result of sucrose hydrolisis using DNS (dinitro salicylic acid). The influence of factor’s changes in each level are determined by using analysis of variance (ANOVA) and Duncan test. The most suitable model and parameter of inhibition kinetic is determined by using SigmaPlot software. CuSO4 concentration, substrate concentration, enzyme concentration, pH value, incubation temperature and heat treatment affect inhibition by CuSO4. At the ratio of invertase to sucrose is 1 : 5000, CuSO4 0.75 - 1.25 mM can be used as an invertase activator, while as invertase inhibitor with the minimum concentration 2.5 mM. CuSO4 0.125 mM give maximum inhibition (95.1%) at 60°C, pH value of invertase is 4.5, ratio of invertase to sucrose is 1 : 2500. Invertase activity is very low at pH 3 and more than pH 7. The activity was also decreases significantly until 20 second of heat treatment. Inhibition was occured by 0 – 10 second of heat treatment.

4

The kinetic inhibition of of sucrose degradation rate by CuSO4 0.125 mM done at pH 7 with three temperature treatment (40°C, 50°C, 60°C) make KM and Vmaks value are vary. The reaction rate of it increases as well as the temperature. The inhibition kinetics model of invertase is different in each temperature. It is mixed (partial) when the temperature at 40°C. KM 8.6 g/l, Vmaks 288.4 µM/min decrease to 64.1 µM/min, Ki 0.5817 mM, α 75.1, β 3.1. The inhibition kinetic model when the temperature at 50°C was also mixed (partial). KM 21.1 g/l, Vmaks 356.6 µM/menit decrease to 69.02 µM/menit, Ki 2.873e-9 mM, α 1201.3, β 232.5, while competitive (full) at 60°C with KM 3555e+6 g/l increase to 4.622e+6 g/l, Vmaks 1.732e+7 µM/min, Ki 11.4 mM.

5

SURAT PERNYATAAN Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul “Inhibisi Aktivitas Invertase pada Sukrosa dengan Menggunakan Tembaga Sulfat (CuSO4)” adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan dosen Pembimbing Akademik, kecuali yang dengan jelas ditunjukkan rujukannya.

Bogor, 31 Agustus 2006 Yang membuat pernyataan,

Rheni Hafidiana F34102016

6

INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO4)

SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN Pada Departemen TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor

Oleh RHENI HAFIDIANA F34102016

2006 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

7

INSTITUT PERTANIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO4)

SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN Pada Departemen TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor

Oleh RHENI HAFIDIANA F34102016 Dilahirkan pada tanggal 18 Juni 1984 di Boyolali Tanggal lulus : 24 Agustus 2006 Menyetujui, Bogor,

September 2006

Prayoga Suryadarma, STP, MT. Pembimbing Akademik

8

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Boyolali pada tanggal 18 Juni 1984. Penulis adalah anak ketiga dari empat bersaudara dari

pasangan Widodo (Alm) dan Muslichah. Pada

tahun 1996, penulis menyelesaikan pendidikan sekolah dasar di SDN 3 Boyolali. Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah di SLTPN 1 Boyolali pada tahun 1999. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan di SMUN 1 Boyolali dan lulus pada tahun 2002. Penulis melanjutkan pendidikan di Perguruan Tinggi Negeri, Institut Pertanian Bogor tahun 2002 melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB) di Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian. Selama kuliah di IPB, penulis pernah menjadi asisten praktikum pada mata kuliah Laboratorium Lingkungan periode 2005/2006 dan Teknologi Minyak Atsiri dan Kosmetika periode 2005/2006. Penulis melaksanakan praktek lapang pada tahun 2005 dengan topik “Penerapan Aspek Pengawasan Mutu pada Proses Produksi Biskuit Bayi di PT. Arnott’s Indonesia-Bekasi, Jawa Barat”. Untuk menyelesaikan tugas akhir ini, penulis melakukan penelitian yang dituangkan dalam skripsi berjudul ”Inhibisi Aktivitas Invertase pada Sukrosa dengan Menggunakan Tembaga Sulfat (CuSO4)”.

9

KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan berkat, rahmat, dan hidayah serta kemudahan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Skripsi ini dibuat sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian. Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada: 1. Prayoga Suryadarma, STP, MT selaku dosen pembimbing akademik yang telah banyak memberikan arahan dan bimbingan , pada saat penelitian dan dalam penyusunan skripsi ini. 2. Dr. Ir. Erliza Noor selaku dosen penguji atas masukannya untuk penyempurnaan skripsi ini. 3. Drs. Purwoko, MSi selaku dosen penguji atas masukannya untuk penyempurnaan skripsi ini. 4. Ibu, kakak dan saudara kembarku yang selalu memberikan dukungan, semangat dan doa. 5. Teman sebimbingan (Rian, Annisa, Mba Fitri, dan Pak Ikhsan) atas bantuan dan kebersamaannya. 6. Teman-teman TIN 39 dan semua pihak yang telah memberikan bantuan kepada penulis baik selama penelitian maupun semenjak menjadi mahasiswa TIN yang tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang dapat membangun dan bermanfaat demi perbaikan skripsi ini. Semoga skripsi ini memberikan manfaat bagi pembaca.

Bogor, Agustus 2006

Penulis

DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR.................................................................................... x DAFTAR ISI................................................................................................... xi DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR...................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xvii I.

PENDAHULUAN ................................................................................ 1 A. LATAR BELAKANG ..................................................................... 1 B. TUJUAN.......................................................................................... 2

II.

TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 3 A. SUKROSA....................................................................................... 3 B. INVERTASE ................................................................................... 3 C. AKTIVITAS DAN STABILITAS ENZIM..................................... 4 D. FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI LAJU DEGRADASI SUKROSA .............................................................. 5 1. Pengaruh Suhu ............................................................................ 2. Pengaruh pH................................................................................ 3. Pengaruh Konsentrasi Substrat dan Enzim ................................ 4. Pengaruh Perubahan Kondisi Lingkungan ................................. 5. Pengaruh Inhibitor .....................................................................

5 5 6 7 7

E. KINETIKA ENZIMATIK ............................................................... 10 III.

METODOLOGI ................................................................................. 15 A. ALAT............................................................................................... 15 B. BAHAN ........................................................................................... 15 C. METODE PENELITIAN ................................................................ 15 1. Tahapan Penelitian ...................................................................... 15 2. Prosedur Percobaan ..................................................................... 17

xi

IV.

HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................ 21 A. Aktivitas Invertase............................................................................ 21 B. Pengaruh Konsentrasi CuSO4 ........................................................... 22 C. Hubungan Pengaruh Perubahan Faktor Terhadap Degradasi Sukrosa ............................................................................ 24 1. Pengaruh Konsentrasi Substrat ................................................... 2. Pengaruh Konsentrasi Enzim...................................................... 3. Pengaruh pH................................................................................ 4. Pengaruh Suhu ............................................................................ 5. Pengaruh Lama Pemanasan .......................................................

24 27 30 33 36

D. Kinetika Inhibisi Reaksi Invertase .................................................. 38 V. KESIMPULAN DAN SARAN............................................................. 45 A. KESIMPULAN................................................................................ 45 B. SARAN............................................................................................ 45 DAFTAR PUSTAKA..................................................................................... 46 LAMPIRAN.................................................................................................... 49

xii

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 1.

Pengaruh jenis logam dan bahan kimia pada konsentrasi 0.005 M terhadap aktivitas invertase ............................................

8

Tabel 2.

Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 40°C................... 39

Tabel 3.

Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 50°C................... 41

Tabel 4.

Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 60°C................... 43

xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1.

Reaksi hidrolisis sukrosa oleh invertase ..................................... 3

Gambar 2.

Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004) .................................................. 5

Gambar 3.

Pengaruh nilai pH terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004) .................................................. 6

Gambar 4.

Ikatan ion logam bivalen (M2+) dan grup sulfhidril.................... 9

Gambar 5.

Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik (Lehninger, 1988)....................................................... 10

Gambar 6.

Kurva Lineweaver-Burk ............................................................. 11

Gambar 7.

Mekanisme inhibisi kompetitif ................................................... 12

Gambar 8.

Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi kompetitif ........................ 12

Gambar 9.

Mekanisme inhibisi nonkompetitif. ............................................ 13

Gambar 10. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi nonkompetitif. ................. 13 Gambar 11. Mekanisme inhibisi unkompetitif. .............................................. 13 Gambar 12. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi unkompetitif. ................... 14 Gambar 13. Diagram alir tahapan penelitian. ................................................. 16 Gambar 14. Kurva aktivitas invertase berdasarkan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 25 g/l. Persamaan garis linier y = 3.2267 x, r2 = 0.9721. ........................................................... 21 Gambar 15. Kurva pengaruh konsentrasi CuSO4 terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit ........................................................................................ 22 Gambar 16. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi substrat terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5mg/l, lama reaksi 5 menit ...................... 25

xiv

Gambar 17. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada konsentrasi substrat yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit ........................................ 26 Gambar 18. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi enzim terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, pH 7, lama reaksi 5 menit ............... 28 Gambar 19. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada konsentrasi enzim yang berbeda, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, pH 7, lama reaksi 5 menit................................... 29 Gambar 20. Kurva pengaruh perubahan nilai pH terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit .................................................................... 30 Gambar 21. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada nilai pH yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit ...................... 33 Gambar 22. Kurva pengaruh perubahan suhu terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertasi 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit .............................................................................. 34 Gambar 23. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 pada suhu yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit....................... 36 Gambar 24. Kurva pengaruh lama pemanasan terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit .......... 37 Gambar 25. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 pada lama pemanasan yang berbeda dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit .......... 38 Gambar 26. Kurva Michaelis Menten invertase suhu 40°C. .......................... 39 Gambar 27. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 40°C................................ 40 Gambar 28. Kurva Michaelis Menten invertase suhu 50°C. .......................... 41 Gambar 29. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 50°C................................ 42 Gambar 30. Kurva Michaelis Menten invertase suhu 60°C. .......................... 43

xv

Gambar 31. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 60°C................................ 43

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1.

Prosedur penelitian................................................................... 49

Lampiran 2.

Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan penentuan konsentrasi CuSO4 .................................................. 50

Lampiran 3.

Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh konsentrasi substrat .................................................. 51

Lampiran 4.

Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada konsentrasi substrat yang berbeda .......... 54

Lampiran 5.

Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh konsentrasi enzim..................................................... 55

Lampiran 6.

Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada konsentrasi enzim yang berbeda ............. 58

Lampiran 7.

Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh pH............................................................................. 59

Lampiran 8.

Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada pH yang berbeda ..................................... 62

Lampiran 9.

Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh suhu .......................................................................... 64

Lampiran 10. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada suhu yang berbeda................................... 67 Lampiran 11. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh lama pemanasan ....................................................... 69 Lampiran 12. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada lama pemanasan yang berbeda................ 71 Lampiran 13. Data kinetika inhibisi suhu 40°C ............................................. 73 Lampiran 14. Data kinetika inhibisi suhu 50°C ............................................. 74 Lampiran 15. Data kinetika inhibisi suhu 60°C ............................................. 75

xvii

I. PENDAHULUAN A. LATAR BELAKANG Sukrosa,

dengan

nama

sistematisnya

β-D-fructofuranosyl-α-D-

glucopyranoside termasuk kelompok disakarida nonpereduksi. Senyawa organik ini merupakan sejenis karbohidrat yang manis, putih dan termasuk bahan dasar makanan. Sumber sukrosa umumnya didapatkan dari nira, seperti nira tebu, nira kelapa, nira siwalan maupun dari bit. Kandungan sukrosa dalam masing-masing nira tersebut berbeda. Nira tebu mengandung 14 - 20% sukrosa, nira kelapa mengandung 15 - 20% sukrosa dan nira siwalan mengandung 10 - 15% sukrosa. Sukrosa banyak digunakan untuk berbagai keperluan dalam industri, namun kerusakan sukrosa mudah terjadi. Proses degradasi sukrosa menjadi gula invert, disebut juga gula pereduksi (glukosa dan fruktosa) sering terjadi karena lamanya waktu menunggu sebelum nira tebu diproses di industri gula. Selain degradasi sukrosa, senyawa-senyawa hasil degradasi sukrosa tersebut dapat mengganggu proses kristalisasi pada industri gula (sukrosa), sehingga dapat menurunkan rendemen gula sukrosa. Astawan (2001) menyatakan bahwa pembentukan gula invert juga tidak diharapkan pada pengolahan gula semut. Jika kadar gula pereduksinya lebih dari 3 persen maka gula yang dihasilkan akan menjadi lembek dan sangat higroskopis. Kerusakan gula atau sukrosa dapat disebabkan oleh aktivitas enzim, mikroorganisme ataupun perlakuan proses (misalnya asam, suhu tinggi, dan lainnya). Invertase, merupakan salah satu enzim yang dihasilkan pada nira tebu atau hasil aktivitas ekstraseluler mikroorganisme yang turut memicu kerusakan sukrosa. Aktivitas invertase pada ekstrak nira tebu adalah 417.6 unit, sedangkan aktivitas spesifiknya 2.86 unit/mg (Rahman, 2004). Upaya penghambatan perlu dilakukan untuk mengurangi kerusakan sukrosa, salah satunya dengan menurunkan aktivitas invertase yang mendegradasi sukrosa. Upaya penghambatan laju kerusakan sukrosa melalui penurunan aktivitas invertase telah dilakukan dengan perlakuan suhu, tekanan serta

penambahan inhibitor. Cavaille dan Didier (1996) mengkombinasikan perlakuan tekanan tinggi dengan suhu untuk menginaktivasi invertase, sedangkan Causette et al. (1998) melakukan inaktivasi enzim dengan menggunakan gelembung gas inert. Akan tetapi, perlakuan suhu dan tekanan yang tinggi akan mempengaruhi kualitas produk (sukrosa) akibat terjadinya reaksi lain yang tidak diinginkan (lateral reaction). Inhibitor invertase juga ditemukan di dalam umbi kentang (Ewing et al., 1977 dan Pressey, 1966), tembakau, dan tomat (Pressey ,1994 dan Weil et al., 1994 dalam Greiner et al., 1998). Inhibitor dari bahan alami tersebut juga memiliki kelemahan, yaitu masih terdapat bahan lain selain inhibitor, bahkan mengandung invertase. Jenis inhibitor lain yang dapat menghambat aktivitas invertase adalah beberapa jenis garam logam, terutama HgCl2, FeCl2, CuCl2, dan CdCl2, yang dapat menurunkan aktivitas hingga 45-99% (Rahman et al., 2004). Terdapat garam logam lain, seperti CuSO4 yang juga tersusun dari kation logam bivalen. Penggunaan garam logam ini memerlukan kondisi tertentu agar dihasilkan kinerja inhibisi invertase yang optimal. Perubahan faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim, seperti konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan perlu dilakukan pada saat garam logam CuSO4 ditambahkan. Perlakuan tersebut diharapkan dapat menghasilkan profil inhibisi aktivitas invertase dalam mendegradasi sukrosa serta diperoleh model kinetika inhibisi yang penting untuk keperluan rekayasa proses. B. TUJUAN Adapun tujuan penelitian ini antara lain untuk menentukan: 1. Pengaruh perubahan pH, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, suhu inkubasi dan lama pemanasan dengan adanya penambahan CuSO4 terhadap degradasi sukrosa 2. Parameter kinetika (KM dan Vmaks) laju degradasi sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4

2

II. TINJAUAN PUSTAKA A. SUKROSA Sukrosa (glucose-1,2 fructose) merupakan pemanis yang banyak dikonsumsi dalam kehidupan manusia. Salah satu sumber sukrosa terpenting adalah tebu karena mengandung sukrosa hingga 20% (Glazer dan Nikaido, 1995 dalam Filho 1999). Sukrosa, dikenal sebagai gula meja (table sugar), merupakan disakarida yang terbentuk dari satu molekul α-D-glukosa dan satu molekul β-D-fruktosa yang dihubungkan oleh ikatan α-1,2-glikosidik (Rahman et al., 2004). Degradasi sukrosa dapat terjadi melalui hidrolisis asam atau secara enzimatis oleh invertase (Monsan et al., 1984 dalam Filho et al., 1999). Degradasi secara enzimatis terjadi ketika ikatan α-1,2-glikosidik dihidrolisis oleh enzim invertase (D-fructofuranosidase, EC 3.2.1.26) atau sucrose synthase (UDP glucose: D-fructose 2-D-glucosyltransferase, EC 2.4.1.13). Hidrolisis sukrosa menghasilkan campuran glukosa dan fruktosa yang disebut dengan gula invert (invert sugar) (Rahman et al., 2004). Reaksi hidrolisis sukrosa oleh invertase (juga disebut sebagai sucrase atau saccharose) dapat dilihat pada Gambar 1.

H

Gambar 1. Reaksi hidrolisis sukrosa oleh invertase B. INVERTASE Sistem tatanama untuk invertase adalah beta-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26), menunjukkan bahwa reaksi dikatalisasi oleh enzim ini adalah reaksi

hidrolisis (Wang, 2002). Invertase terdapat dalam jumlah yang beragam pada tanaman maupun hewan dengan varietas yang luas. Sumber utama invertase berasal dari ragi (yeast) dan fungi lainnya. Reed (1966) dalam Pancoast dan Junk (1980) menyatakan bahwa ragi Saccharomyces cerevisiae dan S. carlsbergensis merupakan sumber utama penghasil invertase untuk aplikasi industri. Aspergillus orizae dan A. Niger adalah fungi yang juga merupakan sumber invertase. Tanaman penghasil enzim ini antara lain tebu (Rahman et al., 2004), buah mangga (Rahman et al., 2001), buah anggur (Nakanishi et al., 1990), buah tomat (Konno et al., 1993 dalam Rahman et al., 2001), padi (Isla et al., 1995) dan umbi kentang (Pressey et al., 1966). Berbeda dengan sebagian besar enzim, invertase memiliki aktivitas yang relatif tinggi pada kisaran pH yang luas antara 3.5 sampai 5.5, dengan aktivitas optimum pada pH 4.5. Aktivitas maksimum dicapai pada suhu 55°C. Nilai Michaelis-Menten untuk jenis enzim yang berbeda bervariasi, tetapi kebanyakan enzim memiliki nilai KM antara 2 mM – 5 mM (Wang, 2002). C. AKTIVITAS DAN STABILITAS ENZIM Aktivitas enzim didefinisikan sebagai kecepatan pengurangan substrat atau kecepatan pembentukan produk pada kondisi optimum. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai satu mikromol (µmol; 10-6 mol) substrat yang bereaksi atau produk yang dikatalisis setiap menit (Rodwell, 1981). Aktivitas enzim dapat dipengaruhi oleh konsentrasi substrat, pH, dan suhu. Setiap enzim berfungsi optimal pada suhu, pH dan konsentrasi substrat tertentu. Konsentrasi substrat yang rendah menyebabkan daerah aktif pada enzim tidak semuanya terikat pada substrat. Terdapat suhu optimal dimana reaksi berlangsung sangat cepat. Ketika suhu di atas suhu optimal, kecepatan reaksi menurun tajam karena enzim sebagai protein akan terdenaturasi, sedangkan pada suhu terlalu rendah, beberapa enzim tidak dapat bekerja. Aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh pH karena sifat ionik gugus karboksil dan gugus amino mudah dipengaruhi pH (Pelczar dan Chan, 1986). Enzim merupakan salah satu jenis protein globular. Stabilitas dan aktivitas enzim ditentukan oleh konformasi tiga dimensinya yang dipengaruhi

4

oleh struktur tertier protein. Terdapat empat jenis interaksi yang menstabilkan struktur tersebut pada suhu, pH dan konsentrasi ion normal, antara lain ikatan hidrogen, gaya tarik ionik, interaksi hidrofobik dan jembatan kovalen. (Lehninger, 1988). D. FAKTOR – FAKTOR YANG MEMPENGARUHI LAJU DEGRADASI SUKROSA Laju degradasi sukrosa dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain suhu, pH, lama pemanasan, konsentrasi substrat dan konsentrasi enzim. Laju degradasi sukrosa dapat diperlambat atau bahkan dihambat dengan penambahan inhibitor. 1. Pengaruh Suhu Peningkatan suhu pada reaksi enzim memiliki dua pengaruh yang tidak seimbang. Pengaruh tersebut adalah peningkatan laju reaksi dan di sisi lain dapat menyebabkan inaktivasi enzim (Stauffer, 1989). Aktivitas enzim invertase meningkat secara perlahan dengan kenaikan suhu. Suhu maksimum aktivitas invertase adalah 60°C, peningkatan suhu lebih lanjut menyebabkan penurunan laju degradasi sukrosa (Rahman et al., 2004). Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase di dalam tebu dapat dilihat pada Gambar 2.

Aktivitas relatif (%)

120 100 80 60 40 20 0 0

20

40

60

80

100

suhu (oC)

Gambar 2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004) 2. Pengaruh pH Invertase memberikan aktivitas maksimum pada pH 7.2. Aktivitas turun perlahan pada pH asam, tetapi turun secara cepat pada pH basa.

5

Observasi ini menunjukkan bahwa enzim relatif stabil pada kisaran pH asam sampai pH netral (Rahman et al., 2004). Nilai pH optimum invertase dari benih padi adalah 7.0 (Chungliang et al. dalam Rahman et al., 2004). Gambar 3 menunjukkan pengaruh pH terhadap aktivitas invertase pada tebu (Rahman et al., 2004).

Gambar 3. Pengaruh nilai pH terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004) Stauffer (1989) menyatakan bahwa perubahan pada laju reaksi enzim oleh pH mungkin dapat disebabkan oleh tiga faktor, yakni: a. Protonasi sisi aktif rantai asam amino pada kompleks enzimsubstrat (ES) berubah, menghasilkan perubahan kemampuan ES dalam menghasilkan produk. b. Perubahan muatan ion pada molekul substrat atau sisi aktif enzim yang dapat mengubah kecenderungan dari dua molekul tersebut untuk membentuk kompleks ES. c. Perubahan pH dari netral dapat melemahkan stabilitas protein, mempercepat denaturasi enzim yang bersifat irreversible. 3. Pengaruh Konsentrasi Substrat dan Enzim Invertase dapat mengkatalisis sukrosa pada konsentrasi di atas 59%wt/vol. Peningkatan konsentrasi sukrosa lebih lanjut sampai 80%wt/vol menurunkan aktivitas enzim secara signifikan, mungkin disebabkan oleh konsentrasi air rendah, inhibisi oleh substrat atau agregasi substrat (Somiari dan Bielecki, 1995 dalam Filho et al., 1999). Brown pada tahun 1902 melakukan penelitian tentang invertase, menyatakan bahwa jika konsentrasi sukrosa lebih tinggi daripada

6

konsentrasi enzim, kecepatan reaksi menjadi tidak tergantung pada konsentrasi sukrosa (Pancoast, 1980). Aktivitas enzimatik akan menurun pada konsentrasi substrat yang tinggi dan cenderung membentuk asimtot. Jenis penghambatan ini akan membentuk kompleks (dead end complex), satu sisi molekul substrat terikat pada enzim dan molekul substrat lain terikat pada sisi lain (sekunder) enzim (Suryani dan Mangunwidjaya, 2002). 4. Pengaruh Perubahan Kondisi Lingkungan Inaktivasi enzim dan mikroorganisme dapat dilakukan dengan perlakuan suhu yang tinggi. Akan tetapi perlakuan suhu yang tinggi juga dapat menyebabkan perubahan produk, sehingga kualitasnya menurun. Metode lain yang dapat digunakan untuk menurunkan aktivitas enzim dan mikroorganisme tanpa merusak produk yang diinginkan adalah dengan cara pemberian gelembung gas inert. Pemberian gelembung gas inert nitrogen mampu menurunkan aktivitas enzim (Causette et al., 1998). 5. Pengaruh Inhibitor Banyak bahan yang dapat mengubah aktivitas suatu enzim dengan menggabungkannya dalam suatu jalur yang mempengaruhi ikatan substrat. Bahan-bahan yang mereduksi aktivitas suatu enzim dengan cara ini dikenal sebagai inhibitor. Inhibitor terbagi menjadi dua jenis, yakni inhibitor reversible yang membentuk kompleks dinamik dengan enzim dan inhibitor irreversible yang dikenal dengan racun pengkatalis (contohnya beberapa logam berat, seperti merkuri, Hg2+). Inhibitor mengikat molekul enzim dan menurunkan aktivitasnya (Flickinger dan Drew, 1999). Stauffer (1989) juga membagi inhibitor menjadi 3 golongan berdasarkan affinitasnya terhadap molekul enzim sebagai berikut: a. Inhibitor beraffinitas rendah Molekul inhibitor ini memiliki konstanta affinitas antara 1 M hingga 106 M. Inhibitor ini sering menyerupai substrat dengan kereaktifan yang biasa.

7

b. Inhibitor beraffinitas tinggi Molekul inhibitor ini memiliki konstanta affinitas antara 106 M hingga 1012 M. Inhibitor ini menjadi transisi dari kompleks enzim-substrat menjadi kompleks enzim-produk atau sebagai molekul yang mengikat kuat pada sisi aktif enzim. c. Inhibitor irreversible Molekul inhibitor ini membentuk ikatan kovalen dengan molekul pada sisi aktif enzim. Ikatan yang dibentuk bersifat stabil. Reaksi lebih jauh lagi dari enzim dengan inhibitor ini (inhibitor berlebih) menyebabkan enzim menjadi tidak aktif. Penambahan garam logam dan senyawa kimia lainnya dapat menyebabkan peningkatan atau penurunan aktivitas enzim. Peningkatan dan penurunan aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh jenis garam logam ataupun senyawa kimia yang ditambahkan. Pengaruh penambahan beberapa jenis garam logam dan senyawa kimia lainnya terhadap aktivitas enzim dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Pengaruh jenis garam logam dan bahan kimia pada konsentrasi 0.005 M terhadap aktivitas invertase No. Garam/bahan kimia 1 Tanpa bahan tambahan 2 MgCl2 3 KCl 4 NaCl 5 MnCl2 6 CaCl2 7 HgCl2 8 CuCl2 9 FeCl2 10 ZnCl2 11 CdCl2 12 AgNO3 13 AlCl3 14 EDTA 15 Glukosa 16 Asam asetat Sumber: Rahman et al. (2004)

Aktivitas relatif (%) 100.00 115.00 110.82 120.00 120.00 114.24 1.02 30.00 20.25 68.27 55.26 80.00 78.00 52.74 76.00 45.30

8

Hampir semua ion logam selalu berinteraksi dengan kompleks protein secara cepat. Interaksi kompleks antara ion logam dengan protein ada dua bentuk: 1. Metaloenzim Ikatan ini merupakan subkelas dari metaloprotein. Protein berikatan kuat dengan ion logam sehingga dianggap sebagai ikatan yang sangat stabil dan lama. Ion logam menjadi bagian dari struktur protein dan hanya dapat dilepas dalam keadaan tertentu. 2. Metal protein Sistem ikatan ini memungkinkan ion logam mudah saling bertukar dengan protein lain (reversible). Laju pertukaran ion logam dengan kondisi larutan lingkungannya sangat mudah. Ion logam sulit dalam menempati sisi protein yang tepat karena ion logam ini bersifat sangat labil. Kekuatan ikatan ion logam dengan protein tergantung pada muatan kation yang mengikatnya. Semakin tinggi muatan kation dari logam maka semakin kuat ikatannya dengan protein, sehingga ikatan tersebut lebih stabil dan konstan (Darmono, 1995). Hochster dan Quastel (1963) menyatakan, ikatan ion logam bivalen dengan grup sulfhidril yang terdapat pada enzim kemungkinan terjadi sebagai berikut: E

dll

S E-SH

E-S- + H+

E-S -M +

E-SH

M 2+

E-SH

E-S- + H+

Gambar 4. Ikatan ion logam bivalen (M2+) dan grup sulfhidril Keterangan: E-SH = enzim yang memiliki grup sulfhidril H+

= ion H+ yang terlepas

M2+ = ion logam bivalen

9

E. KINETIKA ENZIMATIK Enzim merupakan katalisator sejati. Molekul ini dapat meningkatkan kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa adanya enzim akan berlangsung lambat. Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim sangat dipengaruhi oleh berbagai konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi awal apabila konsentrasi enzim dijaga konstan (Lehninger, 1988). Setiap enzim memiliki sifat yang khas, dinyatakan dalam suatu tetapan yaitu KM (tetapan Michaelis-Menten). Hampir semua enzim memiliki kurva kecepatan reaksi dengan bentuk umum yang hampir sama yaitu hiperbola. Oleh sebab itu, Michaelis-Menten mendefinisikan suatu tetapan untuk menyatakan hubungan antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatik. KM didefinisikan sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Persamaan MichaelisMenten adalah: V0 =

Vmaks [S] KM + [S]

Keterangan: V0

= kecepatan awal pada konsentrasi substrat [S]

Vmaks = kecepatan maksimum KM

= tetapan Michaelis-Menten enzim pada substrat tertentu

[S]

= konsentrasi substrat

Gambar 5. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik (Lehninger, 1988) Nilai KM dan Vmaks sulit untuk ditentukan secara tepat dari grafik sederhana yang ditunjukkan pada Gambar 5, karena Vmaks hanya diduga dan

10

tidak dapat diketahui nilai yang sebenarnya. Nilai KM yang lebih tepat dapat diperoleh dengan memetakan data yang sama dengan cara yang berbeda, yakni pemetaan kebalikan-ganda, didapat dari transformasi aljabar persamaan Michaelis-Menten. Hasil transformasi persamaan Michaelis-Menten dikenal dengan persamaan Lineweaver-Burk. 1 = Vo

KM

1

1 +

Vmaks [S]

Vmaks

Selain dapat menentukan Vmaks secara lebih tepat, persamaan ini bermanfaat dalam menganalisa penghambatan enzim (Lehninger, 1988). Persamaan Lineaweaver-Burk menghasilkan kurva yang ditunjukkan pada Gambar 6.

Gambar 6. Kurva Lineweaver-Burk Kinetika inhibisi enzim menyangkut penentuan fungsi laju reaksi terhadap konsentrasi substrat dengan inhibitor pada berbagai konsentrasi. Kurva Lineweaver-Burk memungkinkan untuk menentukan jenis inhibisi yang bersifat reversible, antara lain sebagai berikut. 1. Inhibisi Kompetitif Inhibitor pada model inhibisi ini bersaing dengan substrat untuk memasuki sisi aktif enzim. Struktur kimia inhibitor umumnya menyerupai substrat. Oleh sebab itu, inhibitor tersebut dapat berikatan secara reversible dengan enzim (Rodwell, 2000). Mekanisme inhibisi kompetitif dapat dilihat pada Gambar 7 .

11

±I

EI (inaktif)

±S

ES (aktif)

E E+P

Gambar 7. Mekanisme inhibisi kompetitif Penyajian garis lurus pada kurva Lineweaver-Burk memotong sumbu ordinat pada titik yang sama. Vmaks tidak dipengaruhi oleh inhibitor (Suryani dan Mangunwidjaja, 2002). Kurva Lineweaver-Burk untuk model inhibisi kompetitif ditunjukkan pada Gambar 8. Ditambah inhibitor 1/V1 Tanpa inhibitor

-1/KM

-1/K’M 1/Vmaks 0

1/[S]

Gambar 8. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi kompetitif 2. Inhibisi Nonkompetitif Model

inhibisi

nonkompetitif

tidak

menunjukkan

adanya

persaingan antara inhibitor dengan substrat. Struktur inhibitor biasanya tidak atau sedikit menyerupai struktur substrat. Inhibitor nonkompetitif menurunkan kecepatan reaksi maksimal yang diperoleh pada pemberian sejumlah enzim (Vmaks yang lebih rendah), tetapi biasanya tidak mempengaruhi nilai KM, ditunjukkan oleh kurva Lineweaver-Burk pada Gambar 10. Mekanisme reaksi inhibisi nonkompetitif dapat dilihat pada Gambar 9.

12

±I

EI

±S EIS

E ±S

ES

E+P

Gambar 9. Mekanisme inhibisi nonkompetitif

Ditambah inhibitor 1/V1 Tanpa inhibitor -1/Vmaks -1/KM 1/Vmaks 0

1/[S]

Gambar 10. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi nonkompetitif 3. Inhibisi Unkompetitif Inhibisi ini terjadi jika kompleks EI hilang, tetapi kompleks EIS terbentuk. Inhibitor mengikat langsung pada kompleks enzim-substrat (ES), bukan enzim bebas (Flickinger dan Drew, 1999). Mekanisme inhibisi unkompetitif ditunjukkan pada Gambar 11. E

±S

ES

±I

EIS

E+P

Gambar 11. Mekanisme inhibisi unkompetitif

13

Inhibitor yang bersifat unkompetitif akan mempengaruhi fungsi enzim, tetapi tidak terhadap ikatannya dengan substrat. Plot LineweaverBurk untuk inhibisi unkompetitif adalah linier dengan kemiringan atau slope KM/Vmaks seperti pada reaksi tanpa inhibitor, dapat dilihat pada Gambar 12 (Simanjutak dan Silalahi, 2003). Ditambah inhibitor 1/V1

Tanpa inhibitor

-1/Vmaks 1/Vmaks

-1/KM

0

1/[S]

Gambar 12. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi unkompetitif

14

III. METODOLOGI

A. ALAT Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain peralatan gelas (pipet tetes, corong, tabung reaksi); peralatan ukur (pipet mikro, pipet volumetri,

labu takar, termometer, spektrofotometer, stopwatch dan

timbangan); serta peralatan pendukung (water bath dan vortex). B. BAHAN Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah sukrosa, invertase (Sigma-Aldrich 19253: pH 4.5, 55°C, 355 units/mg solid), dan larutan CuSO4. Sedangkan bahan yang digunakan untuk analisa adalah NaOH 0.1 N, HCl 0.1 N, indikator PP, glukosa, fruktosa, buffer pH 3-11, pereaksi DNS (dinitro salicylic acid) dan aquades. C. METODE PENELITIAN Metode penelitian ini dibagi menjadi tahapan penelitian dan prosedur percobaan. Tahapan penelitian menjelaskan tentang langkah-langkah yang harus dilalui untuk mencapai tujuan penelitian, sedangkan prosedur percobaan merupakan urutan kegiatan dan tatacara yang secara teknis dikerjakan dalam setiap tahapan penelitian. 1. Tahapan Penelitian Penelitian dilakukan dalam empat tahap, yaitu (1) Penentuan aktivitas

invertase,

(2)

Penentuan

pengaruh

konsentrasi

CuSO4,

(3) Penentuan hubungan perubahan faktor konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan dengan adanya penambahan CuSO4 terhadap degradasi sukrosa, (4) Penentuan parameter kinetika (KM dan Vmaks) laju degradasi sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4. Diagram alir tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 13.

Mulai

Penentuan aktivitas invertase

Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO4

Penentuan pengaruh perubahan faktor dengan adanya penambahan CuSO4 terhadap degradasi sukrosa

Penentuan parameter kinetika (KM dan Vmaks) laju degradasi sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4

Selesai

Gambar 13. Diagram alir tahapan penelitian a. Penentuan aktivitas invertase Aktivitas enzim diukur berdasarkan definisi satu unit aktivitas invertase, yaitu banyaknya invertase yang dapat membebaskan 1 mikromol gula pereduksi dari substrat sukrosa selama 1 menit pada kondisi percobaan. Kondisi yang digunakan adalah kondisi optimum invertase, yaitu pada suhu 55°C, di dalam larutan buffer asetat pH 4.5. Slope yang diperoleh dari gula pereduksi yang dihasilkan pada setiap konsentrasi yang diujikan merupakan besarnya aktivitas enzim. b. Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO4 CuSO4 dengan konsentrasi yang berbeda diujikan pada reaksi invertase dengan sukrosa. Nilai gula pereduksi yang lebih rendah dari kontrol (perlakuan invertase tanpa CuSO4) menunjukkan adanya inhibisi, sebaliknya jika lebih tinggi dari kontrol menunjukkan aktivasi. Pengaruh yang berbeda nyata diukur berdasarkan analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan.

16

c. Penentuan pengaruh hubungan faktor dengan adanya penambahan CuSO4 terhadap degradasi sukrosa Uji karakterisasi invertase yang dilakukan antara lain pengaruh konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan dengan ditambahkan CuSO4. Pengaruh yang diidentifikasi adalah adanya kenaikan atau penurunan konsentrasi gula pereduksi pada setiap taraf yang diujikan berdasarkan analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan. Inhibisi invertase diukur berdasarkan perbandingan dengan perlakuan tanpa CuSO4, dinyatakan dalam bentuk persen. d. Penentuan parameter kinetika laju degradasi (KM dan Vmaks) sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4 Penentuan parameter kinetika dilakukan pada tiga suhu yang berbeda dan pH tertentu yang optimum bagi inhibisi invertase. Model kinetika inhibisi diidentifikasi berdasarkan jenis perubahan nilai parameter kinetika (KM dan Vmaks) yang diperoleh dari plot LineweaverBurk. Nilai KM diperoleh dari perpotongan garis linier dengan sumbu x, sedangkan nilai Vmaks diperoleh dari perpotongan garis linier dengan sumbu y. 2. Prosedur Percobaan Prosedur percobaan yang dilakukan pada penelitian ini adalah sebagai berikut. a. Penentuan aktivitas invertase Larutan invertase 0.01 g/l dan larutan sukrosa 50 g/l disiapkan pada tabung reaksi yang terpisah. Masing-masing tabung reaksi kemudian diinkubasi di dalam water bath suhu 55°C sehingga suhu tersebut dicapai oleh larutan di dalam tabung reaksi. Selanjutnya sukrosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi invertase dan mulai diukur waktu reaksi (t = 0). Reaksi dihentikan pada masing-masing waktu yang diujikan, yaitu 0, 30, 60, 90, 120, 180, 240, dan 300 (detik), dengan memasukkan 2 ml pereaksi DNS. Kemudian tabung tersebut dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 95°C. Setelah

17

10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. b. Penentuan konsentrasi inhibitor Larutan CuSO4 dibuat dalam beberapa konsentrasi, 0 mM3.75 mM. Masing-masing larutan CuSO4 dalam berbagai konsentrasi dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dan divortex. Selanjutnya ditambahkan 1 ml invertase 0.01 g/l pada masing-masing tabung reaksi (t = 0). Pada saat t = 5 menit, reaksi dihentikan dengan perekasi DNS. Prosedur untuk menghentikan reaksi mengikuti prosedur sebelumnya pada penentuan aktivitas. c. Penentuan pengaruh perubahan faktor Penentuan pengaruh perubahan faktor dilakukan dengan maupun tanpa adanya penambahan inhibitor. Prosedur yang dilakukan pada perlakuan tanpa inhibitor sama halnya dengan pengujian pada karakterisasi invertase dengan inhibitor, hanya tidak ditambahkan larutan CuSO4. Total volume larutan dalam tiap tabung reaksi tetap sama yakni 2 ml, sehingga volume yang ditambah adalah aquades dan buffer. 1. Pengaruh konsentrasi enzim Larutan invertase 0.01 g/l disiapkan pada berbagai konsentrasi sebanyak 0.0 - 0.83 ml dan ditambahkan larutan buffer pH 7 hingga volumenya 1 ml. Kemudian ditambahkan larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml pada masing-masing tabung reaksi. Selanjutnya larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 1 ml dimasukkan pada tiap-tiap tabung tersebut, dan mulai dihitung waktunya (t = 0 menit). Pada waktu t = 5 menit, dimasukkan 2 ml pereaksi DNS untuk menghentikan reaksi. Kemudian tabung tersebut dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 95°C selama 10 menit. Setelah 10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.

18

2. Pengaruh konsentrasi substrat Larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml dimasukkan pada masing-masing tabung reaksi yang berisi larutan sukrosa 50 g/l dalam konsentrasi yang berbeda. Kemudian aquades ditambahkan hingga volume campuran mencapai 2.0 ml. Larutan invertase 0.01 g/l sebanyak 1.0 ml dimasukkan ke masing-masing tabung reaksi

(t = 0 menit). Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti

prosedur sebelumnya. 3. Pengaruh pH Invertase 0.01g/l sebanyak 1.0 ml dilarutkan dengan menggunakan buffer pH yang bervariasi (pH 3 - 11) pada tabung reaksi. Selanjutnya masing-masing tabung reaksi ditambahkan larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml dan 0.9 ml larutan sukrosa 50 g/l

(t = 0 menit). Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti

prosedur sebelumnya. 4. Pengaruh suhu Penangas air mulai suhu 0 - 90oC disiapkan dengan interval suhu 10oC. Pada setiap kelipatan suhu 10oC tersebut, diuji aktivitas invertase. Larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml, 0.4 ml air dan larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dimasukkan ke dalam setiap tabung untuk setiap kelipatan suhu 10oC. Tabung reaksi selanjutnya dimasukkan ke dalam penangas air pada rentang suhu tersebut dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian ditambahkan invertase 0.01 g/l sebanyak 1.0 ml ke dalam masing-masing tabung reaksi (t = 0 menit) pada suhu inkubasi. Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya. 5. Pengaruh lama pemanasan Larutan invertase 0.01 g/l sebanyak 1.0 ml dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi dan dipanaskan dengan waktu yang bervariasi dari 0 - 5 (menit). Setelah waktu yang diperlukan dicapai, tabung reaksi dikeluarkan dari water bath dan didinginkan.

19

Setelah itu larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml dan larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dimasukkan ke dalamnya (t = 0 menit). Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya. d. Penentuan parameter kinetika Kondisi inhibisi invertase oleh CuSO4 yang optimum dipilih (suhu dan pH) yang kemudian pada selang konsentrasi substrat tertentu diuji aktivitasnya dalam menghidrolisis sukrosa.. Hasil yang diperoleh kemudian diplotkan pada kurva kinetika (Lineweaver-Burk), dan dihitung parameter kinetikanya (KM dan Vmaks) serta dibandingkan antara perlakuan tanpa CuSO4 dan dengan penambahan CuSO4. Nilai KM dan Vmaks dapat diperoleh dari persamaan linier plot kurva Lineweaver-Burk. Slope yang diperoleh merupakan KM/Vmaks, sedangkan intersep menunjukkan 1/Vmaks. Bentuk kurva LineweaverBurk yang diperoleh menunjukkan model kinetika ihibisi. Penentuan model kinetika menggunakan alat bantu program SigmaPlot 2004 for Windows Version 9.01. Program ini menentukan model kinetika inhibisi yang paling tepat berdasarkan nilai r2 tertinggi.

20

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN Kemampuan hidrolisis sukrosa oleh invertase dilakukan dengan mengukur aktivitas enzim tersebut, sedangkan kemampuan inhibisi garam logam CuSO4 dilihat pada setiap perubahan faktor yang berpengaruh (konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan) terhadap aktivitas enzim serta perubahan parameter kinetika (KM dan Vmaks) inhibisi degradasi sukrosa. A. Aktivitas Invertase Penentuan aktivitas invertase penting dilakukan untuk mengetahui seberapa besar perubahan mikromol sukrosa menjadi gula pereduksi setiap menit reaksi. Slope yang diperoleh dari persamaan garis linier adalah 3.2267, yang berarti bahwa invertase mampu menghidrolisis sukrosa 3.2267 µM menjadi glukosa dan fruktosa dalam satu detik atau perubahan 0.3872 µmol sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa dalam satu menit. Aktivitas invertase digambarkan dalam bentuk kurva pada Gambar 14.

konsentrasi gula pereduksi (uM)

1200 1000 800 600 400 200 0 0

50

100

150

200

250

300

350

lama reaksi (detik)

Gambar 14. Kurva aktivitas invertase berdasarkan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 25 g/l. Persamaan garis linier y = 3.2267 x, r2 = 0.9721

B. Pengaruh Konsentrasi CuSO4 Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO4 sebagai inhibitor dilakukan berdasarkan uji daya inhibisi CuSO4 terhadap aktivitas invertase. Adanya inhibisi invertase ditunjukkan dengan menurunnya gula pereduksi yang dihasilkan dari hidrolisis sukrosa oleh invertase. Analisis sidik ragam menunjukkan bahwa konsentrasi yang diujikan memberikan pengaruh yang nyata terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dapat dilihat pada Lampiran 2. Konsentrasi gula pereduksi tertinggi diperoleh dari penambahan larutan CuSO4 1.25 mM sebesar 2064.5 µM, sedangkan konsentrasi gula pereduksi terkecil ditunjukkan oleh penambahan larutan CuSO4 3.75 mM sebesar 1052 µM. Kurva pengaruh konsentrasi CuSO4 terhadap aktivitas invertase dapat dilihat pada Gambar 15.

konsentrasi gula pereduksi (uM)

2500

2000

1500

1000

500

0 0

0.75

1

1.25

1.5

1.875

2.25

2.5

3.75

konsentrasi CuSO4 (mM)

Gambar 15. Kurva pengaruh konsentrasi CuSO4 terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit Hasil uji daya inhibisi menunjukkan bahwa tidak semua konsentrasi CuSO4 yang diujikan menunjukkan adanya penghambatan aktivitas invertase. Gula pereduksi meningkat signifikan dengan penambahan larutan CuSO4 0.75 mM. Hal ini menunjukkan bahwa CuSO4 pada konsentrasi yang rendah tidak memberikan pengaruh inhibisi terhadap aktivitas invertase. CuSO4 mempunyai peranan sebagai aktivator invertase pada konsentrasi yang relatif

22

kecil. Perubahan muatan pada enzim akibat penambahan CuSO4 menyebabkan enzim mudah dalam mengikat substrat. Hal ini sesuai dengan teori bahwa logam yang ditambahkan dalam bentuk garam organik memberikan kestabilan enzim dengan cara menetralkan kelebihan muatan elektrostatik yang melindungi molekul enzim sehingga konformasi enzim dapat dipertahankan (Monsan dan Combess, 1984). Kation seperti Cu (II) kemungkinan terlibat langsung dalam proses katalisis enzim, yaitu dalam pengikatan substrat ke sisi aktif enzim, dalam menjaga konformasi enzim dan kestabilan substrat (Whitaker, 1996). Berdasarkan Gambar 15, besarnya penghambatan setelah aktivitas invertase mencapai maksimum meningkat sedikit demi sedikit hingga akhirnya mengalami inhibisi pada konsentrasi CuSO4 2.5 mM. Kemampuan aktivasi enzim menurun dengan semakin tingginya konsentrasi CuSO4. Besarnya inhibisi ini berbeda nyata dengan kontrol berdasarkan uji lanjut Duncan, dapat dilihat pada Lampiran 2. Gula pereduksi yang dihasilkan pada konsentrasi CuSO4 2.5 mM adalah 1503.25 µM, sedangkan invertase tanpa CuSO4 (kontrol) menghasilkan gula pereduksi 1669.5 µM, sehingga inhibisi yang diberikan sebesar 9.96 %. Inhibisi terhadap aktivitas invertase disebabkan oleh penghambatan substrat untuk memasuki daerah katalitik enzim dimana kation logam Cu (II) terikat pada sisi aktif enzim. Inhibisi dapat terjadi pada sisi aktif enzim maupun sisi sekunder enzim. Jika inhibitor terikat pada sisi aktif enzim, substrat tidak dapat membentuk kompleks dengan enzim, sehingga produk tidak akan terbentuk. Inhibisi juga dapat terjadi selain pada sisi aktif enzim, yaitu pada sisi sekunder enzim. Pengikatan inhibitor pada sisi sekunder enzim menyebabkan perubahan konformasi enzim, sehingga affinitas enzim pada substrat berkurang. Inhibisi pada fungsi katalitik enzim dapat terjadi pada residu asam amino, yang dapat terletak pada sisi aktif enzim. Hal ini sesuai dengan teori bahwa grup sulfhidril terdapat pada sisi aktif maupun di dekat sisi aktif invertase yang penting dalam menjalankan fungsi katalitik enzim tersebut (Sturm, 1999 dalam Hsiao et al., 2001).

23

Inhibisi terhadap aktivitas invertase juga disebabkan oleh adanya asam yang terbentuk dari anion SO42- yang berikatan dengan kation H+ dari grup sulfhidril invertase membentuk senyawa asam H2SO4. Penambahan CuSO4 dengan konsentrasi yang lebih tinggi menyebabkan terbentuknya senyawa asam sulfat semakin banyak yang mengubah pH larutan menjadi lebih asam. Hal ini sesuai dengan teori bahwa ion H+ yang berlebihan mempengaruhi keseimbangan muatan pada sisi aktif enzim, sehingga kemampuan enzim untuk mengikat substrat berkurang (Rodwell, 1981). Jika konsentrasi CuSO4 dinaikkan maka inhibisi akan semakin besar, seperti yang ditunjukkan oleh penambahan konsentrasi CuSO4 3.75 mM. Inaktivasi bahkan dapat terjadi jika konsentrasi tersebut masih dinaikkan, karena semakin banyak grup sulfhidril invertase yang terikat oleh kation logam Cu (II) atau semakin banyak senyawa asam yang terbentuk. Hal ini membuktikan bahwa kation logam Cu (II) bersifat sangat reaktif terhadap grup sulfhidril pada kondisi konsentrasi yang tinggi. Hasil penelitian ini sesuai dengan teori bahwa pengaruh inhibisi dari ion-ion logam disebabkan oleh affinitas (kereaktifan) ion logam. Affinitas enzim terhadap ion logam berbeda disesuaikan dengan sifat ikatan spesifik grup enzim yang terlibat. Kereaktifan unsur-unsur atau senyawa untuk melakukan ikatan kompleks ditunjukkan oleh konstanta pembentukan (log k1) (Klotz, 1954). Konstanta pembentukan kation logam Cu (II) dengan gugus sulfida adalah 41.5 (Gurd dan Wilcox, 1954). C. Hubungan Pengaruh Perubahan Faktor Terhadap Degradasi Sukrosa Aktivitas invertase dalam mendegradasi sukrosa dipengaruhi oleh beberapa faktor. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim antara lain konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu inkubasi dan lama pemanasan. Perubahan faktor-faktor tersebut dengan penambahan CuSO4 dibahas sebagai berikut. 1. Pengaruh Konsentrasi Substrat Hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa perubahan konsentrasi

sukrosa

memberikan

pengaruh

yang

nyata

terhadap

konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dapat dilihat pada Lampiran 3.

24

Semakin tinggi konsentrasi sukrosa diberikan, semakin tinggi konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Hasil uji menunjukkan rentang gula pereduksi dari 0 µM hingga 2157 µM, dengan konsentrasi paling rendah pada perlakuan tidak diberikan sukrosa dan konsentrasi tertinggi pada sukrosa 20.75 g/l tanpa penambahan CuSO4. Hasil pengujian pengaruh perubahan konsentrasi sukrosa terhadap aktivitas invertase dapat dilihat pada Gambar 16.

konsentrasi gula pereduksi (uM)

2500

2000

1500

1000

500

0 0

4.25

8.25

12.5

16.75

20.75

konsentrasi sukrosa (g/l) Perlakuan konsentrasi substrat dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Perlakuan konsentrasi substrat tanpa CuSO4

Gambar 16. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi substrat terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit Peningkatan konsentrasi sukrosa meningkatkan gula pereduksi yang dihasilkan. Peningkatan terjadi dengan curam dari invertase yang tidak ditambahkan sukrosa (sukrosa 0 g/l) hingga sukrosa 12.5 g/l, baik pada perlakuan tanpa maupun dengan penambahan CuSO4. Rasio invertase terhadap sukrosa pada konsentrasi sukrosa 12.5 g/l adalah 1 : 2500. Selanjutnya, peningkatan secara landai terjadi dari konsentrasi sukrosa 12.5 g/l hingga 16.75 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 3350) pada perlakuan tanpa CuSO4. Hal ini disebabkan oleh enzim yang bekerja semakin aktif jika substrat yang diberikan semakin banyak, karena semakin banyak substrat yang berpeluang untuk berikatan dengan sisi aktif enzim. Lehninger (1988) menyatakan bahwa pada konsentrasi substrat

25

yang rendah, kecepatan reaksi akan sangat rendah, tetapi kecepatan ini akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi substrat. Aktivitas invertase menjadi tidak berbeda nyata dari konsentrasi sukrosa 16.75 g/l - 20.75 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 4150). Hal ini disebabkan karena hampir semua sisi aktif invertase telah berikatan dengan sukrosa membentuk kompleks enzim-substrat. Laju reaksi meningkat dengan nilai yang semakin kecil hingga akhirnya tercapai titik batas tertentu. Hal ini sesuai dengan teori bahwa bagaimanapun tingginya konsentrasi substrat yang diberikan setelah titik batas ini tercapai, kecepatan reaksi akan mendekati, tetapi tidak akan pernah mencapai garis maksimum. Pada batas ini disebut dengan kecepatan maksimum (Vmaks), enzim menjadi jenuh oleh substratnya dan tidak dapat berfungsi lebih cepat (Lehninger, 1988). Kedua perlakuan, baik tanpa maupun dengan penambahan CuSO4 menunjukkan pola aktivitas invertase yang hampir sama, hanya berbeda pada tingkat gula pereduksi yang dihasilkan. Konsentrasi CuSO4 mampu menghambat aktivitas invertase dari taraf konsentrasi sukrosa 4.25 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 850) hingga konsentrasi sukrosa tertinggi 20.75 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 4150). Besar inhibisi yang diberikan pada berbagai konsentrasi sukrosa, dapat dilihat pada Gambar 17. 9

50.0 45.0

8 37.2

35.0

7

31.1

6

30.0

5

25.0

4

20.0

3

13.0

15.0

9.2

10.0

2 1

2.4

5.0

subset

inhibisi (%)

40.0

0

0.0 0

4.25

8.25

12.5

16.75

20.75

konsentrasi sukrosa (g/l)

Gambar 17. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada konsentrasi substrat yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit

26

Perbedaan konsentrasi sukrosa berpengaruh nyata terhadap besarnya inhibisi aktivitas invertase berdasarkan analisis sidik ragam, dapat dilihat pada Lampiran 4. Inhibisi berbeda nyata ketika konsentrasi sukrosa dinaikkan dari sukrosa 0 g/l hingga 4.25 g/l. Penambahan CuSO4 menyebabkan kation logam Cu (II) terikat pada grup sulfhidril enzim invertase, sehingga inhibisi terjadi. Inhibisi tidak berbeda nyata dengan kenaikan konsentrasi sukrosa 8.25 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 1650). Hal ini menunjukkan bahwa kenaikan konsentrasi sukrosa menjadi 8.25 g/l belum menurunkan kemampuan inhibisi oleh CuSO4 0.125 mM. Kemampuan inhibisi turun secara tajam dengan kenaikan konsentrasi sukrosa menjadi 12.5 g/l. Hal ini disebabkan karena pada konsentrasi tersebut, laju pembentukan enzim-substrat pada perlakuan tanpa CuSO4 masih meningkat, sehingga menghasilkan nilai gula pereduksi yang tinggi di titik yang hampir sama dengan aktivitas enzim invertase dengan CuSO4 0.125 mM. Aktivitas invertase dengan penambahan CuSO4 0.125 mM pada rasio invertase terhadap sukrosa 1 : 2500 telah jenuh oleh substrat. Hal ini juga merupakan penyebab inhibisi kembali meningkat dengan kenaikan sukrosa dari 12.5 g/l hingga 16.75 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 3350). 2. Pengaruh Konsentrasi Enzim Hasil hidrolisis sukrosa semakin meningkat dengan kenaikan konsentrasi invertase, baik pada perlakuan tanpa CuSO4 maupun dengan penambahan CuSO4. Gula pereduksi yang dihasilkan berada pada rentang 80.75 µM hingga 1725.75 µM, dapat dilihat pada Gambar 18. Hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa konsentrasi enzim yang diujikan menunjukkan pengaruh nyata terhadap gula pereduksi yang dihasilkan. Hasil uji statistik tersebut dapat dilihat pada Lampiran 5.

27

konsentrasi gula pereduksi (uM)

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0

0.15

0.85

1.65

2.5

3.35

4.15

konsentrasi invertase (mg/l) Perlakuan konsentrasi enzim dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Perlakuan konsentrasi enzim tanpa CuSO4

Gambar 18. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi enzim terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, pH 7, lama reaksi 5 menit Aktivitas invertase pada konsentrasi enzim 0 mg/l hingga 0.15 mg/l (invertase : sukrosa = 1 : 1.67 x 105) tidak memberikan respon pengaruh yang berbeda nyata, baik pada perlakuan dengan mupun tanpa CuSO4. Kedua taraf konsentrasi enzim tersebut memiliki kemampuan yang hampir sama dalam menghidrolisis sukrosa. Hal ini dapat disebabkan oleh sisi aktif enzim telah berikatan dengan sejumlah substrat dan menjadi jenuh, sehingga produk yang dihasilkan sedikit. Hal ini sesuai dengan teori bahwa konsentrasi enzim yang terbatas membuat substrat berlebih. Substrat dapat berperan sebagai inhibitor jika substrat mengikat sisi lain dari enzim karena dapat mengubah konformasi enzim. Substrat yang berlebih akan membatasi laju reaksi katalisis enzim (Suryani dan Mangunwidjaya, 2002). Peningkatan aktivitas terjadi ketika konsentrasi enzim invertase dinaikkan menjadi 0.85 mg/l ( invertase : sukrosa = 1 : 2.9 x 104) pada perlakuan dengan penambahan CuSO4 0.125 mM, dan 1.65 mg/l pada perlakuan tanpa CuSO4. Peningkatan gula pereduksi masih terjadi hingga taraf konsentrasi enzim tertinggi yaitu 4.15 mg/l (invertase : sukrosa = 1 : 6 x 103), baik pada perlakuan dengan maupun tanpa penambahan CuSO4. Akan tetapi, peningkatan yang terjadi pada perlakuan tanpa

28

CuSO4 lebih curam. Hal ini menunjukkan bahwa kation logam Cu (II) mampu

menghambat laju

pembentukan kompleks enzim-substrat.

Semakin tinggi konsentrasi enzim, semakin banyak sisi aktif enzim yang berikatan dengan sukrosa sehingga semakin tinggi gula pereduksi yang dihasilkan. Hal ini sesuai dengan teori bahwa kecepatan reaksi tergantung pada konsentrasi enzim yang berperan sebagai katalisator di dalam suatu reaksi. Peningkatan konsentrasi enzim umumnya akan meningkatkan hidrolisis substrat menjadi produk (Simanjutak dan Silalahi, 2003). Analisis sidik ragam menunjukkan bahwa perbedaan taraf konsentrasi enzim berpengaruh nyata terhadap persen inhibisi, dapat dilihat pada Lampiran 6. Inhibisi oleh garam logam CuSO4 mulai terjadi pada konsentrasi invertase 2.5 mg/l (invertase : sukrosa = 1 : 104), dapat dilihat pada Gambar 19. Konsentrasi enzim di bawah konsentrasi tersebut belum menunjukkan inhibisi. Hal ini dapat terjadi karena adanya penurunan laju inversi oleh konsentrasi substrat yang berlebih, sehingga kation Cu (II) tidak dapat memasuki sisi aktif invertase. Inhibisi pada konsentrasi invertase 2.5 mg/l mulai terlihat karena substrat tidak berlebih atau telah diimbangi dengan kenaikan konsentrasi enzim, sehingga kompetisi mulai terjadi antara sukrosa dengan kation Cu (II) dalam mengikat sisi aktif enzim. 4.5

100.0 41.8

50.0

54.8

3

0.0 0

0.15

0.85

1.65

2.5

3.35

4.15

2.5

-50.0

-100.0

2

-55.5

-62.1

subset

inhibisi (%)

4 3.5

15.8

1.5

-88.8

1 -150.0

-130.7

0.5 0

-200.0

konsentrasi invertase (mg/l)

Gambar 19. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada konsentrasi enzim yang berbeda, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, pH 7, lama reaksi 5 menit Inhibisi

pada

konsentrasi

invertase

2.5

–

3.35

mg/l

3

(invertase : sukrosa = 1 : 7.5 x 10 ) tidak berbeda nyata. Begitu juga

29

dengan konsentrasi invertase 3.35 – 4.15 mg/l. Hal ini menunjukkan bahwa untuk mencapai inhibisi yang lebih besar, diperlukan konsentrasi CuSO4 yang lebih tinggi untuk mengikat sisi aktif enzim yang masih bebas. 3. Pengaruh pH Hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa perubahan nilai pH memberikan pengaruh yang nyata terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Perubahan pH menyebabkan perubahan muatan pada gugus residu asam amino dan sisi aktif enzim. Gugus residu asam amino merupakan asam atau basa lemah yang dapat terprotonasi atau terionisasi oleh pengaruh pH lingkungan. Pengujian pengaruh nilai pH dilakukan pada rasio invertase terhadap sukrosa 1 : 4500, dan konsentrasi CuSO4 0.125 mM, sedangkan perlakuan tanpa CuSO4 menggunakan invertase : sukrosa 1 : 5000. Gula pereduksi yang dihasilkan berbeda pada rentang 85.75 µM hingga 2267 µM, dapat dilihat pada Gambar 20. Konsentrasi gula pereduksi paling rendah diperlihatkan pada pH 11, perlakuan tanpa penambahan CuSO4 dan konsentrasi tertinggi pada pH 5, perlakuan dengan penambahan CuSO4 0.125 mM. Hasil uji statistik pengaruh pH dapat

konsentrasi gula pereduksi (uM)

dilihat pada Lampiran 7. 2500

2000

1500

1000

500

0 0

2

4

6

8

10

12

pH Perlakuan pH dengan penambahan CuSO4 0.125 mM

Perlakuan pH tanpa CuSO4

Gambar 20. Kurva pengaruh perubahan nilai pH terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit

30

Invertase dengan maupun tanpa penambahan CuSO4 menunjukkan pola aktivitas yang hampir sama, yaitu aktivitas invertase meningkat dari pH 3 sampai titik optimum pada pH 5. Aktivitas menurun dengan peningkatan pH sampai pH 8 untuk invertase tanpa CuSO4 dan pH 7 untuk invertase dengan penambahan CuSO4 0.125 mM, setelah itu enzim menjadi inaktif. Adanya penambahan CuSO4 memberikan tambahan asam pada larutan, akan tetapi diimbangi dengan adanya buffer pH yang mempertahankan nilai pH. Hal ini sesuai dengan teori bahwa penambahan ion H+ atau OH- ke dalam buffer hanya menyebabkan perubahan kecil pada nisbah konsentrasi relatif asam lemah dan anionnya. Penurunan salah satu komponen dari sistem buffer dengan penambahan sedikit asam diimbangi dengan tepat oleh peningkatan komponen lainnya. Jumlah komponen buffer tidak berubah, yang berubah hanya nisbahnya (Lehninger, 1988). Aktivitas hidrolisis sukrosa oleh invertase sangat rendah pada pH yang sangat asam (pH 3) dan basa tinggi (pH 8 - 11). Hal ini menunjukkan bahwa pada pH yang sangat asam, gugus fungsionil pada sisi aktif enzim terganggu oleh adanya ion H+ yang berlebihan, sedangkan pada pH basa tinggi aktivitas invertase rendah karena ion OH- yang berlebihan. Perubahan pH akan menyebabkan suatu bentuk kurva seperti yang diperlihatkan pada Gambar 20. Bentuk kurva tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor sebagai berkut. 1. Denaturasi enzim pada pH yang sangat tinggi atau rendah Hasil pengujian perubahan pH, denaturasi enzim terjadi pada pH 3 ke bawah untuk pH asam dan pH 8 ke atas untuk pH basa. Hal ini terlihat pada Gambar 20, konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan pada pH 8 ke atas sangat rendah dan tidak berbeda nyata. Denaturasi enzim menyebabkan konformasi enzim rusak, karena struktur protein globular terbuka tanpa memecah ikatan kovalen dalam kerangka polipeptida. Ikatan hidrogen antara gugus residu atom nitrogen pada asam amino menjadi terbuka karena muatannya menjadi

31

tidak seimbang oleh pengaruh pH. Hal ini sesuai dengan teori bahwa enzim terdenaturasi di suhu ruang pada pH tinggi atau rendah, sehingga enzim kehilangan aktivitasnya yang bersifat tidak dapat balik (irreversible) (Stauffer, 1989). 2. Pengaruh terhadap keadaan muatan substrat atau enzim Enzim merupakan protein yang sangat dipengaruhi oleh pH. pH sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzim karena sifat ionik gugus karboksil dan gugus asam amino, yang menyebabkan enzim tidak dapat berinteraksi dengan substrat atau sebaliknya, menjadi mudah berikatan dengan substrat. Rodwell (1981) menyatakan bahwa perubahan muatan pada enzim dapat mempengaruhi aktivitas baik dengan perubahan struktur maupun dengan perubahan muatan pada residu asam amino yang berfungsi mengikat substrat atau katalisis. Tingkat pH yang rendah menyebabkan enzim mengalami protonasi dan kehilangan muatan negatif: Enz - + H+

Enz-H

Tingkat pH yang tinggi menyebabkan ion substrat (SH+) mengalami ionisasi dan kehilangan muatan positif: SH+

S + H+

3. Perubahan konformasi enzim Perubahan konformasi enzim juga dipengaruhi oleh perubahan muatan asam amino. Aktivitas dapat menjadi rendah pada pH yang sangat tinggi atau sangat rendah atau sebaliknya menjadi maksimum pada pH tertentu. Berdasarkan Gambar 20, perubahan konformasi enzim yang berpengaruh pada tingginya aktivitas di pH 5 dapat terjadi karena struktur enzim menjadi lebih kompak. Rodwell (1981) menyatakan, suatu gugus yang bermuatan jauh dari bagian dimana substrat terikat, mungkin perlu untuk mempertahankan struktur tersier atau kuartener yang aktif. Apabila muatan pada gugus ini diubah, molekul protein dapat terbuka atau menjadi lebih kompak.

32

Inhibisi oleh CuSO4 terhadap invertase tidak terjadi pada pH yang diujikan kecuali pada pH 7. Akan tetapi persen inhibisi yang dihasilkan pada pH 7 tidak berbeda nyata dengan pH 4 – 6, dapat dilihat pada Lampiran 8. Hal ini membuktikan bahwa ikatan antara enzim invertase dengan kation logam Cu (II) sangat dipengaruhi oleh tingkat pH. Perubahan pH menyebabkan kereaktifan Cu (II) berkurang karena perubahan muatan pada enzim, sehingga inhibisi tidak terjadi. 50.0

5

15.0

0.0 3

4

5

6

-29.6

-14.2

-6.8

7

8

9

10

11

4

-100.0 3

-150.0 -200.0

-186.8

-196.0

2

subset

inhibisi (%)

-50.0

-250.0 -300.0

-261.4

-255.0 -281.3

1

-350.0 -400.0

0

pH

Gambar 21. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada nilai pH yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit 4. Pengaruh Suhu Pengujian pengaruh perubahan suhu dilakukan pada rasio invertase terhadap sukrosa 1 : 2500, dengan konsentrasi CuSO4 0.125 mM. Analisis sidik ragam menunjukkan bahwa perubahan suhu berpengaruh nyata terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Hasil uji statistik tersebut dapat dilihat pada Lampiran 9. Perubahan suhu menghasilkan konsentrasi gula pereduksi pada rentang 140.75 µM hingga 3537 µM. Konsentrasi tertinggi pada suhu 50°C dengan perlakuan tanpa CuSO4 dan konsentrasi terkecil pada suhu 70°C dengan penambahan CuSO4 0.125 mM. Kurva pengaruh perubahan suhu terhadap aktivitas invertase dapat dilihat pada Gambar 22.

33

konsentrasi gula pereduksi (uM)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

s uhu (oC) Perlakuan suhu dengan penambahan CuSO4 0.125 mM

Perlakuan suhu tanpa CuSO4

Gambar 22. Kurva pengaruh perubahan suhu terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit Aktivitas invertase semakin meningkat dengan kenaikan suhu hingga mencapai aktivitas maksimum. Peningkatan suhu lebih lanjut setelah titik maksimum menyebabkan penurunan aktivitas invertase dalam menghidrolisis sukrosa. Kedua perlakuan terhadap invertase, dengan maupun tanpa penambahan CuSO4 menunjukkan pola aktivitas tersebut. Peningkatan aktivitas invertase tanpa CuSO4 terjadi ketika suhu dinaikkan dari 0°C - 50°C dan 0°C - 40°C pada perlakuan dengan penambahan CuSO4 0.125 mM. Peningkatan suhu menyebabkan kenaikan energi kinetik yang membuat molekul enzim dan substrat saling bertumbukan sehingga semakin banyak kompleks enzim-substrat yang terbentuk. Energi kinetik tersebut mampu meningkatkan aktivitas enzim hingga maksimal pada suhu 50°C, kemudian aktivitas enzim turun dengan tajam pada suhu yang lebih tinggi hingga 70°C. Webb (1963) menyatakan bahwa suhu pada saat aktivitas enzim maksimum disebut dengan suhu optimum. Rodwell (1981) juga menyatakan, suhu optimum kebanyakan enzim adalah suhu sel atau di atas suhu sel tempat enzim-enzim berada. Aktivitas enzim di bawah maupun di atas suhu optimum enzim lebih rendah. Hal ini disebabkan oleh rusaknya ikatan-ikatan yang mempertahankan struktur enzim. Jika ikatan sekunder rusak, keadaan katalitik enzim aktif menjadi berubah. Rusaknya struktur dan konformasi enzim dapat menyebabkan enzim kehilangan aktivitas biologisnya yang disebut dengan denaturasi enzim oleh suhu tinggi. Ikatan-ikatan sekunder

34

enzim yang lemah, seperti ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik semakin

lemah

ikatannya

dengan

meningkatnya

suhu.

Hal

ini

menyebabkan denaturasi yang bersifat reversible pada suhu 60 - 70°C dengan perlakuan tanpa CuSO4 dan 50°C dengan penambahan CuSO4 0.125 mM. Denaturasi irreversible terjadi jika ikatan kovalen pada enzim telah rusak, yaitu mulai suhu 70°C pada perlakuan tanpa CuSO4 dan mulai suhu 60°C pada dengan penambahan CuSO4 0.125 mM. Hal ini sesuai dengan teori bahwa kenaikan kecepatan aktivitas enzim di bawah suhu optimum disebabkan oleh kenaikan energi kinetik molekul-molekul yang bereaksi. Akan tetapi apabila suhu tetap dinaikkan, energi kinetik molekul-molekul enzim menjadi demikian besar sehingga melampaui penghalang energi untuk memecahkan ikatan sekunder (Rodwell, 1981). Penambahan CuSO4 0.125 mM menyebabkan invertase menjadi lebih stabil oleh perubahan suhu, karena perubahan terjadi tidak secara tajam atau signifikan. Hal ini dapat dilihat bahwa aktivitas invertase pada perubahan suhu 10°C menjadi 20°C tidak berbeda nyata. Kenaikan aktivitas menjadi 30°C terjadi secara landai, dan perubahan menjadi suhu 40°C juga tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Begitu juga dengan pola penurunan aktivitas invertase dari suhu optimum enzim ke suhu yang lebih tinggi juga tidak sebesar yang terjadi pada perlakuan tanpa CuSO4. Inhibisi oleh CuSO4 terjadi mulai suhu 10°C hingga 90°C, dapat dilihat pada Gambar 23. Inhibisi aktivitas invertase tidak terjadi pada suhu 0°C. Hal ini dapat disebabkan selain invertase kurang aktif pada suhu rendah karena energi kinetik yang rendah, reaksi pengikatan oleh kation logam Cu (II) juga tidak terjadi pada suhu yang sangat rendah. Suhu dapat mempengaruhi perubahan konfigurasi dari sisi aktif enzim. Jika sisi aktif enzim mudah mengalami perubahan struktur, fleksibilitas enzim akan berubah sehingga manyebabkan inhibitor lebih mudah atau lebih sulit untuk mengikat enzim (Webb, 1963). Daya inhibisi CuSO4 dipengaruhi oleh perubahan suhu pada taraf 0 - 90°C, dapat dilihat pada Lampiran 10. Besarnya persen inhibisi oleh

35

perubahan suhu dapat dilihat pada Gambar 23. Hasil uji pengaruh suhu menunjukkan besarnya inhibisi meningkat seiring dengan kenaikan sampai dengan suhu 60°C, kemudian turun secara tajam. Hal ini menunjukkan bahwa perubahan konfigurasi sisi aktif enzim oleh suhu dapat menyebabkan inhibitor mudah atau sulit untuk mengikat enzim. Inhibisi menjadi sangat besar pada saat suhu 60°C karena

aktivitas

invertase tanpa CuSO4 masih tinggi, sedangkan aktivitas invertase dengan penambahan CuSO4 0.125 mM sangat rendah karena telah mengalami denaturasi. Inhibisi menurun setelah suhu optimum karena aktivitas invertase baik dengan maupun tanpa CuSO4 telah turun. Hal ini menunjukkan bahwa CuSO4 0.125 mM efektif dalam menghambat aktivitas invertase pada suhu optimum enzim pada rasio konsentrasi invertase : sukrosa 1 : 2500. 8

120

85.5 80

83.6

69.7

6 68.4 5

53.5

60

4

37.6

40

subset

%inhibisi

7

95.1

100

3 20

12.3

6.8 0

1 0

-20

2

10

20

30

40

50

-12.2

suhu (oC)

60

70

80

90 0

Gambar 23. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada suhu yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit 5. Pengaruh Lama Pemanasan Pengujian pengaruh lama pemanasan dilakukan pada rasio invertase terhadap sukrosa 1 : 2500, dengan konsentrasi CuSO4 0.125 mM. Analisis sidik ragam menunjukkan bahwa pemanasan invertase yang dilakukan pada waktu yang berbeda memberikan pengaruh yang nyata terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Hasil uji statistik tersebut dapat dilihat pada Lampiran 11. Gula pereduksi yang dihasilkan

36

berda pada rentang 82 µM hingga 1467 µM, dengan konsentrasi tertinggi pada invertase yang tidak dipanaskan dan konsentrasi terkecil pada pemanasan 60 detik dan 300 detik pada perlakuan tanpa CuSO4. Pengaruh lama pemanasan terhadap aktivitas invertase dapat dilihat pada Gambar

1600 1400 1200 1000

(uM)

konsentrasi gula pereduksi

24.

800 600 400 200 0 0

10

20

30

40

50

60

300

lama pemanasan (detik) Perlakuan lama pemanasan dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Perlakuan lama pemanasan tanpa CuSO4

Gambar 24. Kurva pengaruh lama pemanasan terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit Pengujian pengaruh lama pemasan ini memberikan hasil bahwa semakin lama waktu pemanasan, semakin rendah aktivitas invertase dalam menghidrolisis sukrosa. Invertase menunjukkan kestabilan terhadap panas dalam waktu yang sangat singkat. Aktivitas enzim terus menurun sampai 20 detik pemanasan, kemudian menjadi inaktif dengan pemanasan yang lebih lama. Perlakuan dengan maupun tanpa penambahan CuSO4 menunjukkan pola penurunan aktivitas yang sama. Hal ini dapat disebabkan oleh perubahan konformasi enzim oleh panas yang mengakibatkan struktur enzim sulit berikatan dengan substrat. Hal ini sesuai dengan teori bahwa pemanasan dapat mengakibatkan enzim terdenaturasi, karena enzim merupakan protein. Akibat penting dari enzim yang terdenaturasi yaitu enzim tidak akan menjadi aktif mengkatalisis reaksi. Peristiwa ini terjadi karena susunan tiga dimensi yang khas dari rantai polipeptida terganggu dan molekul ini terbuka menjadi struktur yang acak, tanpa adanya kerusakan pada struktur kovalen. Molekul enzim ini bersifat sangat rapuh dan segera rusak oleh panas (Lehninger, 1988).

37

Inhibisi oleh CuSO4 0.125 mM terjadi pada lama pemanasan 0 detik hingga kurang dari 20 detik, dapat dilihat pada Gambar 25. Waktu pemanasan 20 detik hingga detik selanjutnya tidak terjadi inhibisi walaupun aktivitas kedua perlakuan tersebut tidak berbeda nyata berdasarkan uji lanjut Duncan, dapat dilihat pada Lampiran 12. Inhibisi ini tidak terjadi karena invertase telah kehilangan aktivitasnya, sehingga tidak dapat menghidrolisis substrat. Hal ini menyebabkan adanya penambahan CuSO4 0.125 mM tidak dapat menginhibisi enzim karena struktur enzim telah rusak yang berakibat pada rusaknya sisi aktif enzim. Jadi, penambahan CuSO4 0.125 mM pada rasio konsentrasi invertase dengan sukrosa 1 : 2500 tidak berperan sebagai inhibitor pada perlakuan lama pemanasan lebih dari 20 detik karena perlakuan pemanasan sendiri telah memberikan pengaruh penghambatan. 60.0

3

44.4

50.0 35.5

40.0

2

20.0

subset

%inhibisi

30.0

10.0 0.0 -10.0

0

10

20

30

40

50

-17.3

-17.9

-13.3

-15.2

60

300

1

-20.0 -30.0

-19.8 -21.3

-40.0

0

lama pemanasan (detik)

Gambar 25. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 pada lama pemanasan yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit D. Kinetika Inhibisi Reaksi Invertase Kinetika reaksi invertase pada penelitian ini diujikan pada kondisi optimum terjadinya inhibisi oleh CuSO4. Suhu yang diujikan adalah 40°C, 50°C dan 60°C dengan tingkat pH yang sama, yaitu pH 7, sedangkan substrat (sukrosa) diujikan dalam beberapa konsentrasi, dari 0 g/l hingga 25 g/l. Kinetika reaksi invertase dengan maupun tanpa penambahan CuSO4 pada berbagai suhu ini memberikan persamaan linier yang berbeda.

38

Inhibisi yang terjadi pada suhu 40°C bersifat mixed (partial). Model inhibisi ini menunjukkan bahwa enzim maupun kompleks enzim-substrat mengikat inhibitor. Penentuan model inhibisi ini dapat dilihat pada Lampiran

13.

Hubungan

laju

reaksi

terhadap

konsentrasi

substrat

digambarkan oleh kurva Michaelis-Menten pada Gambar 26, sedangkan model inhibisi dapat dilihat pada plot Lineweaver-Burk yang ditunjukkan Gambar 27. Parameter kinetika inhibisi invertase oleh CuSO4 0.125 mM berdasarkan model tersebut dapat dilihat pada Tabel 2.

250

Laju reaksi (µM/min)

200

150

100

50

0 0

5

10

15

20

25

konsentrasi sukrosa (g/l)

Gambar 26. Kurva Michaelis - Menten invertase suhu 40°C. , laju reaksi tanpa CuSO4; , laju reaksi dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Tabel 2. Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 40°C Perlakuan

KM (g/l)

Vmaks (µM/min)

Tanpa CuSO4

8.6

Dengan CuSO4

8.6

Ki (mM)

α

β

288.4

-

-

-

64.1

0.5817

75.1

3.1

39

0.035

-1 1/laju reaksi (µM/min)

0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005

0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

1/konsentrasi sukrosa (µM)-1

Gambar 27. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 40°C. , 1/laju reaksi tanpa CuSO4; , 1/laju reaksi dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Persamaan Lineweaver-Burk menghasilkan nilai KM dan Vmaks yang berubah oleh konstanta α, yang merupakan karakteristik dari inhibisi kompetitif (partial) dan β, karakteristik inhibisi nonkompetitif (partial) atau unkompetitif (partial), yang memiliki nilai lebih dari 1. Nilai Vmaks enzim tanpa inhibitor adalah 288.4 µM/menit, sedangkan nilai KM adalah 8.6 g/l. Model inhibisi mixed (partial) oleh CuSO4 menghasilkan nilai KM enzim tetap, sedangkan Vmaks mengalami penurunan menjadi 64.1 µM/menit. Nilai KM yang tetap menunjukkan bahwa kenaikan atau penurunan konsentrasi substrat tidak mempengaruhi affinitas inhibitor pada enzim. Kation Cu (II) mengikat enzim selain pada sisi pembentukan kompleks enzimsubstrat. Inhibisi oleh kation Cu (II) terlihat dengan terjadinya penurunan laju reaksi yang ditandai dengan turunnya nilai Vmaks. Kuat lemahnya ikatan inhibitor pada enzim atau kompleks enzim-substrat dinyatakan dalam bentuk konstanta, Ki. Nilai Ki CuSO4 terhadap invertase pada kondisi ini adalah 0.5817 mM. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 yang terjadi pada suhu 50°C menunjukkan model mixed (partial), seperti inhibisi pada suhu 40°C.

40

Penentuan model inhibisi ini dapat dilihat pada Lampiran 14. Hubungan laju reaksi terhadap konsentrasi substrat digambarkan oleh kurva MichaelisMenten pada Gambar 28, sedangkan model inhibisi dapat dilihat pada plot Lineweaver-Burk yang ditunjukkan Gambar 29. Parameter kinetika inhibisi invertase oleh CuSO4 berdasarkan model tersebut dapat dilihat pada Tabel 3.

200 180

Laju reaksi (µM/min)

160 140 120 100 80 60 40 20 0 0

5

10

15

20

25

konsentrasi sukrosa (g/l)

Gambar 28. Kurva Michaelis - Menten invertase suhu 50°C. , laju reaksi tanpa CuSO4; , laju reaksi dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Tabel 3. Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 50°C Perlakuan

KM (g/l)

Vmaks (µM/min) Ki (mM)

α

β

-

-

Tanpa CuSO4

21.1

356.6

Dengan CuSO4

21.1

69.02

-

2.873e-9 1201.3 232.5

41

-1 1/laju reaksi (µM/min)

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

1/konsentrasi sukrosa (g/l)-1

Gambar 29. Plot Lineweaver - Burk invertase suhu 50°C. , 1/laju reaksi tanpa CuSO4; , 1/laju reaksi dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Nilai KM dan Vmaks enzim tanpa CuSO4, masing-masing 21.1 g/l dan 356.6 µM/menit. Inhibisi oleh CuSO4 ditunjukkan dengan penurunan nilai Vmaks invertase. Model inhibisi mixed (partial) ini menunjukkan bahwa CuSO4 dapat mengikat enzim bebas maupun kompleks enzim-substrat. Inhibitor terikat sangat kuat dibandingkan suhu 40°C, ditunjukkan dengan nilai Ki yang sangat kecil, yaitu 2.873e-9 mM sehingga menghasilkan inhibisi yang lebih besar. Terdapat perubahan model inhibisi oleh CuSO4 pada invertase yang terjadi pada suhu 60°C, yaitu bersifat kompetitif (full). Inhibisi ini dicirikan dengan perubahan nilai KM oleh inhibitor dan tidak terjadi perubahan nilai Vmaks. Penentuan model inhibisi dapat dilihat pada Lampiran 15. Hubungan laju reaksi terhadap konsentrasi substrat digambarkan oleh kurva MichaelisMenten pada Gambar 30, sedangkan model inhibisi dapat dilihat pada plot Lineweaver-Burk yang ditunjukkan Gambar 31. Parameter kinetika inhibisi invertase oleh CuSO4 berdasarkan model tersebut dapat dilihat pada Tabel 4.

42

140

laju reaksi (µM/min)

120 100 80 60 40 20 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

konsentrasi sukrosa (g/l)

Gambar 30. Kurva Michaelis - Menten invertase suhu 60°C. , laju reaksi tanpa CuSO4; , laju reaksi dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Tabel 4. Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 60°C Perlakuan

KM (g/l)

Vmaks (µM/min)

Ki (mM)

Tanpa CuSO4

3.555e+6

1.732e+7

-

Dengan CuSO4

4.622e+6

1.732e+7

11.4

0.040

1/laju reaksi (µM/min)

1

0.035 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005

-0.02

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

1/konsentrasi sukrosa (g/l)-1

Gambar 31. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 50°C. , 1/laju reaksi tanpa CuSO4; , 1/laju reaksi dengan penambahan CuSO4 0.125 mM

43

Nilai KM invertase pada suhu 60°C lebih tinggi jika dibandingkan dengan nilai KM pada suhu 40°C dan suhu 50°C . Hal ini menunjukkan bahwa enzim memerlukan konsentrasi substrat yang lebih banyak untuk mencapai setengah kecepatan maksimumnya. CuSO4 berperan sebagai inhibitor yang bersifat kompetitif pada kondisi suhu 60°C dan pH 7 yaitu menghambat pembentukan kompleks enzim-substrat pada sisi aktif enzim. Kation Cu (II) mengakibatkan konsentrasi substrat yang diberikan semakin tinggi untuk mencapai nilai Vmaks yang tetap. Penghambatan hanya bersifat kompetitif, dapat disebabkan oleh berubahnya sisi sekunder enzim oleh suhu tinggi, sedangkan sisi aktifnya belum rusak. Ikatan CuSO4 pada enzim lebih lemah jika dibandingkan dengan ikatannya pada suhu 40°C dan suhu 50°C, ditunjukkan dengan nilai Ki yang lebih besar yaitu 11.4 mM.

44

V. KESIMPULAN DAN SARAN A. KESIMPULAN Inhibisi oleh CuSO4 terhadap invertase dipengaruhi oleh perubahan konsentrasi sukrosa, konsentrasi invertase, suhu dan lama pemanasan. Semakin rendah rasio konsentrasi invertase terhadap sukrosa, semakin tinggi konsentrasi CuSO4 yang diperlukan sebagai inhibitor invertase. Inhibisi oleh CuSO4 semakin besar dengan kenaikan suhu (10 – 60°C), sedangkan di atas suhu 70°C inhibisi semakin rendah. Invertase memiliki kestabilan terhadap panas yang sangat rendah (hanya mencapai 20 detik pemanasan) dan inhibisi oleh CuSO4 hanya terjadi pada lama pemanasan 0 – 10 detik. Aktivitas invertase sangat rendah pada pH 3 dan pH 7 ke atas, sedangkan penambahan CuSO4 tidak memberikan pengaruh inhibisi yang signifikan dengan perubahan pH larutan invertase. Kinetika inhibisi laju degradasi sukrosa oleh CuSO4 yang dilakukan pada pH 7, dengan tiga titik suhu (40°C, 50°C, 60°C) menghasilkan nilai KM dan Vmaks yang berbeda. Kecepatan reaksi pada perlakuan tanpa CuSO4 meningkat dengan kenaikan suhu. Model kinetika inhibisi invertase oleh CuSO4 berbeda pada setiap suhu yang diujikan. Model inhibisi oleh CuSO4 pada suhu 40°C adalah mixed (partial), dengan nilai KM 8.6 g/l, Vmaks 288.4 µM/menit turun menjadi 64.1 µM/menit, Ki 0.5817 mM, α 75.1, β 3.1. Model inhibisi oleh CuSO4 pada suhu 50°C juga mixed (partial) dengan nilai KM 21.1 g/l, Vmaks 356.6 µM/menit turun menjadi 69.02 µM/menit, Ki 2.873e-9 mM, α 1201.3, β 232.5. Model inhibisi pada suhu dan 60°C bersifat kompetitif (full), dengan nilai KM 3555e+6 g/l naik menjadi 4.622e+6 g/l, Vmaks 1.732e+7 µM/menit, Ki 11.4 mM. B. SARAN Perlu dilakukan penelitian inhibisi aktivitas invertase dengan menggunakan bahan lainnya, baik berupa bahan alami maupun garam logam.

DAFTAR PUSTAKA Astawan, M. 2001. Gula Semut, Kristal Manis Berpeluang Ekspor. Sedap Sekejap. http://www. CiptaPangan.com. [26 Agustus 2005]. Causette, M., Alain G, Henri P, Pierre M, dan Brigitte L. 1998. Inactivation of Enzymes by Inert Gas Bubbling. Enzyme Engineering XIV. Vol. 864. New York. Cavaille, D. dan Didier C. 1996. High Pressure and Temperature: How to Diactivate Enzymes in Two Different Ways. Enzyme Engineering XIII. Vol. 799. New York. Darmono. 1995. Logam Dalam Sistem Biologi Makhluk Hidup. UI Press. Jakarta. Ewing, E. E., Maria D, Deborah A. M, Martha H. M dan Anne M. H. 1977. Changes in Potato Tuber Invertase and Its Endogenous Inhibitor After Slicing, Including a Study of Assay Methods. J. Plant Physiol, 49 : 925929. Filho, U. C., Hori, C. E. dan Ribeiro, E. J. 1999. Influence of the Reaction Products in the Inversion of Sucrose by Invertase. Brazilian J. Chem Eng, 16 (2). Flickinger, M. C. dan Drew, S. W. 1999. Kinetics and Stoichiometry (Growth, Enzymes). Encyclopedia of Bioprocess Technology : Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation. John Wiley and Sons, Inc. Greiner, S., Krausgrill, S. dan Rausch, T. 1998. Cloning of Tobacco Apoplasmic Invertase Inhibitor. J. Plant Physiol, 116 (2) : 733-742. Gurd, F. R. N. dan Wilcox, P. E.1954. Advances in Protein Chem dalam Hochster dan Quastel. 1963. Metabolic Inhibitors, Vol II. Academic Press. New York. Hochster, R. M. dan Quastel, J. H. 1963. Metabolic Inhibitors. Vol II. Academic Press. New York. Hsiao, C. C., Fu, R. H. dan Sung, H. Y. 2002. A Novel Bound of Plant Invertase in Rice Suspension Cells. Bot. Bull. Acad. Sin, 43: 115-122. Isla, M. I., Graciela S, Horacio P, Marta A. V dan Antonio R. S.1995. Purification and Properties of The Soluble Acid Invertase from Oriza Sativa. J. Phytochem, 38 (2) : 321-325. Lehninger.1988. Dasar-dasar Biokimia. Jilid 1. Terjemahan. Penerjemah : Maggy T. Erlangga. Jakarta.

Monsan, P. dan Combess, D. 1984. Stabilization of Enzyme Activity. The Procedings of Biotechnology `84 Europe Online 1984. Published by online Publication, Ltd., London. Murray, D. R. P. 1933. The Activation of Papain By Cyanide and Other Substances. I. Biochem Journal from Biochemical Laboratory. Cambridge. Pancoast, H. M. dan Junk, W. R. 1980. Handbook of Sugar. Second Edition. AVI Publishing Company, Inc. Westport, Connecticut. Pelczar, M. J. dan Chan, C. S. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Edisi 1. Terjemahan. Penerjemah: S.R. Hadioetomo, Imas T, Angka L S. UI Press. Jakarta. Pennington, N. L. dan Baker, C. W. 1990. Sugar, A User’s Gide to Sucrose. An AVI Book. Van Nostrand Reinhold. New York. Pressey, R dan Shaw, R. 1966. Effect of Temperature on Invertase, Invertase Inhibitor, and Sugars in Potato Tubers. J. Plant Physiol, 1657-1661. Rahman, M. H., Akand, A.H., Tanzima Y, Salim U dan Mahbubur R. 2001. Purification and Properties of Invertase from Mango Fruit. Pakistan J. Biol Sci, 4 (10) : 1271-1274. Rahman, M., Palash K.S, Fida M.H, Sarnad M.A.M, dan Habibur M.R. 2004. Purification and Characterization of Invertase Enzyme from Sugarcane. Pakistan J Biol Sci, 7 (3) : 340-345. Rodwell, V. W. 1981. Kinetic Properties of Enzymes di dalam D. W. Martin, P. A. Mayes dan V. W. Rodwell. 1981. Harper’s Review of Biochemistry. 18th ed. Lange Medical Publications. Los Altos, California. ____________. 2001. Enzim : Kinetik di dalam R. K Murray, D. K. Granner, P. A. Mayes dan V. W. Rodwell. 2000. Biokimia Harper.Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Simanjutak dan Silalahi. 2005. Biokimia. FMIPA USU, Medan. Sizer, I. W. dan Fennesey, J. F. 1950. The Inactivation of Invertase by Tyrosinase. Dept of Biology, Massachusetts Institute of Technology. Cambridge, Massachusetts. Stauffer, C. E. 1989. Enzyme Assays for Food Scientist. An AVI Book. Van Nostrand Reinhold. New York. Suryani, A dan Mangunwidjaya, J. 2002. Rekayasa Proses. Jurusan Teknologi Industri Pertanian, Fateta, IPB. Bogor.

47

Trojanowicz, M., Dario C, Carla G, Zbigniew J, dan Giuseppe P. 2004. Limitations in The Analytical Use of Invertase Inhibition for the Screening of Trace Mercury Content in Environmental Samples. J. Anal Sci, 20. Wang, N. S. 2002. Enzyme Kinetics of Invertase Via Initial Rate Determination. Department of Chemical Engineering, University of Maryland, College Park. Maryland. Webb, J. L. 1963. Enzyme and Metabolic Inhibitors, Vol I. Academic Press. New York. Whitaker, J. R. 1966. Enzymes dalam O. R. Fennema (ed.). Food Chemistry, 3rd ed. 1996. Marcell-Dekker Inc. New York.

48

LAMPIRAN

Lampiran 1. Prosedur penelitian a. Persiapan larutan buffer asetat 0.05 M, pH 4.5 Asam asetat 0.5 M sebanyak 25 ml dimasukkan ke dalam labu takar atau gelas 250 ml, kemudian ditambahkan aquades sebanyak 200 ml. Natrium asetat trihidrat (136.08 g/mol) sebanyak 0.9567 g dilarutkan dan ditambahkan ke dalamnya, kemudian ditera dengan aquades hingga 250 ml. Selanjutnya dilakukan pengukuran pH dengan pH meter, jika belum tepat ditambahkan HCl atau NaOH. b. Persiapan larutan invertase 1 g/l larutan invertase disiapkan dengan melarutkan 0.0009 g invertase (Sigma-Aldrich 19253: pH 4.5, 55°C, 355 units/mg solid) pada 10 ml buffer asetat pH 4.5. Kemudian dilakukan pengenceran dengan perbandingan 1:100 menggunakan larutan buffer yang sama sehingga didapatkan larutan invertase yang setara dengan 0.01 g/l, aktivitas 32 unit/mg. c. Pembuatan kurva standar Kurva standar yang digunakan adalah kurva standar glukosa dan fruktosa. Glukosa dan fruktosa masing-masing 0.09 g dicampur dan dilarutkan ke dalam aquades, ditera dalam labu takar 100 ml. Selanjutnya dibuat beberapa konsentrasi larutan glukosa dan fruktosa tersebut dan dimasukkan DNS dengan perbandingan 1:1. Larutan tersebut dipanaskan dalam water bath 95°C selama 10 menit, kemudian didinginkan dan diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 540 nm.

Lampiran 2. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan penentuan konsentrasi CuSO4 Oneway ANOVA INVERT

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 1749609 6071.875 1755681

df 8 9 17

Mean Square 218701.128 674.653

F 324.168

Sig. .000

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors Value Label KONS

0 1 2 50 60 75 90 100 150

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2

30 40

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: INVERT Source Corrected Model Intercept KONS Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 1749609.028a 56528572.3 1749609.028 6071.875 58284253.3 1755680.903

df 8 1 8 9 18 17

Mean Square 218701.128 56528572.35 218701.128 674.653

F 324.168 83789.135 324.168

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = .997 (Adjusted R Squared = .993)

50

Post Hoc Tests KONS Homogeneous Subsets INVERT a,b

Duncan

Subset KONS 150 100 0 90 75 60 30 40 50 Sig.

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2

1 1052.000

2

3

4

5

6

1503.250 1669.500 1782.000 1819.500 1998.250 2004.500 2055.750 1.000

1.000

1.000

.183

.063

2004.500 2055.750 2064.500 .054

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 674.653. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

Lampiran 3. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh konsentrasi substrat a. Pengaruh konsentrasi substrat tanpa penambahan CuSO4 Oneway ANOVA KONS

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 5490060 1996.875 5492057

df 5 6 11

Mean Square 1098011.938 332.813

F 3299.191

Sig. .000

51

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

SUKROSA

Value Label 0 4.25 8.25 12.5 16.75 20.75

1 2 3 4 5 6

N 2 2 2 2 2 2

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: KONS Source Corrected Model Intercept SUKROSA Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 5490059.688a 19488379.7 5490059.687 1996.875 24980436.3 5492056.563

df 5 1 5 6 12 11

Mean Square 1098011.938 19488379.69 1098011.937 332.813

F 3299.191 58556.634 3299.191

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = 1.000 (Adjusted R Squared = .999)

Post Hoc Tests SUKROSA Homogeneous Subsets KONS Duncan

a,b

SUKROSA 0 4.25 8.25 12.5 20.75 16.75 Sig.

N 2 2 2 2 2 2

1 .000

2

Subset 3

4

5

840.750 1343.250 1673.250

1.000

1.000

1.000

1.000

1892.000 1897.000 .793

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 332.813. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

52

b. Pengaruh konsentrasi substrat dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Oneway ANOVA KONS

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 5018308 12153.125 5030461

df 5 6 11

Mean Square 1003661.521 2025.521

F 495.508

Sig. .000

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

SUKROSA

1 2 3 4 5 6

Value Label 0 4.25 8.25 12.5 16.75 20.75

N 2 2 2 2 2 2

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: KONS Source Corrected Model Intercept SUKROSA Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 5018307.604a 13744150.5 5018307.604 12153.125 18774611.3 5030460.729

df 5 1 5 6 12 11

Mean Square 1003661.521 13744150.52 1003661.521 2025.521

F 495.508 6785.490 495.508

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = .998 (Adjusted R Squared = .996)

53

Post Hoc Tests SUKROSA Homogeneous Subsets KONS Duncan

a,b

Subset SUKROSA 0 4.25 8.25 12.5 16.75 20.75 Sig.

N 2 2 2 2 2 2

1 .000

2

3

4

579.500 842.000

1.000

1.000

1.000

1633.250 1649.500 1717.000 .122

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 2025.521. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

Lampiran 4. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada konsentrasi substrat yang berbeda Oneway ANOVA INHIBISI

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 2343.002 95.612 2438.614

df 5 6 11

Mean Square 468.600 15.935

F 29.406

Sig. .000

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

SUKROSA

1 2 3 4 5 6

Value Label 0 4.25 8.25 12.5 16.75 20.75

N 2 2 2 2 2 2

54

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: INHIBISI Type III Sum of Squares 2343.002a 2880.260 2343.002 95.612 5318.874 2438.614

Source Corrected Model Intercept SUKROSA Error Total Corrected Total

df

Mean Square 468.600 2880.260 468.600 15.935

5 1 5 6 12 11

F 29.406 180.746 29.406

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = .961 (Adjusted R Squared = .928)

Post Hoc Tests SUKROSA Homogeneous Subsets INHIBISI Duncan

a,b

SUKROSA 0 12.5 20.75 16.75 4.25 8.25 Sig.

N 2 2 2 2 2 2

Subset 2

1 .0000 2.3850 9.2366

3

9.2366 13.0469

.067

.377

31.0751 37.2122 .175

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 15.935. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

Lampiran 5. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh konsentrasi enzim a. Pengaruh konsentrasi enzim tanpa penambahan CuSO4 Oneway ANOVA KONS

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 4684113 2262.500 4686375

df 6 7 13

Mean Square 780685.417 323.214

F 2415.380

Sig. .000

55

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

ENZIM

Value Label 0 0.15 0.85 1.65 2.5 3.35 4.15

1 2 3 4 5 6 7

N 2 2 2 2 2 2 2

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: KONS Source Corrected Model Intercept ENZIM Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 4684112.500a 4074843.500 4684112.500 2262.500 8761218.500 4686375.000

df 6 1 6 7 14 13

Mean Square 780685.417 4074843.500 780685.417 323.214

F 2415.380 12607.251 2415.380

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = 1.000 (Adjusted R Squared = .999)

Post Hoc Tests ENZIM Homogeneous Subsets KONS Duncan ENZIM 0.15 0 0.85 1.65 2.5 3.35 4.15 Sig.

a,b

N 2 2 2 2 2 2 2

1 80.750 84.500 95.750

2

Subset 3

4

5

239.500 530.750 1019.500 .448

1.000

1.000

1.000

1725.750 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 323.214. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

56

b. Pengaruh konsentrasi enzim dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Oneway ANOVA KONS

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 692992.0 2665.625 695657.6

df 6 7 13

Mean Square 115498.661 380.804

F 303.302

Sig. .000

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

ENZIM

1 2 3 4 5 6 7

Value Label 0 0.15 0.85 1.65 2.5 3.35 4.15

N 2 2 2 2 2 2 2

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: KONS Source Corrected Model Intercept ENZIM Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 692991.964a 2087102.161 692991.964 2665.625 2782759.750 695657.589

df 6 1 6 7 14 13

Mean Square 115498.661 2087102.161 115498.661 380.804

F 303.302 5480.784 303.302

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = .996 (Adjusted R Squared = .993)

57

Post Hoc Tests ENZIM Homogeneous Subsets KONS a,b

Duncan

Subset ENZIM 0.15 0 0.85 1.65 2.5 3.35 4.15 Sig.

N 2 2 2 2 2 2 2

1 130.750 159.500

2

3

4

5

6

220.750 370.750 447.000 593.250 .184

1.000

1.000

1.000

1.000

780.750 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 380.804. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

Lampiran 6. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada konsentrasi enzim yang berbeda Oneway ANOVA INHIBISI

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 59366.714 1239.780 60606.494

df 6 7 13

Mean Square 9894.452 177.111

F 55.866

Sig. .000

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

ENZIM

1 2 3 4 5 6 7

Value Label 0 0.15 0.85 1.65 2.5 3.35 4.15

N 2 2 2 2 2 2 2

58

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: INHIBISI Source Corrected Model Intercept ENZIM Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 59366.714a 14430.130 59366.714 1239.780 75036.623 60606.494

df

Mean Square 9894.452 14430.130 9894.452 177.111

6 1 6 7 14 13

F 55.866 81.475 55.866

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = .980 (Adjusted R Squared = .962)

Post Hoc Tests ENZIM Homogeneous Subsets INHIBISI Duncan ENZIM 0.85 0 0.15 1.65 2.5 3.35 4.15 Sig.

a,b

N 2 2 2 2 2 2 2

1 -130.7069

Subset 3

2 -88.7574 -62.1261

4

5

-62.1261 -55.5097 15.8153 41.7897

1.000

.085

.634

.092

41.7897 54.7609 .362

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 177.111. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

Lampiran 7. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh pH a. Pengaruh pH tanpa penambahan CuSO4 Oneway ANOVA KONS

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 10538490 9850.000 10548340

df 8 9 17

Mean Square 1317311.285 1094.444

F 1203.635

Sig. .000

59

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

PH

Value Label 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 2 3 4 5 6 7 8 9

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: KONS Type III Sum of Squares 10538490.3a 8898574.222 10538490.3 9850.000 19446914.5 10548340.3

Source Corrected Model Intercept PH Error Total Corrected Total

df 8 1 8 9 18 17

Mean Square 1317311.285 8898574.222 1317311.285 1094.444

F 1203.635 8130.677 1203.635

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = .999 (Adjusted R Squared = .998)

Post Hoc Tests PH Homogeneous Subsets KONS Duncan

a,b

Subset PH 11 9 10 8 3 7 4 6 5 Sig.

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2

1 85.750 87.000 88.250 109.500 142.000

2

3

4

532.000 1630.750 1668.250 .150

1.000

.286

1984.500 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 1094.444. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

60

b. Pengaruh pH dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Oneway ANOVA KONS

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 11792236 17637.500 11809874

df 8 9 17

Mean Square 1474029.514 1959.722

F 752.162

Sig. .000

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

PH

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Value Label 3 4 5 6 7 8 9 10 11

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: KONS Source Corrected Model Intercept PH Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 11792236.1a 15375360.9 11792236.1 17637.500 27185234.5 11809873.6

df 8 1 8 9 18 17

Mean Square 1474029.514 15375360.89 1474029.514 1959.722

F 752.162 7845.684 752.162

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = .999 (Adjusted R Squared = .997)

61

Post Hoc Tests PH Homogeneous Subsets KONS Duncan

a,b

Subset PH 9 10 11 8 3 7 6 4 5 Sig.

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2

1 249.500 313.250 327.000

2

3

313.250 327.000 395.750 418.250

4

5

6

395.750 418.250 452.000 1782.000 2113.250

.128

.054

.255

1.000

1.000

2267.000 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 1959.722. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

Lampiran 8. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada pH yang berbeda Oneway ANOVA INHIBISI

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 245841.1 7960.260 253801.4

df 8 9 17

Mean Square 30730.144 884.473

F 34.744

Sig. .000

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

PH

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Value Label 3 4 5 6 7 8 9 10 11

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2

62

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: INHIBISI Source Corrected Model Intercept PH Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 245841.148a 329060.895 245841.148 7960.260 582862.303 253801.408

df

Mean Square 30730.144 329060.895 30730.144 884.473

8 1 8 9 18 17

F 34.744 372.042 34.744

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = .969 (Adjusted R Squared = .941)

Post Hoc Tests PH Homogeneous Subsets INHIBISI Duncan

a,b

Subset PH 11 8 10 3 9 4 5 6 7 Sig.

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2

1 -282.0598 -261.4155 -254.7679

.403

2

3

-261.4155 -254.7679 -195.9723

.064

4

-254.7679 -195.9723 -186.7816

.056

-29.5792 -14.3620 -6.9729 15.0406 .194

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 884.473. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

63

Lampiran 9. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh suhu a. Pengaruh suhu tanpa penambahan CuSO4 Oneway ANOVA KONS Sum of Squares Between Groups 26705183 Within Groups 18003.125 Total 26723186

df

Mean Square F 9 2967242.535 1648.182 10 1800.313 19

Sig. .000

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

SUHU

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Value Label 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: KONS Source Corrected Model Intercept SUHU Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 26705182.8a 46367737.8 26705182.8 18003.125 73090923.8 26723185.9

df 9 1 9 10 20 19

Mean Square F 2967242.535 1648.182 46367737.81 25755.383 2967242.535 1648.182 1800.313

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = .999 (Adjusted R Squared = .999)

64

Post Hoc Tests SUHU Homogeneous Subsets KONS Duncan SUHU 90 0 80 10 70 20 30 40 60 50 Sig.

a,b

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

1 304.500

2

3

4

Subset 5

6

7

8

9

432.000 480.750 734.500 857.000 1137.000 1809.500 2782.000 3152.000 1.000

.277

1.000

1.000

1.000

1.000

1.000

1.000

3537.000 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 1800.313. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

65

b. Pengaruh suhu dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Oneway ANOVA KONS

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 1459931 7937.500 1467869

df 9 10 19

Mean Square 162214.583 793.750

F 204.365

Sig. .000

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

SUHU

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Value Label 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: KONS Source Corrected Model Intercept SUHU Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 1459931.250a 4574461.250 1459931.250 7937.500 6042330.000 1467868.750

df 9 1 9 10 20 19

Mean Square 162214.583 4574461.250 162214.583 793.750

F 204.365 5763.101 204.365

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = .995 (Adjusted R Squared = .990)

66

Post Hoc Tests SUHU Homogeneous Subsets KONS Duncan

a,b

SUHU 70 80 60 90 0 50 10 20 30 40 Sig.

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

1 140.750 152.000 153.250

Subset 3

2

4

5

267.000 484.500 513.250 678.250 709.500

.681

1.000

.332

.293

842.000 842.000 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 793.750. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

Lampiran 10. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada suhu yang berbeda Oneway ANOVA INHIBISI

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 24026.759 83.887 24110.646

df 9 10 19

Mean Square 2669.640 8.389

F 318.243

Sig. .000

67

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

SUHU

Value Label 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

N 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: INHIBISI Source Corrected Model Intercept SUHU Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 24026.759a 51514.675 24026.759 83.887 75625.320 24110.646

df 9 1 9 10 20 19

Mean Square 2669.640 51514.675 2669.640 8.389

F 318.243 6140.964 318.243

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = .997 (Adjusted R Squared = .993)

Post Hoc Tests SUHU Homogeneous Subsets INHIBISI a,b

Duncan SUHU 0 90 10 20 30 80 40 70 50 60 Sig.

N

1 2 -12.4811 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1.000

2

3

Subset 4

5

6

7

12.3153 13.1184 38.3006 53.9205 67.4803 69.9611 83.5754 85.9618 .787

1.000

1.000

.412

.429

95.3647 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 8.389. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

68

Lampiran 11. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh lama pemanasan a. Pengaruh lama pemanasan tanpa penambahan CuSO4 Oneway ANOVA KONS

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 4493934 2178.125 4496112

df

Mean Square 641990.569 272.266

7 8 15

F 2357.957

Sig. .000

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

WAKTU

1 2 3 4 5 6 7 8

Value Label 0 10 20 30 40 50 60 300

N 2 2 2 2 2 2 2 2

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: KONS Source Corrected Model Intercept WAKTU Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 4493933.984a 2378920.641 4493933.984 2178.125 6875032.750 4496112.109

df 7 1 7 8 16 15

Mean Square 641990.569 2378920.641 641990.569 272.266

F 2357.957 8737.499 2357.957

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = 1.000 (Adjusted R Squared = .999)

69

Post Hoc Tests WAKTU Homogeneous Subsets KONS Duncan

a,b

WAKTU 60 300 30 40 50 20 10 0 Sig.

N 2 2 2 2 2 2 2 2

1 82.000 82.000 83.250 84.500 84.500 87.000

Subset 2

3

1114.500 .782

1.000

1467.000 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 272.266. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

b. Pengaruh lama pemanasan dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Oneway ANOVA KONS

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 1355415 26946.875 1382362

df

Mean Square 193630.748 3368.359

7 8 15

F 57.485

Sig. .000

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

WAKTU

1 2 3 4 5 6 7 8

Value Label 0 10 20 30 40 50 60 300

N 2 2 2 2 2 2 2 2

70

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: KONS Source Corrected Model Intercept WAKTU Error Total Corrected Total

Type III Sum of Squares 1355415.234a 1131298.141 1355415.234 26946.875 2513660.250 1382362.109

df

Mean Square 193630.748 1131298.141 193630.748 3368.359

7 1 7 8 16 15

F 57.485 335.860 57.485

Sig. .000 .000 .000

a. R Squared = .981 (Adjusted R Squared = .963)

Post Hoc Tests WAKTU Homogeneous Subsets KONS Duncan

a,b

WAKTU 40 50 30 300 60 20 10 0 Sig.

N 2 2 2 2 2 2 2 2

Subset 1 2 95.750 97.000 98.250 98.250 99.500 102.000 719.500 817.000 .922 .131

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 3368.359. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

Lampiran 12. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada lama pemanasan yang berbeda Oneway ANOVA INHIBISI

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 10065.508 335.540 10401.047

df 7 8 15

Mean Square 1437.930 41.942

F 34.283

Sig. .000

71

Univariate Analysis of Variance Between-Subjects Factors

LAMA

Value Label 0 10 20 30 40 50 60 300

1 2 3 4 5 6 7 8

N 2 2 2 2 2 2 2 2

Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: INHIBISI Type III Sum of Squares 10065.508a 156.692 10065.508 335.540 10557.740 10401.047

Source Corrected Model Intercept LAMA Error Total Corrected Total

df 7 1 7 8 16 15

Mean Square 1437.930 156.692 1437.930 41.942

F 34.283 3.736 34.283

Sig. .000 .089 .000

a. R Squared = .968 (Adjusted R Squared = .940)

Post Hoc Tests LAMA Homogeneous Subsets INHIBISI Duncan LAMA 60 300 30 20 50 40 10 0 Sig.

a,b

N 2 2 2 2 2 2 2 2

Subset 1 2 -21.3415 -19.8171 -17.9319 -17.3383 -15.1962 -13.3136 35.4615 44.4417 .281 .203

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 41.942. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. b. Alpha = .05.

72

Lampiran 13. Data kinetika inhibisi suhu 40°C Enzyme Kinetics Model Comparison Notebook1 8/5/2006 6:36:33 AM Study Type: Single Substrate - Single Inhibitor Number of Replicates: 2 Rank by R² 1 2 3 4 5 6 7 8

Equation

R²

Mixed (Partial)* 0.99880 Competitive (Full) 0.99879 Mixed (Full) 0.99879 Competitive (Partial) 0.99879 Noncompetitive (Partial) 0.99686 Noncompetitive (Full) 0.99686 Uncompetitive (Partial) 0.99258 Uncompetitive (Full) 0.99258

AICc

Sy.x

116.1615.25916 110.5965.09946 113.4225.18972 113.4225.18972 143.9778.36541 141.1518.21991 171.43212.84673 168.60612.62329

Runs Test Convergence

pass pass pass pass fail fail fail fail

Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes

*) Model terpilih berdasarkan nilai R2 tertinggi, AICc terendah, dan Sy.x terendah

Enzyme Kinetics Nonlinear Fit Results Notebook1 8/5/2006 6:36:33 AM Mixed (Partial) Number of Replicates: 2 Parameters Vmax Km Ki alpha beta

Value 288.3556 8.5628 0.5817 75.0981 3.1027

Goodness of Fit Degrees of Freedom AICc R² Sum of Squares Sy.x Runs Test p Value Data Number of x values Number of replicates Total number of values Number of missing values βI ⎞ ⎛ ⎜ ( Ki + ) ⎟ α ⎟[ S ] v maks ⎜ ⎜ ( Ki + I ) ⎟ ⎜ ⎟ ⎝ ⎠ v= [s] + K M

±Std. Error 95% Conf. Interval 8.7192 270.4650 to 306.2462 0.7148 7.0960 to 10.0296 96,258.0886 -1.975e+5 to 1.975e+5 1.738e+8 -3.566e+8 to 3.566e+8 4.932e+6 -1.012e+7 to 1.012e+7 27 116.161 0.999 746.787 5.259 0.236 16 2 32 0

K M ( Ki + I ) 1 1 ( Ki + I ) 1 + ⋅ = ⋅ βI βI [S ] v Vmaks ( Ki + ) Vmaks ( Ki + )

α

α

73

Lampiran 14. Data kinetika inhibisi suhu 50°C Enzyme Kinetics Model Comparison Notebook2 8/5/2006 6:42:22 AM Study Type: Single Substrate - Single Inhibitor Number of Replicates: 2 Rank by R² 1 2 3 4 5 6 7 8

Equation

R²

Mixed (Partial)* 0.99698 Competitive (Full) 0.99666 Competitive (Partial) 0.99666 Mixed (Full) 0.99666 Noncompetitive (Partial)0.99539 Noncompetitive (Full) 0.99539 Uncompetitive (Full) 0.99058 Uncompetitive (Partial)0.99058

AICc

Sy.x

130.6496.59516 128.0186.69490 130.8446.81340 130.8446.81340 141.2098.01123 138.3837.87193 161.23511.24995 164.06111.44908

Runs Test Convergence pass pass pass pass pass pass fail fail

Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes

*) Model terpilih berdasarkan nilai R2 tertinggi, AICc terendah, dan Sy.x terendah

Enzyme Kinetics Nonlinear Fit Results Notebook2 8/5/2006 6:42:22 AM Mixed (Partial) Number of Replicates: 2 Parameters Vmax Km Ki alpha beta

Value ±Std. Error 95% Conf. Interval 356.6163 30.5212 293.9907 to419.2418 21.1456 3.2419 14.4936 to27.7976 2.873e-9 0.4394 -0.9015 to 0.9015 1,201.3049 5,371.8099 -9,820.9561 to 12,223.5659 232.5060 1,036.1233 -1,893.4854 to 2,358.4973

Goodness of Fit Degrees of Freedom AICc R² Sum of Squares Sy.x Runs Test p Value Data Number of x values Number of replicates Total number of values Number of missing values βI ⎞ ⎛ ⎜ ( Ki + ) ⎟ α ⎟[ S ] ⎜ v maks ⎜ ( Ki + I ) ⎟ ⎜ ⎟ ⎝ ⎠ v= [s] + K M

27 130.649 0.997 1,174.395 6.595 0.351 16 2 32 0

K M ( Ki + I ) 1 1 ( Ki + I ) 1 + ⋅ = ⋅ βI βI [S ] v Vmaks ( Ki + ) Vmaks ( Ki + )

α

α

74

Lampiran 15. Data kinetika inhibisi suhu 60°C Enzyme Kinetics Model Comparison inhibisi 60.JNB 8/14/2006 6:47:16 PM Study Type: Single Substrate - Single Inhibitor Number of Replicates: 2 Rank by R² 1 2 3 4 5 6 7 8

Equation

R²

Mixed (Partial) 0.99015 Mixed (Full) 0.99015 Competitive (Full)* 0.99015 Competitive (Partial) 0.99015 Noncompetitive (Full) 0.99015 Uncompetitive (Full) 0.98910 Uncompetitive (Partial) 0.98910 Noncompetitive (Partial) 0.95352

AICc

Sy.x

129.5108.37565 126.2388.19932 123.2508.03368 126.2388.19935 123.2518.03390 126.0888.45138 129.0858.62703 169.68317.81162

Runs Test Convergence pass pass pass pass pass pass pass fail

Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes

*) Model terpilih berdasarkan nilai R2 tertinggi, AICc terendah, dan Sy.x terendah

Enzyme Kinetics Nonlinear Fit Results inhibisi 60.JNB 8/14/2006 6:47:14 PM Competitive (Full) Number of Replicates: 2 Parameters Vmax Km Ki

Value 1.732e+7 3.555e+6 11.3719

Goodness of Fit Degrees of Freedom AICc R² Sum of Squares Sy.x Runs Test p Value Data Number of x values Number of replicates Total number of values Number of missing values

v=

vmaks KM I (1 + ( ) ⋅ (1 + )) S Ki

±Std. Error 3.714e+11 7.624e+10 2.8686

95% Conf. Interval -7.649e+11 to 7.649e+11 -1.570e+11 to 1.570e+11 5.4638 to17.2800

25 123.250 0.990 1,613.500 8.034 0.306 14 2 28 0

1 1 1 = + ⋅ v vmaks [ S ]

K M (1 +

I ) Ki

vmaks

75