Masarykova univerzita Lékařská fakulta
Imunoturbidimetrické stanovení ferritinu – validace metody.
Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant
Vedoucí diplomové práce:
Autor:
Prim. MUDr. Tomáš Šálek
Bronislava Jahodová
Brno, duben 2012
1
Jméno a příjmení autora: Bronislava Jahodová
Název bakalářské práce: Imunoturbidimetrické stanovení ferritinu – validace metody.
Pracoviště: Oddělení klinické biochemie, KNT. Bati, a. s. Zlín
Vedoucí bakalářské práce: Prim. MUDr. Tomáš Šálek
Rok obhajoby bakalářské práce: 2012
Souhrn:
Validace/verifikace analytické metody je proces, nezbytný pro rozhodování o jejím využití v daných podmínkách biochemické laboratoře. Práce obsahuje zkrácenou validaci imunoturbidimetrické metody Quantia ferritin od firmy Abbott. Byly testovány základní výkonnostní parametry metody: opakovatelnost, mezilehlá preciznost, pracovní rozsah, mez detekce, mez stanovitelnosti a bias. Výsledky jsou porovnány s firemní dokumentací. Dále bylo provedeno srovnání výsledků pacientských vzorků, naměřených imunoturbidimetrickou (IMT) metodou a metodou chemiluminiscenční (CMIA), kterou se ferritin v naší laboratoři v současné době vyšetřuje. V závěru se práce také zabývá referenčními hodnotami a jejich verifikací.
Klíčová slova: Ferritin, imunoturbidimetrie, chemiluminiscence, validace, verifikace.
Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.
2
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně po vedením primáře MUDr. Tomáše Šálka, a konzultanta RNDr. Svatavy Vaňkové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje.
Ve Zlíně dne: 10.4.2012
……………………………… ( vlastnoruční podpis autora )
3
Děkuji paní RNDr. Vaňkové S. a MUDr. Šálkovi T. za odborné vedení, pomoc při zpracování a v neposlední řadě i za ochotu a čas věnovaný této bakalářské práci. Jejich cenné rady, připomínky, znalosti a bohaté zkušenosti byly pro mě velkým přínosem. Děkuji také kolektivu našeho oddělení za podporu a ochotu při spolupráci.
4
Obsah:
1. Úvod
8
2. Teoretická část
9
2.1.Chemická struktura ferritinu
9
2.2.Funkce ferritinu v organismu
10
2.2.1. Homeostáza železa
10
2.2.2. Úloha ferritinu v homeostáze železa
13
2.3.Klinické využití ferritinu
14
2.3.1 Referenční hodnoty
16
2.4.Validace a verifikace analytických metod
18
2.4.1. Pojem validace
18
2.4.2. Pojem verifikace
19
2.4.3. Kdy se provádí validace/verifikace
20
2.4.4. Výkonnostní parametry metody
21
3. Experimentální část
23
3.1.Metody a instrumentace
23
3.2.Použité reagencie
24
3.3.Biologický materiál
25
3.4.Statistické postupy
25
4. Výsledková část
28
4.1.Výsledky a jejich hodnocení
28
4.1.1. Opakovatelnost
28
4.1.2. Mezilehlá preciznost
28 5
4.1.3. Pracovní rozsah měření, ověření kalibrační funkce
33
4.1.4. Stanovení meze detekce a meze stanovitelnosti
36
4.1.5. Porovnatelnost metod
37
4.1.6. Vychýlení (Bias) metody
44
4.1.7. Verifikace referenčních hodnot
45
5. Závěr
50
5.1.Shrnutí dosažených výsledků
50
5.2.Závěrečné hodnocení
51
6. Seznam použité literatury
52
6
Symboly a zkratky ACHN
Anémie chronických nemocí
AM
Aritmetický průměr
CE
Conformité Européenne (značka evropské shody)
CLSI
Clinical Laboratory Standard Institute
CMIA
Chemiluminiscent Mikroparicle Immunoassay
ConV
Consensus value (průměry skupin)
CRM
Certifikovaný referenční materiál
CV
Variační koeficient
ČSKB
Česká společnost klinické biochemie
EHK
Externí hodnocení kvality
ILMA
Imunoluminiscenční analýza
IMT
Imunoturbidimetrie
IS
Interval spolehlivosti
IVD MD
In vitro Diagnostic Medical Device
LoD
Limit of detection (mez detekce)
LoQ
Limit of quantification (mez stanovitelnosti)
LR
Likelihood ratio (věrohodnostní poměr)
r
Korelační koeficient
SD
Směrodatná odchylka
SEKK
Systém externí kontroly kvality
VKK
Vnitřní kontrola kvality
WHO
World Hospital Organization
7
1. Úvod Ferritin je intracelulární bílkovina, jejíž hlavní funkcí v buňce je skladování železa a jeho kontrolované uvolňování. Tento protein je produkován téměř všemi živými organismy včetně bakterií, řas vyšších rostlin a živočichů. U člověka slouží současně jako ochrana proti nedostatku, ale i nadbytku železa. Tuto bílkovinu, neobyčejně bohatou na železo objevil český lékař, fyziolog Vilém Laufberger. Svůj objev poprvé publikoval v časopise Biologické listy v roce 1934 (19). V klinické biochemii je ferritin využíván především jako marker první volby pro diagnostiku anémií z nedostatku železa. Cílem předkládané práce je validovat/verifikovat imunoturbidimetrické stanovení ferritinu na biochemickém analyzátoru Architect c8000. V laboratoři OKB v KNTB, a.s. dosud vyšetřujeme ferritin metodou imunochemiluminiscence na imunochemickém analyzátoru Architect i2000. Změna dosud používané metody na metodu imunoturbidimetrickou vychází z praktických požadavků laboratoře. Jedním z nich je snaha umístit všechny markery zainteresované v buněčné homeostáze železa (Fe, transferin, transferinové receptory a ferritin) na jeden (biochemický) analyzátor a tím přispět ke snížení potřeby alikvotace vzorků. Další důvod je ekonomický. Při zavádění nové metody je laboratoř povinna tuto metodu verifikovat, případně validovat ve svých laboratorních podmínkách. V případě ferritinu byla zvolena validace, protože nás zajímaly další výkonnostní parametry, které verifikace nezahrnuje. Jsou to mez detekce, mez stanovitelnosti, ověření referenčních mezí, ale především srovnání výsledků, dosažených novou a dosud používanou metodou. Na druhou stranu nebyla realizována validace některých parametrů, které přesahují možnosti laboratoře, ale i rozsah předkládané práce (výtěžnost, interference). Při měření jednotlivých analytických parametrů metody jsem až na malé výjimky postupovala podle doporučení ČSKB k provádění validace a verifikace analytických metod v klinických laboratořích (4).
8
2. Teoretická část 2.1.
Chemická struktura ferritinu
Makromolekula ferritinu je proteinový globulární komplex o molekulové hmotnosti cca 474 kDa, který tvoří 24 bílkovinných podjednotek. U většiny obratlovců jsou podjednotky dvojího typu, označované jako L-(Light, Liver) a H-(Heavy, Heart) o molekulové hmotnosti 19 a 21 kDa. Tyto podjednotky se organizují do struktur, které mají tvar duté koule. Koule má v průměru 80 angströmů a tloušťka stěny je přibližně 10 angströmů. Ferritiny se od sebe liší zastoupením L- a H- podjednotek a to závisí na tkáni, ze které ferritin pochází. Jsou také označovány jako izoferritiny. Oba typy těchto podjednotek jsou potřebné pro normální funkci ferritinu. H-ferritin je peroxidáza a její aktivita usnadňuje rychlou inkorporaci atomu železa do ferritinových komplexů a na druhé straně je toto železo rychleji z ferritinu uvolňováno. Izoferritiny, bohaté na L-podjednotky přijímají železo pomaleji a déle je skladují. Ferritin má tvar duté koule, přičemž každá je schopna pojmout několik tisíc atomů trojmocného železa (Obr. 1) Casidy (2). To je uloženo uvnitř kulovité molekuly ve formě komplexní sloučeniny [FeO(OH)]8 [FeO( H2 PO4 ) ]. Ve struktuře kulovité makromolekuly se nacházejí kanálky, malé dutinky, kterými mohou procházet ionty nebo molekuly. Tyto kanálky jsou zcela zásadní pro schopnost ferritinu uvolňovat železo kontrolovaným způsobem. Vznikají v průsečíku tří nebo čtyř peptidových podjednotek. Existují dva typy kanálků, které mají odlišné chemické vlastnosti a plní i odlišnou funkci. Jak již bylo řečeno, železo je uloženo uvnitř duté koule v krystalické, nerozpustné podobě. Pokud má být uvolněno z ferritinu, musí být krystalová mřížka narušena. Uvolnění železa je spojeno s jeho redukcí na dvojmocné ionty Fe2+.Ty jsou hydratovány molekulami vody na hexaakvoželeznatý kation Fe(H2O)62+. V této formě opouští železo přes již zmíněné kanálky molekulu ferritinu. Transport usnadňuje polární charakter kanálků, které obsahují ve velké míře kys. asparágovou a glutámovou s polárními postranními řetězci.
9
Obr. 1: Molekula ferritinu. Casidy (2)
2.2.
Funkce ferritinu v organismu
2.2.1. Homeostáza železa
Železo se ze všech biogenních kovů vyskytuje v lidském těle v největším množství, což představuje asi 35 mg/kg u žen a 45 mg/kg u mužů, Novotný (2007) (12). Největší podíl celkového množství železa je obsažen v hemoglobinu (60-70 %), asi 10 % je součástí myoglobinu, cytochromů a dalších enzymů (katalázy, peroxidázy, ribonukleotidreduktázy aj.), asi 20-30 % tvoří zásobní pool v podobě vazby na ferritin, méně jak 1 % je obsaženo v cirkulujícím poolu v krevním řečišti. Vedle své nejznámější funkce transportu kyslíku, plní železo i řadu dalších vitálních funkcí. Je nezbytné pro syntézu nukleových kyselin, syntézu řady proteinů, účastní se řízení buněčné proliferace, buněčné diferenciace a apoptózy. Je nutné pro syntézu myelinu a formování dendritů neuronů, což se odráží v ovlivňování pochodů učení a paměti. Pozornost řady vědeckých týmů je upřena na úlohu železa v procesech stárnutí tkání, neurodegenerace, maligního bujení, aterosklerózy a role železa v imunitním systému. 10
Vzhledem k obrovskému biologickému významu na straně jedné a potenciální toxicitě na straně druhé musí být přísun železa do buněk a jeho celkový obsah v organismu precizně regulován. Pro tyto účely má organismus specializované bílkoviny, určené pro získávání, transport nebo ukládání železa ve vázané netoxické formě, Pospíšilová (2007) (14). K nejlépe popsaným a nejdéle známým proteinům, zapojeným do metabolizmu železa patří transferin, transferinové receptory a ferritin. Železo je v organismu transportováno mezi místy absorpce, skladování a utilizace transportním glykoproteinem – transferinem, který váže železo těsně, ale reverzibilně. Chelatace železa vazbou na transferin jej udržuje v rozpustné formě, předchází tvorbě kyslíkových radikálů a umožňuje transport železa do buněk. Při nedostatku železa se zvyšuje exprese genu pro transferin s následným zvýšením jeho syntézy v játrech. Celkové množství plazmatického transferinu reprezentuje celkovou vazebnou kapacitu plazmy pro železo. Za fyziologických podmínek je transferin nasycen asi ze 30 % (saturace transferinu). Železo vázané na transferin je krví transportováno k povrchu buněk, kde je vázáno na další bílkovinu a tou je transferinový receptor. Endocytózou je potom transportováno do buněk, kde je spotřebováno pro metabolické procesy nebo ukládáno v buňce po vazbě na další velmi důležitou bílkovinu a tou je ferritin. Ferritin je hlavním ukazatelem zásob železa v organismu. Je současně reaktantem akutní fáze a tato jeho funkce je nadřazena funkci ukazatele zásob. Při zánětu proto může být hladina ferritinu zvýšená i přes jeho nedostatek v organismu. V posledních letech byla identifikována řada dalších genů, jejichž proteinové produkty hrají důležitou úlohu v metabolizmu železa. Jde především o tři nově popsané proteiny: ferroportin, hepcidin a DMT1 protein. Ferroportin je hlavní protein zajišťující export železa z enterocytů a makrofágů do krevního oběhu. Blokáda jeho funkce vede k zastavení exportu železa z buněk do krevního oběhu a k jeho hromadění ve formě intracelulárního ferritinu v obou typech buněk. Hepcidin je nízkomolekulární peptid, tvořený 25 aminokyselinami a syntetizovaný v játrech. Poprvé byl izolován z lidského séra a moči v roce 2001. Je považován za klíčový regulátor resorpce a kinetiky železa v organismu. Ovlivňuje vstřebávání železa enterocyty a jeho uvolňování z makrofágů. Jeho exprese se zvyšuje při nadměrném množství železa. Hepcidin snižuje jeho vstřebávání v duodenu a způsobuje jeho retenci v makrofázích. Produkce hepcidinu se zvyšuje také při zánětu a je tedy považován i za protein akutní fáze.
11
DMT1 protein je exprimován na povrchu všech buněk. Zajišťuje transport železa přes apikální membránu enterocytů a transport z transferinu do nitra makrofágů. Přehled proteinů, zainteresovaných v metabolizmu železa je dále přehledně uveden v tabulce 1, Neuwirtová (2010) (11). Objev a objasnění funkce těchto proteinů má značný klinický význam. Přinesly důležité poznatky pro pochopení patogeneze ACHN a hemochromatóz. Chemické vlastnosti železa, které jsou důležité pro nesčetné biochemické reakce, mohou být pro organismus nebezpečné. Toxické jsou především volné ionty dvojmocného železa. Jejich toxicita je dána schopností Fe
2+
tvořit volné kyslíkové radikály. Železnatý ion se
uplatňuje v tzv. Haber-Weiss-Fentonově reakci, kdy Fe
2+
iniciují tvorbu peroxidu vodíku,
který pak oxiduje ion přechodného kovu v nižším mocenství, tedy i železo a současně vzniká velmi reaktivní hydroxylový radikál, Sedláčková (2009) (20). Fe 2+
+
O2
→
Fe 3+
+
O2.
2 O2.
+
2H+
→
H2 O2
+
O2
Fe 2+
+
H2 O2
→
Fe 3+
+ .OH + OH.
Produkce volných radikálů pak může vést k závažnému poškození organismu. Proto se snaží této reakci zabránit, např. likvidací peroxidu vodíku pomocí katalázy a glutathionperoxidázy nebo oxidací Fe
2+
na Fe
3+
ceruloplasminem a inaktivací trojmocného železa vazbou na
specifické proteiny – transferin, ferritin nebo laktoferin nebo jeho chelatací. Metabolismus železa je regulován tak, aby ho bylo dostatek pro hemopoézu, ale zároveň aby se nikde nevyskytovalo ve dvoumocné formě. Jeho regulace probíhá jak na buněčné, tak na systémové úrovni. Množství železa v organismu je v podstatě stálé, protože denní příjem potravou vyrovnává pouze denní ztráty železa, jinak dochází k jeho recirkulaci. Neexistuje žádný mechanismus, který by zajistil vyloučení přebytečného železa, proto jsou jeho příjem a další distribuce v organismu velmi přísně řízeny řadou zmíněných speciálních bílkovin a peptidů.
12
Tabulka 1: Proteiny, účastnící se metabolismu železa, železa, Neuwirtová (2010) (11 (11)
2.2.2. Úloha ferritinu v homeostáze homeostáze železa
Jak již bylo řečeno, ferritin f hraje jednu z klíčových klíčových rolí v homeostáze železa, jeho hlavní funkcí je skladování železa v buňce. Z ferritinu ritinu se může tvořit další zásobní forma Fe - hemosiderin hemosiderin. Molekulární povahu hemosiderinu lze jen obtížně definovat. definovat Jedná edná se o komplex, který tvoří ferritin, itin, denaturovaný fer itin a další materiál, ferritin materiál, Bowen (2001) (1)).. Je pravděpodobně pravděpodobně výsledkem nekompletní lysozomální degradace ferritinu. lysozomální fer . Nachází se pouze uvnitř buněk, necirkuluje v krevním 13
oběhu. Železo z hemosiderinu je pro organismus špatně dostupné, jeho tvorba je v úzkém vztahu k fagocytóze červených krvinek a hemoglobinu. Naopak ferritin reaguje velmi citlivě na potřeby organismu. Je přítomen jednak v buňkách a jednak cirkuluje v krvi ve formě glykosylovaného ferritinu. Hladiny v séru jsou poměrně nízké a velmi dobře korelují s celkovou zásobou železa v organismu. Jeho biosyntéza je řízena koncentrací železa v buňce. Tato regulace probíhá na úrovni translace. Bílkovina s názvem železo vázající protein slouží jako senzor cytoplazmatické koncentrace železa. Když je koncentrace železa nízká, tento protein neváže železo a je schopen se navázat na 5‘ konec messenger RNA pro ferritin a tímto způsobem blokuje translaci mRNA. A opačně, když je koncentrace železa vysoká a buňky potřebují ferritin, aby je chránil, regulační protein váže železo. Tím je znemožněna vazba na ferritin mRNA a tím translace, takže syntéza ferritinu může probíhat.
2.3.
Klinické využití ferritinu
Hladiny ferritinu v krvi jsou poměrně nízké, ale velmi dobře korelují s celkovým množstvím zásob železa v organismu. Z těchto důvodů je ferritin v klinické biochemii využíván jako marker první volby pro stanovení deficitu železa. Nedostatek železa je celosvětově nejrozšířenější nutriční deficiencí. Ve vyspělých státech prevalence anémie z nedostatku železa v posledních desetiletích prudce poklesla, avšak problémem stále zůstává subklinická sideropenie. Ta se týká především dětí ve věku od 1 do 3 let, adolescentů obou pohlaví, žen v produktivním věku, ale i starší generace. Stanovení sérového ferritinu spolu s parametry krevního obrazu spolehlivě diagnostikuje nekomplikované anémie z nedostatku železa. Pro odhalení subklinické (prelatentní) sideropenie je doporučován ferritin v kombinaci s transferinovými receptory. Koncentrace ferritinu v séru výrazně klesá jako první z krevních markerů, již při snižování zásob železa (obr.2), Suominen (1998) (21). Jak ferritin tak transferinové receptory procházejí v průběhu vývoje sideropenie charakteristickými změnami. Během I. stadia poklesu zásob železa progresivně klesá ferritin, zatímco koncentrace transferinových receptorů ani hemoglobinu se nemění. Jakmile pokles zásob železa dosáhne určité hranice, dochází k omezování syntézy hemoglobinu i ostatních funkčních bílkovin obsahujících železo. Na obr. 2 je tento stav označen jako II. stadium, deficientní erytropoéza z nedostatku železa. Zde je jediným indikátorem zvýšená koncentrace transferinových receptorů v séru. Teprve ve třetím stadiu 14
rozvoje anémie (funkční unkční nedostatek železa) dochází k poklesu poklesu koncentrace hhemoglobinu moglobinu pod normální hodnoty. hodnoty
Obr 2: Změny ukazatelů sideropenie s nárůstem růstem deficience železa, Suominen (1998) (21)
V Využití ferritinu itinu v diferenciální diagnostice anémií má však svá omezení. Ferritin Fer je také proteinem akutní fáze, takže takže u pacientů se zánětlivým onemocněním nacházíme v různé míře zvýšené koncentrace ferritinu fer v séru. Právě v těchto situacích vyšetření deficitu železa výborně doplňují transferinové receptory. Jejich koncentrace v séru není ení ovlivněna ovlivně zánětlivými procesy v organismu. organis Zvýšené hladiny ferritinu nacházíme také u pacientů s hemochromatózou, což je geneticky podmíněné onemocnění, při kterém je v tenkém střevě absorbováno velké množství železa. Dále je ferritin fer itin i nespecifickým nádorovým markerem s hlavním využitím u hematologických malignit, zejména u akutní myeloblastické leukémie a Hodgkinovy nemoci. K nespecifickému zvýšení může dojít i u řady dalších nádorů - hematomy, terminální nádo nádory, ry, karcinomy prsu a pli plic. Fer itin je také doporučen jako marker stavu zásob železa u dialyzovaných pacientů. Pro Ferritin podávání železa u dialyzovaných pacientů je podle National Kidney Foundation Kidney Disease a Dialysis Outcome Quality Initiative Initiative doporučena hranice ferritinu v séru 800 µg/l, µg Kalantar Zadeh, aj. (2004) (10). Podle těchto doporučení by při Kalantar-Zadeh, při vyšších koncentracích 15
ferritinu měla být suplementace přerušena vzhledem k možnosti předávkování železem. Stanovení této hranice je však velmi problematické právě proto, že ferritin je současně proteinem akutní fáze a prevalence zánětlivých procesů u dialyzovaných pacientů je vysoká. Autoři Kalantar-Zadeh aj. (2004) (10) se ve své práci zabývají právě problematikou vztahů mezi sérovým ferritinem a zásobami železa, zánětlivými procesy a malnutricí u pacientů na dialýze. Z jejich studie, kterou provedli u 82 hemodialyzovaných pacientů vyplývá, že i vyšší hodnoty ferritinu v séru v rozmezí 800 - 2000 µg/l jsou způsobeny spíše záněty a malnutricí, než předávkováním železem. To bylo potvrzeno až u pacientů s hodnotami ferritinu nad 2000 µg/l.
Hlavní indikace k vyšetření ferritinu: 1) Detekce deficitu železa. 2) Monitorování odpovědi na perorální léčbu železem. 3) Diferenciální diagnostika anémií. 4) Monitorování zásob železa u chronického renálního selhání (včetně dialyzovaných). 5) Detekce stavů akumulace Fe a odpověď na léčbu.
2.3.1. Referenční hodnoty
Hladina ferritinu v séru je závislá na pohlaví, věku a mění se v průběhu života. Je vysoká po narození, v průběhu několika měsíců klesá a po jednom roce až do puberty se příliš nemění, hodnoty jsou v průměru nižší než v dospělosti. U zdravých dospělých jsou hladiny ferritinu vyšší u mužů než u žen. U seniorů pak dochází k mírnému zvýšení. Pro správné využití ferritinu v klinické biochemii, zejména pro včasné odhalení subklinické anémie je zásadní správné určení referenčních hodnot. Metody pro stanovení ferritinu nemají návaznost na standardní referenční materiál nebo na referenční metodu. Proto pro ně platí, stejně jako pro většinu imunochemických metod, že získané výsledky jsou závislé na použité metodě, případně na použité instrumentaci. Proto laboratoře v těchto případech používají nejčastěji referenční meze, doporučené ve firemní dokumentaci. Ty jsou zpravidla stanoveny měřením vybrané skupiny probandů s „definovaným stavem zdraví“. Interval referenčních hodnot je určen neparametrickou metodou. Dolní mez jako 2,5 nebo 5 percentil a horní mez jako 97,5 nebo 95 percentil. Tak jsou definovány referenční meze i ve firemní dokumentaci firmy Abbott (5). 16
V příbalovém letáku pro chemiluminiscenční metodu je uveden 95 % ref. interval: muži
22 – 275 µg/l
ženy
5 – 204 µg/l
Tyto hodnoty byly získány vyšetřením 32 zdravých mužů a 60 zdravých žen. Dále je v dokumentaci uvedeno, že hladiny ferritinu nižší než 10 µg/l jsou známkou anémie z nedostatku železa. Již z této diskrepance je zřejmé, že hladinu 5 µg/l nelze přijmout za dolní mez referenčního rozmezí pro ženy. V dokumentaci k imunoturbidimetrické metodě (17) jsou uvedeny následující referenční meze: děti a dospívající
15 – 120 µg/l
muži
30 - 300 µg/l
ženy do 50 let
15 - 160 µg/l
ženy nad 50 let
20 – 300 µg/l
Další informace o způsobu, jakým byly referenční hodnoty získány, ani údaje o referenční skupině probandů nejsou uvedeny. Podobná je situace v příbalové dokumentaci i u jiných firem. Jen výjimečně jsou uvedeny pouze jedny ref. hodnoty bez rozlišení pohlaví a věku. Nejčastěji jsou rozlišeny hodnoty pro muže a ženy. Někdy jsou ženy rozděleny na dvě skupiny, před a po menopauze. Jen zřídka jsou uvedeny ref. meze pro děti, případně je odkaz na odbornou literaturu. Je zřejmé, že dolní mez referenčního intervalu, určená jako 2,5 percentil není pro vyloučení subklinické sideropenie vyhovující. Do výběru mohou být zahrnuti pacienti (zejména u menstruujících žen a dospívajících) s mírným nedostatkem železa, kteří dolní hranici ref. intervalu posouvají k nižším hodnotám. V odborné literatuře, která se věnuje určení koncentrace ferritinu (rozhodovacího limitu), která odliší prelatentní sideropenii od fyziologického stavu se nejčastěji objevuje hodnota kolem 20 µg/l (21,15,9). V těchto studiích jsou koncentrace ferritinu u vyšetřovaných osob porovnávány s dalšími ukazateli zásob železa, především s vyšetřením makrofágů kostní dřeně a se solubilními transferinovými receptory. V publikaci Evidence Based Laboratory Medicine (15) jsou uvedeny výsledky studie, zabývající se úlohou ferritinu v diagnostice anémií z nedostatku železa. Koncentrace ferritinu jsou porovnány s vyšetřením kostní dřeně na železo. Z výsledků vyplývá, že u pacientů s koncentrací ferritinu pod 20 µg/l bylo zjištěno vysoké riziko sideropenie, vyjádřené vysokou hodnotou věrohodnostního poměru LR. 17
Chrobák (2001) (9) v přehledném článku o anémiích uvádí, že hladina sérového ferritinu je dnes pro posouzení zásob železa v organismu nejpoužívanějším a pro průkaz sideropenické anémie nejcennějším testem. Jako fyziologickou hodnotu uvádí u mužů 30 – 400 µg/l a u žen 30 – 150 µg/l. U těhotných žen hladina ferritinu postupně klesá ve třetím trimestru až na hodnoty 17 – 26 µg/l. U zdravých jedinců je sérový ferritin přímo úměrný zásobám železa. U mladší generace se hodnoty ferritinu pod 20 µg/l obecně pokládají za dostatečně průkazné pro anémii z nedostatku železa. S věkem koncentrace ferritinu stoupá. Dále uvádí, že podle některých literárních pramenů se u osob nad 65 let zvyšuje pravděpodobnost sideropenie již u hodnot pod 45 µg/l. Chronické i akutní zánětlivé procesy, jaterní a maligní onemocnění zvyšují hodnoty ferritinu v séru a tím mohou přítomnost sideropenie maskovat. Referenční meze, které používáme v naší laboratoři, vznikly kombinací rozhodovacích limitů, převzatých z klinických studií (dolní referenční mez) a hodnot uvedených ve firemní dokumentaci (horní referenční mez). Referenční meze pro kojence jsou převzaty z publikace Průši (2000) (16).
kojenci 0-6 týdnů
145 – 458 µg/l
kojenci 6 týdnů-1rok
52 – 200 µg/l
děti 1-15 let
20 – 142 µg/l
muži
20 – 275 µg/l
ženy
20 – 204 µg/l
2.4.
Validace a verifikace analytických metod
Definice validace a verifikace a popis použitých validačních nástrojů jsou převzaty z doporučení ČSKB k provádění validace a verifikace analytických metod v klinických laboratořích (4).
2.4.1. Pojem validace
Validaci definuje mezinárodní metrologický slovník jako ověřování, že specifikované požadavky jsou přiměřené pro zamýšlené použití. 18
Validace potvrzuje, že měřící postup /měřící systém/výrobek IVD MD je schopen plnit požadavky na ně kladené. V současné době se v klinické laboratoři používají v naprosté většině validované metody, produkované výrobci in vitro diagnostik v souladu se Směrnicí IVD 98/79 EC. Podle této direktivy musí výrobce uvádět na trh pouze validované výrobky nebo měřící systémy. Validace v laboratoři se musí provést v případech, že dojde k modifikaci metody validované výrobcem nebo u metod, vypracovaných pracovníky laboratoře.
2.4.2. Pojem verifikace
Pojem verifikace se používá v laboratořích pro proces ověřování. Procesem verifikace si laboratoř ověřuje, zda je schopna dosáhnout výrobcem deklarovanou výkonnost validované metody. Verifikace potvrzuje, že validovaný měřící postup /měřící systém/výrobek IVD MD je plně funkční v konkrétní laboratoři. Verifikaci musí klinická laboratoř provádět u všech metod a měřících postupů. Verifikaci můžeme považovat za zkrácenou verzi validace. Pracuje se stejnými nástroji jako validace (Tabulka 2), (4) a jejím cílem je prokázat, že získané hodnoty analytických a výkonnostních znaků jsou ve shodě s hodnotami deklarovanými výrobcem a že jich lze v konkrétní laboratoři docílit za běžných podmínek rutinní činnosti.
19
Tabulka 2:Výkonnostní parametry validace/verifikace analytického postupu (4)
Validace
Verifikace
Opakovatelnost
Opakovatelnost
Mezilehlá preciznost
Mezilehlá preciznost
Vychýlení (Bias)
Vychýlení (Bias)
Pracovní rozsah
Pracovní rozsah
Mez detekce a mez stanovitelnosti Ostatní (matricové interference, srovnání s jinou metodou, srovnání pomocí výsledků EHK, robustnost, výtěžnost…).
2.4.3. Kdy se provádí validace/verifikace
Před zavedením nové metody. Před aplikací nového analytického měřícího systému do laboratoře. Před zavedením nové (jiné) diagnostické soupravy. Pokud rozšíříme použití stávající metody o další účel (např. o další druh biologického materiálu). Ukazuje-li kontrola kvality přetrvávající problém. Při zavedení metody, vypracované pracovníky laboratoře nebo přejaté z jiné laboratoře, nebo literatury. Významná změna instrumentace. Podle validačního/verifikačního plánu.
20
2.4.4. Výkonnostní parametry metody
Opakovatelnost Cílem je kvantifikace náhodné chyby měření v krátkém časovém intervalu, během jedné měřící série.
Mezilehlá preciznost Cílem je kvantifikace náhodné chyby měření v delším časovém intervalu, během více měřících sérií, jak umožňuje stabilita vzorků a reagencií. V obou případech lze alternativně použít buď kontrolní materiály nebo pacientské vzorky. Hodnotí se aritmetický průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient.
Vychýlení (Bias) metody Cílem je odhad systematické chyby měření pomocí analýzy referenčního nebo vhodného kontrolního materiálu. K provedení tohoto odhadu musí být minimalizována náhodná chyba použitím dostatečného počtu opakovaných měření.
Pracovní rozsah měření Cílem je ověřit pracovní rozsah měření v podmínkách laboratoře. U nelineárních závislostí se doporučuje diluční pokus s číselně vyjádřenými hodnotami výtěžnosti (R%).
Mez detekce a mez stanovitelnosti Cílem je stanovit nejnižší hodnotu analytu, kterou lze změřit s přijatelnou mezilehlou precizností. Požadavek na přijatelnou mezilehlou preciznost není jednoznačně určen, u imunochemických metod je za tuto hodnotu často považován variační koeficient 20 %.
Porovnatelnost metod Cílem je porovnání výsledků validované metody s výsledky metody srovnávací. Hodnotí se korelace, vychýlení, případně typ systematické chyby. Ideální srovnávací metodou je referenční měřící postup, v rutinní praxi obvykle nedostupný. Zpravidla se srovnává nová validovaná rutinní metoda s jinou rutinní metodou, např. s metodou, v laboratoři dosud používanou.
21
Ověření referenčního intervalu Názory na validaci/verifikaci referenčních hodnot a její provádění zatím nejsou jednoznačné. V Doporučení ČSKB k provádění validace a verifikace analytických metod v klinických laboratořích (4) není postup pro verifikaci ani validaci referenčních hodnot uveden. Je zde pouze odkaz na dokument Clinical Laboratory Standard Institute C28-A3, který se zabývá definicí, stanovením a verifikací referenčních intervalů v klinické laboratoři. Friedecký (2008) (7) doporučuje provedení verifikace referenčních intervalů jedním ze dvou způsobů, bez experimentů nebo experimentálně. Verifikace bez experimentu: -
Periodické prověřování dat z pracovní dokumentace výrobců IVD.
-
Provádění potřebných korekcí a zdůvodnění, proč bylo použito jiných dat.
-
Porovnání s údaji literárními nebo s doporučeními odborných společností.
-
Kontrola konzistence používaných jednotek měření se soustavou SI.
Experimentální verifikace Předmětem experimentální verifikace jsou referenční intervaly, poskytnuté výrobcem měřícího systému. Účelem je potvrdit, že intervaly, uvedené ve firemní dokumentaci jsou použitelné pro populaci pacientů příslušné laboratoře. Na základě postupu, který vychází z dokumentu CLSI C28-A3 se doporučuje změřit vzorky od 20ti zdravých probandů. Pokud minimálně 18 výsledků bude ležet uvnitř referenčního intervalu, nebo případně pod hodnotou cut-off, jsou doporučené ref. hodnoty považovány za ověřené. Dále Friedecký (2008) (7) uvádí návrh zásad, jak přistupovat k referenčním intervalům: -
Používat referenční intervaly výrobců IVD a verifikovat je pro vlastní laboratorní populaci (bez experimentů nebo experimentálně).
-
Případné změny provádět odůvodněně a s dobrou dokumentací.
-
Hodnoty diagnostických rozhodovacích limitů, podložené příslušnými mezinárodními doporučeními by neměly být měněny. Obvykle totiž reflektují současný stav medicíny založené na důkazech.
22
3. Experimentální část 3.1.
Metody a instrumentace
Metoda, kterou v současné době vyšetřujeme hladinu ferritinu v séru.
Chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích - Chemiluminescent Microparticle Immunoassay ( CMIA). Analyzátor: Architect i 2000 Jedná se o dvoukrokovou imunoanalýzu ke stanovení přítomnosti ferritinu v lidském séru a plasmě. Během prvního kroku se smíchá vzorek s paramagnetickými mikročásticemi, které jsou potaženy protilátkami proti ferritinu. Ferritin přítomný ve vzorku se naváže na tyto protilátky. Po promytí se během druhého kroku přidá konjugát druhé protilátky s akridiniem. Chemiluminiscenční reakce se zahájí tím, že se přidá Pre-Trigger (peroxid vodíku) a Trigger (NaOH). Dojde k oxidační reakci, vzniká excitovaný N-metylakridon, který při návratu do základního energetického stavu uvolní energii ve formě luminiscenčního záření, jehož intenzita se měří luminometrem. Jedná se o heterogenní imunoanalýzu v sendvičovém uspořádání. Separace imunokomplexu probíhá na magnetu. Analytické parametry metody byly v analyzátoru nastaveny podle protokolu firmy Abbott. Množství vzorku, potřebné k analýze je 70 µl. Doba trvání analýzy je 30 minut.
Metoda, která je předmětem validace
Imunoturbidimetrická metoda na latexových částicích. Analyzátor: Architect c 8000 Jedná se o jednokrokovou imunoanalýzu. Polystyrenové částice stejné velikosti jsou potaženy protilátkou proti ferritinu. Po smíchání vzorku séra se suspenzí latexových částic dochází k aglutinaci. Vzniklý zákal se měří na principu turbidimetrie při vlnové délce 572 nm. Analytické parametry metody byly v analyzátoru nastaveny podle protokolu firmy Abbott. Množství vzorku, potřebné k analýze je 25 µl. Doba trvání analýzy je 14 minut. 23
3.2.
Použité reagencie
V obou případech se jedná o diagnostika, která byla uvedena na trh v souladu se zásadami Direktivy IVD 98/79 EC a jsou označena značkou Evropské unie CE. Pro chemiluminiscenční analýzu byly použity: Reagenční souprava Ferritin pro systémy Architect od firmy Abbott (5), která obsahuje: Mikročástice, potažené myšími monoklonálními protilátkami proti ferritinu v TRIS pufru s myšími a bovinními bílkovinnými stabilizátory. Konjugát králičích polyklonálních protilátek proti ferritinu s akridiniem v MES pufru s bovinními bílkovinnými stabilizátory. Další reagencie nejsou součástí soupravy a jsou společné pro všechny CMIA metody. Roztok Pre-Trigger, obsahující 1,32 % peroxid vodíku. Roztok Trigger, obsahující 0,35 M hydroxid sodný. Promývací pufr obsahující fyziologický roztok s fosfátovým pufrem. Ke kalibraci byl použit Ferritin Calibrators od firmy Abbot (6), který je určen ke kalibraci na imunochemických analyzátorech Architect. Kalibrační souprava obsahuje dva kalibrátory s koncentrací 10 a 1000 µg/l. Ferritin v kalibrátoru je lidského původu, připravený ve fosfátovém pufru s proteinem bovinního původu jako stabilizátorem. V dokumentaci se dále uvádí, že je připraven gravimetricky a je standardizován k WHO prvnímu mezinárodnímu standardu 80/602 pro ferritin. Jako kontrolní materiál byl použit multikomponentní kontrolní materiál Abbott immunoassayMCC (Liquid) od firmy Abbott. Kontrola je kapalná, připravena k použití, obsahuje tři koncentrační hladiny.
Pro imunoturbidimetrickou metodu byly použity: Reagenční souprava Quantia Ferritin pro systémy Architect a Aeroset (17), která obsahuje: Činidlo R1 je pufr o hodnotě pH 7,0. Činidlo R2 je suspenze polystyrenových latexových částic, potažených protilátkami třídy IgG proti lidskému ferritinu v pufru. Ke kalibraci byl použit doporučený kalibrátor Quantia Ferritin Standard od firmy Abbott (18), určený ke kalibraci turbidimetrické metody. Kalibrační souprava obsahuje čtyři kalibrátory s vyznačenými koncentracemi ferritinu. Jako nulový kalibrátor byl dle doporučení použit fyziologický roztok. Ferritin v kalibrátoru je lidského původu. Pokud se týká standardizace, 24
výrobce pouze uvádí, že je standardizován vzhledem k mezinárodnímu referenčnímu standardu WHO. Jako kontrolní materiál pro VKK byl použit kontrolní materiál Ferritin Controls od firmy Abbott. Souprava obsahuje tři kontroly, označené L (Low), M (Medium) a H (High) s různou koncentrací ferritinu. Kontroly jsou kapalné, připraveny k okamžitému použití.
3.3.
Biologický materiál
Všechny pacientské vzorky byly odebrány z loketní žíly za pomocí standardního odběrového systému. Nejdříve po 20 minutách srážení bylo získáno sérum centrifugací zkumavek, 10 min při otáčkách 3500/min. Všechny vzorky byly vyšetřeny nejpozději do 48 h po odběru, sérum nebylo nikdy mraženo. Hemolytické, ikterické a chylózní vzorky nebyly pro testování použity.
3.4.
Statistické postupy
Pro zpracování naměřených dat byly použity následující statistické charakteristiky, Hendel (2009) (8).
Aritmetický průměr Aritmetický průměr je definován jako součet všech naměřených údajů xi, vydělený jejich počtem n. V práci je označen pomocí symbolu AM a jeho výpočet má podobu: Směrodatná odchylka
Σ .
Vyjadřuje rozptýlenost dat kolem aritmetického průměru. Je označena symbolem SD a její výpočet má podobu: Σ i 1 (xi – x) je výpočet jednotlivých odchylek od průměru. Umocnění na druhou převádí záporné odchylky na kladná čísla a zároveň větším odchylkám dává větší váhu. 25
Součet čtverců odchylek zachycuje všechny odchylky jedním číslem. Dělením číslem n-1 vypočteme průměr kvadratických odchylek a odmocnina převádí druhou mocninu do původního měřítka dat. Variační koeficient Variační koeficient se používá k posouzení relativní velikosti rozptýlenosti dat vzhledem k průměru x. V práci je označen symbolem CV, uváděn v procentech a jeho výpočet má podobu:
.100
Regresní analýza Výsledkem regresní analýzy je výpočet korelačního koeficientu (r) a regresní přímky. Korelační koeficient posuzuje pouze míru závislosti mezi metodami, není kritériem pro posouzení shody. Korelační koeficient indikuje pouze, jak těsně se experimentální body přimykají k regresní přímce, ale nevypovídá nic o shodě regresní přímky s přímkou ideální závislosti obou metod. O shodě výsledků obou metod vypovídají parametry regresní přímky. Pro výpočet regresní přímky y = a + bx byla použita metoda nejmenších čtverců. y je závisle proměnná, x nezávisle proměnná, parametr a (intercept) je úsek, který vytne regresní přímka na ose Y, parametr b (slope) je směrnice regresní přímky. Při ideální shodě výsledků obou metod je a = 0 a b = 1. Dohnal (1998) (3) uvádí, že lineární regrese vypočtena klasickou metodou nejmenších čtverců není ideální pro porovnání výsledků dvou analytických metod. Klasická lineární regrese je vystavěna na předpokladu, že závisle proměnná y je měřena s určitou nepřesností, zatímco nezávisle proměnná x je změřena přesně nebo je přesně dána. Pokud tento předpoklad není splněn, vede to k jevu, že regresní přímka výsledků y na x má obecně jinou směrnici a jiný intercept než regresní přímka x na y. Klasická lineární regrese zahrnuje ještě další předpoklady, jako např. normální (gaussovské) rozdělení reziduálních odchylek (vzdálenosti experimentálních bodů od regresní přímky měřených ve směru osy Y), dále že reziduální odchylky nejsou korelovány a nevykazují trend. Tyto podmínky v praxi často nejsou splněny, proto jsou navrhovány další postupy pro porovnání výsledků. Jsou to např. Demingova nebo Passing-Bablokova regrese. Passing a Bablok navrhli svoji neparametrickou metodu tak, aby jejich odhad byl kvalitní pro případ, že 26
obě metody jsou zatíženy podobnou náhodnou chybou, což je v praxi častý případ. Další, nejčastěji doporučovanou metodou je Blandův-Altmanův rozdílový graf, který je použit i v této práci.
Blandův-Altmanův graf Bland a Altman navrhli pro porovnání dvou metod grafickou analýzu. Jedná se o modifikaci grafu reziduálních hodnot pro regresi. Modifikace podle Blanda a Altmana spočívá v tom, že na osu Y nanášíme rozdíl hodnot získaných srovnávanou a referenční metodou a na osu X jejich průměr. Blandův-Altmanův graf, nazývaný též rozdílový graf, adekvátněji hodnotí nepodobnost měření dvěma metodami ve srovnání s klasickou lineární regresí. Především umožňuje posoudit, zda rozdíly mají systematický charakter a jak diference kolísají. Graf je doplněn o průměrnou hodnotu rozdílů a interval spolehlivosti IS průměrné diference. Interval spolehlivosti IS byl vypočten podle vztahu: prům. dif. 1,96
SD
√n
Kromě klasické verze rozdílového grafu je v práci použita modifikace dle Pollocka aj.( 1992 ) (13). Zde jsou diference mezi metodami nanesené na osu y vyjádřeny jako % z průměrné hodnoty obou metod. V klinické biochemii je tato modifikace zvláště užitečná. Zde se často měří u jednoho analytu velké rozpětí koncentrací a stejná diference má jiný význam v oblasti nízkých a v oblasti vysokých hodnot.
Všechny výpočty a tvorba grafů byly provedeny v počítačovém programu Excel 2007.
27
4. Výsledková část 4.1 Výsledky a jejich hodnocení V následujících kapitolách jsou prezentovány a hodnoceny dosažené výsledky validované metody.
4.1.1. Opakovatelnost
Ke stanovení opakovatelnosti byly použity tři pacientské vzorky s různou koncentrací ferritinu. U vzorku A se koncentrace pohybuje těsně pod hranicí meze stanovitelnosti, u vzorku B je v blízkosti spodní referenční hodnoty a u vzorku C je koncentrace ferritinu blízko horní hodnoty referenční meze. Každý vzorek byl testován v 15-ti replikacích. Všech 15 měření bylo provedeno v jednom dni, stejným operátorem na jednu kalibraci. Průměrná koncentrace ferritinu u vzorku A je 7,4 µg/l. Tato hodnota je vyšší než validovaný detekční limit, ale nižší než dolní mez stanovitelnosti. Tomu odpovídá i vyšší hodnota nalezeného variačního koeficientu a to 9,9 %. (Tabulka 3). U vzorku B byla průměrná koncentrace ferritinu 25,1 µg/l a u vzorku C 176,6 µg/l. Pro tyto, klinicky rozhodující hladiny ferritinu byly nalezeny variační koeficienty 3,6 a 1,2 % (Tabulka 3). Tyto hodnoty jsou zcela vyhovující a přibližně odpovídají hodnotám variačních koeficientů, uvedeným ve firemní dokumentaci (Tabulka 6).
4.1.2 Mezilehlá preciznost
Imunoturbidimetrická metoda Ke stanovení mezilehlé preciznosti byl použit kontrolní materiál s třemi hladinami ferritinu. Kontrola L s průměrnou hodnotou ferritinu 13,3 µg/l, kontrola M s průměrnou hodnotou ferritinu 111,9 µg/l a kontrola H s průměrnou hodnotou ferritinu 316 µg/l. Každá hladina byla testována ve 20-ti replikacích. Měření preciznosti bylo provedeno v průběhu šesti týdnů. Během této doby byla metoda jednou překalibrována.
28
Tabulka 3: Stanovení opakovatelnosti
č.měření
Vzorek A
Vzorek B
Vzorek C
µg ferritinu/l
µg ferritinu/l
µg ferritinu/l
1
7,7
25,4
176,9
2
6,8
22,9
173,0
3
8,3
25,5
176,2
4
7,8
25,4
177,1
5
6,3
25,1
178,9
6
8,4
24,1
177,2
7
7,2
25,9
176,3
8
7,1
23,6
174,5
9
7,8
25,6
176,7
10
6,8
25,6
182
11
7,7
24,6
177,9
12
8,0
25,4
176,2
13
7,5
26,1
174,7
14
7,9
25,8
175,1
15
5,8
25,6
175,6
AM (µg/l)
7,4
25,1
176,6
SD (µg/l)
0,73
0,91
2,10
CV (%)
9,91
3,63
1,19
Naměřené hodnoty a vypočtené základní statistické parametry jsou uvedeny v tabulce 4. Pro mezilehlou preciznost u nejnižší koncentrace 13,3 µg/l, která se pohybuje těsně nad dolní mezí stanovitelnosti, byl nalezen vyšší variační koeficient 17,1 %. Obecně přijímaný požadavek na CV pro dolní mez stanovitelnosti je méně než 20 %, takže i tento výsledek lze považovat za vyhovující. U vyšších koncentrací bylo dosaženo velmi dobrých výsledků, hodnoty variačních koeficientů jsou 4,7 a 3,5 % (Tabulka 4). 29
Imunochemiluminiscenční metoda Pro srovnání je uvedena mezilehlá preciznost i u současně používané metody. Je průběžně sledována v rámci VKK. I zde byl použit kontrolní materiál s třemi hladinami ferritinu. Kontrola L s průměrnou hodnotou ferritinu 26,5 µg/l, kontrola M s průměrnou hodnotou 212,1 µg/l a kontrola H s průměrnou hodnotou 453,4 µg/l. Každá hladina byla testována ve 20-ti replikacích. Měření preciznosti bylo provedeno v průběhu deseti týdnů. Během této doby byla metoda jednou překalibrována. Naměřené hodnoty a vypočtené základní statistické parametry jsou uvedeny v tabulce 5. Pro jednotlivé hladiny ferritinu byly vypočteny variační koeficienty 3,7 % pro kontrolu L a 4,8 % pro kontrolu M a H. Lze konstatovat, že mezilehlá preciznost u obou porovnávaných metod je vyhovující a srovnatelná
s výjimkou
nízkých
koncentrací,
imunoturbidimetrické metody.
30
blízkých
mezi
stanovitelnosti
u
Tabulka 4: Stanovení mezilehlé preciznosti – Imunoturbidimetrie
č. měření
Hladina L
Hladina M
Hladina H
µg ferritinu/l
µg ferritinu/l
µg ferritinu/l
1
11,9
111,1
290,6
2
13,2
115,5
314,1
3
10,2
107,3
320,1
4
12,4
101,9
318,6
5
18,1
118,1
315,9
6
13,0
115,4
304,4
7
12,2
123,7
300,1
8
12,5
115,8
319,9
9
11,4
115,8
334,4
10
12,7
110,0
318,5
11
17,4
115,7
330,8
12
18,1
113,6
332,4
13
13,2
112,0
323,0
14
11,7
112,4
327,1
15
13,9
110,0
318,7
16
11,9
110,5
315,0
17
12,7
105,1
318,5
18
15,5
108,2
312,8
19
12,7
103,1
306,7
20
10,9
112,4
304,9
AM (µg/l)
13,28
111,88
316,3
SD (µg/l)
2,26
5,23
11,03
CV (%)
17,05
4,67
3,49
31
Tabulka 5: Stanovení mezilehlé preciznosti – Imunochemiluminiscence
č. měření
Hladina L
Hladina M
Hladina H
µg ferritinu/l
µg ferritinu/l
µg ferritinu/l
1
28,3
221,7
487,3
2
27,6
214,7
473,7
3
27,2
217,6
472,83
4
28,5
230,0
473,2
5
27,0
201,7
426,6
6
25,7
211,5
502,5
7
25,6
220,6
423,9
8
26,0
205,6
447,7
9
26,5
198,3
439,8
10
26,7
210,9
453,6
11
26,0
192,7
460,6
12
27,9
213,3
447,4
13
25,7
206,0
449,2
14
26,0
221,0
418,8
15
26,1
209,7
442,1
16
25,1
224,7
473,3
17
26,4
218,9
437,6
18
25,8
213,8
441,6
19
25,7
192,3
445,1
20
25,7
217,8
451,0
AM (µg/l)
26,5
212,1
453,39
SD (µg/l)
0,98
10,26
21,57
CV (%)
3,69
4,84
4,76
Porovnání s firemními výsledky U imunoturbidimetrické metody lze nalezené hodnoty variačních koeficientů pro opakovatelnost a mezilehlou preciznost jen v omezené míře porovnat s firemními výsledky. 32
Hodnoty pro mezilehlou preciznost nejsou v příbalovém letáku jednoznačně specifikovány. Je zde pouze uvedena tabulka, nazvaná přesnost (Tabulka 6).
Tabulka 6: Tabulka přejata z firemní dokumentace Quantia Ferritin (17)
Počet vzorků/
Průměr
CV%
CV %
Počet sérií
µg/l
v rámci jedné
Celkem
série vyšetření 5/10
106,4
2,3
2,5
5/10
256,0
1,3
1,6
5/10
428,5
0,7
0,9
Hodnoty naměřené v rámci jedné série získané pouze z pěti opakování lze považovat za opakovatelnost. Variační koeficient nazvaný Celkem není dostatečně specifikován, a nelze jej ztotožnit s mezilehlou precizností. Chybí také údaj pro nižší koncentraci ferritinu, v blízkosti spodní hranice referenčního rozmezí. Pro vyšší hodnoty je námi naměřená opakovatelnost srovnatelná s firemními údaji. V příbalovém letáku u metody CMIA není uvedena opakovatelnost metody, ale mezilehlá preciznost je dobře definována. Je měřena na dvou šaržích reagencií, denně v průběhu 20ti dní, ve dvou samostatných sériích a na třech hladinách kontrolního materiálu. Pro hladinu ferritinu 20 µg/l byl nalezen CV 5,6 %, pro 146 µg/l 5,7 % a pro koncentraci 390 µg/l byl CV rovněž 5,6 %. S těmito hodnotami naše výsledky dobře korespondují, dokonce jsou ještě příznivější.
4.1.3. Pracovní rozsah měření, ověření kalibrační funkce
Ke kalibraci byl použit výrobcem doporučený kalibrátor. Návaznost kalibrátoru na vyšší metrologickou úroveň (referenční metodu, standardní referenční materiál) neexistuje. Příbalový leták pouze uvádí, že se jedná o produkt lidského původu, standardizovaný k WHO mezinárodnímu standardu.
33
Hodnoty kalibrátorů a naměřené absorbance jsou uvedeny v tabulce 7. Kalibrační křivka je pětibodová nelineární, s nejvyšším bodem kalibrace 500 µg/l. Je znázorněna na obr. 3. K proložení křivky byla použita funkce Spline.
Tabulka 7: Kalibrační křivka - naměřené absorbance kalibrátorů
Ferritin
Absorbance
µg/l
REP 1
REP 2
REP 3
Průměr
0
-0,0027
-0,0025
-0,0047
-0,0033
25
0,0106
0,0122
0,0121
0,0116
100
0,0564
0,058
0,0553
0,0566
200
0,1111
0,1121
0,1132
0,1121
500
0,2388
0,2404
0,2371
0,2388
Obr 3. Grafické znázornění kalibrační křivky
0.3
0.25
Absorbance
0.2
0.15
0.1
0.05
0 0 -0.05
100
200
300
400
Koncentrace ferritinu (µg/l)
34
500
600
Kalibrace je stabilní minimálně 35 dní, což bylo experimentálně ověřeno měřením kontrolních vzorků. Tento nález se dobře shoduje s údajem v příbalovém letáku, kde je uvedena stabilita kalibrace 30 dní. Pracovní rozsah měření je ve firemní dokumentaci uveden 10 - 500 µg/l. Hodnota 10 µg/l odpovídá deklarované mezi stanovitelnosti, hodnota 500 µg/l je koncentrace nejvyššího kalibrátoru. Pracovní rozsah byl validován dilučním pokusem. Naměřené hodnoty jsou průměry ze tří měření a jsou uvedeny v tabulce 8. Z výsledků lze uzavřít, že pracovní rozsah byl validován, naměřené hodnoty jsou rozptýleny kolem vypočtené hodnoty s chybou ± 2 – 7 %. Pouze v oblasti nízkých hodnot se rozdíl od vypočtené hodnoty zvyšuje až na 22 %, což může být způsobeno jednak vysokým ředěním, ale také to potvrzuje skutečnost, že v oblasti nízkých hodnot se přesnost imunoturbidimetrické metody zhoršuje, jak již bylo prokázáno při ověřování opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti.
Tabulka 8: Ověření pracovního rozsahu – diluční pokus
Naměřená Ředění
průměr µg/l
hodnota Vypočtená µg/l
hodnota R(%)
1
511,0
511,0
1,1
475,5
464,5
102,3
1,5
356,5
340,6
104,7
2,0
237,8
255,5
93,1
3,0
182,5
170,3
107,2
4,0
136,3
127,8
106,6
5,0
99,2
102,2
97,1
10,0
57,4
51,1
112,3
21,0
28,5
24,3
117,3
26,0
24,1
19,7
122,3
35
4.1.4. Stanovení meze detekce a meze stanovitelnosti
Ke stanovení meze detekce LoD (Limit of detection) byl v deseti replikacích změřen blank za podmínek rutinně používané kalibrace a vypočtena směrodatná odchylka. Naměřené hodnoty blanku a hodnota směrodatné odchylky jsou uvedeny v tabulce 9.
Tabulka 9: Stanovení meze detekce
č. měření
µg ferritinu/l
1
0,0
2
4,1
3
0,0
4
2,1
5
1,4
6
0,9
7
0,0
8
0,0
9
2,5
10
1,2
AM
1,2
SD
1,37
Hodnota meze detekce byla vypočtena podle vztahu: LoD = 3 . SDblank LoD = 3 . 1,37 = 4,1 Pro výpočet meze stanovitelnosti LoQ (Limit of quantification) byl použit výpočet z LoD podle vztahu: LoQ = 3 . LoD LoQ = 3 . 4,1 = 12,3 Experimenálně byla stanovena mez detekce 4,1 µg/l, ve firemní dokumentaci je uvedena hodnota vyšší, 6,0 µg/l. 36
Mez stanovitelnosti nebo-li dolní mez pracovního rozsahu byla určena pouze výpočtem, jako trojnásobek meze detekce. Vypočtená hodnota 12,3 µg/l je pouze orientační a lze říci, že koresponduje s hodnotou 10 µg/l, uvedenou ve firemní dokumentaci.
4.1.5. Porovnatelnost metod
Výsledky validované IMT metody jsou porovnávány s výsledky imunochemické CMIA metody, kterou v laboratoři dosud používáme. Pro tento experiment byl použit náhodný soubor padesáti pacientských vzorků, tak aby byl pokryt celý kalibrační rozsah. Naměřené hodnoty ferritinu CMIA metodou se pohybovaly v rozmezí od 5 do 463 µg/l. Dále byl vybrán soubor 23 pacientských vzorků s vysokou hodnotou ferritinu > 500 µg/l. Tyto vzorky musely být pro získání přesné hodnoty u imunoturbidimetrie ředěny. Všechny vzorky sér byly bez hemolýzy, lipémie a ikterity. Naměřené hodnoty ferritinu oběma metodami jsou uvedeny v tabulkách 10 a 11. Porovnatelnost metod byla hodnocena jednak metodou lineární regrese. Byly vypočteny parametry a, b rovnice přímky y = a + bx a korelační koeficienty r (Obr. 3, 4, 5). Dále byly rozdíly naměřených výsledků hodnoceny pomocí Blandova–Altmanova rozdílového grafu. Diference na ose Y byly vyjádřeny jednak v měřených jednotkách µg/l (Obr.6, 8) a jednak jako relativní diference v % (Obr.7, 9). V grafech jsou zvlášť hodnoceny výsledky naměřené v rámci kalibračního rozsahu IMT metody (10 – 500 µg/l), a zvlášť výsledky s vyšší hodnotou ferritinu, které u imunoturbidimetrie již musely být ředěny. Kalibrační rozsah CMIA metody je širší 1 – 2000 µg/l. Důvodem tohoto rozdělení je skutečnost, že u jedné z porovnávaných metod přistupuje kromě chyby měření ještě chyba způsobená ředěním. Navíc rozdíly u vzorků s vysokou koncentrací mají menší klinický význam, v řadě případů je možné výsledek vyjádřit jako > 500 µg/l.
37
Tabulka 10: Hodnoty ferritinu naměřené porovnávanými metodami
Architect i2000 č. vzorku ferritin µg/l
Architect c8000 ferritin µg/l
Architect i2000 č. vzorku ferritin µg/l
Architect c8000 ferritin µg/l
1
207
178
26
280
251
2
33
25
27
13
8
3
61
54
28
8
10
4
18
16
29
35
23
5
84
95
30
5
1
6
392
416
31
16
16
7
15
10
32
6
3
8
216
236
33
14
12
9
62
57
34
34
21
10
96
87
35
38
28
11
235
181
36
23
18
12
11
14
37
45
39
13
30
21
38
92
55
14
226
232
39
369
410
15
45
64
40
185
162
16
15
5
41
312
289
17
170
140
42
208
176
18
19
19
43
207
236
19
197
188
44
439
457
20
36
33
45
373
380
21
11
13
46
68
67
22
30
28
47
126
77
23
52
256
48
41
40
24
83
52
49
15
14
25
232
221
50
463
417
38
Tabulka 11: Vysoké hodnoty ferritinu naměřené porovnávanými metodami
Architect i2000 č. vzorku ferritin µg/l
Architect c8000 ferritin µg/l
č.vzorku
Architect i2000 ferritin µg/l
Architect c8000 ferritin µg/l
1
860
1072
13
781
665
2
624
645
14
2690
2289
3
1117
1092
15
536
412
4
615
699
16
616
757
5
701
691
17
630
646
6
595
785
18
720
747
7
1141
1329
19
1572
1514
8
912
1076
20
818
978
9
1020
782
21
1390
1443
10
1592
1260
22
1095
1153
11
612
675
23
1068
1091
12
681
597
Obr.3: Srovnání metod – lineární regrese
500 450
µg ferritinu/l-Arch c8000
400 350 300 250 200 150 100 y = 0,9799x - 0,3969 r = 0,9274
50 0 0
50
100
150
200 250 300 µg ferritinu/l-Arch i2000
39
350
400
450
500
Obr 4: Srovnání metod (vypuštěna odlehlá hodnota) – lineární regrese 500
µg ferritinu/l - Arch c8000
400
300
200
100 y = 0,9976x - 6,7276 r = 0,9785 0 0
50
100
-100
150
200
250
300
350
400
450
500
µg ferritinu/l - Arch i2000
Obr.5: Srovnání metod (koncentrace nad 500 µg/l) – lineární regrese 2500
µg ferritinu/l - Arch c 8000
2000
1500
1000
500 y = 0,8018x + 193,4 r = 0,9 0 0
500
1000 1500 2000 µg ferritinu/l -Arch i2000
40
2500
3000
Obr.6: Rozdílový graf – diference v µg/l 70
50
Diference (µg/l)
30
10
-10
50
0
100
150
200
250
300
350
400
450
500
-30
-50 průměrná dif. = -7,0µg/l IS = -12,4 12,4 až -1,7µg/l
-70 Průměr metod (µg/l)
Obr.7 Rozdílový graf – diference v % Obr.7: 100.0 80.0 60.0
Diference (%)
40.0 20.0 0.0 0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
-20.0 -40.0 -60.0 Průměrná dif. = -16,5 % IS = -24,9 24,9 až -8,1 %
-80.0 -100.0
Průměr metod (µg/l)
41
Obr.8: Rozdílový graf – diference v µg/l - koncentrace nad 500 µg/l 500 400
Průměrná dif. = 0,52 µg/l IS = -65,6 až 66,6 µg/l
300
Diference (µg/l)
200 100 0 450
950
1450
1950
2450
2950
-100 -200 -300 -400 -500
Průměr metod (µg/l)
Obr.9: Rozdílový graf – diference v % - koncentrace nad 500 µg/l 100.0 80.0 Průměrná dif. = 1,5 % IS = -4,9 až 7,9 %
60.0
Diference (%)
40.0 20.0 0.0 450
950
1450
1950
-20.0 -40.0 -60.0 -80.0
-100.0 Průměr metod (µg/l)
42
2450
2950
Z obrázku 3, kde jsou metody hodnoceny pomocí lineární regrese je zřejmé, že obě metody spolu poměrně dobře korelují, vypočtený korelační koeficient je 0,927. Pouze u jednoho vzorku byly naměřeny výrazně rozdílné hodnoty. Imunoturbidimetrií 256 µg/l, metodou CMIA 52 µg/l. Tyto hodnoty byly potvrzeny opakovaným měřením. Jednalo se o náhodně vybranou ambulantní pacientku a další odběr ani šetření této diskrepance nebylo možné provést. Po vyloučení tohoto vzorku z měřeného souboru se zlepšil korelační koeficient na hodnotu 0,979 (obr. 4). Vztah mezi získanými hodnotami vyjadřuje rovnice regresní přímky. Z konstant a a b je zřejmé, že vypočtené hodnoty závisle proměnné (imunoturbidimetrie) budou v průměru o 6,7 µg/l nižší ve srovnání s metodou CMIA. Regresní závislost pro vysoké hodnoty nad 500 µg/l znázorňuje graf na obr. 5. I u těchto vysokých koncentrací byla prokázána poměrně těsná korelace s koeficientem 0,9. Rozdíly mezi oběma metodami lépe vystihuje rozdílový graf. Na obr. 6 jsou diference vyjádřeny v měřených jednotkách. Jednotlivé body jsou rozptýleny na obě strany od nuly s mírnou převahou záporných rozdílů. Průměrná diference mezi srovnávanými metodami je -7,0 µg/l s intervalem spolehlivosti -12,4 až -1,7 µg/l. Je zde tedy patrný určitý systematický posun k záporným hodnotám, tzn. že srovnávaná metoda vykazuje nižší výsledky v průměru mezi -1,7 až -12,4 µg/l. Protože tento interval nezahrnuje nulovou hodnotu, nemůžeme výsledky obou metod prohlásit za shodné. Dále je zřejmé, že rozdíly v naměřených hodnotách vykazují trend v závislosti na průměru. Diference se zvyšují s narůstající koncentrací ferritinu. Na dalším obr. 7 jsou na ose Y vyneseny relativní diference v %. Tuto modifikaci navrhli Pollock aj. (1992) (13) a je užitečná tím, že ilustruje relativní velikost diference. Přirozeně, největší rozdíly vidíme u nejnižších hodnot s koncentrací kolem meze stanovitelnosti. V této oblasti dosahují rozdíly mezi oběma metodami ojediněle až -100 %. S narůstající koncentrací ferritinu se relativní diference snižují. Průměrná diference je -16,5 % s IS -24,9 až -8,1 %, který opět nezahrnuje nulovou hodnotu. Stejným způsobem jsou pomocí rozdílového grafu hodnoceny i výsledky naměřené pro vysoké koncentrace ferritinu (obr. 8 a obr. 9 ) Na obr. 8 jsou diference vyjádřeny v měřených jednotkách. Jednotlivé body jsou rovnoměrně rozptýleny kolem nuly a nevykazují výraznější trend v závislosti na průměru. Průměrná diference 0,52 µg/l se blíží nule, IS je -65,6 až 66,6 µg/l.
43
Na obr. 9 jsou rozdíly vyjádřeny v procentech. I zde vidíme, že jednotlivé body jsou rovnoměrně rozptýleny kolem nuly, průměrná diference má hodnotu 1,5 % s IS -4,9 až 7,9 %. Dále vidíme, že maximální rozdíly mezi oběma metodami se pohybují v intervalu ± 26 %. Podíváme-li se znovu na oba grafy (obr. 8 a 9) vidíme, že v obou případech intervaly spolehlivosti průměrné diference zahrnují nulovou hodnotu. Můžeme tedy říci, že v oblasti vysokých hodnot nad 500 µg/l poskytují obě metody srovnatelné výsledky, přičemž diference mezi metodami se pohybují od 0 do ± 26 %. Ve firemní dokumentaci je porovnatelnost metody provedena velmi jednoduchým způsobem, který nedává uživateli příliš mnoho informací. IMT metoda Quantia Ferritin je pouze testována na dvou biochemických analyzátorech Aeroset/Architect.
4.1.6. Vychýlení (Bias) metody
Odhad systematické chyby měření (Bias) nebylo možné realizovat ve smyslu Doporučení k provádění validace a verifikace analytických metod v klinických laboratořích (4). Pro stanovení ferritinu není k dispozici vhodný certifikovaný referenční nebo kontrolní materiál. Není možné ani použít náhradní postup, a to je srovnání s výsledky jiných laboratoří v EHK, používající
reagencie
a
kalibraci
od
stejného
výrobce.
Skupina,
používající
imunoturbidimetrickou metodu Quantia Ferritin v SEKKu není zatím zastoupena. Byly pouze změřeny kontrolní materiály Endokrinologie 1 2/11 a 2 2/11. Naše výsledky, získané validovanou imunoturbidimetrickou metodou jsou uvedeny v tabulce 12. Jedná se o průměry ze tří měření. Současně je zde uvedena průměrná hodnota všech dosažených výsledků spolu s nejnižší a nejvyšší dosaženou průměrnou hodnotou (ConV), napříč všemi zúčastněnými skupinami. Z výsledků, uvedených v tabulce 12 je zřejmé, že dosažené průměry ve stejnorodých skupinách se značně liší, výsledky jsou tedy výrazně závislé na použitém kalibrátoru, reagenciích a instrumentaci. V cyklu Endokrinologie 1 2/11 bylo dosaženo nejnižších výsledků ve skupině Johnson & Johnson, metoda ILMA a nejvyšších ve skupině Abbott, metoda ILMA. V cyklu Endokrinologie 2 2/11 bylo dosaženo nejnižších výsledků ve skupině Beckman Coulter, metoda ILMA a nejvyšších ve skupinách Abbott, metoda ILMA a Roche, metoda IMT. Naše výsledky se u cyklu Endokrinologie 1 2/11 pohybují přibližně uprostřed intervalu získaného z průměrů všech zúčastněných skupin, u cyklu Endokrinologie 2 2/11 jsou naopak na jeho spodní hranici. 44
Tabulka 12: Výsledky validované metody v EHK
Průměry stejnorodých skupin Cyklus
Min µg/l
Max µg/l
Průměr všech výsledků µg/l
Vlastní výsledek µg/l
E1 2/11 Endokrinologie 1
A
39,3
62,6
56,8
50,5
B
210
362
316
269
E2 2/11 Endokrinologie 2
A
90
139
121
87
B
20,9
32,6
28,5
21
4.1.7. Verifikace referenčních hodnot
Jak již bylo řečeno v kapitole 2.4. není postup verifikace, případně validace referenčních hodnot zcela ujasněn. Jedná se o poměrně složitý úkol, jehož řešení je zpravidla mimo možnosti běžné klinické laboratoře. Na druhou stranu je správné určení referenčních mezí, případně hodnot cut-off zcela zásadní pro správnou klinickou interpretaci laboratorních výsledků. Jednoznačná je situace u analytů, které vykazují návaznost na standardní referenční materiál nebo referenční metodu a u kterých jsou referenční hodnoty nebo hodnoty cut-off podloženy rozsáhlými multicentrickými studiemi a doporučeny mezinárodními odbornými společnostmi na základě konsenzu. V těchto případech se nedoporučuje tyto hodnoty měnit. V ostatních případech se doporučuje vycházet z referenčních hodnot, uvedených ve firemní dokumentaci přiložené k používaným reagenciím a ty podrobit ověření ve vlastní laboratoři. Byl proveden pokus o experimentální verifikaci referenčního intervalu podle doporučení přejatého z dokumentu CLSI C28-A3. Výběr 20ti zdravých probandů byl v případě ferritinu dosti problematický. V laboratořích se často pro ověření referenčních hodnot používají dárci krve. V případě ferritinu však tato skupina také není zcela vhodná, protože je popisováno, že u dárců, zejména při četnějších odběrech se můžeme setkat s jeho sníženými hodnotami. Dále jsou referenční hodnoty ferritinu závislé na pohlaví a u žen před menopauzou je často popisován subklinický nedostatek železa. 45
Vzhledem ke snadné dostupnosti odběrů byl i přes výše zmíněný nedostatek ferritin vyšetřen u náhodně vybrané skupiny dárců, dvacet mužů ve věku od 27 do 62 let a dvacet žen ve věku od 20 do 53 let. Naměřené výsledky ferritinu jsou uvedeny v tabulce 13. Dále byla vybrána, v rámci oddělení s laskavým svolením kolegů, skupina relativně zdravých jedinců, tedy především z hlediska testovaného ferritinu. Z této skupiny byli vyloučeni dárci krve. Naměřené výsledky jsou uvedeny v tabulce 14, 15. U dárců ve skupině muži se naměřené hodnoty ferritinu pohybovaly v rozmezí 10,8 - 106,9 µg/l, s průměrnou hodnotou 32 µg/l. Ve firemní dokumentaci k použitým reagenciím jsou pro muže uvedeny referenční hodnoty 30 – 300 µg/l. Těmto doporučeným hodnotám nevyhovělo 12, tedy více než polovina vyšetřených mužů, jejich naměřené hodnoty byly nižší než 30 µg/l. Jak již bylo uvedeno v kapitole 2.3.1., v naší laboratoři jsme provedli korekci referenčních hodnot uvedených ve firemní dokumentaci na základě výsledků, publikovaných v odborných studiích a také na základě vlastních zkušeností. Jako dolní mez referenčního intervalu používáme rozhodovací limit pro vyloučení sideropenie 20 µg/l, stejný pro obě pohlaví a také stejný pro ženy před a po menopauze. Tomuto limitu nevyhovělo 9 vyšetřených mužů - dárců, jejich naměřené hodnoty byly nižší než 20 µg/l. U dárců ve skupině ženy se naměřené hodnoty ferritinu pohybovaly v rozmezí 8,9 – 62,4 µg/l, s průměrnou hodnotou 27,8 µg/l. Ve firemní dokumentaci k použitým reagenciím jsou pro ženy do 50ti let uvedeny referenční hodnoty 15 – 160 µg/l. Těmto doporučeným hodnotám nevyhověly 4 ženy, jejich naměřené hodnoty byly nižší než 15 µg/l. Rozhodovacímu limitu 20 µg/l již nevyhovovalo 11 vyšetřených žen. Ve skupině zdravých jedinců, vybraných z pracovníků našich laboratoří nebylo prakticky možné dodržet dělení podle pohlaví, případně u žen podle věku. Nebylo možné získat 20 zdravých mužů, kteří navíc nejsou dárci, ani 20 zdravých žen po menopauze. Vybraná skupina je tedy tvořena 20ti ženami ve věku od 20 do 50 let a skupinou 10ti mužů a 10ti žen po menopauze. Ve skupině 20ti žen před menopauzou byly naměřeny hodnoty ferritinu v rozmezí 15,3 – 124,9 µg/l, s průměrnou hodnotou 60 µg/l. Doporučeným hodnotám z firemní dokumentace vyhovovaly všechny ženy, jejich hodnoty byly vyšší než 15 µg/l. Na hodnotu rozhodovacího limitu 20 µg/l nedosáhla pouze jedna žena.
46
Tabulka 13: Hodnoty ferritinu u skupiny dárců krve
Muži
Ženy
pacient č.
věk
µg ferritinu/l
pacient č.
věk
µg ferritinu/l
1
27
106,9
1
20
15,8
2
29
17,0
2
22
18,6
3
30
18,1
3
22
9,9
4
31
55,0
4
24
24,8
5
31
47,9
5
24
18,7
6
31
32,8
6
31
13,4
7
32
20,8
7
32
30,1
8
32
14,7
8
32
15,1
9
32
25,0
9
37
17,3
10
33
11,3
10
40
60,1
11
34
13,3
11
42
15,1
12
37
49,0
12
42
40,7
13
39
51,2
13
44
12,9
14
46
13,0
14
44
49,8
15
47
10,8
15
45
37,1
16
48
17,0
16
47
54,7
17
52
54,2
17
48
33,6
18
54
41,8
18
49
8,9
19
59
11,5
19
52
17,6
20
62
28,2
20
53
62,4
Můžeme tedy konstatovat, že ve skupině žen do 50 let byly referenční meze, dodané výrobcem verifikovány. Ve druhé skupině muži byly naměřeny hodnoty ferritinu v rozmezí 37 – 240,8 µg/l, s průměrnou hodnotou 121 µg/l a ve skupině ženy nad 50 let hodnoty v rozmezí 24,6 – 208 µg/l, s průměrnou hodnotou 93,0 µg/l. 47
Tabulka 14: Hodnoty ferritinu u pracovníků laboratoře
Ženy do 50 let Pacient č.
věk
µg ferritinu/l
Pacient č.
věk
µg ferritinu/l
1
27
37,2
11
50
15,3
2
50
124,9
12
29
49,2
3
42
96,8
13
36
60,1
4
50
52,2
14
50
29,9
5
29
89,8
15
18
22,6
6
30
122,6
16
37
30,0
7
49
33,9
17
31
67,0
8
38
107,0
18
32
65,7
9
50
56,2
19
39
28,1
10
29
48,5
20
44
56,2
Tabulka 15: Hodnoty ferritinu u pracovníků laboratoře
Muži a ženy nad 50 let Muži č.
věk
µg ferritinu/l
Ženy č.
věk
µg ferritinu/l
1
61
103,0
11
59
126,5
2
36
80,5
12
54
24,6
3
38
37,0
13
59
90,5
4
60
100,5
14
52
208,0
5
32
24,3
15
51
139,5
6
48
51,6
16
50
92,6
7
60
164,0
17
63
159,9
8
56
206,1
18
59
35,3
9
35
240,8
19
54
56,2
10
45
198,0
20
60
80,7
48
Je tedy možné uzavřít, že u žádného z vyšetřovaných probandů nebyla naměřena nižší hodnota než 20 µg/l, u jednoho muže byla naměřena nižší hodnota než 30 µg/l. Rovněž nebyla překročena hodnota horního referenčního limitu, což je pro tyto skupiny 300 µg/l. Jinými slovy naměřené hodnoty u 19 probandů této smíšené skupiny se pohybovaly uvnitř referenčního intervalu, uvedeného ve firemní příbalové dokumentaci, všech 20 mělo hodnoty nad 20 µg/l. Naopak vyšetřením skupiny dárců byly prokázány snížené hodnoty ferritinu a to jak u mužů, tak i u žen oproti zdravým jedincům bez dárcovství krve. Experimentálně bylo prokázáno, že dárci krve nejsou vhodnou skupinou k verifikaci referenčních hodnot ferritinu.
49
5. Závěr 5.1. Shrnutí dosažených výsledků
Cílem předložené práce bylo validovat imunoturbidimetrickou metodu Quantia Ferritin od firmy Abbott, určenou pro biochemické analyzátory a na základě získaných výsledků rozhodnout,
zda
může
být
v
laboratoři
přijata
s tím,
že
nahradí
dosavadní
imunochemiluminiscenční metodu. Postup validace vychází z doporučení ČSKB k provádění validace a verifikace analytických metod v klinických laboratořích (4). Validace některých parametrů metody (výtěžnost, interference a analytická selektivita) nebyla provedena. Toto omezení vychází z technických možností laboratoře, z rozsahu předkládané práce, ale i z charakteru testované metody. Např. výtěžnost je důležitým parametrem především pro separační metody. Přesnost imunoturbidimetrické metody (tj. opakovatelnost a mezilehlá preciznost) vykazuje velmi dobré výsledky s výjimkou nízkých hodnot, blízkých dolní mezi stanovitelnosti. Nebylo možné tento výsledek srovnat s výsledky uvedenými výrobcem. Přesnost pro nižší hodnoty není v dokumentaci uvedena. Dosud používaná CMIA metoda je v oblasti nízkých hodnot přesnější, v oblasti vyšších hodnot, přibližně nad 20 - 25 µg/l je přesnost obou metod srovnatelná. Tyto výsledky odpovídají i velkému rozdílu v dolní mezi stanovitelnosti mezi oběma metodami. U IMT je to 10 µg/l (v práci byla zjištěna hodnota 12,3 µg/l), u CMIA 1 µg/l. Rozdíly jsou také v horní mezi stanovitelnosti. U IMT je to 500 µg/l, u CMIA 2000 µg/l. Pracovní rozsah 10 – 500 µg/l byl validován dilučním pokusem. Pravdivost metody, vyjádřenou pomocí systematické chyby (bias) nebylo možné validně vyjádřit. Pro ferritin není k dispozici referenční metoda ani CRM. Byl pouze analyzován kontrolní materiál SEKK a dosažené výsledky byly porovnány s ostatními účastníky kontrolního cyklu. Výsledky, naměřené metodou IMT u vybrané skupiny 50ti pacientů byly porovnány s výsledky naměřenými metodou CMIA u téže skupiny. Srovnání bylo provedeno pomocí lineární regrese a rozdílového grafu. Vzhledem k tomu, že se jedná o dvě analyticky odlišné metody s rozdílnou instrumentací, bylo dosaženo poměrné dobré shody. Z výsledků
50
vyplývá, že metoda IMT poskytuje v oblasti pracovního rozsahu 10 – 500 µg/l v průměru nižší výsledky, a to v rozmezí -12,4 až -1,7 µg/l, vyjádřeno relativní chybou -24,9 až -8,1 %. V oblasti vysokých hodnot nad 500 µg/l se průměrná diference blížila nule, průměrné rozdíly se pohybovaly v intervalu od -66 do +67 µg/l, vyjádřeno relativní chybou od -4,9 do 7,9 %. Verifikace referenčních hodnot byla provedena u skupiny zdravých jedinců, 20 žen do 50 let, 10 žen nad 50 let a 10 mužů. Podle dosažených výsledků lze konstatovat, že referenční meze uvedené ve firemní dokumentaci lze považovat za ověřené ve smyslu doporučení, vycházejícího z dokumentu CLSI C28-A3. Byl měřen i ferritin u skupiny dárců. Tímto pokusem bylo prokázáno, že dárci krve často vykazují snížené hodnoty sérového ferritinu a nejsou tudíž vhodnou skupinou k verifikaci referenčních hodnot.
5.2. Závěrečné hodnocení
Testovanou imunoturbidimetrickou metodu Quantia Ferritin od firmy Abbott lze považovat za validovanou/verifikovanou a lze ji používat v laboratoři k vyšetření sérového ferritinu. Dosažené výsledky se shodují s údaji, uvedenými ve firemní dokumentaci. Výhodou této metody, ve srovnání s metodou CMIA, je možnost jejího použití na běžných biochemických analyzátorech a nižší cena. Cena jednoho vyšetření u IMT metody je cca 48 Kč, u CMIA cca 93 Kč. Také objem vzorku, potřebný k analýze je menší u IMT a čas analýzy je kratší. Nevýhodou je nižší pracovní rozsah, což v naší laboratoři představuje poměrně časté ředění, vzhledem k početnému zastoupení pacientů na dialýze a onkologických pacientů. Tato skutečnost částečně eliminuje ekonomickou výhodu. Další nevýhodou je poměrně vysoká spodní mez stanovitelnosti 10 µg/l a nižší přesnost v této oblasti hodnot. A za třetí, metoda není dosud zastoupena v externím hodnocení kvality SEKK, není tedy možné ani orientačně vypočítat bias metody porovnáním s ostatními účastníky stejnorodé skupiny. Proto prozatím doporučuji vyšetřovat v naší laboratoři ferritin dosud používanou CMIA metodou.
51
6. Seznam použité literatury 1) Bowen, R. Ferritins and hemosiderin. Biomedikal Hypertext Home, 2001, Dostupné na http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/molecules/ferritin.html
2) Casidy, R.-Frey, R. Iron use and storage in the body:Ferritin and molecular representations. Washington University, St.Louis, Department of chemismy Dostupné na http://www.chemistry.wustl.edu/~edudev/Lab Tutorials/Ferritin/Ferritin.html
3) Dohnal, L. Porovnání výsledků dvou metod stanovení-lineární regresí nebo jinak. FONS 1998, roč. 7, č. 2, s. 27-31
4) Doporučení k provádění validace a verifikace analytických metod v klinických laboratořích. Klinická biochemie a metabolismus 2011, roč. 19, č. 1, s. 36-44
5) Ferritin i, Architect systém. Příbalová dokumentace k použitým reagenciím od firmy Abbott.
6) Ferritin Calibrators. Architect i System. Příbalová dokumentace k použitému kalibrátoru od firmy Abbott.
7) Friedecký, B. Verifikace referenčních intervalů. FONS 2008, roč. 18, č. 1, s. 31-32
8) Hendel, J. Přehled statistických metod. Praha 2009 Portál, s.r.o., ISBN 978-80-7367482-3
9) Chrobák, L. Mikrocytární a hypochromií anémie. Vnitřní lékařství 2001, roč. 47, č. 3. s. 166-174
10) Kalantar-Zadeh, K.-Rodriguez, R. A. a Humphreys M.H. Association between serum ferritin and measures of inflammation, nutrition and iron in haemodialysis patiens. Neohrol Dial Transplant, 2004, roč. 19, s. 141-149
11) Neuwirtová, R.-Poňka, P. Železo - přítel, či nepřítel člověka? Interní medicína pro praxi 2010, roč. 12, č. 7 a 8, s. 366-368 52
12) Novotný, J. Sideropenická anémie. Medicína pro praxi 2007, roč. 4, č. 10, s. 390-394
13) Pollock, M. A. aj. Method comparison – a different approach. Ann Clin Biochem 1992, roč. 29, s. 556-560
14) Pospíšilová, D. Anémie chronických chorob ve světle nových poznatků. Pediatrie pro praxi 2007, roč. 8, č. 5, s. 276-280
15) Price, Ch. P.-Christenson, R.H. Evidence-Based Laboratory Medicine. From principles to Outcomes. Washington 2003, AACCPress, ISBN 1-890883-90-5
16) Průša, R. aj. Orientační rozmezí hodnot laboratorních vyšetření podle věkových skupin. Fakultní nemocnice v Motole, Praha 2000, ISBN 80-238-5473-9
17) Quantia Ferritin, Aeroset/Architect. Příbalová dokumentace k použitým reagenciím od firmy Abbott.
18) Quantia ferritin standard. Aeroset/Architect. Příbalová dokumentace k použitému kalibrátoru od firmy Abbott.
19) Schreiber, V.- Trojan, S. Ferritin stále živý-60 let po objevu. Vesmír 1995, roč. 74, č.8, s. 476
20) Sedláčková, T.- Racek, J. Metabolismus železa a jeho regulace. Klin.Biochem.Metab. 2009, roč. 17, č. 1, s. 17-23
21) Suominen, P. aj. Serum transferin receptor and transferin receptor-ferritin index identify healthy subjects with subclinical iron deficits. Blood 1998, roč. 92, č. 8, s.2934-2939
53
