Validace analytické metody

Nejistoty v analytické chemii

přednáška z cyklu Analytická chemie II

Patrik Kania

24. 9. 2013

Proč validace metod a nejistoty výsledků ? Výsledky analýz se v dnešní době čím dál tím víc podílejí na rozhodnutích s významnými ekonomickými náklady.

Z toho vyplývá nutnost mít spolehlivá a věrohodná data.

Validace analytické metody

K získání takových dat je třeba vždy vybrat nejvhodnější analytickou metodu. a provést její VALIDACI pro daný účel a k získaným výsledkům přiřadit jejich NEJISTOTY

Co je validace analytické metody ? - proces, při němž se určuje vhodnost dané analytické metody pro získání spolehlivých dat

- při validaci posuzujeme, zda jsou parametry analytické metody takové, aby bylo možno touto metodou získat výsledky požadované jakosti

K čemu je validace užitečná ? Laboratoře by měly prokázat, že pracují v systému jakosti, jsou odborně kompetentní a jsou schopny produkovat věrohodné výsledky.

Mezi základní 2 prvky systému jakosti patří:  Validace měřicí metody  Nejistota výsledku měření

1

K čemu je validace užitečná ? • validace poskytuje informace o pracovních charakteristikách analytické metody

• validace zvyšuje spolehlivost výsledku: – pro uživatele metody (analytika v laboratoři)

Jaké metody by měly být validovány ? •

nestandardní

•

vyvinuté v laboratoři

•

standardní, ale používané mimo rámec standardu

•

standardní, ale upravené laboratoří

– pro uživatele výsledků (zákazníka) Zdroje standardních metod:

validace umožňuje lepší dialog mezi zákazníkem a analytikem !

- postupy uveřejněné v mezinárodních, regionálních, národních normách (ISO, EN, DIN, BS, ASTM, …) - postupy uveřejněné uznávanými organizacemi v jejich publikacích (AOAC pro potraviny a zemědělské produkty; ICH pro klinickou analýzu)

Typický průběh validace metody •

stanovení pracovních charakteristik dané analytické metody

•

stanovení rozsahu a omezení dané analytické metody

•

identifikace ovlivňujících parametrů, které mohou měnit pracovní charakteristiky dané analytické metody

•

jaký analyt můžeme stanovit, v jaké matrici, za přítomnosti jakých interferentů?

•

za jakých definovaných podmínek můžeme dosáhnout předem určenou nejistotu?

Typické pracovní charakteristiky metody  selektivita, specifičnost  výtěžnost  linearita, pracovní rozsah, citlivost  LOD, LOQ  opakovatelnost  robustnost  rozšířená nejistota

Selektivita, specifičnost

Selektivita je schopnost rozlišovat mezi analytem, který má být stanoven, a ostatními složkami vzorku (matricí). Specifičnost je 100%-ní selektivita. - jen málo analytických metod je specifických

Selektivita, specifičnost

Selektivita Nízká

Střední

Vysoká

Specifická metoda

Vážení

Acidobazické titrace

Spektrofotometrie

EDTA titrace

Chromatografie GC-MS Rotační spektroskopie

2

Výtěžnost, R

Lineární rozsah, pracovní rozsah

Míra pravdivosti dané analytické metody

R

nalezená _ hodnota referenční _ hodnota

1,0

pracovní rozsah

0,8

referenční hodnotu obdržíme z: odezva

Cnalezená - CRM (certifikovaného materiálu) R  CCRM cnalezená  cmatrice - spiku čisté látky R cspike

lineární rozsah

0,6

LOQ

0,4

LOD

0,2 0 0

Čím je R blíže k 1, tím je menší vychýlení metody a pravdivost metody je vyšší.

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

koncentrace

Citlivost

Mez detekce (LOD - limit of detection) Mez detekce analytické metody je dána nejmenším množstvím analytu ve vzorku, které může být detekováno.

- změna odezvy měřicího zařízení dělená odpovídající změnou nezávislé proměnné (koncentrace, obsah, množství) - citlivost je směrnice kalibračního vztahu

- určuje se z hodnot analytického signálu, LOD je tedy signálově orientovaná veličina - je rovna hodnotě slepého pokusu Ybl + 3s (s je odhad směrodatné odchylky slepého pokusu, tzv. blanku)

YLOD = Ybl + 3 sbl

- citlivost není rovna detekčnímu limitu !!!

Odpovídající koncentrace analytu se vypočte pomocí kalibrační rovnice:

signál Y = b0 + b1*c LOD = (YLOD – b0)/b1



Mez stanovitelnosti (LOQ - limit of quantification) Mez stanovitelnosti analytické metody je nejnižší množství analytu, které může být stanoveno s přijatelnou nejistotou.

Robustnost Robustnost analytické metody je charakterizována necitlivostí výsledku vůči malým změnám experimentálních podmínek, např. pH, teplotě, množství činidla....

- určuje se z hodnot analytického signálu, LOQ je tedy signálově orientovaná veličina - je rovna hodnotě slepého pokusu Ybl + 10s (s je odhad směrodatné odchylky slepého pokusu, tzv. blanku)

Nerobustní parametr

Robustní parametr

YLOQ = Ybl + 10 sbl Response

D

Response

Odpovídající koncentrace analytu se vypočte pomocí kalibrační rovnice:

D~0

signál Y = b0 + b1*c 

LOQ = (YLOQ – b0)/b1

Parameter Values

Parameter Values

Pn

Pa

Pn

Pa

3

Závěr validace - validační zpráva ukázka validační zprávy: Postup:

Stanovení obsahu kadmia podle EN-1234 (GF-AAS)

Měřená veličina:

Obsah celkového kadmia v potravinářských výrobcích

Matrice:

Potraviny a krmiva

Zdroj metody:

Vlastní, vypracovaná laboratoří

Předpokládané použití:

Rychlé posuzování výrobků

Analytický postup:

Rozklad v MW, analýza GF-AAS

Kalibrace:

Kalibrační roztoky od výrobce ZZZ

Závěr validace - validační zpráva ukázka validační zprávy: žádné interference do 1000 ng/g chloridů např. (95 ± 2) % CRM (mléko) lineární v rozmezí 3,5 - 20 ng/g pracovní rozsah 3,5 - 27 ng/g LOD =1 ng/g; LOQ = 3,5 ng/g sr = 3 % při 10 ng/g netestováno U = 10 % (k = 2)

 selektivita/interference  výtěžnost  linearita  pracovní rozsah  LOD; LOQ  opakovatelnost  robustnost  rozšířená nejistota

detaily o nejistotách výsledku budou probrány na následujících snímcích

Měřená veličina - obsah alkoholu v krvi [mg/g]

Nejistoty výsledků měření

Chyba versus nejistota

Hodnota, rozdíl a nejistota

Nejistota měření - znamená pochybnost o exaktnosti výsledku měření - je parametr související s výsledkem měření, který charakterizuje rozptyl hodnot, které by bylo možno důvodně přiřadit měřené veličině výsledek = hodnota ± nejistota 0,51 ± 0,07 mg/kg - má podobu rozsahu (intervalu) - nejistotu nelze použít ke korekci výsledku

Chyba měření - je rozdíl mezi individuálním výsledkem a skutečnou hodnotou měřené veličiny - má diskrétní hodnotu - lze ji využít ke korekci výsledku

rozpětí nejistoty y–U … y+U

bias

y-U

yR

y

y+U měřená veličina individuální výsledek

referenční hodnota (nejlepší odhad pravé hodnoty)

chyba

má naměřená průměrná hodnota

4

K čemu je nejistota výsledku užitečná ? •

nejistota výsledku prokazuje KVALITU měření

Kdy se vyhodnocuje nejistota výsledků měření ? • když je metoda nově zaváděna do laboratoře

(ale pozor, měření s nejmenší nejistotou nemusí být nejkvalitnější !!!)

•

je vyžadována normou ISO 17025 – akreditace

•

zlepšuje poznání měřicího postupu

•

v laboratoři  dokumentuje měřicí postup transparentním způsobem

•

pro koncového uživatele  poskytuje výsledku patřičnou důvěryhodnost

•

umožňuje porovnávání výsledků

•

identifikuje hlavní příspěvky nejistoty a umožňuje zlepšit daný postup

Typy nejistot Typ A:

• když se změní kritický faktor v používané metodě (přístroj, operator, typ vzorku…)

• během / zároveň s validací postupu

 samostatné vyhodnocování pro každý dosažený výsledek není nutné!

Základní pojmy spojené s nejistotami • měřená veličina - veličina, která je předmětem měření

- vyhodnocena pomocí statistických metod z naměřených údajů a vyjádřena ve formě směrodatné odchylky - měřena v laboratoři

• analyt - látka, která má být detekována nebo kvantitativně stanovena • přesnost - těsnost souhlasu mezi výsledkem měření a přijatou referenční hodnotou. Je určena pravdivostí a precizností.

Typ B: - vyhodnocena jinak než statistickou analýzou (předchozí experimenty, údaje z literatury, informace výrobce a expertní odhad)

• pravdivost - těsnost souhlasu mezi průměrnou hodnotou získanou z velkého počtu výsledků měření s přijatou referenční hodnotou. Pravdivost se obvykle vyjadřuje vychýlením - biasem.

Základní pojmy spojené s nejistotami

Vztah preciznosti, pravdivosti a přesnosti

měření. Přesnost je obvykle vyjádřena mírou nepřesnosti a vypočte se jako směrodatná odchylka výsledků měření. Menší přesnost je vyjádřena větší směrodatnou odchylkou.

• opakovatelnost - přesnost za podmínek opakovatelnosti. Podmínkami opakovatelnosti se rozumějí podmínky, při nichž jsou nezávislé výsledky měření získány toutéž metodou, tímtéž pracovníkem při použití téhož zařízení a v krátkém časovém období.

• reprodukovatelnost - přesnost za podmínek reprodukovatelnosti. Podmínkami reprodukovatelnosti se rozumějí podmínky, při nichž jsou výsledky měření získány toutéž metodou, v různých laboratořích při použití různého zařízení.

Zlepšení pravdivosti (trueness)

• preciznost - těsnost souhlasu mezi jednotlivými nezávislými výsledky

Odchylka (bias)

Zlepšení preciznosti (precision)

5

Výpočet standardních nejistot

Druhy nejistot

záleží na statistickém rozdělení uvažované veličiny

Standardní nejistota, u(x): nejistota hodnoty veličiny vyjádřená jako směrodatná odchylka (k = 1).

Kombinovaná standardní nejistota, u(y): standardní nejistota výsledku měření získaná z odpovídajících hodnot nejistot vstupních veličin. Je rovna kladné hodnotě druhé odmocniny součtu výrazů nejistot vstupních veličin a případných kovariancí těchto veličin (k = 1).

Rozšířená nejistota, U(y): veličina definující interval hodnot v okolí výsledku měření, o kterém lze předpokládat, že se v něm nalézá skutečná hodnota měřené veličiny na vyšší úrovni spolehlivosti. Hodnota U(y) se získá vynásobením standardní kombinované nejistoty u(y) koeficientem rozšíření k. Pro hladinu spolehlivosti přibližně 95 % má k hodnotu 2.

Výpočet standardních nejistot

v případě veličiny s NORMÁLNÍM ROZDĚLENÍM, které je charakterizováno střední hodnotou (očekávanou)  a rozptylem 2

je standardní nejistota veličiny rovna



výběrové směrodatné odchylce



u ( x)  s

použití: při odhadu nejistotu z opakovaných měření náhodného procesu

Výpočet standardních nejistot

v případě veličiny s ROVNOMĚRNÝM ROZDĚLENÍM, které je charakterizováno střední hodnotou (očekávanou) x a rozptylem a2/3

v případě veličiny s TROJÚHELNÍKOVÝM ROZDĚLENÍM, které je charakterizováno střední hodnotou (očekávanou) x a rozptylem a2/6

je standardní nejistota veličiny rovna

je standardní nejistota veličiny rovna

2a(=  a)

u ( x)  a / 3

u ( x)  a / 6 1/2a

1/a

X použití: - pokud v certifikátu nebo jiné specifikaci jsou uvedeny meze bez udání hladiny spolehlivosti (např. 25 ml  0,05 ml) - pokud odhad ve formě rozpětí ( a) je udán bez typu rozdělení

Výpočet kombinované nejistoty využití zákona šíření nejistot

u( y) 

2a(=  a)

X použití: - pokud hodnoty těsně kolem x jsou pravděpodobnější než v blízkosti hranic - toto rozdělení mají např. tolerance odměrného nádobí podle ČSN

Výpočet kombinované nejistoty Aditivní model měření (platí pro operace sčítání a odečítání)

N 1

N

 c u( x ) i 1

2 i

i

2

N

 2   ci c j u ( xi , x j ) i 1 j i 1

y = k(x1 + x2 + x3)

(k je konstanta)

kde ci jsou citlivosti (koeficienty selektivity) měřené hodnoty y vzhledem k hodnotám jednotlivých vstupních veličin

ci 

y xi

u( y)  k  u( x1 ) 2  u( x2 ) 2  u( x3 ) 2

pokud jsou vstupní veličiny xi vzájemně nezávislé, je kovarianční člen roven nule a pro výpočet kombinované nejistoty se využívá zjednodušeného vztahu:

u( y) 

N

 ci2u ( xi )2 i 1

6

Výpočet kombinované nejistoty Multiplikativní model měření (platí pro operace násobení a dělení) y = k(x1·x2·x3)

(u(xx ) )  (u(xx ) )  (u(xx ) )

u( y)  y 

1

2

2

1

Výpočet kombinované nejistoty

pomocí Kragtenova algoritmu

- pro n vstupních veličin je třeba zkonstruovat matici n x n - základem je zákon šíření nejistot

OBECNĚ

 c u( x )

u( y) 

i 1

2 i

2

i

kde koeficienty citlivosti ci jsou aproximovány Taylorovým rozvojem ci 

y y( xi  u ( xi ))  y( xi )  xi u ( xi )

po dosazení výrazu pro koeficienty ci do zákona šíření nejistot dostáváme finální výraz pro kombinovanou nejistotu u( y) 

N

i

i

5,03

0,11

0,0253 0,0005 60,25

5,14

5,03

5,03

0,0253

0,0258

0,0253

0,25

60,25

60,25

60,50

346,074

329,672

337,128

y (x i)

337,378 59,382

0,063

43,97%

0,05%

diff

2

75,614 2

index

ui u1

x1 + u1

x1

x2

u2

x2

x2 + u2

x2

x3

u3

x3

x3

x3 + u3

y (x i, u i)

y (x 1+u 1;x 2;x 3)

y (x 1;x 2+u 2;x 3)

y (x 1;x 2;x 3+u 3)

y (x i)

y (x 1; x2 ; x3 )

diff 2

[y (x 1;x2;x3)-y (x 1+u 1;x 2;x 3)]2

[y (x 1;x 2;x 3)-y (x 1;x 2+u 2;x 3)]2

[y (x 1;x 2;x 3)-y (x 1;x 2;x 3+u 3)]2

diff22 / suma(diff 2) . 100%

diff 32 / suma(diff 2) . 100

2

suma(diff )

2

2

diff 1 +diff 2 +diff3

x1

2

diff 12 / suma(diff 2) . 100%

Rozšířená nejistota veličina definující interval hodnot v okolí výsledku měření, o kterém lze předpokládat, že se v něm nalézá skutečná hodnota měřené veličiny na vyšší úrovni spolehlivosti. Hodnota U(y) se získá vynásobením standardní kombinované nejistoty u(y) koeficientem rozšíření k. Pro hladinu spolehlivosti 95 % má k hodnotu 2 99,7 % má k hodnotu 3 UKÁZKA pomocí předchozího příkladu

135,06 55,99%

xi

Rozšířená nejistota, U(y):

2x1  x3 x2

y (x i, u i)

suma(diff )

3

i

Výpočet kombinované nejistoty UKÁZKA

2

2

2

i 1

y

3

x1

index

 y( x  u( x ))  y( x )

2

Výpočet kombinované nejistoty

pomocí Kragtenova algoritmu - není třeba rozkládat model měření na aditivní a multiplikativní části

N

(k je konstanta)

u( y )  suma(diff 2 )  135,06  11,6

výsledek lze zapsat 337  12 (k=1)

výsledek s rozšířenou nejistotou (k = 2)

337  24 (k=2)

U(y) = ku(y) = 212 = 24

7

Nejistoty výsledků měření u složitějších systémů následující snímky ilustrují univerzální postup při určení nejistoty výsledku

Krok 1 – Měřicí postup a měřená veličina

Kroky pro vyhodnocení nejistoty ?

Zpracování vzorku

1 - Definujte měřicí postup a měřenou veličinu

• Navažování vzorku, m

2 - Napište modelovou rovnici (pro daný postup měření)

• Extrakce, R

3 - Identifikujte (všechny možné) zdroje nejistoty 4 - Určete hodnotu každé vstupní veličiny 5 - Vyhodnoťte standardní nejistotu (1s) každé vstupní veličiny 6 - Vypočtěte hodnotu měřené veličiny (pomocí modelové rovnice) 7 - Vypočtete kombinovanou standardní nejistotu výsledku

Stanovení dusičnanů v rostlinném materiálu iontovou chromatografií

• Příprava roztoku vzorku, VNO3• Naředění roztoku vzorku, fdi

Příprava standardního roztoku, Cst

Instrumentální měření, ANO3-

Instrumentální měření, Ast

8 - Vypočtete rozšířenou nejistotu (s vybraným k) 9 - Analyzujte příspěvky nejistot

Výpočet výsledku, QNO3-

10 - Zapište výsledky s rozšířenou nejistotou Měřená veličina je v tomto případě celkový obsah NO3- v (mg/g)

Krok 2 - Modelová rovnice 

vzorkování v laboratoři



podmínky skladování



čistota reagencií



výtěžnost analytu z komplexních matric

obsah dusičnanů ve vzorku (mg/g)



příprava kalibračních standardů

koncentrace dusičnanů ve standardním roztoku (mg/l)



nejistota standardů a CRM

intenzita signálu (plocha píku) odpovídající roztoku vzorku



podmínky měření

intenzita signálu (plocha píku) odpovídající roztoku standardu



kalibrační odchylka (bias) přístroje

objem roztoku vzorku ( l )



variabilita opakovaných pozorování



interference od ostatních sloučenin



předpokládaná stechiometrie

QNO   Cst 3

QNO3Cst ANO3Ast VNO3m fdi R

Krok 3 - Možné zdroje nejistot

ANO  VNO  3

3

Ast  m

1  f di  R

hmotnost vysušeného vzorku (g) ředicí faktor (bezrozměrné); faktor výtěžnosti (viz příprava vzorku)

8

Krok 3 - Možné zdroje nejistot

QNO   Cst

Koncentrace standardu, Cst

ANO  VNO 

3

3

Ast  m

3

 f di 

1 R • opakovaná pozorování (A)

Teplota

Čistota

Objem Hmotnost standardu

VNO  3

• validační experimenty (A a/nebo B)

Výtěžnost, R

Certifikát nádobí

Kalibrace vah

Krok 4 – Určení hodnoty každé vstupní veličiny (typ A & B)

• specifikace výrobce (B) QNO3-

Kalibrace vah

Ředění vzorku,

VNO3, fdi

Stabilita signájlu

Signál standardu Ast Kalibrace přístroje

Hmotnost vzorku, m

• kalibrační certifikáty (B) • výsledky mezilaboratorní validace metod (A/B) • ze zkušenosti anebo z literatury (B)

Signál vzorku, ANO3

Krok 6 - Vypočtěte hodnotu měřené veličiny

Krok 5 – Vyhodnoťte nejistotu (1s) každé vstupní veličiny Před sloučením, všechny příspěvky nejistoty musí být vyjádřeny/převedeny do „odhadované“ standardní nejistoty pokud je k dispozici jako: – směrodatná odchylka: – konfidenční intervaly: – udávané rozpětí: – rozšířené nejistoty:

použijte přímo převeďte převeďte převeďte

Použijte modelovou rovnici k výpočtu výstupní veličiny Y (QNO3-)

QNO   Cst 3

QNO   0,801 3

ANO  VNO  3

3

Ast  m

 f di 

1 R

0,0131 0,1000 1 10  0,0232 1,142 0,78

QNO  0,508 mg / g 3

Krok 7 – Vypočtěte kombinovanou standardní nejistotu Tam, kde není žádná korelace mezi vstupními veličinami kombinovaná standardní nejistota se vypočítá jako odmocnina sloučených rozptylů podle:

uc (QNO ) 3

QNO 3

2

2

2 2 2 2 2  u (Cst )   u ( ANO3 )   u ( Ast )   u (VNO3 )   u (m)   u ( f di )   u ( R)                      C A A V m f R   di     st   NO3   st   NO3  

kde u (Xi)/Xi je relativní standardní nejistota Xi

2

 f    u ( xi ) 2 uc ( y)     X i 

Krok 7 – Vypočtěte kombinovanou standardní nejistotu

2

kde

uc(y) u(xi)

2

Zákon šíření nejistot

uc (QNO  ) 3

= kombinovaná standardní nejistota = standardní nejistota každé ze vstupních veličin

Může se provést pomocí tabulkového editoru nebo jiným jednoúčelovým softwarem!

QNO  3



2

2

 0,00058   0,0003   0,0006          0,801   0,0131   0,0232  2

2

2

 0,0003   0,00058   0,023   0,04           0,1000   1,1420   10,000   0,78 

Absolutní nejistota

2

 0,063

uc(QNO3-) = 0,063 × 0,508 mg/g = 0,032 mg/g

9

Krok 8 – Vypočtěte rozšířenou nejistotu Rozšířená nejistota U se získá vynásobením kombinované standardní nejistoty uc(y) koeficientem rozšíření k:

U  k  uc Výsledek pak lze vyjádřit jako: Například:

Výsledek  y  U (k  ??)

QNO3- = (0,510 ± 0,064) mg/g , k = 2



nejlepším odhadem hodnoty přiřazené měřené veličině je „y“,



interval [y – U , y + U] je rozpětím, které zahrnuje velký podíl rozdělení hodnot, které by mohly být důvodně přiřazeny měřené veličině.

Krok 8 – Vypočtěte rozšířenou nejistotu

 Rozšířená nejistota poskytuje realističtější rozsah možných hodnot.  Obvykle používaný koeficient rozšíření je k = 2, který znamená záběr okolo 95 %, je-li rozdělení normální

Standardní nejistota by se měla používat při vnitřním použití v laboratoři - pro potřebu šíření nejistot Rozšířená nejistota je lépe vystihujícím rozmezím určeným pro koncového uživatele výsledků

Krok 10 - Uvádění výsledků

Krok 9 – Analyzujte příspěvky nejistoty Hlavní příspěvky :

R 68,7%

 • Typu A?  • Typu B?

QNO3- = (0,510 ± 0,064) mg/g (*) (*) uváděná nejistota je rozšířená nejistota vypočtená s použitím koeficientu rozšíření k = 2, což odpovídá hladině spolehlivosti přibližně 95 %

0,3%

17,4%

Rozšířenou nejistotu U nebo standardní nejistotu u je zřídkakdy zapotřebí uvádět na více než 2 platné číslice. Výsledek se musí zaokrouhlovat tak, aby byl v souladu s uváděnou nejistotou.

Ostatní

13,6%

Ast

ANO3-

Otázky 1. Co je validace analytické metody? 2. Uveďte některé pracovní charakteristiky analytické metody. 3. Vysvětlete rozdíl mezi LOD a LOQ. 4. Vysvětlete rozdíl mezi chybou a nejistotou měření.

Zdroje informací • Jakost v analytické laboratoři 2000: odpovědi manažerům jakosti [editor Miloslav Suchánek], Praha : Eurachem - ČR, 2000

• http://www.eurachem.org/guides/pdf/QUAM2000-1.pdf • http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf

5. K čemu slouží nejistota měření? 6. Jaké statistické rozdělení mají tolerance odměrného nádobí podle ČSN a jaký je vztah pro přepočet tolerance nádobí na jeho příslušnou nejistotu? 7. Vysvětlete rozdíl mezi pravdivostí a přesností. 8. Co je rozšířená nejistota? 9.

Uveďte vztahy pro výpočet kombinované nejistoty aditivního a multiplikativního modelu.

10. Vysvětlete podstatu Kragtenova algoritmu.

kontakt:

Ing. Patrik Kania, Ph.D. č. d. 235, budova A tel.: 220 444 274 e-mail: [email protected]

10