VALIDACE ALTERNATIVNÍ METODY PRO URÈENÍ NEBEZPEÈNOSTI CHEMICKÝCH LÁTEK A JEJICH SMÌSÍ

Pùvodní práce

VALIDACE ALTERNATIVNÍ METODY PRO URÈENÍ NEBEZPEÈNOSTI CHEMICKÝCH LÁTEK A JEJICH SMÌSÍ VALIDATION OF ALTERNATIVE METHOD FOR HAZARD ESTIMATION OF CHEMICALS AND THEIR MIXTURES MILOÒ TICHÝ1, MARIÁN RUCKI1, IVETA HANZLÍKOVÁ1, ROSTISLAV ÈIHÁK3, ALŽBÌTA DYNTEROVÁ3, LADISLAV FELTL2, ZDENÌK ROTH1 Státní zdravotní ústav, Centrum pracovního lékaøství a oddìlení biostatistiky, Praha 2 Karlova Univerzita v Praze, katedra analytické chemie, Praha 3 Centrum ekologie, toxikologie a analytiky, Výzkumný ústav organických syntéz, a. s., Pardubice 1

Èásteènì pøedneseno na 24. mezioborové vìdecké konferenci „Priemyselná toxikológia ´04“, Spišská Nová Ves, Slovensko, èerven 2004 jako „Toxicita smìsí chemikálií a odhad rizika expozice smìsím“

ÈESKÉ PRACOVNÍ LÉKAØSTVÍ  ÈÍSLO 3  2005

SOUHRN

140

Pro otestování nebezpeènosti chemických slouèenin a pøípravkù a jejich registraci podle nových zákonù a vyhlášek je nutné hledat kapacity v alternativních, rychlejších a levnìjších metodách testování, než jsou užívané metody klasické, které kapacitou nedostaèují. Kromì toho není pro urèení nebezpeènosti smìsí chemických látek prostý souèet pøíspìvkù složek ve smìsi dostateènì informativní. Oba tyto požadavky vyžadují rychlé a efektivní alternativní testy, které poskytují potøebné a spolehlivé údaje. V tomto pøíspìvku je demonstrována validace rychlého (tøíminutového) testu akutní toxicity, stanovení EC50 zástavy pohybu s oligochaete Tubifex tubifex (nitìnka vìtší), a to korelací EC50 (Tubifex tubifex) s IGC50 (Inhibition Growth Concentration – koncentrace inhibující rùst, prvoci Tetrahymena pyriformis) a s LC50 (ryba Pimephales promelas). Hodnoty EC50 stanovené na nitìnkách jsou použitelné pro odhad LD50 na potkanech po orálním podání výpoètem pomocí odvozené regresní rovnice mezi obìma experimentálními charakteristikami. Odchylky od aditivity indexù akutní toxicity smìsí byly prokázány testem jak s nitìnkami, tak s potkany. Test s nitìnkami vykazoval pro smìs benzenu s ethanolem inhibici, pro smìs benzenu s anilinem potenciaci, u benzenu s nitrobenzenem byla konstatována aditivita a u smìsi anilinu s ethanolem byla nalezena smíšená interakce, tj. potenciace nebo inhibice v závislosti na pomìru složek ve smìsi. Test s potkany pro smìs benzenu s ethanolem vykazoval rovnìž odchylku od aditivity; údaje tohoto testu pro další smìsi je nutné ještì doplòovat a upøesòovat. Nicménì i již zjištìné skuteènosti mohou mít za následek i závažné chyby pøi urèení nebezpeènosti smìsí chemických látek, pokud jsou její indexy poèítány prostým souètem pøíspìvkù jednotlivých složek ve smìsi, a následnì mùže dojít k chybám i pøi odhadu rizika expozice smìsím chemických látek. Klíèová slova: alternativní testy, test Tubifex tubifex, akutní toxicita, smìs chemikálií, urèení nebezpeènosti

SUMMARY For testing the risk of chemical compounds and preparations and their registration according to new laws and regulations it becomes necessary to look for available alter native, more rapid and cheaper methods of testing than the presently used classical methods, whose capacity is not sufficient. Moreover, to determine the risk of mixtures of chemical compounds a simple sum of the constituents in the mixture is not sufficiently informative. Both these requirements need rapid and efficient alternative tests, which provide necessary and reliable data. The present contribution demonstrates validation of a rapid (three-minute) test for acute toxicity, determination of E50 for the stop of movements with an oligochaete Tubifex tubifex by correlating EC50 (Tubifex tubifex) with IGC50 (Inhibition Growth Concentration – protozoan Tetrahymena pyriformis) and LC50 (fish Pimephales promelas). The EC50 values determined with Tubifex worms may be used for estimation in LD50 in rats after oral administration by calculation derived using a regression equation between two experimental characteristics. The deviations from additivity of indexes for acute toxicity of mixtures were demonstrated by the test with the Tubifex worms as well as with rats. The test with the Tubifex worms displayed inhibition for the mixture of benzene with ethanol, potentiation for the mixture of benzene with aniline, additivity for the mixture of benzene and nitrobenzene and a mixed interaction for the mixture of aniline and ethanol, i.e., potentiation or inhibition in relation to the ratio of components in the mixture. The test in rats for the mixture of benzene and ethanol also displayed deviation from additivity; data of the test for other mixtures must be added and made more precise. Nevertheless, the so far obtained data make it clear that severe errors can be made for the determine ation of the risk of mixtures of chemical compounds, if the indexes are calculated by a simple sum of constituents of the mixture and there may be subsequently errors in the risk estimate for exposure of mixtures of chemical compounds. Key words: alternative tests, the Tubifex tubifex test, acute toxicity, mixture of chemicals, risk assessment

Úvod

Pùvodní práce ÈESKÉ PRACOVNÍ LÉKAØSTVÍ  ÈÍSLO 3  2005

Jedním z hlavních parametrù pro odhad rizik expozice chemickým látkám je jejich nebezpeènost. Jde o soubor vlastností látek jak ve smyslu kvalitativním, tak ve smyslu kvantitativním. Takových vlastností si lze pøedstavit celou øadu a v Evropské unii byly pragmaticky dohodnuty ty, které jsou pokládány za nebezpeèné pro zdraví. Tyto vlastnosti jsou pak nezbytné pro popis nebezpeènosti chemikálií a jsou uvedeny v zákonì (4), který pøedstavuje transpozici evropských pøedpisù, zejména smìrnice 67/548/EHS v platném znìní. Údaje o jejich charakteru a jejich kvantitativní hodnoty je možné nalézt v literatuøe i mnoha datových souborech, v tabulkách nebo je lze stanovit. Pøedepsané metody pro stanovení tìchto vlastností lze najít pøedevším ve tøech vyhláškách (3). Opìt jde o pøepis evropských pøedpisù, které provádìjí zmínìnou smìrnici 67/548/EHS. Èlovìk je však, zejména v pracovním prostøedí, vystaven expozici smìsím chemikálií, nìkdy v nezanedbatelných koncentracích, navíc i chemikáliím v potravinách, pøípadnì užívanému léèivu. Zmìny ve velikosti úèinkù léèiv pøi jejich podávání v kombinacích farmakologové znají a stále je studují, aby bylo zamezeno nepøíznivým zmìnám jak žádoucích úèinkù, tak vedlejších, toxických úèinkù (antagonismus, synergismus, potenciace, inhibice nebo bez ovlivnìní – aditivita). Pro popis spoleèného pùsobení léèiv nebo obecnì látek ve smìsi používají farmakologové isobologramy, které postihují aditivní nebo neaditivní chování binárních smìsí (14). Isobologram pøedstavuje výnos ekviefektivních koncentrací nebo dávek v pravoúhlém grafu, ve kterém jsou na jeho pravoúhlých osách vynášeny podíly chemikálie v binární smìsi; na ose x látky A, na ose y látky B. Isobologramy tak definují nejen koncentrace (dávky) každé ze složek smìsi, ale zároveò i jejich pomìr. Je to užiteèný prostøedek pro klasifikaci rùzných typù úèinkù léèiv ve smyslu antagonismu, synergismu apod. podle tvaru køivky ekviefektivních koncentrací v grafu; aditivní pùsobení látek pøedstavuje pøímka spojující 100% koncentrace látek ve smìsi (tj. koncové body koncentraèních škál na osách x a y). Isobologram však nemùže být využit pro matematické modelování, které by bylo využitelné pro odhad velikosti úèinku smìsi, protože vyjádøení koncentrace jedné látky, A, jako funkce koncentrace druhé látky, B, nemá smysl. Pro prùmyslovì používané látky je však takových studií zanedbatelnì, i když jsme exponováni pouze smìsím. Navíc se bìhem dne pomìr chemikálií v pracovním ovzduší mìní. Zatímco farmakologùm staèí sledovat ovlivnìní úèinkù v úzkém rozmezí úèinných dávek nebo koncentrací, v prùmyslové toxikologii mohou být pomìry složek v exponující smìsi velmi rozdílné a právì tak mohou být rozdílné výsledné interakce. Otestovat tuto škálu možných interakcí tradièními testy na pokusných zvíøatech pøedstavuje velkou èasovou zátìž a mohutnou pracovní kapacitu. Pøistupuje povinnost testovat individuální chemikálie a pøedkládat údaje o nebezpeènosti pro zaøazení chemikálií nebo pøípravkù k registraci a pøi pøedkládání ke schválení použití (4). Navíc pøistupuje zábrana v používání obratlovcù k pokusùm i testování. Výše uvedený výèet je zvládnutelný jen rychlými testy in vitro, pøípadnì na nižších organismech nebo in silico (odhady výpoètem na poèítaèi). Z metod in silico je v souèasné dobì nejpropracovanìjší analýza QSAR (z angl.Quantitative Structure – Activity Relationships, kvantitativní vztahy mezi chemickou strukturou a biologickou úèinností (8, 20, 28)). Celosvìtovì se legalizaci tìchto metod, tj. jejich

právnímu ošetøení s cílem, aby jejich výsledky byly pøijímány stejnì jako výsledky metod tradièních, vìnují organizace OECD (Organization of Economical and Cultural Development – Organizace pro ekonomický a kulturní rozvoj) a ECVAM JRC (European Centre for Validation of Alternative Methods, Joint Research Centre of European Committee – Evropské centrum pro validaci alternativních metod, Spojené výzkumné centrum Evropské komise, Ispra). Validaci a hledání kritérií pro netradièní alternativní testy, které pracují s jinými testovanými objekty, než jsou obratlovci, organizuje a propaguje ECVAM JRC. Zámìrem jejich snažení je prevence a snížení vlivu chemických látek na zdraví lidí v pracovním i životním prostøedí a dosažení zlepšení životních podmínek obyvatel. A to v dohledné dobì, což tradièní metody pokusù a testování již nejsou schopny zajistit. Tyto tradièní metody a získávání srovnatelných výsledkù však dovolily vytvoøit dostateènì rozsáhlé datové soubory, které posloužily k ohodnocení výsledkù metod alternativních. Bylo je možné zobecnit do predikèních toxikologických modelù. Výzkum vhodnosti a výbìr nejvhodnìjších validovaných metod zkoušení je zamìøen na takové, které svojí rychlostí a relativnì nízkou cenou umožní získávání potøebných údajù pro velké množství zejména „starých“ (tedy již používaných) látek. Pro to se jeví alternativní metody, které využívají postupy bez pokusných zvíøat – obratlovcù nebo jejich poèet minimalizují, jako výhodné, protože poskytují informace rychleji. Hlavním kritériem pro uznání alternativních metod k testování toxicity je splnìní podmínky, že informace z výsledkù pøijatelného alternativního testu musí být adekvátní informaci, která je získána tradièním a pøedepsaným testem. Alternativní metody, vèetnì výpoètových, lze pak využít i pøi studiu úèinností smìsí chemikálií. Cílem tohoto pøíspìvku je pøedvést, že vybraný test indexu nebezpeènosti – akutní toxicity – lze stanovit jednoduchým testem pomocí oligochaete Tubifex tubifex (nítìnka vìtší) (22), která poskytne informaci adekvátní informaci té, která je získána tradièními testy (zvláštì v integrovaném alternativním testu, kde je využita znalost EC50 (Tubifex tubifex), rovnice a techniky analýzy QSAR a rozdìlovací koeficienty stanovené chromatograficky). Dále je cílem tohoto pøíspìvku ukázat, jak jsou tyto metody využitelné i pro stanovení nebezpeènosti smìsí chemikálií a následnì pro zkvalitnìní odhadu rizika expozice lidí smìsím chemikálií. Využití rozdìlovacích koeficientù látek ve smìsi a koeficient jejich distribuce je tématem jiné práce (15) a ukazuje na použitelnost fyzikálnì-chemických vlastností i pro odhad biologické úèinnosti chemikálií, jsou-li ve smìsi. Potenciace, synergismus, inhibice nebo antagonismus mohou mít podstatný vliv na urèení nebezpeènosti. Údaje, se kterými se dnes pracuje, jsou údaje o individuálních chemikáliích a pøedpokládá se, že úèinky jsou pouze aditivní. Tento pøíspìvek má za cíl poskytnout námìt na zlepšení urèení nebezpeènosti a následnì odhadu rizika expozice smìsím chemikálií. Materiál a metody Pro ovìøení vhodnosti informací, které poskytuje rychlý, tøíminutový, alternativní test akutní toxicity mìøením EC50 zástavy pohybù Tubifex tubifex (22), byly použity korelace s výsledky testù na prvocích Tetrahymena pyriformis (IGC50 – Inhibition Growth Concentration, koncentrace, která zpùsobí 50% inhibici množení prvokù za 48 hodin)

141

Pùvodní práce

(18), na rybách Pimephales promelas (LC50 za 96 hodin) (5) a na laboratorních potkanech (LD50 za 48 hodin, orálnì) (2). S výsledky jednotlivých testù byla provìøena tìsnost korelací s rozdìlovacím koeficientem chemikálií mezi n- oktanol a vodu (logP) (9) pro ovìøení hypotézy, že platí-li BAij=f(logP) a BAik=f(logP)

kde i jsou individuální chemikálie testované dvìma testy j a k, pak lze formálnì napsat matematickou rovnici 2

ÈESKÉ PRACOVNÍ LÉKAØSTVÍ  ÈÍSLO 3  2005

BAij=f(BAik)

142

(rovnice 1),

(rovnice 2)

a rovnici použít pro vzájemnou extrapolaci biologických úèinností, tedy i velikosti úèinkù toxických (21, 24). Tato zkušenost byla publikována a využita rùznými autory (10–13, 16, 19 a další). EC50 (Tubifex tubifex, nitìnky) (22) byla stanovena na nitìnkách, které byly prùbìžnì kupovány v obchodì akvaristiky nebo v zimì chovány v laboratoøi. Jejich životnost a prùbìh testu byly kontrolovány soubìžným testováním MnCl2.2H2O a porovnáním s referenèní hodnotou (22). Teplota místnosti byla pod neustálou kontrolou a pohybovala se mezi 20–24oC. LD50 na potkanech po orálním podání byly pro jednotlivé chemikálie získány z toxikologických uznávaných souborù (1). IGC50 na prvocích (17) a LC50 na rybách (16) jsou pøevzaty z validovaných souborù prací známých laboratoøí. EC50 (Tubifex tubifex) a LD50 (potkan, orálnì, 48 hod.) pro smìsi byly stanoveny a normalizovány (23). Mìøení EC50 (Tubifex tubifex) byla provádìna pro 14–16 rùzných pomìrù složek ve smìsi (molární zlomek R = 0–1), tøikrát vždy v tripletu v rùzné dny rùznými, minimálnì však dvìma pracovníky. Na potkanech bylo stanovení LD50 smìsí provedeno akreditovanou metodou podle vyhlášky Ministerstva zdravotnictví (2). U potkanù bylo promìøeno šest smìsí s rùzným molárním zlomkem R, vèetnì obou èistých složek. Pro hodnocení akutní toxicity smìsí prùmyslovì dùležitých chemikálií byly použity R-grafy (23, 25). R-grafem nazýváme výnos úèinnosti (na ose y), v tomto pøípadì EC50 (Tubifex tubifex) v molárních koncentracích smìsí, proti molárnímu zlomku R (na ose x). Molární zlomek R vystihuje pomìr složek v molárních jednotkách ve smìsi; udává, jakou èást zaujímá slouèenina, jejíž molární zlomek se uvádí, z celkové koncentrace slouèenin v roztoku. Je tedy vždy bezrozmìrný. Hodnota molárního zlomku R se pohybuje od 0 do 1, tj. od jedné èisté látky ke druhé èisté látce, napø. RBz, molární zlomek pro benzen ve smìsi, je roven 1 pro èistý benzen a 0 pro èistou druhou látku binární smìsi. Pro výpoèet EC50 pomocí závislosti úèinnosti na koncentraci jsou u smìsí molární koncentrace obou slouèenin v testovaných roztocích sèítány. V R-grafech jsou vynášeny na osu y experimentální hodnoty EC50 po normalizaci. Normalizace, struènì øeèeno, je relativizace EC50 smìsí k EC50 èistých látek za pøedpokladu jejich aditivity. Pokud jsou úèinnosti EC50 aditivní a neodchylují se pod vlivem nìjaké interakce, rovná se jejich normalizovaná hodnota v celém rozsahu R jedné – R-graf je pak pøímka rovnobìžná s osou x pøi hodnotì y =1. Pokud dochází k inhibici nebo antagonismu, hodnoty jsou vyšší než jedna, pøi potenciaci nebo synergismu jsou nižší než jedna. Jsou to údaje opìt bezromìrné. Tìmito hodnotami byl proložen polynom tvaru (rovnice 3)

BAij=f(Ri)n

(rovnice 3),

kde BA je velikost biologického úèinku (zde efektivní koncentrace zpùsobující zástavu pohybu 50 % populace nitìnek, EC50) binární smìsi chemikálií i a j jako polynomická funkce molárního zlomku R slouèeniny i n-tého stupnì. Proložení bylo provedeno váženým souètem nejmenších ètvercù, kde vahami byly pøevrácené hodnoty rozptylù hodnot po normalizaci (23, 25). Shoda proložení experimentálních dat polynomem a aditivita byly testovány bìžným χ2-testem, aditivita rovnìž testem podle Finneyho (7). Pokud bylo p<0,05, nebyla hypotéza o aditivitì pokládána za prokázanou, tj. úèinky nebyly pokládány za aditivní. Použitý chlorid manganatý byl od firmy Merck èistoty extra pure grade, benzen, anilin a nitrobenzen byly od firem Merck, Fluka a Aldrich, ethanol Lachema èistoty pro analysis. Vodné roztoky byly pøipravovány vždy v deionizované vodì. Koncentrace pracovních roztokù byly kontrolovány na plynovém chromatografu, koncentrace kontrolních roztokù chloridu manganatého atomovou absorpèní spektrofotometrií. Lineární regrese realizované v rovnicích 4–11 byly provedeny programem ORIGIN 7.5, kde n znamená poèet párù dat, r korelaèní koeficient regrese, SD standardní odchylku namìøených dat kolem proložené pøímky a p pravdìpodobnost, že mezi experimentálními výsledky srovnávaných metod není žádný statistický vztah. Výsledky a diskuse Korelace mezi hodnotami log EC50 (Tubifex tubifex) a log LD50 (potkan, orálnì) pro jednotlivé chemikálie je popsána regresní rovnicí 4: log EC50 (Tubifex tubifex) (mol.dm–3)=1,22 (±0,17) log LD50 (potkan, or) (mol.kg–1)+0,48 (±0,29) n=51; r =0,720; SD=0,62; p<0,0001

(rovnice 4).

Tìsnost korelace pro tento heterogenní soubor chemikálií je srovnatelná s korelací mezi efektivní koncentrací pro zástavu pohybu nitìnek log EC50 (Tubifex tubifex) a letální koncentrací ryb log LC50 (Pimephales promelas) (rovnice 5): log EC50 (Tubifex tubifex) (mol.dm–3)=0,58 (±0,07) log LC50 (Pimephales promelas) (mol.dm–3)+0,25 (±0,22) n=35; r=0,819; SD=0,52; p<0,0001

(rovnice 5).

Korelace s indexem akutní toxicity IGC50 mìøené na prvocích Tetrahymena pyriformis je tìsnìjší (rovnice 6), nicménì standardní odchylka odhadu je srovnatelná s rovnicí 4: log EC50 (Tubifex tubifex) (mol.dm–3)=0,78 (±0,04) log IGC50 (Tetrahymena pyriformis) (mol.dm–3)+0,31(±0,10) n=80; r=0,923; SD=0,34; p<0,0001

(rovnice 6).

Rozptyl bodù v korelaci mezi údaji na nitìnkách a údaji na potkanech je zpùsoben porovnáváním údajù strukturnì heterogenní série látek. Pokud jsou korelovány indexy akutní toxicity pro strukturnì homogenní sérii látek, korelaèní koeficient je vysoký (napø. rovnice 7 pro sérii alifatických nasycených alkoholù):

n=14; r=0,906; SD=0,36; p<0,0001

(rovnice 7).

Vzájemná korelace mezi indexy akutní toxicity stanovenými na nitìnkách a na potkanech podporuje naši teorii o možnosti extrapolace mezi údaji stanovené na nejrùznìjších testovacích objektech, pokud každý z nich koreluje (21, 24) s rozdìlovacím koeficientem látek mezi n-oktanol a vodu (log Poct/water). Takovou korelaci indexù akutní toxicity chemikálií s log Poct/water pro strukturnì heterogenní soubory demonstrují rovnice 8 pro Tubifex tubifex, rovnice 9 pro Tetrahymena pyriformis, rovnice 10 pro ryby Pimephales promelas a rovnice 11 pro potkany po orálním podání: log EC50 (Tubifex tubifex) (mol.dm–3)= –0,78 (±0,04) log Poct/water–0,56 (±0,06) n=81; r=0,923; SD=0,34; p<0,0001

(rovnice 8)

log IGC50 (Tetrahymena pyriformis) (mol.dm–3)= –0,86 (±0,06) logPoct/water–1,32 (±0,10) n=77; r=0,862, SD=0,54; p<0,0001

(rovnice 9)

log LC50 (Pimephales promelas) (mol.dm )= –0,97 (±0,15) logPoct/water–1,78 (±0,23) –3

1,6

log LD50 (potkan, or) (mol.kg–1)= –0,36 (±0,08) logPoct/water –1,21 (±0,14) n=52; r=0,547; SD=0,55; p<0,0001

(rovnice 11).

Takto validovaný test akutní toxicity na nitìnkách byl použit pro testování binárních smìsí chemikálií s cílem opìt porovnat jeho výsledky s výsledky tradièních testù. Indexy akutní toxicity binárních smìsí byly porovnány mezi EC50 (Tubifex tubifex) a LD50 (potkan, or), a to pro smìs benzenu s ethanolem, benzenu s anilinem a benzenu s nitrobenzenem. Na nitìnkách Tubifex tubifex byly u tìchto smìsí nalezeny základní interakce mezi úèinky: benzen s ethanolem vykazoval inhibici, benzen s anilinem potenciaci a benzen s nitrobenzenem vykazoval aditivitu. Polynomy v R-grafech jsou popsány rovnicemi (12–14) (27) a hodnoty jsou vždy po normalizaci. RBz je hodnota molárního zlomku benzenu ve smìsi. Akutní toxicita mìøená jako EC50 (Tubifex tubifex) ve smìsi benzenu s ethanolem vykazuje v celém rozsahu molárního zlomku (R = 0–1) inhibici. Køivka dosahuje maxima pøi R kolem 0,75 a polynom je popsán rovnicí 12: EC50 (Tubifex tubifex) = 1–0,24RBz+2,50RBz2+0,69RBz3– 2,95RBz4 χ2–test shody=9,97; stupòù volnosti=6; p=0,125

(rovnice 12).

1,2 1,0 0,8 0,6 1,4

LD50 (potkan, or)=1–4,6RBz+17,6RBz2–28,6RBz3+15,6RBz4

1,2

χ2–test shody s polynomem=7,56; stupòù volnosti=1; p=0,006 (rovnice 13)

1,0 0,8

LD50 (potkan, or)=1–2,85RBz+2,85RBz2

0,6

test aditivity podle Finneyho χ2=1305,6; stupòù volnosti=4; p<<0,001 χ2–test shody s polynomem=82,47; stupòù volnosti=3; p<<0,001.

0,4 0,2 0,0 0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

RBz Obr. 1: Akutní toxicita smìsi benzenu s ethanolem stanovená s oligochaete Tubifex tubifex jako EC50 (T.t.) (èást A) a s potkany po orálním podání jako LD50 (potkan, or) (èást B). Svislé úseèky pro jednotlivé pokusné body udávají standardní chybu údaje, teèkované vodorovné pøímky znaèí polohu údajù, pokud by byly úèinky aditivní. A. Závislost je v textu popsána rovnicí 12. B. Parabolická závislost, naznaèená èárkovanou èarou, je popsána rovnicí 14, rovnice 13 vystihuje prùbìh naznaèený plnou èarou.

(rovnice 14)

ÈESKÉ PRACOVNÍ LÉKAØSTVÍ  ÈÍSLO 3  2005

1,4 EC50 (T.t)

(rovnice 10)

Shodu mezi køivkou a daty lze pokládat za prokázanou pøi p>0,05; hodnota p = 0,125 je vìtší než 0,05, a køivka tedy dobøe vystihuje experimentální data. Tato køivka popisuje odchylky od aditivity v celém rozsahu pomìrù složek ve smìsi; jde o inhibici akutní toxicity (pro aditivitu platí EC50 (T. t.) = 1; obr. è. 1A). Výsledky stanovení na potkanech, tj. LD50, ukazuje obr. è. 1B. Lze je proložit polynomem ètvrtého stupnì, avšak vypoètený prùbìh se s daty neshoduje kvùli odklonu bodu pøi RBz = 0,95. Navíc je vypoètený prùbìh nepravdìpodobný (rovnice 13, obr. è. 1B). Pro interpretaci je pravdìpodobnìjší parabolická závislost LD50 na složení smìsi (rovnice 14), i když data jsou kolem køivky znaènì rozptýlena.

1,8

LD50 (potkan, or.)

n=33; r=0,768; SD=0,82; p<0,0001

Pùvodní práce

log EC50 (Tubifex tubifex) (mol.dm–3)=1,55 (±0,21) log LD50 (potkan, or) (mol.kg–1)+1,45 (±0,34)

Jakékoliv proložení køivky pokusnými daty prokazuje, že úèinky na potkanech jsou jasnì rovnìž neaditivní. Potenciace akutní toxicity mìøené jako EC50 (Tubifex tubifex) byla nalezena v celém rozsahu R (0 až 1) ve smìsi benzenu s anilinem (rovnice 15): EC50 (Tubifex tubifex)=1–1,40RBz+3,90RBz2+5,10RBz3+2,60RBz4 χ2–test shody=15,40; stupòù volnosti=8; p=0,051

(rovnice 15).

143

Pùvodní práce

Polynom vystihuje rozložení pokusných dat s dostateènou pøesností a demonstruje neaditivitu akutní toxicity (obr. è. 2A). Výsledky testování na potkanech po orálním podání smìsi benzenu s anilinem jsou ukázány na obr. è. 2B. V tomto pøípadì nebylo nutné polynom vyššího stupnì prokládat, protože pøedpoklad o aditivitì úèinkù obou látek ve smìsi, testovaný podle Finneyho (χ2 = 6, 17, 4 stupnì volnosti, z toho vyplývá p > 0,05), nebylo možné zamítnout. Lze proto LD50 smìsi vyjádøit polynomem 0.stupnì, tedy pøímkou a rovnicí 16:

jednoznaènì prokazuje aditivitu úèinkù (obr. è. 3A), je test aditivity pro výsledky testování LD50 (potkan, or) smìsi negativní (podle Finneyho χ2 = 153,6, p < 0,001). Závislost LD50 (potkan, or) na molárním zlomku RBz nelze proto popsat polynomem 0. stupnì (znamenajícím aditivitu) (rovnice 17):

LD50 (potkan, or)=1

Ani proložení dat polynomem 4. stupnì však není zcela ideální (χ2test shody s polynomem = 17,6, pøi 1. stupni volnosti je stále p<<0,001) (rovnice 18):

(rovnice 16).

O nevýznamnosti testu rozhoduje zejména vysoký rozptyl experimentálních výsledkù pøi RBz asi 0,05 a 2,2. Jde o systematické chyby v jednom smìru – k vyšším hodnotám LD50. Jde tedy o pøípad, kdy interpretace je velmi obtížná. Jiný pøípad nastal pøi testování LD50 (potkan, or) smìsi benzenu s nitrobenzenem. Zatímco proložení pokusných EC50 (Tubifex tubifex) této smìsi horizontální pøímkou

LD50 (potkan, or)=1

(rovnice 17)

χ2–test shody s polynomem=153,6; stupòù volnosti=4; p<<001.

LD50 (potkan, or)=1–0,22RBz+6,14RBz2–13,39RBz3+7,47RBz4 test aditivity podle Finneyho χ2 = 153,6; stupòù volnosti = 4; p<<0,001 χ2–test shody s polynomem = 17,6; stupòù volnosti = 1; p<<0,001 (rovnice 18).

1,8 1,6 1,4 EC50 (T.t)

1,2 1,1

EC50 (T.t)

0,9

0,8

0,8

0,6

0,7

0,4 1,4

3,0

1,2 LD50 (potkan, or.)

2,5

2,0

1,5

1,0

0,8

1,0 0,6 0,5 0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

RBz

144

1,0

0,6

LD50 (potkan, or.)

ÈESKÉ PRACOVNÍ LÉKAØSTVÍ  ÈÍSLO 3  2005

1,0

1,2

Obr. 2: Akutní toxicita smìsi benzenu s anilinem stanovená s oligochaete Tubifex tubifex jako EC50 (T.t.) (èást A) a s potkany po orálním podání jako LD50 (potkan, or) (èást B). Svislé úseèky pro jednotlivé pokusné body udávají standardní chybu údaje, teèkované vodorovné pøímky polohu údajù, pokud by byly úèinky aditivní. A. Závislost je v textu popsána rovnicí 15. B. Rovnice 16 popisuje závislost, pokud by úèinky byly aditivní.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

RBz Obr. 3: Akutní toxicita smìsi benzenu s nitrobenzenem stanovená s oligochaete Tubifex tubifex jako EC50 (T. t.) (èást A) a s potkany po orálním podání jako LD50 (potkan, or). Svislé úseèky pro jednotlivé pokusné body udávají standardní chybu údaje, èárkované vodorovné pøímky polohu údajù, pokud by byly úèinky aditivní. A. Závislost je popsána rovnicí pøímky, která je rovnobìžná s osou x: EC50 (T. t.) = 1. B. Závislost je vyznaèená èárkovanou èarou a v textu popsána rovnicí 18. Rovnice 17 popisuje závislost, jsou-li úèinky aditivní.

Závìr

1,4

EC50 (T.t)

1,2

1,0

0,8

0,6 0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

REt Obr. 4: Závislost akutní toxicity smìsi ethanolu s anilinem stanovená s oligochaete Tubifex tubifex jako EC50 (T.t.) na složení smìsi popsané molárním zlomkem ethanolu REt. Svislé úseèky pro jednotlivé pokusné body udávají standardní chybu údaje, teèkovaná vodorovná pøímka udává polohu bodù, pokud by byly úèinky aditivní.

Podìkování. Práce byla podpoøena granty GAÈR 305/03/ 1169 a 203/00/1619, IGA MZ ÈR NJ/7435-3, MŽP ÈR VaV/ 340/2/01 a Státním zdravotním ústavem. Za pomoc zvláštì pøi sepisování úvodu, kde se jedná o legislativu, dìkuji Alexandru Fuchsovi.

LITERATURA 1. Toxikologické datové soubory TOMES Plus System (Toxicology, Occupational Medicine and Environmental Sciences), REPRORISK System, Dolphin MSDS, které jsou souèástí ChemKnowledge System, MICROMEDEX (Greenwood Village, Colorado), CCINFO (2003), WinSPIRS, verse 5.0 2. Vyhláška Ministerstva zdravotnictví ÈR è. 251/1998 Sb.: Metoda B.1. Akutní toxicita orální (per os), totožná s metodou OECD è. 401, Acute oral toxicity 3. Vyhláška Ministerstva vnitra ÈR è. 164/2004 Sb., kterou se stanoví základní metody pro zkoušení nebezpeèných vlastností chemických látek a chemických pøípravkù z hlediska hoølavosti a oxidaèní schopnosti Vyhláška Ministerstva životního prostøedí ÈR è. 222/2004 Sb., kterou se u chemických látek a chemických pøípravkù stanoví základní metody zkoušení fyzikálnì-chemických vlastností a vlastností nebezpeèných pro životní prostøedí Vyhláška Ministerstva zdravotnictví ÈR è. 443/2004 Sb., kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických pøíspìvkù 4. Zákon è. 356/2003 Sb. Zákon o chemických látkách a chemických pøípravcích a o zmìnì nìkterých zákonù 5. Brooke LT, Call DJ, Geiger DL,Northcott CE: Acute toxicities of organic chemicals to fathead minnows (Pimephales promelas). Vol. 1. Centre for Lake Superior Environmental Studies, University of Wisconsin, Superior, WI 1984, 414s. 6. Cronin MTD, Schultz TW: Structure-toxicity relationships for three mechanisms of action of toxicity to Vibrio fischeri. Ecotoxicol. Environ. Saf., 39, 1998, s. 65–69. 7. Finney DJ: The analysis of toxic tests of mixture of poisoins. Ann. Appl. Biol., 29, 1942, s. 82–9 8. Hansch C, Maloney PP, Fujita T, Muir RM: Correlation of biological activity of phenoacetic acids with Hammett substituent constants and partition coefficients. Nature, 194, 1962, s. 178–180 9. Hansch C, Leo AJ: Substituent constants for correlation analysis in chemistry and biology. Wiley-Intersci., Publ.,New York, Chichester, Brisbane, Toronto, 1979, 339s.

ÈESKÉ PRACOVNÍ LÉKAØSTVÍ  ÈÍSLO 3  2005

Bylo prokázána použitelnost EC50, stanovená jako zástava pohybu oligochaete Tubifex tubifex, pro odhad LD50 na potkanech po orálním podání chemikálie, a to výpoètem pomocí rovnic typu QSAR analýzy (QAAR – Quantitative Activity – Activity Relationships). Validace byla potvrzena tìsnými korelacemi EC50 (Tubifex tubifex) s indexy akutní toxicity LC50 mìøené na rybách Pimephales promelas a na prvocích Tetrahymena pyriformis. Nálezy podporují pøedpoklad, že indexy akutní toxicity získané rychlým testem na nitìnkách (Tubifex tubifex) podávají stejné informace jako ty, které jsou stanoveny tradièním testem na potkanech.

Byly nalezeny závislosti experimentálních EC50 (Tubifex tubifex) na složení binárních smìsí, které bylo popsáno molárním zlomkem: benzen s ethanolem vykazující inhibici akutní toxicity, benzen s anilinem potenciaci, benzen s nitrobenzenem vykazující aditivitu akutní toxicity. U smìsi anilinu s ethanolem se projevuje závislost interakce mezi pùsobením chemikálií na pomìru složek ve smìsi. Inhibice se projevuje pøi pøebytku ethanolu, potenciace pøi pøebytku anilinu. Neaditivita akutní toxicity byla nalezena jak pro EC50 (Tubifex tubifex), tak pro LD50 (potkan, or) pøi testování smìsi benzenu s ethanolem. Pro tuto smìs nelze získat výsledný index akutní toxicity sèítáním aś koncentrací nebo úèinkù. Pro závìry tohoto druhu s testováním smìsí benzenu a anilinu a benzenu a nitrobenzenu na potkanech bude nutné získat více pokusných údajù o LD50. Nalezené skuteènosti upozoròují na možné chyby pøi odhadu nebezpeènosti expozice smìsím chemikálií, pokud jsou údaje o nebezpeèných vlastnostech látek poèítány jako prostý souèet pomìrných pøíspìvkù jednotlivých složek smìsi. Tyto chyby mohou být až øádové vùèi skuteèným hodnotám a mohou ovlivnit odhad rizika expozice chemickým smìsím.

Pùvodní práce

Tato situace vznikla kvùli pomìrnì vysoké statistické pøesnosti stanovených LD50 (potkan,or; obr. è. 3B), která zøejmì nezahrnuje možné kolísání citlivosti zvíøat mezi jednotlivými pokusy. Neaditivita akutní toxicity binárních smìsí chemikálií mùže pozmìnit reálný odhad rizika expozice chemikáliím, respektive jejich smìsím (26). Indexy toxicity – nebezpeènost chemikálií ve smìsích se obvykle sèítají, protože se pøedpokládá, že jsou aditivní. Tento pøedpoklad by mohl být pøijatelný u zøedìných smìsí, nikoliv u indexù charakterizujících nebezpeènost. Rozdíl mezi namìøeným indexem EC50 a vypoèítaným sèítáním pøíspìvkù úèinkù mùže pøesahovat i tisíc procent, pøi sèítání koncentrací, kterými pøispívají jednotlivé složky smìsi, desítky procent (26). Další chyba mùže být zpùsobena skuteèností, že potenciace nebo inhibice indexu akutní toxicity ve smìsi látek nemusí být jednoznaèná, ale závisí na pomìru látek ve smìsi. Takový pøíklad byl nalezen pøi stanovování EC50 (Tubifex tubifex) smìsi anilinu s ethanolem. Pøedbìžná mìøení lze charakterizovat tak, že k inhibici dochází pøi molárním zlomku ethanolu kolem 0,7 (pøebytek ethanolu), zatímco pøi molárním zlomku ethanolu kolem 0,3 (pøebytek anilinu) se projevuje spíše potenciace (obr. è. 4). Tato skuteènost je možná pro odhad nebezpeènosti chemikálií ve smìsích nejnebezpeènìjší.

145

Pùvodní práce ÈESKÉ PRACOVNÍ LÉKAØSTVÍ  ÈÍSLO 3  2005

146

10. Kaiser KLE, Esterby ST: Regression and cluster analysis of acute toxicity of 267 chemicals to six species of biots and the octanol/water partition coefficient. Sci. Total. Environ., 109/110, 1991, s. 499–514 11. Kaiser KLE, McKinnon MB, Fort FL: Interspecies toxicity correlations of rat, mouse and Photobacterium phosphoreum. Environ. Toxicol. Chem., 13, 1994, s. 1599–1606 12. Kaiser KLE: Correlation of Vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms. Environ. Health Persp., 106, Suppl. 2, 1998, s. 583–591 13. Kanaga EE: Test organisms and methods useful for early assessment of acute toxicity of chemicals. Environ. Sci. Technol., 12, 1978, s. 1322–1329 14. Loewe S, Muischnik H: Über Kombinationswirkungen. Arch. Exp. Pathol. Pharmakol., 114, 1926, s. 313–326 15. Reitmajer J, Feltl L, Roth Z, Tichý M: Rozdìlení slouèenin v binárních smìsích mezi jejich vodnou a plynnou fází. Chem. Listy, 99, 2005, v tisku 16. Russom CL, Bradbury SP, Broderius SJ, Hammermeister DE, Drummond RA: Predicting modes of toxic action from chemical structure: acute toxicity in the fathead minnows (Pimephales promelas). Environ. Toxicol. Chem., 16, 1997, s. 948–968 17. Seward JR, Hamblen EL, Schultz TW: Regression comparisons of Tetrahymena pyriformis and Poecilia reticulata toxicity. Chemosphere, 47, 2002, s. 93–101 18. Schultz TW, Lin DT, Wilke TS, Arnold LM: Quantitative structure-activity relationships for the Tetrahymena pyriformis population growth end point: a mechanism of action approach. V: Karcher, W., Devillers, J. (red.) Practical applications of quantitative structure-activity relationships (QSAR) in environmental chemistry and toxicology. Kluwer Academic Publs., Dordrecht 1990, s. 241–262 19. Schultz TW, Wyatt NL, Lin DT: Structure–activity relationships for nonpolar narcosis: a comparison of data from the Tetrahymena, Photobacterium and Pimephales systems. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 44, 1990, s. 67–72 20. Tichý M (red.): Quantitative structure-activity relationships. Sborník 1. European QSAR Symposium, Praha 1973. Experientia Suppl. 23, Akadémia Kiadó, Budapest, Birkhäuser Verlag, Basel 1976, 265 s. 21. Tichý M, Trèka V, Roth Z, Krivucová M: QSAR analysis and data extrapolation among mammals in a series of aliphatic alcohols. Environ. Hlth. Persp., 81, 1985, s. 321–325

22. Tichý M, Rucki M: Alternativní stanovení akutní toxicity chemikálií: zástava pohybu èervù Tubifex tubifex. Pracov. Lék., 48, 1996, s. 225–230 23. Tichý M, Cikrt M, Roth Z, Rucki M: QSAR analysis in mixture toxicity assessment. SAR QSAR Environ. Res., 9, 1998, s. 155–159 24. Tichý M, Boøek-Dohalský V, Rucki M: Worms (Tubifex tubifex) and partition coefficients for estimation of acute toxicity. V: Balls, M., van Zeller, A.-M., Halder, M.E., (red.) Progress in reduction, refinement and replacement of animal experimentation. Amsterdam, Lausanne, New York, Oxford, Shannon, Singapore, Tokyo, Elsevier BV 2000, s. 513–520 25. Tichý M, Boøek-Dohalský V, Matoušová D, Rucki M, Feltl L, Roth Z: Prediction of acute toxicity of chemicals in mixtures: worms Tubifex tubifex and gas/liquid distribution. SAR QSAR Environ. Res. 13, 2002, s. 261–269 Rault F-M: General law of vapor pressure of solvents (franc.). Compt. rend. 104, 1887, s. 1430–1433 (podle Leicester, H.M., Klickstein, H.S.: A source book in chemistry 1400–1900, Cambridge, MA, Harvard 1952) 26. Tichý M, Boøek-Dohalský V, Rucki M, Reitmajer J, Feltl L: Risk assessment of mixtures: possibility of prediction of interaction between chemicals. Int. Arch. Occup. Environ. Health 75 (Suppl.), 2002, s. S133–S136 27. Tichý, M., Roth, Z., Reitmajer, J., Rucki, M., Hanzlíková, I., Feltl, L.: Possibilities of quantitative structure-activity relationships (QSAR) analysis in toxicity assessment of binary mixtures. V: Walker, J.D. (red.) QSAR for predicting ecological effects of chemicals. Kap. 13, SETAC Press, Pensicola, Florida 2005, v tisku 28. Zahradník R, Chvapil M: Study of the relationship between the magnitude of biological activity and the structure of aliphatic compounds. Experientia 16, 1960, s. 511–514

Doc. RNDr. Miloò Tichý, DrSc. Centrum PL, SZÚ Šrobárova 48 100 42 Praha 10 Pøedloženo k publikaci: 11. 8. 2004

ZE ZAHRANIÈNÍ LITERATURY Joseph LaDou: Warning Auto Mechanics about Asbestos Hazards (Riziko azbestu – nebezpeèí pro automechaniky) Int. Jour. Occup. Environ. Health., 10, 2004, è. 1., s. 108–109 V r. 1986 americká spoleènost U.S. Environmental Protection Agency (EPA) vydala smìrnici o prevenci azbestových nemocí u automechanikù. Smìrnice byla distribuována do škol v USA, kde probíhá pøíprava automechanikù na jejich povolání. Od r. 1989 øídí EPA postupné zakazování azbestu v mnoha výrobcích, ale v brzdách a spojkách aut se vyskytuje azbest v USA dosud. Dovoz tøecích prvkù s azbestem pro brzdy do USA se od

r. 1996 do r. 2002 zdvojnásobil. Nìkteøí právníci nyní požadují, aby EPA oficiálnì odvolala smìrnici z r. 1986. Právníci výrobních firem poukazují na nové zprávy, které ukazují, že azbestová expozice u automechanikù nezpùsobuje azbestózu, rakovinu plic ani mezoteliom. 24. 11. 2003 vydala EPA prohlášení, že zrevidovala podle „rùzných informaèních materiálù“ svùj azbestový program, vèetnì smìrnice o brzdách. Návrh revize smìrnice bude pøedložen veøejnosti k diskusi v druhé ètvrtinì r. 2004. Zdravotniètí profesionálové a jiní zainteresovaní budou mít pøíležitost pøedložit svoje názory na návrh revidovaného dokumentu. L. Rychlá