9
III.
METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dimulai pada bulan Juni 2015 sampai Februari 2016 dan dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta. B. Bahan dan Alat Penelitian Bahan yang digunakan meliputi eksplan tanaman genderuwo (S. foetida Linn.) berupa batang tanaman genderuwo, media Woody Plant Medium (WPM), alkohol, aquades, clorox, sabun cuci serta bakterisida (Agrept) dan fungisida (Delsene). Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), autoklaf, magnetic stirrer, petridish, timbangan analitik, botol-botol kutur, pisau scalpel dan alat pendukung lainnya. C. Perancangan Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret Surakarta. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua faktor perlakuan yaitu pemberian BAP pada media WPM (Woody Plant Medium) dengan 4 taraf perlakuan (0 ppm, 2 ppm, 4 ppm, dan 6 ppm) dan pemberian IAA pada media Woody Plant Medium (WPM) dengan taraf 3 perlakuan (0 ppm, 0,5 ppm, dan 1 ppm). Kedua faktor perlakuan tersebut dikombinasikan sehingga diperoleh 12 kombinasi perlakuan dan masing-masing diulang sebanyak 3 kali. Kombinasi perlakuan tersebut antara lain : 1.
B0I0 = BAP 0 ppm + IAA 0 ppm
2.
B0I1 = BAP 0 ppm + IAA 0,5 ppm
3.
B0I2 = BAP 0 ppm + IAA 1 ppm
4.
B1I0 = BAP 2 ppm + IAA 0 ppm
5.
B1I1 = BAP 2 ppm + IAA 0,5 ppm
6.
B1I2 = BAP 2 ppm + IAA 1 ppm
7.
B2I0 = BAP 4 ppm + IAA 0 ppm
8.
B2I1 = BAP 4 ppm + IAA 0,5 ppm
9
10
9.
B2I2 = BAP 4 ppm + IAA 1 ppm
10. B3I0 = BAP 6 ppm + IAA 0 ppm 11. B3I1 = BAP 6 ppm + IAA 0,5 ppm 12. B3I2 = BAP 6 ppm + IAA 1 ppm D. Pelaksanaan Penelitian 1. Sterilisasi alat Alat-alat yang disterilkan adalah botol kultur, pinset besar dan kecil. Alat-alat tersebut dicuci hingga bersih menggunakan sabun cuci lalu dikeringkan. Setelah kering, dibungkus dengan kertas koran (kecuali botol kultur). Botol kultur disterilkan bersama dengan media yang telah dibuat dan tertutup tutup botol, kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 45 menit. 2. Pembuatan larutan stok Menimbang bahan-bahan larutan stok sesuai komposisi dalam media WPM (Tabel 2 dalam Lampiran 1). Garam-garam makro ditimbang untuk pembuatan 10 liter media sehingga setiap penimbangan bahan dikalikan 10. Kemudian bahan-bahan tersebut dilarutkan dengan aquades sampai 500 ml. Penimbangan bahan vitamin dikalikan 10 kemudian dilarutkan dalam aquades sampai 100 ml. Penimbangan garam-garam mikro dikalikan 100 kemudian dilarutkan dalam aquades sampai 500 ml. Masing-masing bahan tersebut diaduk hingga homogen dengan magnetic stirrer, baru kemudian dimasukkan ke dalam botol dan disimpan ke dalam refrigerator. Pembuatan larutan stok BAP dan IAA dilakukan dengan cara menimbang bahan sebanyak 10 mg kemudian ditetesi NaOH sebagai pelarut dan diencerkan dengan aquades sampai 100 ml. 3. Pembuatan media Media untuk penanaman eksplan yaitu media dasar WPM. Pembuatan media WPM dilakukan 2 tahap, tahap pertama mencampurkan larutan stok dengan takaran tertentu dan menambahkan ZPT yaitu BAP dengan konsentrasi 0 ppm, 2 ppm, dan 4 ppm ke dalam labu takar kemudian menambahkan aquades hingga volume 250 ml. Tahap kedua mencampurkan larutan stok
11
dengan takaran tertentu dan menambahkan ZPT yaitu IAA dengan konsentrasi 0 ppm, 1 ppm, dan 2 ppm ke dalam labu takar kemudian menambahkan aquades hingga volume 250 ml. Larutan kemudian dipindahkan ke dalam beker glass dan diaduk pada magnetic stirrer (Gambar 16 Lampiran 2). Menambahkan gula ke dalam larutan sebanyak 30 g, setelah homogen mengukur pH dengan pH meter hingga 5,8-6,3. Apabila pH terlalu rendah ditambahkan NaOH dan apabila pH terlalu tinggi ditambahkan HCl. Setelah pH sesuai, menambahkan agar sebanyak 8 g kemudian dipanaskan hingga mendidih. Setelah mendidih, larutan selanjutnya dituangkan ke botol-botol kultur, kurang lebih 25 ml setiap botolnya. Botol ditutup dengan tutp botol, kemudian dapat dilakukan sterilisasi dengan cara mengautoklaf pada suhu 121oC, pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 45 menit. Setelah selesai, botol diangkat dari autoklaf selanjutnya disimpan pada rak-rak kultur. 4. Sterilisasi eksplan Eksplan yang digunakan berasal dari bagian batang tanaman genderuwo. Tahapan sterilisasi eksplan sebagai berikut : a.
Di luar LAFC 1) Eksplan dibersihkan dengan aquades sampai bersih 2) Eksplan dimasukkan ke dalam botol berisi larutan fungisida dan bakterisida masing-masing 3 g/100 ml selama ± 5 menit (Gambar 17 dalam Lampiran 2). 3) Eksplan dibersihkan dengan larutan sabun dan dibilas aquades sampai bersih 4) Eksplan dimasukkan ke dalam botol berisi aquades dan dibawa ke dalam LAFC
b.
Di dalam LAFC 1) Eksplan dari rendaman aquades diambil dan diletakkan di petridish untuk dipotong menggunakan pisau scalpel menjadi ukuran ± 2-3 cm 2) Hasil potongan eksplan dimasukkan ke dalam botol berisi larutan betadine (5 tetes + 10 ml aquades) selama ± 1 menit
12
3) Eksplan hasil rendaman larutan betadine ditiriskan pada petridish dan siap untuk ditanam pada media 5. Penanaman eksplan Penanaman eksplan dilakukan dengan cara menanam eksplan yang telah dipotong menjadi berukuran ± 2-3 cm secara steril. Sebelum botol ditanami, terlebih dahulu di bagian mulut botol dipanaskan agar kontaminasi terhindarkan. Dengan hati-hati tutup botol selanjutnya dibuka. Setelah itu menanam eksplan dalam botol, selama penanaman mulut botol selalu didekatkan dengan api bunsen. Kemudian menutup botol dengan tutup botol dan melapisi dengan plastik wrap. 6. Pemeliharaan Pemeliharaan botol-botol kultur dilakukan dengan cara meletakkan pada rak-rak kultur. Ruangan penyimpanan botol
bersuhu 25-28oC dan
terdapat lampu fluorescent dengan intensitas cahaya antara 1000-4000 ft-c (1000-4000 lux) sebagai sumber cahaya. Botol-botol tersebut setiap dua hari sekali disemprot dengan alkohol untuk mencegah kontaminasi. E. Pengamatan Peubah 1.
Pertumbuhan eksplan Pengamatan variabel pertumbuhan eksplan dilakukan seminggu sekali, meliputi pertumbuhan eksplan hingga akhir pengamatan (12 Minggu Setelah Tanam, MST).
2.
Saat muncul kalus Pengamatan variabel saat muncul kalus dilakukan setiap hari. Penentuannya dilakukan dengan menghitung minggu pertama sejak awal penanaman hingga muncul kalus pertama. Hal ini diindikasikan dengan pembengkakan (terdapat benjolan) ekplan pada permukaan eksplan, diamati warna dan tekstur kalusnya.
3.
Saat muncul tunas Pengamatan variabel saat muncul tunas dilakukan setiap hari. Penentuannya dilakukan dengan menghitung minggu pertama sejak awal
13
penanaman hingga muncul tunas pertama. Ditandai dengan adanya tonjolan kehijauan pada permukaan eksplan.
4.
Jumlah tunas Jumlah tunas diamati pada akhir pengamatan (12 MST), dilakukan dengan menghitung jumlah tunas yang muncul.
5.
Tinggi tunas Tinggi tunas diamati pada akhir pengamatan (12 MST), dilakukan dengan mengukur tinggi tunas (cm) yang muncul.
6.
Saat muncul daun Pengamatan variabel saat muncul daun dilakukan setiap hari. Penentuannya dilakukan dengan menghitung minggu pertama sejak awal penanaman hingga muncul daun pertama. Ditandai dengan adanya daun kehijauan pada permukaan eksplan.
7.
Jumlah daun Jumlah daun diamati pada akhir pengamatan (12 MST), dilakukan dengan menghitung jumlah daun yang muncul pada setiap planlet.
8.
Panjang daun Panjang daun (cm) diamati pada akhir pengamatan (12 MST), dilakukan dengan menghitung rerata panjang daun pada setiap planlet.
9.
Saat muncul akar Pengamatan variabel saat muncul akar dilakukan setiap hari. Penentuannya dilakukan dengan menghitung minggu pertama sejak awal penanaman hingga muncul akar pertama. Ditandai dengan adanya akar pada ujung bawah eksplan.
10.
Jumlah akar Jumlah akar diamati pada akhir pengamatan (12 MST), dilakukan dengan menghitung jumlah akar yang muncul pada setiap planlet.
11.
Panjang akar Panjang akar (cm) diamati pada akhir pengamatan (12 MST), dilakukan dengan menghitung rerata panjang akar pada setiap planlet.
14
F. Analisis Data Data hasil penelitian dianalisis menggunakan metode deskriptif yaitu mendeskripsikan hasil dari pengamatan penelitian.
