II. GENOMIKA: TÖBBFÉLE MAKROMOLEKULA VIZSGÁLATA EGYIDŐBEN
Genomika Strukturális Funkcionális
Integratív
Strukturális genomika Genomkönyvtárak DNS szekvenálás Genom programok
Polimorfizmusok RFLP
1.
DNS könyvtár készítés – humán genom Emésztés RE-kal
Emberi duplaszálú (ds) DNS
(genomi) DNS fragmensek milliói
DNS fragment plazmidba építése
Plazmidok baktériumba juttatása
Rekombináns DNS molekulák Génkönyvtár
2.
Genomkönyvtár készítés 1.:ligálás emésztés restrikciós endonukleázzal 2.: plazmid vektorba 2
3
4
6
5
1 5
2 1
3
2
3
4
5
6
1 4 6
2
Genomkönyvtár készítés 2.: transzformáció ligálás plazmid vektorba 3.: Escherichia coli-ba
5
2 3 1 4
6
5
3.
Génkönyvtárak
4.
Genom könyvtár: klóngyűjtemény, amelyben megtalálható egy adott organizmus genomjának minden darabja (genom projektek) Felhasználása: szekvenálás, gének izolálása
cDNS könyvtár: egy organizmus összes mRNS-ének másolatait tartalmazza Felhasználás: génszerkezet megállapítása, cDNS-ek izolálása (intron-mentes gének). A transzkriptomot hivatott reprezentálni.
EST könyvtár: ‘expressed sequence tag’, a transzkriptomot reprezentálja, de a cDNS-eknek csak valamelyik végét (5’ vagy 3’) tartalmazza. Felhasználás: egy sejttípus vagy szövettípus transzkriptom gyors meghatározása (értsd: Milyen gének fejeződnek ki ebben a sejtben?). Az „aktív” genom gyors szekvenálására is használták.
5.
cDNS-könyvtár készítés Hogyan készítünk cDNS-t? cDNS 5’ GGGGG5’ mRNS második cDNS 3’ CCCCC 3’ szál első szál
1. RNS (mRNS) tisztítás: használhatunk teljes, vagy mRNS preparátumot
2. Reverz transzkripció: oligo-dT primerrel és reverz transzkriptázzal (RNS-függő DNS polimeráz) elkészítjük a cDNS első szálát 3. RNáz kezelés 4. Linker szintézis: terminális dezoxinukleotidil transzferázzal (DNS polimeráz, amely nem igényel templátot) oligo G linkert szintetizálunk 5. Második szál szintézis: oligo dC primerrel és DNS polimerázzal készül el a cDNS második szála.
AAAAAAAAA 3’ 3’ TTTTTTTTT 5’
DNS szekvenálás – A Sanger módszer v Didezoxi-nukleotid módszer Stop-nukleotid módszer Láncterminációs módszer AUTOMATIZÁLHATÓ
6.
7.
DNS szekvenálás – A Sanger módszer (A) A DNS szál szintézis kezdete
(B) Didezoxinukleotid
Primer 5’
Templát DNS
3’
3’ 5’ 3’ 5’
T
T
T
5’
T
T
T
5’
T
T
T
5’
Bázis
3’
3’
3’
(D) Az autoradiogram eredménye A T G C
(C) Amikor egy ddNTP (a példában ddATP) kapcsolódik, a szál szintézise leáll ddA
DNS szekvencia
GAATTGGCGCG GAATTGGCGC GAATTGGCG GAATTGGC GAATTGG GAATTG GAATT GAAT GAA GA G
T ddA T
T ddA ddA
ddA Az “A” család
ddA
T
T
T
T
T
T
DNS szekvenálás – A Sanger módszer Templát: Primer
3’
CCGGTAGCAACT
: 5’
8.
5’
GG 3’
dATP dCTP + ddCTP dGTP dTTP
dATP + ddATP dCTP dGTP dTTP
GGCCA GGCCATCGTTGA
GGC GGCC GGCCATC
n 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
A
dATP dCTP dGTP + ddGTP dTTP
GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT
GGCCATCG GGCCATCGTTG
C
G
dATP dCTP dGTP dTTP + ddTTP
T A3’G T T G C T A C C5’
A templát DNS-sel komplementer szekvencia
9.
Automatizált DNS szekvenálás fluoreszcens ddNTP-kel (A)
ddA
ddC
ddT
ddG
ddNTP-k – mindegyik típus más-más színű fluoreszcens festékkel megjelölve
Szekvenálási reakció, a termékek frakciói ddT ddA ddA ddG ddC ddC ddG
Képalkotó rendszer
Detektor
(B) CACCGCATCGAAATTAACTTCCAAAGTTAAGCTTGG
Valódi egymolekulás szekvenálás tSMS
100-200bp-os DNS szálak szekvenálása 100 milliós nagyságrendben, egyidőben
Naponta több milliárd bázis megszekvenálása
Humán Genom Program
10.
11.
A módszerek Hierarchikus módszer (HGP)
vs.
Shotgun szekvenálás (Celera)
Kromoszómák
Nagy BAC klónok készítése, végeik megszekvenálása
BAC klónok darabolása, szubklónozás
Teljes genom feldarabolás és azonnali szekvenálás
Ki a megszekvenált genom gazdája? 2001 A humán genom program eredményeként a haploid humán genom nyers szekvenciája
50 férfi és nő etnikailag diverz csoportja
21 férfi és nő etnikailag diverz csoportja
(HGP)
(Celera)
8 ismeretlen etnikumú férfi
2 férfi, 3 nő, 1-1 ázsiai, afrikai, latin.-amerikai 2 kaukázusi
2003 Az első teljes emberi genom 2006 Az teljes genom kiegészítése az 1-es kromoszómával
2007 Az első 2 diploid genom: Venter & Watson 2008 Egy han kínai és egy yoruba férfi diploid genomja
12.
Genom programok
13.
Polimorfizmusok/molekuláris markerek14.a humán genomban Polimorfizmus
Alap szekvencia (bp)
SNP
1
Single Nucleotide Polymorphisms
STR: mikroszatellit
2-20 (?)
VNTR: miniszatellit
15-100
RFLP
-
Polimorfizmus: többalakúság (görög) Polimorf DNS lokusz: amelyen két vagy több eltérő allél figyelhető meg egy adott népességben
VNTR és STR analízis 1. Amplifikálás PCR-rel A PCR primerek azon DNS szekvenciáknak komplementerei, amelyek közvetlenül a ripít szomszédságában vannak. A PCR termék hossza függ: a ripítben ismétlődő „egység” hosszától a kópiák számától VNTRek: 3 személy 4 pár homológ kromoszómája
A
B
C
15.
16.
VNTR és STR analízis 2. Gélelektroforézis Az „egység” DNS szakasz hosszának ismeretében és a PCR termék mérete alapján meghatározható a kópiák száma. Adott emberre jellemző mintázatot kapunk. Anya
Apa
Lányok
Fiúk
Apasági vizsgálat, személyazonosítás
DNS ujjlenyomat
Érzékeny technika: egyetlen hajhagyma vagy vércsepp alapján elvégezhető
SNP-k Egyetlen nukleotid (A, T, G, vagy C) cseréje/változása a genomban
ACGGCTAA
Egy variáció SNP, ha a populáción belül valamennyi allélja minimum 1% gyakorisággal előfordul. Az SNP-k 66,6%-ban C--->T cserét jelentenek.
17.
SNP-k Egyetlen nukleotid (A, T, G, vagy C) cseréje/változása a genomban
ATGGCTAA
Egy variáció SNP, ha a populáción belül valamennyi allélja minimum 1% gyakorisággal előfordul. Az SNP-k 66,6%-ban C--->T cserét jelentenek.
17.
18.
SNP-k vizsgálata: ASA PCR termékek
Primerek A polimorf specifikus oligo hosszabb
Normál allél Polimorf allél
Közös primer 3’ vége fluoreszcensen jelölt
PCR reakció
Homozigóta normál genotípus Heterozigóta genotípus Homozigóta polimorf genotípus
Elektroforézis
méret
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism restrikciós fragment hosszúság-polimorfizmus
Restrikciós emésztést követő PCR
Agaróz gél elektroforézis
Ha egy báziscsere létrehoz vagy megszüntet egy restrikciós enzim felismerési helyet, akkor a hasítás mintázata megváltozik: a PCR során felsokszorozott DNS szakaszok emésztése során keletkező fragmentumok száma és mérete alapján a genotípus meghatározható.
19.
20.
RFLP RFLP markerek öröklődése
Szülők Gyerekek
Genotípusok
Funkcionális genomika Microchip
Microarray scanner
21.
A Chip (microarray) technológia Strukturális genomika
GENOM - szekvencia megállapítása - mutációk felderítése - egy nukleotid eltérések (SNP) - deléció inszerció - metilációs mintázat
22.
Funkcionális genomika
DNS chip-ek
TRANSZKRIPTOM - gén expresszió megváltozása, - splice-variánsok kimutatása - szabályozó RNS-ek (miRNS) kimutatása
CITOPLAZMA DNS transzkripció
SEJTMAG
Fehérje chip-ek
pre-mRNS
transzláció
protein
tRNS
PROTEOM
mRNS riboszóma
- kifejeződés - módosítások - kölcsönhatások
23.
A DNS chip
DNS-chipen több ezer gén aktivitását nyomon tudjuk követni. Minden pont egy génre jellemző szekvenciát tartalmaz. A biológiai mintából kinyert, fluoreszcensen megjelölt RNS a gén aktivitásával arányos fluoreszcens jelet ad.
- a működés alapja: DNS-DNS vagy DNS-RNS hibridizáció - nagyszámú gén expressziós mintázatának egyidejű meghatározása - egy chip 6-10,000 gén vizsgálatára alkalmas. - cDNS chipek - oligonukleotid chip-ek
2. Szövetminták begyűjtése
24.
1. Chip elkészítése: - nyomtatás kontrol
beteg
3. RNS tisztítás
4. Reverz transzkripció (fluoreszcens jelölés)
5. Hibridizálás
6. Detektálás
25.
Microarray analízis - összefoglalás 1. RNS izolálás. cDNS szintézis.
minta 4. Adatelemzés
2. Jelölt próbák és a microarray hibridizálása 8x4x2
3. Szkennelés
2x4x8
ChIP (kromatin immunprecipitáció)
Antitestekkel való tisztítás
26. Az antitest a specifikus transzkripciós faktorhoz köt
A kromatin/antitest komplex összegyűjtése
Formaldehiddel kezelt sejtek DNS fragmentek kinyerése szonikálással DNS tisztítás
A fragmentek és a transzkripciós faktorok között keresztkötések létesülnek
Specifikus transzkripciós faktor kötőhelyet tartalmazó DNS szekvencia
Real-Time PCR alapja: fluoreszcencia detektálása a PCR reakció mindenegyes ciklusában A fluoreszcencia intenzitása arányos a PCR termék mennyiségével a reakció végén nincs szükség gél-alapú kiértékelésre analízis: szoftver alapú
27.
28.
29.
mRNS expresszió vizsgálata lépések: RNS tisztítás (totál RNS, mRNS; sejt, szövet) reverz transzkripció (RNS → cDNS) Real-Time PCR
• „Fogalmak” • Real-Time PCR = qPCR (kvantitatív) • RT2-PCR = qRT-PCR • RT-PCR = reverz transzkripciót követő PCR
30.
• allél-specifikus Real-Time PCR TaqMan próbával • az egyik primer 3’- vége az SNP-re kell, hogy essen • a DNS szintézis, azaz a PCR reakció működik, ha a használt primer 3’-vége az SNP-vel komplementer ebben az esetben detektálható a riporter fluoreszcenciája
• kezelt-kezeletlen • egészséges-beteg • érzékenyebb a DNS chipeknél • kevesebb minta egyidejű analízise • Relatív kópiaszám meghatározás: ∆Ct
fluoreszcencia
31.
tumor egészséges
ciklusszám
32.
1. Na-biszulfitos kezelés Met
Met
Na-Biszulfit CpG CpG 2a. MetilC-Seq PCR Klónozás Szekvenálás 2b. Real-Time PCR
CpG UpG
33.
33.
33.
