I. Strukturális Genomika
II. Funkcionális Genomika III. Integratív Genomika
A genomika főbb területei Strukturális (szerkezeti ) genomika Funkcionális (működési) genomika Transzkriptomika Proteomika Integratív genomika Komparatív (összehasonlító) genomika Metabolomika In silico genomika Farmakogenomika Pszichogenomika
Strukturális genomika DNS szekvenálás
DNS szekvenálás – A Sanger módszer Templát: 3’
CCGGTAGCAACT
Primer : 5’
GG 3’
dATP dCTP + ddCTP dGTP dTTP
dATP + ddATP dCTP dGTP dTTP
GGCCA GGCCATCGTTGA
GGC GGCC GGCCATC
n 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
A
5’
dATP dCTP dGTP + ddGTP dTTP
GGCCATCG GGCCATCGTTG
C
G
T
A3’ G T T G C T A C C5’
dATP dCTP dGTP dTTP + ddTTP
GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT
A templát DNS-sel komplementer szekvencia
Automatizált Sanger-módszer
Nagy-volumenű, újgenerációs szekvenálási módszerek MULTIPLEX DNS SZEKVENÁLÁS Hibridizáció alapú SBH DNS szintézisen alapuló Piroszekvenálás tSMS SMRT Nanopórusos technikák
Második generációs szekvenátorok
Harmadik generációs szekvenátorok
Hibridizáláson alapuló szekvenálás (SBH) Ismert DNS szekvenciához képest kis
eltérések kimutatására SNP-analízis
Microarray alapú Nem enzimatikus
DNS szintézisen alapuló szekvenálási módszerek
Közös jellemzőik DNS polimeráz (enzimatikus) Fénydetekció Parallel, multiplex módszerek Piroszekvenálás tSMS: valódi egymolekulás szekvenálás SMRT: egymolekulás real-time technológia
Piroszekvenálás (DNS)n + dNTP APS + PPi
dNTP
apiráz
ATP T/G polimorfizmus pirogramja
DNS polimeráz
szulfuriláz
ATP
(DNS)n+1 + PPi luciferáz
dNDP + dNMP + Pi ADP + AMP + Pi
fény
Valódi egymolekulás szekvenálás tSMS
100-200bp-os DNS szálak szekvenálása 100 milliós nagyságrendben, egyidőben
Naponta több milliárd bázis megszekvenálása
Egymolekulás real-time technológia SMRT 2013: a 100$-os genom 15 perc alatt
Nanopórusos szekvenálás ultragyors (többszáz kb (kilobázis) megszekvenálása néhány perc alatt) olcsó (a teljes genom
megszekvenálásának költségeit kb 4 nagyságrenddel csökkenti) Nem enzimatikus Nem fényt, hanem áramerősséget detektál
Nanopórusos szekvenálás I. Exonukleáz szekvenálás Jelölésmentes Nem szintézis alapú d=1nm Molekulánkénti szekvenálás Áramerősség detekció Oxford Nanopore Technologies
α-hemolizin nanopórus α-hemolizin nanopórus + ciklodextrin
Nanopórusos szekvenálás II.
A DNS szekvencia ismeretében lehetővé válik • genetikai hátterű betegségekre való hajlam kimutatása • fertőzések diagnosztikája (kórokozók azonosítása) • rokonsági fok meghatározására (apasági vizsgálatok ) • személyazonosítás (bűnüldözés) • génváltozatok összehasonlítása • törzsfák készítése • biológiai folyamatok kutatása • betegségek genetikai hátterének elemzése • új terápiás lehetőségek felfedezése SZEMÉLYRE SZABOTT GYÓGYMÓDOK
Kromoszóma séta 1. lépés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
G
E F
A B C D
A1 Próba: A1 klónból származó inszert Pozitív jelek: A1, E7, F6 klónok
E7
F6
H
2. lépés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D G H
E F
A1 Próba:F6 klónból származó inszert Pozitív jelek: A1, B12, F6 klónok
E7
B12 F6
Kromoszóma séta PCR-ral 1. fragment
primerek
Klónok sorszáma
Eredmény: az 1. és 14. klónok átfednek
Strukturális genomika
GENOM
Funkcionális genomika
DNS chip-ek
- szekvencia megállapítása - mutációk felderítése - egy nukleotid eltérések (SNP) - deléció inszerció - metilációs mintázat
TRANSZKRIPTOM - gén expresszió megváltozása, - splice-variánsok kimutatása - szabályozó RNS-ek (miRNS) kimutatása
CITOPLAZMA DNS transzkripció
SEJTMAG
Fehérje chip-ek
pre-mRNS
transzláció
protein
tRNS
PROTEOM
mRNS
riboszóma
- kifejeződés - módosítások - kölcsönhatások
A DNS chip (microarray)
DNS-chipen több ezer gén aktivitását nyomon tudjuk követni. Minden pont egy génre jellemző szekvenciát tartalmaz. A biológiai mintából kinyert, fluoreszcensen megjelölt RNS a gén aktivitásával arányos fluoreszcens jelet ad.
-Működés alapja: DNS-DNS vagy DNS-RNS hibridizáció - Nagyszámú gén expressziós mintázatának egyidejű meghatározására szolgál. Valójában fordított Southern blot: az ismert próbák kovalens kötéssel rögzítettek az üvegfelületen.
- Egy chip 6-10,000 gén vizsgálatára alkalmas. -cDNS chipek -oligonukleotid chip-ek
1. Chip elkészítése: - nyomtatás
2. Szövetminták begyűjtése kontrol
kezelt
3. RNS tisztítás
4. Reverz transzkripció (fluoreszcens jelölés)
5. Hibridizálás
6. Detektálás
Chipek felhasználása • Fertőzések felismerése
mikroorganizmusok azonosítása
• Rákdiagnosztika
diffúz nagy B-sejtes limfóma (DLBLC) típusok megkülönbözetése alkalmas kezelés
• SNP-k detektálása • miRNS microarray
különböző ráktípusokban megfigyelhető, hogy bizonyos miRNS-ek alul/túlexpresszálódnak
Chipek felhasználása – mikroorganizmusok azonosítása
Chipek felhasználása rákdiagnosztika • DLBLC: diffúz nagy B-sejtes limfóma (nem-Hodgkin-limfóma) • 2 típus: - aktivált B-sejtszerű - GC-szerű • Markergének (sejttípus azonosítás) • Cél: betegek génexpresszió alapján való besorolása
megfelelő kezelés
SNP-k & fenotípus SNP –Single Nucleotide Polymorphism Biológiai markerek
Association study SNP-profilok megállapítása
SNP-k & fenotípus gén
Betegség, vagy egyéb fenotípusos jelleg
ApoE
Alzheimer-kór
Nos2
NO›, malária ellen jobban ellenálló
BRCA1 Mc1R
Alternatív splicing bizonyos ráktípusok esélye nő Pheomelanin›, eumelanin‹, vörös haj + midazolam rezisztencia
ApoE & Alzheimer-kór •Alzheimer-kór: poligénes •Apolipoprotein E •2 SNP •3 allél: E2, E3, E4 •1-1 AS különbség
Nos2 Plasmodium fajok okozzák Anopheles szúnyog a vektor Nos2 gén promóterében T -> C csere Több NO a vérben - > csökken a malária esélye
Kenya&Tanzánia
25%
BRCA1 BRCA1 mutáció esetén 85% esély a mellrák kialakulására ESE: exonic splicing enhancher->SNP->exon nem épül be ESS: exonoc splicing silencer -> SNP -> exon beépül, nem kellene
Változások: fehérje struktúrájában és funkciójában
Mc1R – melanocortin 1 receptor
Fehérje chip
Fehérje chip Jelölési stratégiák 1. Direkt jelölés
2. Szendvics módszer
WGT Whole Genome Tiling •új típusú microarray •gének transzkripciójának vizsgálata •alternatív-splicing analízise •transzkripciós faktor kötő helyek, DNS metilációs helyek feltérképezése •polimorfizmusok vizsgálata •genotipizálás PRÓBÁK (25-60 bp) •szabályosan elrendezett •átfedő •szeparált •„step”: az egymást követő próbák centrumainak távolsága
WGT Whole Genome Tiling A próbák szintézise: oligonukleotid, v. PCR termék „spot” direkt az üveglap felületére a próbák fluoreszcensen jelölt cRNS-hez, vagy cDNS-hez kötnek
fluoreszcencia intenzitás
Tiling próbák
próba intenzitása
transzkripciós aktivitás 30 kb-os régió
PCR - ismétlés 3.ciklus
4.ciklus
35 PCR ciklus
Target DNS 2.ciklus 1.ciklus
1 kiindulási kópia
Ideális reakció: 2n kópia/ciklus Exponenciális növekedés
235=34 milliárd kópia
PCR • • • •
DNS-templát – tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját 2 primer – meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét DNS-polimeráz – lemásolja az amplifikálandó szakaszt Nukleotidok – amelyekből a DNS-polimeráz felépíti az új DNS-t
• Puffer – biztosítja az enzim számára megfelelő kémiai környezetet
Real-Time-PCR • alapja: fluoreszcencia detektálása a PCR reakció mindenegyes ciklusában REAL–TIME • A fluoreszcencia intenzitása arányos a PCR termék mennyiségével • a reakció végén nincs szükség gél-alapú kiértékelésre • analízis: szoftver alapú
Real-Time vs. End Point
RT2-PCR (reverz transzkripción alapuló Real-Time PCR)
• mRNS expresszió vizsgálata • lépések: – RNS tisztítás (totál RNS, mRNS; sejtből, szövetből) – reverz transzkripció – (RNS cDNS) – Real-Time PCR
• „Fogalmak” • Real-Time PCR = qPCR (quantitative) • RT2-PCR = qRT-PCR • RT-PCR = reverz transzkripciót követő PCR
Detektálás • Nem-specifikus – SYBR® Green
• Specifikus – TaqMan® próba
SYBR® Green • interkalálódó molekula (~ etidium-bromid) • dsDNS-hez köt (kis árok) • monokróm fénnyel indukálva 530nm hullámhosszú fényt emittál • a fluoreszcens jel nagysága arányos a PCR során keletkező DNS mennyiségével ssDNS dsDNS
TaqMan® próba 20-30 bp hosszú, módosított oligonukleotid az amplifikálandó régió középső szakaszával komplementer 5’ vég: fluoreszcens festék molekulával jelölt → reporter (R) 3’ vég: a reporter fluoreszcenciáját kioltó, nem fluoreszcens quencher (NFQ) molekulát tartalmaz • a próba intakt állapotában a kioltó molekula elnyeli a reporter fluoreszcens emisszióját • energiaátadás: fluoreszcens rezonancia energia transzferrel (FRET) → a két molekula fizikai közelségén alapul • • • •
amplifikációhoz három oligonukleotid egyidejű bekötődése szükséges
nagyfokú specificitás a termék szintézisének megkezdése után a DNS polimeráz (P) 5’-exonukleáz aktivitásának megfelelően hasítja a próbát → a reporter molekula távolabb kerül a quencher molekulától a reporter molekula egyre növekvő fluoreszcens emissziójának detekciója arányos a termék exponenciálisan növekvő mennyiségével, (a minta kiindulási RNS tartalmával)
Analízis I. (melting curve) primer dimer specifikus termék
Analízis II. (Ct: threshold cycle) plató
threshold (küszöb)
exponenciális fázis
log
minták összehasonlítása az exponenciális fázisban
háttér fluoreszcencia(zaj)
Real-Time PCR a gyakorlatban - SNP detektálás • allél-specifikus Real-Time PCR TaqMan próbával • az egyik primer 3’- vége az SNP-re kell, hogy essen • a DNS szintézis, azaz a PCR reakció működik, ha a használt primer 3’-vége az SNP-vel komplementer ebben az esetben detektálható a reporter fluoreszcenciája
• kezelt-kezeletlen • egészséges-beteg • érzékenyebb a DNS chipeknél • kevesebb minta egyidejű analízise • Relatív kópiaszám meghatározás: ∆Ct
fluoreszcencia
Real-Time PCR a gyakorlatban - expresszió vizsgálat -
tumor
ciklusszám
Összehasonlító genomika
MYH16– a gondolat szobája
FOXP2 – a beszéd génje
HAR – Human accelerated region
Genom és komplexitás
Fugu sp. Mus musculus FAJ
GÉNEK SZÁMA
A. thaliana
25.000
C. elegans
19.000
F. rubripes
24.000
M. musculus
24.000
H. sapiens sapiens
24.000
Humán genom
J. Craig Venter, a yachtja és a genom szekvenciája
A böngészhető szekvencia külön file-ként feltöltve
Eukarióta genomok •Sejtmagi, mitokondriális (és kloroplasztisz) genom •Ismétlődések, mozgó genetikai elemek, stb.
