GENOMIKA Fogalmak A genom az élőlényekben, illetve azok egyetlen sejtjében található öröklési anyag (DNS) teljes állománya. A genetika a tulajdonságok öröklésével, egyes gének szerkezetével és működésével foglalkozik. A genomika a genom vizsgálatával foglalkozó tudomány. 1995-ben „született”, amikor meghatározták az első sejtes élőlény (a Haemophilus influenzae baktérium) teljes DNS-szerkezetét (nukleotidsorrendjét). A genomika tárgya az élőlény génjeinek, illetve DNS-ének összessége. A genomika tehát vizsgálja az egyes genomok szerkezetét, a gének eloszlását, számát, méretét, a génnek nem tekinthető DNS-szakaszok (intergénikus, gének közti régiók) szerkezetét, elhelyezkedését, biológiai szerepét, összehasonlítja a különböző genomokat egymással. A genomika megismeri a DNS-szerkezetet és annak ismeretében keresi meg az egyes DNS-szakaszok funkcióit. A genomika főbb területei (1) Strukturális (szerkezeti) genomika: nem foglalkozik a funkcióval, csupán leltárba, veszi a DNS elemeit, a DNS-t alkotó bázisok sorrendjét határozza meg. A genomikai módszereket elsősorban DNS szerkezetének a vizsgálatára használják, nem pedig a DNS megváltoztatására. A strukturális genomika létrejöttének alapvető feltétele a DNS szekvenálás (bázis sorrend megállapítása) módszerének megalkotása volt. A tudományterület létrejöttét a DNS szekvenálás alapozta meg (Frederick Sanger, az 1970-es évek eleje), azonban a napjainkban tapasztalható rohamos fejlődés nem az általa kidolgozott dideoxi-nukleotid módszer, hanem az új generációs, ún. high-throughput (nagy-volumenű) szekvenálási technikáknak köszönhető. (2) Funkcionális genomika: vizsgálódási területei a transzkriptom (és a proteom) működése, változása. A genomikai módszereket elsősorban DNS működésének a vizsgálatára használják. Funkción elsősorban mRNS-ek vagy fehérjék egyidejű expressziójának a vizsgálatát értik, abban az értelemben, hogy egy kezelt (vagy beteg) szövetben megváltozik-e, s ha igen, mennyire az egyes gének kifejeződése. (2a) Transzkriptomika: a genomról képződő transzkriptumok (RNS-ek) összességével foglalkozik. (2b) Proteomika: a fehérjék összességével foglalkozik. A genomika további területei: Integratív genomika: ötvözi a genomikai, sejtbiológiai tudást az informatikával, s azt vizsgálja, hogyan állnak össze a részek egy működő egésszé. Komparatív (összehasonlító) genomika: az a tudományterület, mely a különböző fajok genom struktúrája és funkciója közti hasonlóságokat vizsgálja. Metabolomika: az anyagcserében résztvevő enzimek összességével foglalkozik. In silico genomika: számítógépes predikciókat (jóslatokat, hipotéziseket) ad, egy-egy gén in vivo működéséről. Farmakogenomika: gyógyszerek és genomok interakcióinak vizsgálata. Pszichogenomika: a farmakegenomika ága, hangulat-javító (antidepresszáns, stb.) szerek genomra, génekre gyakorolt hatását vizsgálja.
1
A Sanger-módszer (Lásd „A molekuláris biológia technológiai arzenálja II.”, DIA 6-9): in vitro DNS szintézis, amely során izotóppal jelölik a keletkező új szálat. E módszer eredeti verziója szerint előállítják a templát DNS egyes szálát (single-stranded DNA; ssDNS), majd radioaktívan (újabban fluoreszcensen) jelölt primert hibridizálnak hozzá. Ezután négyfelé osztják az elegyet és kiegészítő szálat szintetizálnak az eredeti lánchoz dNTPk (dezoxiribonukleotid-trifoszfát) jelenlétében (DNS polimeráz enzim segítségével), minden esetben úgy, hogy a reakcióelegyekben egy-egy dideoxi-nukleotid (ddNTP) is jelen van (a módszer ennek köszönheti másik közismert nevét: dideoxinukleotid-módszer). A DNS polimeráz hatására megindul a kiegészítő DNS lánc szintézise, de bizonyos esetekben, amikor véletlenszerűen egy dideoxi analóg épül be a „normál” nukleotid helyett, akkor a szintézis nem tud folytatódni, hanem megáll (innen származik a technika 3. neve: stop-nukleotid módszer, vagy lácterminációs módszer). A ddNTP cukor-foszfát láncáról hiányzik egy hidroxil csoport (a szén 3’ helyén, s helyette egy H van), tehát a következő dNTP nem tud hova kötni, nem tud foszfodiészter kötést kialakítani. Mivel a ddNTP-k kapcsolódása a DNS szálhoz véletlenszerűen történik, az egyes reakciók véletlenszerűen állnak le. A kapott DNS fragmenteket (poliakrilamid) géleken megfuttatjuk, majd autoradiográfiával (vagy a fluoreszcens festéket detektálva, megfelelő gerjesztőfénnyel) meghatározzuk a helyzetüket. Végül alulról felfelé olvasva megkapjuk a vizsgált oligonukleotid szekvenciájának komplementerét. A DNS-szekvenálás az 1980-as évek végéig manuálisan történt. Ezzel a módszerrel, egyetlen ilyen készüléket alkalmazva, a humán genom megszekvenálása 1000 évebe telne!!! (Hogy a jelenlegi tudással rendelkezzünk az emberi genomot illetően, a szekvenálást már a Honfoglaló magyaroknak el kellett volna kezdenie ) Automatizált festék-terminációs módszer: az eljárás során a négyféle ddNTP-hez négyféle fluoreszcens anyagot kapcsolnak, és négyféle reakcióelegyben végzik el a DNS polimeráz által vezérelt reakciót (DNS szintézist). A reakcióelegyet ezután egyetlen mintakamrába helyezik és elvégzik az elektroforézist. Megfelelő gerjesztő fény alkalmazásakor a fluoreszcencia színe fogja jelenteni az adott nukleotidot, mely megfelel a beépült ddNTP-nek. Ezeket automata méri, így napi 10 000 bázisnyi szekvencia is meghatározható. Egyetlen ilyen automata készülék alkalmazása esetén a teljes humán genom szekvenciájának meghatározása 1000 évet venne igénybe. Robotok alkalmazása gyorsítja a szekvenálást. Nagy-volumenű, újgenerációs szekvenálási módszerek MULTIPLEX DNS SZEKVENÁLÁS Hibridizáció alapú o SBH DNS szintézisen alapuló o Piroszekvenálás o tSMS o SMRT Nanopórusos technikák
2
AZ ÚJGENERÁCIÓS TECHNIKÁK KÖZÜL EGY TETSZŐLEGESEN KIVÁLASZTOTTAT KELL MEGÉRTENI ÉS MEGTANULNI, EXTRA KÖVETELMÉNYKÉNT (DIA 7, 9, 10, 11, 13, 14). EXTRA KÖVETELMÉNY Hibridizáláson alapuló módszer (Sequencing by hybridization, SBH): DNS mikroarray-en alapuló, nem enzimatikus módszer. Teljes genomok megszekvenálására alkalmas. Ennél a megközelítésnél a fluoreszcensen jelölt templát DNS fragmenseit ismert szekvenciákat tartalmazó mikroarray (chip, vagy membrán) felszínéhez kötik (így tehát annak minden pontján – spot – ismert és egymástól különböző szekvenciájú oligók vannak). Egy adott spot-ból származó fluoreszcens jel azt jelenti, hogy oda egy komplementer szekvencia hibridizált, melynek bázissorenje tehát az array adott pontjárhoz kötött oligó komplementere. A chip kb. 10 cm2-es, és 60 millió egyszálú DNS van hozzá kötve. Egy-egy kis „négyzet” 400.000 próbát tartalmaz. A Perlegen nevű amerikai cég használja főemlősök kromoszómáinak és a humán genom SNP-inek vizsgálatához. A genom szkennerük hatalmas „gén chipek”-ből áll, mely parallel képes kiválogatni egyedi DNS szegmensek millióit, s így teszi lehetővé az SNP-k millióinak detektálását. DNS szintézisen alapuló szekvenálási módszerek Közös jellemzőik DNS polimeráz (enzimatikus reakciók) Fénydetekció Parallel, multiplex módszerek Típusaik o Piroszekvenálás o tSMS: valódi egymolekulás szekvenálás o SMRT: egymolekulás real-time technológia EXTRA KÖVETELMÉNY Piroszekvenálás: A piroszekvenálás egy enzimkaszkád, mely real-time (valós idejű) detekciót tesz lehetővé. A target DNS-t feldarabolják, gyantához, vagy valamilyen hordozóhoz rögzítik, hozzáadják a DNS polimerázt, mely facilitálja az amplifikációt (DNS szintézist): a hordozó felület egy pikoliter nagyságú kamrájában egyetlen DNS fragment millió kópiában lesz jelen. A minta ATP-szulfuriláz és luciferáz enzimeket valamint adeno-foszfoszulfátot (APS) és luciferint is tartalmaz. A reakció első lépéseként egy típusú dNTP-t adnak a rendszerhez, s ha a templáton az adott nukelotiddal komplementer bázis következik, akkor az beépül a készülő láncba. A dNTP-ről leszakad egy pirofoszfát (PPi), melyet a szulfuriláz megköt és az APS-ből ATP-t állít elő, melyből a luciferáz a luciferin segítségével fényfelvillanást hoz létre. A felvillanást kamera érzékeli, melyből következtetnek a soron következő bázis milyenségére (A, T, G, vagy C). (Az ATP-nek egy olyan módosult változatát használják a DNS szintézishez, melyet a DNS polimeráz fel tud használni, az szulfuriláz viszont nem, így a keletkező ATP biztosan a pirofoszfátból származik, s nem a hozzáadott ATP-ről van szó). Ha a templáton egymásután ugyanazon bázisok ismétlődnek (pl. GGGG), akkor a dCTP-k hozzáadásakor négy fog beépülni a szintetizálódó DNS-be, ennek köszönhetően a luciferáz négy luciferint tud felhasználni, s emiatt a fényfelvillanás a kamera által is érzékelhetően, négyszer erősebb lesz. A dNTP-ket addig adják a rendszerhez, míg a teljes templát végére nem érnek. A be nem épült dNTP-ket és a fölösleges ATP-t az apiráz enzim bontja le még a következő ciklus előtt.
3
EXTRA KÖVETELMÉNY Helicos tSMS (True Single Molecule Sequencing) a szekvenálni kívánt DNS-t 100-200 bp-os darabokra vágják (restrikciós endonukleázokkal), majd a kettős hélixeket széttekerik: 94°C-ra melegítik, s így denaturálják. Egyetlen kis kamra felületére kötik a 100-200 bp-ra darabolt DNS molekulák milliárdjait olyan módon, hogy a kamra felszínéhez oligoT-k vannak kötve rendkívül nagy denzitással: egy négyzetcentiméter felületen 100 millió. A feldarabolt DNS szálakhoz fluoreszcensen jelölt poly-A-kat „ragasztanak” (adapter), majd ezek hibridizálnak az oligoT-kel, így a DNS molekulák a felszínhez kötődnek. Ezek a DNS szálak, mint templátok fognak viselkedni a szintézis során, primerként pedig az oligoT fog funkcionálni. A „DNS-ekkel hibridizált kamrát” behelyezik a Heliscope készülékbe, ahol gerjesztő (lézer) fény hatására világítani fognak azok a pontok, ahová DNS kapcsolódott. (A lézerfény feltérképezi, hogy hol vannak a szintetizálásra váró DNS szálak). Ezután lemossák a fluorszcens molekulát a felületről, s megkezdik a szintézist, s egyben a szekvenálást. E folyamatok első lépéseként DNS polimeráz enzimet és fluoreszcensen jelölt dNTP-t adnak a rendszerhez. Nagyon fontos tudni, hogy ennél az eljárásnál egy lépésben csak egy fajta dNTP-t (pl. először csak dATP-t) használhatunk. A hozzáadott dATP-k csak oda épülnek be, ahol a lánc poly-A utáni első bázisa T (timin). A gerjesztő fény hatására ezek a helyek, azaz ezek a DNS szálak világítani fognak. Következő lépésként lemossák a felesleges (azaz be nem épült) dATP-ket, s új reakciót indítanak, de ebben a reakcióban egy másik fluoreszcensen jelölt dNTP (dCTP-t, vagy dGTP-t, vagy dTTP) használnak. Ezek is csak a velük komplementer bázisok esetén épülnek be a láncba. Minden lépés végén csak azok a DNS szálak világítanak, melyek soron következő bázisa a reakcióhoz adott dNTP komplemetere (azaz dATP esetén T, dCTP esetén G, dGTP esetén C, dTTP esetén pedig A), s a készülék minden lépés után fotót készít a világító régiókról. E módszer (Helicose Ltd.) jellemzője, hogy minden DNS szál egyedi, egymástól függetlenül szekvenálódik, s használatával naponta milliárd bázis nagyságrendben lehet szekvenálni. EXTRA KÖVETELMÉNY SMRT (Single Molecule Real-Time, Egymolekulás Real-Time) technológia: ezzel a megközelítéssel az ötletgazda Pacific Biosciences szerint 2013-ra humán genom megszekvenálása 100$-ból 15 perc alatt megvalósítható lesz. A folyamat ún SMRT kamrákban zajlik, a DNS szintézist fluoreszcensen jelölt nukleotidokkal (mind különböző színű) oldják meg. Azonban festéket a foszfátcsoportra teszik, nem a bázisra, s így, mikor az adott bázis beépül a szinetizálódó szálba, a DNS polimeráz a festéket levágja róla, melynek felvillanását ZMW (Zero Mode Waveguide) nanofotonikus vizualizáló kamra érzékeli. Ez a kamera 20 zeptoliter (10-21 liter) minta detektálására alkalmas. Egymás mellett számos SMRT kamrákban zajlik a folyamat, tehát multiplex módszer, paralell minták ezrei szekvenálhatók meg a DNS polimeráz működési sebességének megfelelő idő alatt. 5 Nanopórusos szekvenálás: ultragyors (többszáz kb megszekvenálása néhány perc alatt) és olcsó szekvenálási módszer (a teljes genom megszekvenálásának költségeit kb 4 nagyságrenddel csökkenti). A különböző cégek más-más módszereket dolgoztak ki (Oxford Nanopore Technologies; NabSys); közös jellemzőjük, h nem enzimatikus reakciókról van szó, s nem fényt, hanem áramerősséget detektálnak.
4
EXTRA KÖVETELMÉNY Oxford Nanopore Technologies: Foszfolipid kettősréteg két oldalán töltésegyenlőtlenség van, a DNS molekulák a negatív helyek felől a pozitív felé igyekeznek. Az egyetlen lehetséges út számukra az α-hemolizin által alkotott 1nm-es átmérőjű nanopórusok tömege, ezen haladnak át a DNS láncok. A nanopórus ciklodextrinnel bélelt, ami szükséges a detekcióhoz. A nanopórushoz exonukleáz enzim van rögzítve, mely a pórushoz közeledő DNS-ről egyesével levagdossa a nukleotid bázisokat, melyek így egyesével haladnak át a nanopóruson, a rájuk jellemző mértékben változtatják meg az áramerősséget, amelyet a készülékkel detektálni tudunk. EXTRA KÖVETELMÉNY NabSys: A genomi DNS-t kb 100 kb-os darabokra hasítják, egyszálúsítják, majd az ssDNS-ekhez 6 bp-os, ismert szekvenciájú oligókat hibridizálnak (párhuzamosan futó reakciókban különböző bázissorrendűeket, de egy adott „csőben” egy adott típusút). Ez az oligó a 100 kb-s DNS számos régiójával komplementer, s ezen régiókhoz oda is hibridizál. A DNS-t egy vékony membrán pórusain „préselik” át, s közben áramerősséget mérnek az idő függvényében. Amikor a 6-mer-es oligóval hibridizált DNS rész érkezik a nanopórushoz, az áramerősség megváltozik. Ezt a készülék megjegyzi, s beazonosítja, h a genom ezen régiója az ismert szekvenciájó oligó komplementere; az áramerősség monitorozásából lehet tehát a primer pozíciójára, s ebből a DNS régió szekvenciájára következtetni. Az ugyanolyan próbákkel hibridizált hosszú DNS szakaszokat az átfedő próbák alapján állítják sorba, s így megkapják az adott próba genomi térképét. Rengetek típusú oligó párhuzamos használatával megkapható az összes próba teljes géntérképe. A próbák elhelyezése közti hézagokat az ún „moving window Sequencing By Hibridization (mwSBH)” módszerrel oldják meg, s így kapják meg a teljes genomot. Miért jó a DNS szekvenciák ismerete? A DNS szekvencia ismeretében lehetővé válik: genetikai hátterű betegségekre való hajlam kimutatása fertőzések diagnosztikája (a kórokozók azonosítása) rokonsági fok meghatározása (apasági vizsgálatok) személyazonosítás (bűnüldözés) génváltozatok összehasonlítása törzsfák készítése különböző biológiai folyamatok kutatása betegségek genetikai hátterének elemzése terápiás lehetőségek kidolgozása SZEMÉLYRE SZABOTT GYÓGYMÓDOK KIALAKÍTÁSA Chromosome walking (kromoszóma séta) Hosszú (250 kb-ig) random, DNS fragmentek könyvtára (általában BAC vektorban). A fizikai térkép (az a térkép, mely megmutatja a genom egy részletét, vagy a kromoszómát alkotó anyag elrendezését) megszerkesztésére alkalmas technika. A genomkönyvtárból kiválogatják az egymással átfedő klónokat, és így meghatározzák az egymás után elhelyezkedő gének sorrendjét. Lényegében az ismert (marker) gént tartalmazó kiindulási klónt fragmentálják, és minden fragmentet szubklónoznak, hogy génpróbaként használják a szomszédos és az egymást átfedő szegmenseket tartalmazó egyéb klónok azonosítására. Másfelől ezeket a szomszédos szegmenseket fragmentálják és szubklónozzák, és próbaként használják a további árfedésekre, és így tovább. A klónozott szegmentumokat a kromoszómán is található megfelelő sorrendbe helyezik.
5
EXTRA KÖVETELMÉNY: A módszer finomításakor, melyet kromoszómaugrásnak neveznek, csak a szegmensek végeit azonosítják, így a vizsgálatot végző a középen lévő szakaszokat „átugorhatja”. Így felgyorsul a folyamat, és így figyelmen kívül hagyhatják a ismétlődő DNS szakaszokat, amelyek a kromoszóma séta alkalmazásával nem kezelhetők. EXTRA KÖVETELMÉNY PCR alapú kromoszóma séta A példa azt mutatja be, hogy hogyan lehet megállapítani PCR-ral, hogy számos klón közül melyik fed át egy adott fragmenssel. Az 1-es sorszámú fragment felamplifikálására tervezett primer párt felhasználják az összes többi (2-26) fragment felsokszorozására is, majd az eredményt gélben megfuttatják. Amint látható , a 25 klón közül egyedül a 14-es sorszámú eredményezett PCR terméket (DNS-t), tehát ez a klón és az 1-es számú átfednek egymással. A FUNKCIONÁLIS GENOMIKA ESZKÖZTÁRA (1) Real‐Time PCR (2) Microarray technológia (DNS és fehérje chipek) (3) Whole Genome Tiling (4) RACE (5) SAGE A CHIPEK TÖRTÉNETE: 1996: a chip-technológia bevezetése. 1997-ben már egy microarray-vel kimutatott komplett eukarióta genomról az élesztőgomba genomról (Saccromyces cerevisiae) számoltak be amerikai szerzők. 2001 óta baktériumok, élesztő, szőlőmuslica, fonalféreg és növények mellett az emberi genom és az egér teljes genomiális géntérképe rendelkezésre áll, a világháló adatbázisaiból lehívható és elemezhető. 2005 –ben vált ismertté a kutya teljes genomja. Az évszázadokon át tartó, beltenyésztésekkel tarkított kutyatenyésztés révén olyan fajták alakultak ki, melyek bizonyos fajta betegséggel szemben rendkívül fogékonyak, vagy éppen ellenkezőleg, rezisztensek. E kutyafajták és a kapcsolódó betegségek vizsgálata humán szempontból is rendkívül jelentős, (részben) ezért vált a kutya a kardiológiai-, rák-, cukorbetegség-, magatartásbeli rendellenességek- és számos más, genetikai eredetű humán betegség legfontosabb modellállatává. már létezik a kutyamicroarray. 2010 – Panda és az első békafaj genom szekvenciája ismert, utóbbi kiváló modell az emberi szervezet vizsgálata szempontjából, a microarray bevezetése már csak rövid idő kérdése. A DNS CHIP (MICROARRAY) TECHNOLÓGIA: A huszadik század végéig a gének funkciójának és szabályozásának tanulmányozása egyedi vizsgálatokon alapult. Köszönhetően annak, hogy egyre több organizmus genomjának szekvenciája vált és válik ismertté, új technikák alakultak ki, melyekkel számos gén expressziójának egyidejű tanulmányozása válik lehetővé. A technikák közül az egyik automatizálható módszer a chip technológia, melynek bevezetése (1996) forradalmasította a molekuláris biológiát, a funkcionális genomikát és napjainkban a klinikai diagnosztikai módszereket is. A chipek két típusa, DNS-, ill. fehérje chipek közti alapvető különbség a vizsgálat tárgya: a DNS-chipek a (1) génexpresszió megváltozásának vizsgálatát, (2) splice-variánsok, valamint (3) szabályozó RNS-ek kimutatását teszik lehetővé, míg a fehérje chip a proteom (1) kifejeződését, (2) módosulásait, (3) kölcsönhatásait megcélzó vizsgálatok eszköze. A transzkriptom vizsgálata mellett a DNS-chipekkel lehetőségünk van (1) mutációk, (2) SNP-k , (3) deléciók, (4) inszerciók detektálására, (5) szekvencia megállapítására, (6) metilációs mintázat felderítésére (Strukturális genomika).
6
A DNS-chip nagyszámú gén expressziós mintázatának egyidejű meghatározására szolgál. Egyetlen chip 6-10000 gén szimultán vizsgálatát teszi lehetővé. Működésük alapja a DNS-DNS vagy DNS-RNS hibridizáció. A DNS-chip-ek a próbák minősége alapján két csoportra különíthetők el: (1) cDNS chipek: mRNS-ről reverz transzkripcio segitsegevel, in vitro előallitva; (2) oligonukleotid chipek (20-25 bp) FAKULTATÍV ANYAG A DNS-CHIP KÉSZÍTÉS I: FOTOLITOGRÁFIA (IN SITU , azaz helyben szintetizált chip): ún. fotolitográfiai módszerrel szintetizálják a próbákat a hordozó felszínére. E módszer egy magyar származású kutató, Steven Fodor ötlete. A módszer elve az, hogy az üres lapocskát fényre bomló anyaggal borítják, majd egy olyan maszkkal fedik le, amely miniatűr (< 1 mikron) átmérőjű, bizonyos pontokon perforált kis lyukak ezreit tartalmazza, előre megtervezett eloszlásban. Ha ezt követően fénnyel világítják meg a maszkkal fedett lapocskát, csak ott jön le a fotolabilis anyag, ahol a kis lyukak helyezkedtek el. Ezzel egyidejűleg az egyik a fotolabilis molekulával kapcsolt nukleotidot (pl. A) hozzáadják a rendszerhez, amely így kapcsolódni képes a fény által szabaddá tett pozícióhoz. Ugyanezt három másik, más perforációs mintázatot hordozó maszkkal (C, T, G) megismételve a teljes lapocska fedve lesz kötött nukleotidokkal. Minthogy a nukleotidok fotolabilis anyagot hordoznak, további négy maszk egymásutáni adásával, megvilágítással és a megfelelő nukleotid adagolásával felépíthető a második, harmadik, stb. "emelet", Tehát, például egy 10 "emeletes" oligonukleotid 10 x 4=40 maszkot, negyven megvilágítást és minden negyedik ciklusban ugyanazzal a nukleotiddal való inkubációt jelenti. Ez nem több mint ciklusonként egy perc, tehát példánkban 40 perc alatt készül el egy gén-chip. Minthogy a maszkok perforáltsági mintázatát a számítógép tervezi, az tudni fogja, hogy mely pozíción milyen "emeletek" következtek egymás után tehát az in situ szintetizált oligonukleotid szál sorrendjét. Így már az is érthető, hogy a leolvasáskor (lásd előző rész) az egyes pontok pozitivitása milyen génnek, mely génszakasznak felelt meg. Az előállítás tehát úgy történik, hogy a gyártó betáplálja azokat a génsorrendeket a számítógépbe, amelyekre kíváncsi (pl. vírusok egyedi génjeit, tumort okozó mutációkat, hisztokompatibilitási HLA-molekulák jellegzetes szakaszait, stb.) A számítógép ezek alapján megtervezi a maszkok perforáltságát, sorrendjét és egy automata szintetizátor létrehozza a gén-chipet. Már ma is egy-egy gén-chip előállítása igen olcsó és a kereskedelmi ár sem haladja meg a 100 USD-t. A DNS-CHIP KÉSZÍTÉS II: „NYOMTATÁS”: egy kis lapocskára, szilárd hordozó felületre (lehet üveg, speciális műanyag) robot segítségével (spotted microarray) DNS-próbát visznek fel, akár 1 000 000 DNS-szálat. Ismert e DNS próbák szekvenciája (nukleotidsorrendje) és helyzete is. Ez úgy lehetséges, hogy a számítógép "megjegyzi", hogy a kétdimenziós rácson melyik pozícióban, milyen nukleotidszerkezet található. A DNS kovalensen köt a hordozóhoz. Ezt követően ehhez a chiphez adják hozzá az in situ hibridizációhoz hasonló módon egy oldatban a vizsgálandó személy (organizmus) sejtjeiből izolált DNS- (illetve RNS-) darabokat (esetleg ezek polimeráz láncreakcióval (PCR) felszaporított tömegét), melyet előzőleg fluoreszcens festékkel megjelöltek. Rövid inkubálás után kimossák a nem kapcsolódó nukleinsavdarabokat. Könnyen belátható, hogy a megfelelő színes nukleinsavdarabok csak oda kapcsolódnak, ahol az előbb említett nukleotidbázis komplementaritás teljesül. Más szóval, úgy történik meg az inkubálás majd a mosás, hogy csak azok a szálak kössék meg a nekik megfelelő jelzett nukleinsavdarabokat, ahol teljes a sorrend azonossága. Ezt követően egy "scanning" rendszer leolvassa a színes és sötét pontokból álló mintázatot és már csak az eredmények értékelése van hátra. Itt újra a számítógépé a főszerep, hiszen az "tudja", hogy mely pozícióban milyen génszakasz található. Ha például az egyik rácsponton a HIV jellegzetes génszakaszát helyezték el, és ott pozitív reakciót jelez a leolvasó, ez azt jelenti, hogy a beteg mintájában előfordult ez a vírus.
7
HASZNÁLATA különböző mintákból a génexpressziók összehasonlítására: Több szín, fluoreszcens festék alkalmazása lehetővé teszi, hogy ugyanazon fajta chip-ből az egyiket egy kezelt pl. piros festékkel jelzett, a másikat pedig egy kezeletlen minta zöld festékkel jelölt DNS-mintájával inkubálják Ebben az esetben a két mintából származó RNS-t reverz transzkripcióval cDNS-sé írunk át. A cDNS-t felépítő nukleotidokat fluoreszcensen jelöljük: a két RNS populáció átírására szolgáló nukleotidok jelöléséhez tehát két, spektrális tulajdonságaiban egymástól különböző festéket használunk (a példában a kontroll mintából származó RNS-ek átírásához zöld Cy3 festékkel jelölt nukleotidokat használunk, míg a kezelt esetben piros Cy5 festéket) pirosan és zölden fluoreszkáló cDNS-eket kapunk, amelyeket egy DNS-chipen hibridizálva, majd egy nagyfelbontású lézerszkenneres leolvasás után meghatározhatjuk az egyes gének relatív kifejeződése. A gén aktivitása az adott pontban detektálható fluoreszcens jel intenzitásával arányos. Ha egy pontban a kezelt mintából származó fluoreszcens jel erősebb, az azt jelenti, hogy a kezelés hatására az adott gén aktivitása megemelkedett. KIÉRTÉKELÉS A rendkívül nagyszámú mintakapcsolás kiértékelése bonyolult programokkal és igen fejlett számítógépes technikával történik. A számítógép a leolvasás után egymásra képes vetíteni a leolvasott mintázatokat. Ott, ahol mindkét esetben (kezelt-kezeletlen, vagy beteg-egészséges, stb.) azonos a gén (illetve az ennek megfelelő DNS-darab) szerkezete, a zöld és a piros egymásra vetülve sárga színt ad. Ahol hiányzik a kezelt mintából a megfelelő DNS-szakasz, a zöld szín jelenik meg, ahol csak a kezeltben van valamely DNS-szerkezet, ott a piros szín dominál. Így, mintegy kivonható egymásból a két eredmény és a különbségre génszinten derül fény. Az eljárással képet kaphatunk egyes gének föl-, illetve alulexpresszálódásáról. Egyes daganatokban expresszálódó gének, az ún. génmintázat, a normálissal, illetve különböző daganattípusok egymással hasonlíthatók össze. Ennek eredményeképpen a daganatok a génexpressziós profil alapján egymástól elkülöníthetők. A DNS CHIPEK FELHASZNÁLÁSA: (1) Fertőzések felismerése, mikroorganizmusok azonosítása. (2)Rákdiagnosztika: diffúz nagy B-sejtes limfóma (DLBLC) típusok megkülönbözetése alkalmas kezelés. (3) SNP-kdetektálása. (4) miRNS-microarray–különböző ráktípusokban megfigyelhető, hogy bizonyos miRNSekalul/túlexpresszálódnak FERTŐZÉSEK DETEKTÁLÁSA: a jelenleg ismert genomú mikroorganizmusok: vírusok, baktériumok, gombák teljes, specifikus génszekvenciája felvihető a chipekre, s így pl. néhány csepp vérből kimutatható, hogy a vér „tulajdonosa” mivel fertőzött. Nemcsak maga a mikroorganizmus, de a terápiás megoldás is megközelíthető (pl. antibiotikum-rezisztencia spektrum) ezzel a módszerrel. Már jelenleg is rendelkezésre áll a kereskedelmi forgalomban az a chip, amely a HIV-ellenes szerekkel szembeni rezisztenciát mutatja ki. EXTRA KÖVETELMÉNY DIAGNOSZTIKA: a microarray a betegségek diagnosztizálásának jövőbeli fontos eszköze??? Egy amerikai kutatócsoport (Pat Brown & David Botstein csoportja) és jó néhány más kutatóintézet kapcsolatot épített ki egymással annak érdekében, hogy a DNS chipeket a diffúz nagy B-sejtes limfóma (DLBCL) diagnosztizálására alkalmassá tegyék. A DLBLC a B-sejtek rendkívül agresszív, rosszindulatú elváltozása. Az USA-ban évente kb. 25 000 új esetet jelentenek. A DLBLC diagnózisa morfológiai és molekuláris jellegzetességek kombinációján alapul. Kemoterápiával a betegek
8
40%-a kezelhető sikeresen. Hogy a többieknél miért hatástalan ez a kezelési mód, senki sem tudja. A feladat elvégzéséhez 128 db, 17856 pontból álló, emberi DNS-t tartalmazó microarray-t állítottak elő. 96 egészséges, illetve malignusan elváltozott limfocitamintából származó mRNS-t írtak át cDNS-sé, majd vizsgálták meg. 1,8 millió arányszámot kaptak, melyből egy szoftver egy érdekes tendenciát emelt ki. Először a géneket csoportosították expressziós mintázatuk alapján, majd a 96 mintát csoportosították a hasonló génexpressziós mintázatuk alapján. Az eredmény ún. markergének felismerése, melyek segítségével azonosíthatók az egyes sejttípusok. Az aktivált B-sejtekben pl. meghatározott gének indukálódnak, mások represszálódnak, s e gének együttese alkotja az aktivált B-sejtek merkergéncsoportját. Tehát bizonyos géncsoportok felhasználásával a mintákat sejttípus, sőt, sejtfunkció szerint is csoportosítani lehet. A DLBLC-s sejtekeben sok sejtosztódásban (proliferáció) szerepet játszó gén expresszálódik; ez egybecseng azzal, hogy a DLBLC rendkívül agresszív, malignus tumortípus. A microarray adatok alátámasztották a klinikai megfigyeléseket: nem minden DLBLC egyforma. A kutatócsoport ezután a klinikai adatok elemzése felé fordult. A kérdés az volt, hogy hogyan alakul a betegek sorsa a kemoterápiás kezelés után. Negyven, éveken át kezelt beteg közül 22 halt meg, mely a betegek 55%-a; ez az arány közel van a DLBLC esetén jellemző átlagos túlélési arányhoz. Amikor a betegeket és mintáikat párosították és ábrázolták, megfigyelték, hogy ha a beteg mintája a DLBLC egyik típusába került (GC-szerű csoport; a germinális centrum génjei indukálódnak), akkor jobb volt a túlélés, mint amikor aktivált B-sejtszerű DLBLC-t mutattak ki. A betegek génexpressziós mintázat alapján történő csoportosítása még kísérleti fázisban tart, de cél, hogy megjósolhassák, hogy melyik betegnek fog használni a standard kemoterápia, s kinél lesz szükség csontvelő-átültetésre. SNP-K DETEKTÁLÁSA DNS-CHIPEKKEL: A DNS-chipek használata lehetővé teszi az egypontos nukleotid polimorfizmusok (SNP) detektálását. Egyik lehetőség az Affymetrix GeneChip® microarray technológia: 25 bp hosszúságú oligókat (próbákat) kötnek a hordozó felületre; allélenként (SNP variánsonként) 4-6-szoros ismétlésben. A vizsgálni kívánt DNS-eket viszonylag kis (200-1100 bp) darabokban viszik fel a chipre. Az Affymetrix chipek SNP detektálása a hibridizáció különbözőségén alapul. SNP-k & fenotípus SNP (Single nucleotide polymorphism; egy nukleotid polimorfizmus; lásd „A molekuláris biológia technológiai arzenálja II.”, DIA 17-18). Minden ember genetikai anyaga egyedi SNP mintázattal bír. A közelmúlt kutatásai azt az eredményt hozták, hogy az SNP-k nem felelősek betegségekért. Viszont, biológiai markerként funkcionálnak a humán genom térképen, mivel rendszerint betegségekkel kapcsolatba hozott gének szomszédságában vannak. Asszociációs tanulmánynak (association study) nevezik azokat az elemzéseket, ahol bizonyos, ismert genetikai hátterű betegséggel rendelkező emberek csoportjának SNP mintázatát egészségesekével hasonlítják össze, s így arról szereznek információt, hogy melyik SNP variáns előfordulása esetén a leggyakoribb az adott betegség. Végeredményként ún. SNP-profilokat állapítanak meg, melyek karakterisztikus jellemzői egy-egy betegségnek. Jelen ismereteink szerint tehát, az SNP-k nem okoznak betegségeket, de segítségükkel detektálni lehet annak a valószínűségét, hogy valakiben bizonyos betegség ki fog-e alakulni. Az Alzheimer-kór a 65 év felettiek 10%-át, míg a 85 év felettiek 30-40%-át, más kutatások szerint csaknem felét sújtó idegrendszeri betegség.
9
EXTRA KÖVETELMÉNY Az ApoE (apolipoprotein E) két SNP-t tartalmaz, melyeknek köszönhetően a génnek három allélja létezik: E2, E3 és E4. Mindhárom allél 1-1 nukleotidban különbözik egymástól, az általuk kódolt fehérjetermékek között 1-1 aminosav különbség van. Minden embernek egy anyai és egy apai ApoE gén kópiája van. A kutatások azt mutatták ki, hogy azoknak a személyeknek, akiknek legalább egy E4 allélje van, nagyobb az esélye, hogy kialakul majd bennük az Alzheimer kór. Úgy tűnik, hogy az E4 fehérjében megfigyelhető egyetlen aminosav- csere révén megváltozott struktúra és funkció elég ahhoz, hogy a betegség kialakulásának esélye nagyobb legyen. Az E2 allél örököseként viszont jóval kisebb az esély, hogy az Alzheimer-kór tünet együttese jelentkezni fog. Természetesen az SNP-k nem abszolút indikátorai egy-egy betegségnek: előfordulhat, hogy az E2 allél jelenlétében kialakul a betegség, míg egy E4 alléllel rendelkezőnél nem. Az ApoE gén csak egy a sok közül, mely kapcsolatba hozható az Alzheimer kórral. Csakúgy, mint számos krónikus betegség, szívbetegségek, diabétesz, vagy a rák, az Alzheimer-kór is számos gén variációjának működése révén alakul ki, ezen betegségek poligénes természete miatt a genetikai vizsgálatuk is rendkívül bonyolult. EXTRA KÖVETELMÉNY A malária (régies nevén: váltóláz) az Anopheles szúnyog nőstényei által terjesztett, kórokozók (Plasmodium fajok) által kiváltott betegség. A világon népbetegségnek számít, főleg trópusi vidékeken fordul elő, emberek, főként gyerekek millióit öli meg minden évben. Egy kelet-afrikai hematológus csoport a Nos2 gén promóterében előforduló SNP-k gyakoriságát kutatta. (Nos2 gén: nitrogén oxid szintáz, NO-t termel.) Azt figyelték meg, hogy abban az esetben, ha a gén egy bizonyos pontján T→C csere történik, akkor a gyerekek vérében több volt a NO és az ő körükben 80%-kal csökkent az esélye, a (fatális) malária kialakulásának. A malária-védő SNP változat a tanzániai és kenyai gyerekek 25%-ban volt megfigyelhető. (Más országokból nincs adat). Ez a felfedezés lehetővé tette a malária-kezelés egy új – elvi - módjának kialakítását: gyógyszerek révén szabályozni a NO megfelelő mennyiségben való termelődését. EXTRA KÖVETELMÉNY Az SNP vizsgálatok egy fontos lépése annak megfigyelése, hogy az adott SNP exonban van-e, vagy sem. Ha az exonban találják, akkor a következő lépés, hogy megállapítsák azt, hogy ez az SNP okoz-e aminosav-módosulást a kódolt fehérjében. Ha az SNP az aminosav milyenségét nem befolyásolja, akkor hajlamosak vagyunk „csendes SNP”-nek titulálni. Egy kutatócsoport munkatársai számos ilyen csendes SNP-t azonosítottak a BRCA1 gén exonjában. A BRCA1 hírhedt „mellrákgén”. (Élete során egy nőnek kb. 13% az esélye, hogy mellrákja legyen, ennek a génnek mutációja esetén az esély 85% lehet). A BRCA1-ben előforduló SNP-k alternatív splicing-gal járnak együtt. Az exonokon belül vannak ún. exonikus hatást erősítők (exonic splicing enhancer: ESE) és csendesítők (exonic splicing silencer:ESS). Ezeknek a kb 6bp-os nukleotidszakaszoknak szerepe meghatározni, hogy a splicing során az adott exon beépüljön-e az RNS-be (ESE), vagy ellenkezőleg, ne épüljön be (ESS). Azt figyelték meg, hogy abban az esetben, ha egy erősítőben van SNP, akkor egy exon, mely normálisan része lenne az mRNS-nek nem épül be, azaz a kódolt fehérje struktúrája és funkciója nem biztos, hogy rendeltetés-szerű lesz. A csendesítőkhöz olyan fehérjék kötődnek, melyek megakadályozzák, hogy az adott csendesítőt hordozó exon beépüljön a mRNS-be. Ha egy ilyen csendesítőben van tehát SNP, akkor az exon beépül(het) a mRNS-be, elrontva ezzel a normális fehérje működését. A kutatócsoport által a BRCA1 génben talált SNP-k magyarázatul szolgálhatnak arra, hogy miért alakul ki csendes mutációt hordozó nőkben mell-, vagy petefészekrák. Ez az eset egy kiváló példa arra, hogy még a csendes mutációknak is súlyos hatásuk lehet a fenotípusra, beleértve az olyan poligénes jellegeket, mint a rák.
10
EXTRA KÖVETELMÉNY Egy, az Mc1R (melanocortin 1 receptor) génben megfigyelhető SNP esetén azt figyelték meg, hogy több pheomelanin és kevesebb eumelanin termelődik, mint a normál változatban. Ezek az emberek vörös hajúak, nagyon fehér bőrűek, gyakran szeplősek. Az SNP-nek fenotípusban megjelenő hatása van. A kutatások azt is megállapították, hogy ezek az emberek egy altatóra, a midazolamra rezisztensek. FEHÉRJECHIPEK A DNS-chip technológiával hasonló módon készülnek el a fehérje chipek, azzal a különbséggel, hogy a lecseppentett pontokban nem kölcsönható DNS molekulák, hanem fehérjékkel specifikus kölcsönhatásba lépő (általában) antitestek vannak kihorgonyozva. A biológiai mintából nem RNS-t vagy DNS-t vonunk ki, hanem fehérjét, amelyet szintén fluoreszcens festékkel jelölünk, majd a fehérje-chip felületén inkubáljuk a jelölt fehérjék elegyét. (A jelölési stratégiák között találunk direkt és indirekt módszereket is, előbbi esetben a már említett módon fluoreszcens festékkel jelöljük a fehérjét, míg utóbbi esetben a fehérjét biotinnal jelöljük, melyhez pl. fluoreszcens festékkel kapcsolt streptavidin kapcsolódik). A detektálás szintén a DNS-chipeknél már említett lézerszkenneres leolvasás, amelyet az intenzitásértékek meghatározása és kezelt és kezeletlen minták relatív fehérje mennyiségének meghatározása követ. Ezzel a módszerrel egy kísérletben több száz vagy akár ezer fehérje mennyisége határozható meg, így azonosíthatók olyan fehérjék, amelyeknek mennyisége egy gyógyszeres kezelés során megváltozott. EXTRA KÖVETELMÉNY WHOLE GENOME TILING – TELJESGENOM CSEREPEZÉS: A teljes genom vizsgálatához használt újabb típusú microarray. Alkalmas: gének transzkripciójának vizsgálatára, transzkripciós faktor kötő helyek, DNS metilációs helyek feltérképezésére, alternatív spicing analízisére. 25-60bp-os oligonukleotidokat, vagy PCR termékeket használnak próbaként. A próbákat szabályosan rendezik el, ennek 2-féle módja van: a próbák vagy átfedik egymást (azt jelenti, hogy úgy tervezik a próbákat, hogy az első 3’-vége és a következő 5’-vége átfedő bázisokat tartalmazzon), vagy kisebb-nagyobb hézag van közöttük. Step-nek nevezik a szomszédos próbák centrumainak távolságát. A vizsgált genomból származó cDNS-t, vagy cRNS-t fluoreszcensen jelölik, s hibridizálják az array felületére. Minél nagyobb az intenzitása, annál erősebb a transzkripció aktivitása. PCR – ISMÉTLÉS: egy-egy PCR reakció ciklusokból áll (kb 30-50); a ciklusokban 3 lépés követi egymást: 1; denaturáció, 2; annelaing, 3; elongáció. A PCR reakcióhoz szükséges: (1) DNS-templát – tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját. (2) 2 primer – meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét. (3)DNS-polimeráz (Taq) – lemásolja az amplifikálandó szakaszt. (4) Nukleotidok – amelyekből a DNS-polimeráz felépíti az új DNS-t. (5)Puffer – biztosítja az enzim számára megfelelő kémiai környezetet. REAL-TIME PCR – ALAPOK: A Real-Time PCR (valós idejű PCR) technika a PCR alapelvein nyugszik. Alapvető funkciója, hogy meghatározott DNS-szakaszokat nagy hatékonysággal és nagyfokú specificitással amplifikáljon (szaporítson) fel. Működésének alapja: fluoreszcencia detektálása a PCR reakció mindenegyes ciklusában Real-Time. A Real-Time PCR reakciók során a PCR-nál megismert reakció-összetevőkön túl szükség van fluoreszcens festék(ek)re, amelyek megfelelő fény hatására a ciklusok végén fényt emittálnak, s e fluoreszcencia intenzitása arányos az adott ciklus végére jelen lévő kópiák (DNS klónok) számával. A Real-Time PCR reakciók végén nincs szükség gél alapú kiértékelésre, az analízis szoftver alapú.
11
REAL-TIME vs END-POINT PCR: a hagyományos PCR-ok esetén csak a gélben való kiértékeléshez a beállított ciklusok lejárta után van lehetőség, tehát. end-point (végpont) analízisret végezhetünk csak. A Real-Time PCR során azonban lehetőségünk van a kezdeti ciklusok során képződő termékek mennyiségéről információt szerezni. REAL-TIME PCR – NEVEZÉKTAN: qPCR (kvantitatív) = Real-Time PCR: minden mintából származó fluoreszcens jelet numerikus értékké alakít át a reakció mindenegyes ciklusában. RT2 PCR: reverz transzkripción alapuló Real-Time PCR: olyan PCR reakció, melynek kiindulási templátja cDNS (mRNS-ről reverz transzkripcióval írják át) REAL-TIME PCR – A DETEKTÁLÁS LEHETŐSÉGEI: (1) nem specifikus módon ún. SYBR® Green festék használatával. (2) specifikus, ún. TaqMan® próbák használatával. A SYBRGreen festék az etidium-bromidhoz hasonlóan interkalálódó molekula, amely a dupla szálú (ds) DNS kis árkába kötődik a reakcióelegyben. Bekötődve, adott monokróm fénnyel indukálva 530 nm-s hullámhosszú fényt emittál. Az ebből keletkező mérhető fluoreszcens jel nagysága a PCR folyamán szaporodó dsDNS mennyiségével arányosan növekszik. Ez a megoldás nem igényel extra próbákat (oligo, primer), ezért a relatíve olcsósága miatt népszerű. EXTRA KÖVETELMÉNY A TaqMan módszerrel még pontosabban meghatározható a minta DNS tartalma. Maga a próba egy 20-30 bp hosszúságú oligonukleotid, mely a felamplifikálni kívánt DNS szakasz egy, a közepén lévő régiójával komplementer. A próba a két végén módosított: 5’ vég: fluoreszcens festék molekulával jelölt → reporter (R). 3’ vég: a reporter fluoreszcenciáját kioltó, nem fluoreszcens quencher (NFQ) molekulát tartalmaz A próba intakt állapotában a kioltó molekula a reporterhez való fizikai közelségéből kifolyólag képes a reporter fluoreszcens emisszióját kioltani. Az energia átadás fluoreszcens rezonancia energia transzferrel (FRET) történik és a két molekula fizikai közelségén alapul. A TaqMan alapú PCR reakcióhoz, az amplifikáció működéséhez három oligonukleotid egyidejű bekötődése szükséges, mely a nagyfokú specificitást biztosítja. Az amplifikáció során a DNS polimeráz 5’-exonukleáz aktivitásának köszönhetően képes a próbát hasítani, miáltal a reporter távolabb kerül a kioltó molekulától, amely így már nem képes elnyelni a reporter által emittált fluoreszcenciát. A reakció előrehaladtával egy detektor folyamatosan érzékeli az exponenciálisan* növekvő fluoreszcenciát, ami arányos az adott minta kiindulási RNS (cDNS) tartalmával, a vizsgálni kívánt gén expressziójának mértékével. * ideális PCR reakciók esetén figyelhető meg az exponenciális növekedés: n-edik ciklus kópiaszáma 2n EXTRA KÖVETELMÉNY OLVADÁSPONT-ANALÍZIS A PCR TERMÉKEK ELEMZÉSÉRE - MINŐSÉGI ANALÍZIS: Minden DNS fragmentumra jellemző az olvadáspontja (Tm), mely definíciószerűen az a hőmérséklet, melyen az adott DNS fragmens 50%-a egyszálú. Az olvadáspontot leginkább befolyásoló tényezők: a fragment G+C tartalma, valamint hossza. A készülék a hőmérséklet fokonkénti emelése közben képes folyamatosan monitorozni a keletkező fluoreszcenciát. Amikor a kapillárisban a hőmérséklet eléri a vizsgált fragmens Tm értékét, a fluoreszcencia emisszió hirtelen csökkenni kezd, az alkalmazott fluoreszcens technikától függően, vagy azért, mert a (duplaszál-specifikus) SYBR Green I leválik az amplikonról, vagy azért, mert a hibridizációs próbák az amplikonról leolvadva már nincsenek többé megfelelő közelségben.
12
Mire használható az olvadáspont analízis? (1) mutáció detektálására, mivel a próba és a target közötti mismatch a Tm csökkenését okozza, (2) termékek megkülönböztetésére, mivel a rövidebb termékek (pl. primer-dimerek) Tm értéke alacsonyabb mint a specifikus fragmenté,(3) a termék azonosítására, a termékspecifikus Tm érték kimérésével. EXTRA KÖVETELMÉNY ANALÍZIS II – MENNYISÉGI ANALÍZIS: A Real-Time PCR reakciók során keletkező termékek mennyiségi kiértékeléséhez szükség van a Ct (threshold cycle; küszöbfluoreszcencia) fogalom ismeretére. Minden egyes Real-Time PCR reakciónak van egy adott Ct értéke; mely az a ciklusszám, ahol az adott mintából származó fluoreszcens jel az ún. háttérfluoreszcencia (zaj) szintje fölé emelkedik. Zaj: a kezdeti ciklusokban nem a speifikus termékekből származó fluoreszcencia. EXTRA KÖVETELMÉNY REAL-TIME PCR A GYAKORLATBAN – SNP DETEKTÁLÁS: SNP-k detektálásához a TaqMan alapú Real-Time PCR használható. Az allél specifikus PCR-nál megismert módon, az egyik primert itt is úgy tervezzük, hogy 3’-vége az SNP-re essen. A DNS szintézis, azaz a PCR reakció működik, ha a használt primer 3’-vége az SNP-vel komplementer, s ebben az esetben a reporter festék fluoreszcenciája detektálható lesz. EXTRA KÖVETELMÉNY REAL-TIME PCR A GYAKORLATBAN – EXPRESSZIÓ VIZSGÁLAT A chipekhez hasonlóan a Real_time PCR is a génexpressziós vizsgálatokban rendkívül hasznos. Ugyanúgy összehasonlíthatjuk vele a kezelt és kezeletlen, beteg és egészséges minták génexpersszióját. A limitáló tényező, hogy egyszerre jóval kevesebb mintáról kapunk információt, viszont a microarray-hez képest jóval érzékenyebb technika. Két minta Ct értéke közti különbségből (∆Ct) meghatározható a relatív kópiaszám (egyikben hányszor több kópia van, mint a másikban). FAKULTATÍV ANYAG RACE: Rapid Amplifiation of cDNA Ends (cDNS végek gyors felszaporítása): Módszer a cDNS-ek elejének és végének azonosítására. Az RNS-t reverz transzkripcióval (RT) cDNS-sé írjuk, majd PCR-rel felamplifikáljuk. A cDNS kópiákat megszekvenáljuk. Megkülönböztetünk 5’ és 3’ RACE-PCR módszert. 5’ RACE esetén az mRNS 5’-végéhez tapadó ún. génspecifikus primert használunk a reverz transzkripcióhoz. Ezután egy enzimmel (tDt: terminális dezoxinukleotid transzferáz) egy homopolimer „farkat” (azonos nukleotidokból áll) adunk a cDNS 3’ végére. A PCR során egy másik génspecifikus primerrel és a „farokkal” komplementer primert használunk a felamplifikáláshoz. 3’ RACE során a reverz transzkripciókor kihasználjuk az mRNS-ek 3’ végén lévő PolyA farkat (csupa Tből álló OligodT primert használunk), ezért nincs szükség tDt-re. A PCR-t egy génspecifikus primer, s egy az OligodT-vel komplementer (csupa A) primerrel végezzük el. FAKULTATÍV ANYAG SAGE: Serial Analysis of Gene Expression (Génexpresszió sorozatvizsgálat): nagyszámú transzkriptum egymás melletti analízisére alkalmas. A módszer alapvetően két alapfeltevésen nyugszik: (1) egy rövid (kb 10-14 bázispár) nukleotidszekvencia-részlet elég információt tartalmaz ahhoz, hogy egy géntermék azonosítható legyen, (2) ezeknek a rövid szekvenciarészleteknek az egymásutáni láncolata lehetővé teszi sok géntermék egymásmelletti hatékony analízisét. A módszer során olyan, 910 bázispár hosszúságú, úgynevezett SAGE-címkéket (tag-ek) kapunk, amelyek egy adott mRNS-populációt tükröznek. A technikának az az előnye, hogy segítségével a különböző kísérleti körülményekből származó mRNS-populációk között szignifikáns mennyiségi reláció
13
állítható fel. Érzékeny az alacsony kópiaszámú géntermék kimutatásában. A DNS-csipek előfutárának tekinthető, azonban időigényessége miatt ez a módszer mára jelentősen háttérbe szorult. A módszer lépései röviden a következők: (1) mRNS izolálás (2) mRNS kihorgonyzott OligodT-hez kapcsolása (PolyA-ja révén) (3) cDNS írás (RT) (4) Emésztés egy restrikciós endonukleázzal (RE); csak a kihorgonyzott részre lesz szükségünk (5) Egy RE hasítóhelyét tartalmazó adaptert ligálunk hozzá (olyan RE-t használunk, mely a felismerő helyéhez képest beljebb hasít)(6) Az előbb használt RE-vel megemésztjük (7) Az így kapott kis cimkéket (tag-eket) kettesével összeligáljuk (ditagek képződnek) (8) Ditagaket felszaporítjuk PCR-rel (9) Leemésztjük a végükről a hasítóhelyet tartalmaző adaptereket (10) Konkatamerekké ligáljuk össze és megszekvenáljuk. Komparatív (összehasonlító) genomika: az a tudományterület, mely a különböző fajok genom struktúrája és funkciója közti hasonlóságokat vizsgálja. A genom szekvenálás eredményei lehetővé teszik, hogy az egyes élőlények genomjait géntartalmuk és a gének szerkezete szerint összehasonlítsák. Egyes fajokon belül is lehet összehasonlításokat tenni. A vizsgálatok eredményiből a gének szerepére és evolúciójukra lehet következtetni. Ha egy bizonyos genom szekvencia, vagy mintázat egy adott, közös leszármazási vonalú (monofiletikus) rendszertani kategória tagjai között gyakori, akkor konzervatív szekvenciáról beszélünk. Egy-egy ilyen szekvencia, azaz motívum evolúciós konzerváltsága arra utal(hat), hogy szelekciós előnyhöz juttatja az ezzel rendelkező élőlényeket. A konzervatív szekvenciák kifejeződhetnek, mint fehérjék, de lehet, hogy szabályozó szerepet töltenek be. Találtak olyan konzervált DNS-szakaszokat is, melyekről RNS leíródik, de fehérje nem képződik. Ezek szerepe még nem tisztázott (valószínűleg szabályozó RNS-ekről van szó). Hasonló szekvenciák azonosítása (géneket is beleértve) távoli rokon élőlényekben (nem monofiletikusak), ahhoz a feltevéshez vezet, hogy ezekre az egyikük horizontális géntranszferrel tett szert. Ez a jelenség baktériumok körében gyakori, de magasabbrendűeknél is előfordul. Eukarióta genomokban is jelen lehetnek prokarióta eredetű gének. Ezek mitokondriális (vagy növények esetében színtestek) felépítésében résztvevő fehérjéket kódolnak, az endoszimbionta elméletet támasztva alá. Számos genomikai vizsgálatot végeztek, melyek az emberi agy kialakulásának megértését tűzték ki célul. EXTRA KÖVETELMÉNY MYH16 (miozin nehézlánc kódoló gén): egy philadelphiai klinikán azt találták, hogy bármely populációból származó minden emberben az MYH16 géneknek két DNS-bázisa hiányzik, ha összehasonlítjuk bármely más főemlős hasonló génjeivel, tehát redukció történt. A főemlősökben található változat a hosszú, eredeti verzió előfeltétele volt annak, hogy erős rágóizom fejlődjön ki. Ez a nagy rágóizom, amely szükséges az egész napos táplálkozásnál (ez a nagyizom a csimpánznál is megtalálható), a halántéki csonton található nagy csontkiemelkedéshez kapcsolódik. Anatómiai tanulmányok arra utalnak, hogy ez az extra csontmegnagyobbodás valamilyen módon gátló kapcsolatban van az agykoponya kiterjedésével és az agykoponya csontjai között található növekedési gócokkal: s ezek növekedésgátlásán keresztül gátolja az agykoponya, s az agy fejlődését is. A mutáció során kialakuló, emberi gén egy rövidebb gén, mely kevesebb rágóizom-fehérjét termel, így csökken a rágóizom nagysága is. Emiatt nem szükséges extra csontkiemelkedés a koponyán, tehát felszabadítja a koponyát a növekedését gátoló tényező alól. Tehát növekedhet a koponya, így az agyunk is. Kutatók a vizsgálatok alapján azt gondolják, hogy ez a mutáció, amelyet a „gondolat szobájának” neveztek el, kb. 2,4 millió évvel ezelőtt jött létre, éppen Homo nemzetség fejlődésének egy olyan szakaszában, amikor ezzel párhuzamosan felgyorsult az agy fejlődése is.
14
EXTRA KÖVETELMÉNY FOXP2 (forkhead box protein P2): a „beszéd génje”. Az a protein, amelyet kódol, szinte azonos az egérben, csimpánzban és az emberben. A 715 aminosavból két aminosav különbözik a csimpánz és az ember között. (Az egér és a csimpánz között csak néma mutációk vannak). A kutatók szerint a FOXP2 génnek ez a humánspecifikus mutációja kb. 50-100 000 évvel ezelőtt jött létre. Ez a mutáció teszi lehetővé azokat a finom mozgásokat, amelyek szükségesek ahhoz, hogy motorikusan létrejöjjön a beszéd. Ilyen módon a FOXP2 gén kis mutációja jelentős mértékben hozzájárult a beszéd és a nyelv kifejlődéséhez. EXTRA KÖVETELMÉNY HAR (Human Acceleraled Region): nagyon felgyorsult evolúciós változáson ment át az emberelődökben és az emberekben, s különösen aktív az agyfejlődés kritikus szakaszában. Összehasonlították a csimpánzok és emberek genomjait, kiderítették, hogy kb. 48 olyan terület található a humán emberi genomban, amelyek különösen gyorsabban fejlődtek, mint a csimpánz vagy más állatok ugyanazon 48 régiója. Az egyik régió ezek közül a HAR. Az elemzések során kimutatták azt is, hogy a HAR1 lényegében ugyanaz minden emlősben, kivéve az embereket. Ez a hasonlóság azt jelenti, hogy ez a DNS-szekvencia tulajdonképpen változatlan maradt százmillió éveken keresztül az evolúció során, ami egyben azt is jelzi, hogy egy biológiailag rendkívül fontos funkciót lát el. Abban az időben azonban, amikor az emberi vonal szétvált a csimpánzzal közös elődtől, kb. öt-hétmillió évvel ezelőtt, a HAR1 elkezdett változni, sokkal gyorsabban, mint azelőtt. Egyáltalán, míg azelőtt nem volt lényegi változás, most rendkívüli módon változott: 18 különbséget találtak a csimpánz és a humán HAR1 DNS-e között, ami fantasztikusan gyors és nagy változás, különösképpen figyelembe véve azt, hogy néhány millió év alatt játszódott le. Különösen fontos e tekintetben az, hogy a neokortexnek az első része a prefrontális, vagyis előhomloki lebeny, kortex, rendkívüli módon, hatalmasra fejlődött a hominid evolúcióban, az ember fejlődése során. Genom és komplexitás (lásd I. félév, Genom c. előadás) 2009-re már több mint 50 eukarióta genom nukleotid sorrendjét olvasták le. Szinte minden „completly sequenced” genom tartalmaz hiányokat, nem szekvenált szakaszokat. Ezek főként heterokromatin szakaszok. Ezért a genomok mérete, DNS tartalomban és génszámban egyaránt becslésen alapszik. Az eukarióta genomok DNS tartalma nagyobb, mint a prokariótáké. Az egyes eukarióták komplexitása és genomjuk DNS tartalma vagy génjeik száma között nincs szoros összefüggés. Például a lúdfű genomja nagyobb a bonyolultabb C.elegans genomjánál. A muslica komplexebb élőlény, mint a C.elegans, de a fonálféregnek több génje van, mint a muslicának. Az ember vagy az egér és a fugu halnak körülbelül ugyanannyi génje van, de a fugu genom DNS tartalma csak kb. tizede az egér vagy ember genomjának. Humán genom csak szemléltetés Eukarióta genomok Sejtmagi, mitokondriális és kloroplasztisz genom. Ismétlődő genetikai szegmensek, transzpozonok, stb. Az emberi genom struktúrája gyakorlatilag 100-osan ismert (egy prototípus), azonban a gének funkciójáról jóval kevesebb az ismeret. A jövő a genomika és a bioinformatika alapján új utat jelöl ki az orvosbiológia fejlődésében, a megelőzésben, diagnosztikában és a gyógyításban, gyógyszer-, védőoltásfejlesztésben egyaránt. A bioinformatika és a genomika révén jelentősen nő az esély az életminőség javítására, az átlagéletkor emelésére.
15
