Brown-mozgás magyarázata
Vámosi György
• Az anyag részecskéi állandó mozgásban vannak. Haladó mozgás átlagos energiája: E=3/2 kT • Emlékeztető: Maxwell-féle sebességeloszlás gázokban: 0.002
Diffúzió és ozmózis
•Átlagsebesség:
v = 3kT / m
f(v)~Δn/n
T=20 C
2
T=500 C
0.001
0 0
N
500
1000 1500 2000 v (m/s)
¾A Brown-mozgást a megfigyelt részecskék és a közeg részecskéinek ütközései okozzák, energia- és lendület-átadás
Brown-mozgás • Robert Brown botanikus, 1827: vízben lebegő virágpor szemcsék zegzugos mozgását figyelte meg • A jelenséget valamilyen „életerő” megnyilvánulásának tekintette • Könnyű szemcsék (füst, por, apró folyadékcseppek) mozgása levegőben
Makromolekula (DNS) fluktuációja
Diffúzió
Fick II. törvénye
•Adolf Fick kísérlete: festékmolekulák spontán szétoszlása
•Nem stacionárius diffúzió leírása egy dimenzióban
vízben
c = c(x,t): a koncentráció időben és térben változik x
∂c ∂ 2c =D 2 ∂t x ∂x t
víz
0
festék •folyadékok: keveredés néhány hét alatt •gázok: néhány másodperc alatt
•Diffúzió: részecsketranszport Koncentrációkülönbségek (vagy egyéb tényezők, pl. hőmérsékletkülönbség, oldékonyságbeli különbség) hatására bekövetkező, a részecskék rendezetlen hőmozgásán alapuló, nettó anyagáramlással járó változás.
Stacionárius diffúzió leírása (dc/dt = 0, dc/dx = állandó) dc dm = − DA dx dt
c2 x1 x2 dx
dc c( x 2 ) − c( x1 ) = dx x 2 − x1
x
adott t időpillanatban a konc. hely szerinti második parciális deriváltja
¾Parciális differenciálegyenlet. Időben elsőrendű, hely szerint másodrendű. ¾A differenciálegyenlet c(x,t) megoldása a kiindulási feltételektől, a geometriától függ. Nincs általános analitikus megoldása.
Fick II. megoldása: szabad diffúzió 1 dimenzióban
Fick I. törvénye
c c 1
adott x helyen a konc. idő szerinti változási gyorsasága (parciális deriváltja)
-felület -diffúziós állandó -diffúziós áram: egységnyi idő alatt átáramló anyagmennyiség -koncentráció gradiens
D: időegység alatt, egységnyi felületen, egységnyi koncentráció gradiens hatására átáramló anyagmennyiség [D] = m2/s (cm2/s)
¾Ha t=0 pillanatban minden molekula az origó kicsiny l szélességű környezetében van, a hely szerinti eloszlás egy (időben egyre jobban kiszélesedő) normál eloszlás:
c ( x, t ) =
c0 l 4πDt
e
−
c c0
x2 4 Dt
l
t1
Szórásnégyzet (t pillanatban): σ2 = <Δx2> = 2Dt
σ
t2 0
x
A diffúziós mozgás időfüggése: lineáris ábrázolás
Diffúzió különböző fázisokban. Mitől függ D értéke?
•A molekulák átlagos négyzetes elmozdulása, <Δx2> (= <x2> ) a „t” időpillanatban (az eloszlás szórásnégyzete), Einstein-Schmoluchowski-egy.:
σ2 = •Diffúzió 3D-ban:
<Δx2>
•Gázok: Az egy transzlációs szabadsági fokra eső átlagenergia: ½ mvx2 = ½ kT D ∝ vx ∝ T m
= 2Dt
<Δr2> = <Δx2> + <Δy2> + <Δz2> = 6Dt
•Az átlagos négyzetes elmozdulás gyöke (rms) •Egyenes vonalú egyenletes mozgás
Δx = 2 Dt
Δx = vt
•Makromolekulák, kolloid részecskék oldatban Stokes-Einstein egyenlet (gömbszerű molekulákra):
idő •Diffúzió: „random walk”, (véletlenszerű mozgás) rövid távon gyors - hosszú távon lassú
idő
A diffúziós mozgás időfüggése: logaritmikus ábrázolás
D hőmérsékletfüggése: -közvetlen (kT) -közvetett (T nő → η csökken)
0
1 cm -2 -4
-8
1μs
1ms
1s
-10 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 log t (s)
1nap 4
6
1év 8
•Elég gyors molekuláris/sejtbeli folyamatokhoz •Lassú a makroszkopikus transzporthoz → keringés szükséges
• η: közeg viszkozitása
Közeg
D(m2/s)
H2O
H2O
2.26×10-9
2 cm
K+
H2O
1.96×10-9
1.8 cm
H+
H2O
9.3×10-9
4 cm
etanol
H2O
1.24×10-9
1.5 cm
H2O
1.05×10-9
1.3 cm
szacharóz (342)
H2O
5×10-10
0.9 cm
ribonukleáz (13 000)
H2O
1.1×10-10
0.4 cm
H2O
6.1×10-11
0.3 cm
H2O
2.2×10-11
0.19 cm
dohány mozaik vírus (40 millió)
H2O
3×10-12
0.07 cm
H2
levegő
6.4×10-5
330 cm
glicin (75)
1 μm -6
r ∝ 3 MW
Néhány részecske diffúziós állandója Diffundáló anyag
1m
• f: alakfaktor vagy súrlódási együttható – megnyúlt molekulaalakra nagyobb mint gömb alakra • r: hidratált molekulasugár
kT kT D= = f 6πηr
szérum albumin (69 000) tropomiozin (93 000)
Δx (naponta)
Miért van nettó anyagáramlás? Molekuláris magyarázat c1, N1 , V1
Diffúzió szerepe az élő szervezetben
c2, N2 , V2
• A transzportlánc végén az anyagok diffúzióval jutnak el a kapillárisból a sejtekhez és vissza. (tápanyagok, salakanyagok, O2, CO2) Tfh. minden részecske azonos valószínűséggel mozdulhat el a tér bármely (±x, ±y, ±z) irányában: p = 1/6 Az egyik térrészből a másik felé elinduló molekulák száma: ΔN(1→2) = 1/6 N1 = 1/6 c1V
ΔN(2→1) = 1/6 N2 = 1/6 c2V
Eredő anyagáramlás 1-ből 2-be: ΔN(1→2) - ΔN(2→1) = 1/6 (c1- c2 ) V > 0
Miért van nettó anyagáramlás? Termodinamikai magyarázat ¾Emlékeztető: Konstans T és p mellett a rendszer szabadentalpiája csökken spontán lejátszódó folyamatokban. G(T,p,N) = E + pV - TS, ΔG ≤ 0 ¾A kémiai potenciál (egy molekulára jutó szabadentalpia) : μ = μ0(T,p) + RT ln c [μ0(T,p): 1M oldat kémiai potenciálja] ¾G úgy csökkenhet, ha a molekulák a magasabb kémiai potenciálú (magasabb c vagy T) hely felől az alacsonyabb kémiai potenciálú hely felé áramolnak. Statisztikus hajtóerő, G csökkenése ΣS növekedésével ekvivalens!
• Exkretált, szekretált anyagok, hormonok, gyógyszerek, hatóanyagok sejtekhez való eljutása • Transzmembrán (membránon keresztül történő) és a membrán síkjában történő laterális/rotációs diffúzió • Sejten belüli diffúzió, kémiai reakciók, molekuláris felismerési folyamatok
A transzmembrán diffúzió mechanizmusai •A membrán különféle molekulák számára különböző áteresztőképességű akadályt jelent •Passzív diffúzió: alacsonyabb (szabadentalpia csökkenés) irányában
koncentráció
•Facilitált diffúzió: alacsonyabb koncentráció irányában, transzporter molekulák segítségével megy végbe •Aktív transzport: energiaigényes (ATP)
konc.
gradienssel
szemben,
Passzív transzmembrán diffúzió A sejtmembrán permeabilitása egy molekulára nézve annál kisebb, minél nagyobb a molekula mérete és polárossága/töltése.
Gázcsere a tüdőben alveolus O2 CO2
Gázok Kisméretű semleges poláros molekulák
alveoláris epithelium intersticiális tér kapilláris endothelium
Víz
vérplazma
Nagyméretű poláros molekulák
•Passzív diffúzió •Diffúziós kapcsolat az alveoláris térrel: ~0.3 s Δx2 = 2Dt
Ionok
vvt.
DCO2
s −9 m2 = 6 ×10
Töltött poláros molekulák
Passzív diffúzió a membránon keresztül H2O c1,w
Lipid c1,l
2,l
β<1 x
dm = PA(c1, w − c2, w ) dt
~Fick I.
c2,w
s
t CO2 = 80μs
Facilitált diffúzió ¾Szelektív transzport - alacsony lipidoldékonyságú molekulák/ionok
H2O
β>1 c
t O2 = 500μs
2
DO2 = 10−9 m
specifikus transzportja transzporter ionofórok és ioncsatornák) segítségével.
β=
cl Megoszlási hányados cw
(a hidrofobicitás mértéke)
P = βD / x permeabilitási állandó Mitől függ P értéke? •β, ez függ leginkább a molekula típusától •D, (kb. egyforma ugyanakkora molekulákra) •a membrán vastagságától (kb. állandó)
molekulák
(permeáz
fehérjék,
¾Nem igényel külső energiát, az alacsonyabb koncentrációjú hely felé irányul.
¾Jellemzői: •Gyorsabb a passzív diffúziónál •Szelektív •Telíthető •Specifikusan gátolható
facilitált passzív
¾Példák: •Glükóz transzporter a vvt. membránjában •Víztranszporter a vvt-ben, vesében és a hólyagban (aquaporin) •(ioncsatornák, bár ezek nem telíthetők)
c
Laterális diffúzió mérése a sejtmembránban I.
Facilitált diffúzió kötődés
transzlokáció
•FRAP: (Fluorescence Recovery After Photobleaching) •fehérje megjelölése fluoreszcens antitesttel, v. membrán jelölése lipid analóggal •fókuszált lézernyalábbal megvilágítjuk a membrán kicsiny darabját, CCD kamerával/fotoelektronsokszorozóval megmérjük a fluoreszcencia intenzitást •1000-szeres intenzitással kiégetjük a fluoreszcenciát •Időben követjük a fluoreszcencia visszatérését •időállandó: τ~1/D •R visszatérési hányad: mobilis hányad (lipidek: 90-100%, fehérjék: 10-90%)
disszociáció
vmax
v c v = max KM + c
½ vmax
KM
c
KM: Michaelis-állandó (konc., melynél v = ½ vmax)
F∞
Fk -F0 F0
R=
F∞ − F0 Fk − F0
τ idő
Diffúzió a plazma membrán síkjában ¾A sejtmembrán dinamikája •A membránban elhelyezkedő fehérjék és lipidek laterális (és rotációs) diffúziós mozgást végeznek •viszkozitás: ηmembrán >> ηvíz (200-1000×) •Különböző molekuláris összetételű, fluid és gél állapotú lipid domének •A membránfehérjék kapcsolódhatnak egymáshoz, az extracelluláris mátrixhoz, a citoszkeletonhoz, mozgásukat gátolhatja a citoszkeleton membránhoz asszociált hálózata, a „membrán szkeleton” – mindez gátolhatja a diffúziót. •Fehérjék: D ~ 10-9-10-13 cm2/s •Lipidek: D ~ 10-8 cm2/s
Fk
¾Kísérleti módszerek a laterális diffúzió mérésére: •Fotokioltás utáni fluoreszcencia visszatérés (FRAP) •Részecske/festékmolekula nyomkövetés (SPT, SDT) •Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS)
Laterális diffúzió mérése a sejtmembránban II. ¾SPT: (Single Particle Tracking), részecske nyomkövetés •A vizsgált molekulát fluoreszcensen v. kolloidális aranygömbbel jelölik •CCD kamerával közvetlenül nyomon követik a részecske mozgását •membrán domének megjeleníthetők •A diffúzió különböző formái elkülöníthetők: •szabad diffúzió, <Δr2> = 4Dt •irányított diffúzió, <Δr2> ~ v2t2 •gátolt diffúzió, <Δr2> negatív irányban tér el a szabad diffúzióra jellemző időfüggéstől
aranygömb “membrán szkeleton”
receptor
Ld. a transzferrin receptor gátolt diffúzióját bemutató mozit (© Prof. Akihiro Kusumi, Department of Biology, Nagoya University, Japan).
Részecske nyomkövetés 2.
Axonális transzport II.
Δr 2 ~ v2t2 Δr 2
irányított diff.
Δr 2 = 4Dt szabad diffúzió
Δr 2 < 4Dt ha t nagy gátolt diffúzió
1μm
Δt (s )
Axonális transzport: irányított mozgás Vezikulák transzportja tintahal óriás axonjában
Gyors: vezikulák, 250 mm/nap Közepes: mitokondrium, 50 mm/nap Lassú: polimerizált citoszkeletális proteinek, 0,2-1 mm/nap
Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia A diffúziós állandó mérésére alkalmas módszer extrém alacsony koncentráció esetén is (10-10 M)
A fluoreszcencia időfüggése: δF (t )
t
τD
A fluoreszcencia ún. időbeli autokorrelációs függvénye: T
0,3 μm
G (τ ) =
δ F (t ) ⋅ δ F (t + τ ) F
2
=
∫ δF (t ) ⋅ δF (t + τ ) dt 0
F
2
1,5 μm
G(τ ) G(0) ~ 1/ N •A vizsgálandó molekula (fehérje, lipid, stb.) fluoreszcens jelölése •Kicsiny, <1μm3-es térfogat megvilágítása fókuszált lézernyalábbal •A fluoreszcencia időbeli változásának detektálása érzékeny fotodetektorral •A jelenlévő molekulák száma kicsi – az ingadozás relatív értéke jelentős
diffúziós idő τD ~1/D
Milyen kölcsönhatások vizsgálhatók?
A fluktuáció analízis elve A fluoreszcensen jelölt molekula fotonokat emittál, míg a lézer által megvilágított térfogatelemen áthalad Az időegység alatt kibocsátott fotonok száma függ a molekulaszámtól (konc.) a kvantumhatásfoktól instrumentális paraméterektől Az ingadozás kinetikája függ a diffúziós állandótól a megvilágított térfogatelem nagyságától
Fehérje – DNS
Nukleinsavak hibridizációja
Jelölt oligonukleotid próba
Tesztelt nukleinsav szekvencia Antigén – antitest kötődés
Receptor – ligandum kötődés
Az ozmózisnyomás orvosi, biológiai jelentősége
Ozmózis ¾Ozmózis: oldószermolekulák termodinamikai egyensúlya féligáteresztő hártya két oldalán. ¾Csak a 2. térrész tartalmaz (a membránon átjutni képtelen) oldott molekulákat → Az oldószer koncentrációja (és kémiai potenciálja) az 1-es térrészben magasabb. ¾Oldószer áramlás a 2-es térrész felé → p2 megnő → μ2 megnő. A kialakuló egyensúly neve ozmotikus egyensúly (ozmózis: „behatolás”). 1.
2. . . h . . . .. . . . . . . .... oldószer. . . . . . . . . . .c . 0. . oldószer . . oldat
van’t Hoff egyenlet
μv,1 = μ0(p0,T) + RT lnXv,1 + Vv (p1-p0) μv,2 = μ0(p0,T) + RT lnXv,2 + Vv (p2-p0)
¾Sejt ozmotikus egyensúlyának feltétele: a külső és belső ozmózisnyomás megegyezzen • A vér ozmolalitása: kb. 300 milliosm (ozmózisnyomása π~7,2 atm.) • alacsonyabb ozmolalitású oldat: „hipotóniás” • magasabb: „hipertóniás” • a vérrel „izotóniás” pl. 5.5% (0.3M) glükóz 0.87% (0.15M) NaCl, „fiziológiás sóoldat” • vvt hipotóniás közegben – duzzadás, kipukkanás (hemolízis) hipertóniás közegben – zsugorodás (plazmolízis)
μ0 : tiszta oldószer normál kémiai potenciálja μv,i : oldószer kém. pot-ja az 1. és 2. térrészben Xv,i : oldószer móltörtje, Vv : moláris térfogata Egyensúly feltétele:
μv,1 = μv,2
π = p2 − p1 = RTc0 π: ozmózisnyomás oldott anyag koncentrációja
Ozmózis 2.
Hipertóniás oldatok
•Oldat ozmózisnyomása, ha az oldatban több ozmotikusan aktív anyag is jelen van: π = RT ∑ ci i
Növények •A gyökér vízfelvétele, a turgor létrejötte
•csak a koncentráció számít, az anyagi minőség közömbös •disszociáló anyagoknál a részecskék összkoncentrációját kell figyelembe venni
• Ozmolalitás: az oldott anyagok összegzett koncentrációja. pl. 0.1 mol/liter glükóz: 100 milliosm 0.1 mol/liter NaCl (Na+, Cl-): 2×100 = 200 milliosm •100 mM glükóz oldat ozmózisnyomása: π = RTc0 = 0.0821 dm3×atm/(M×K) × 293 K × 0.1M = 2.4 atm
Gyógyítás • Keserűsós borogatás • Hashajtók: MgSO4, Mgcitrát (rosszul felszívódó sók) • Ödémák kezelése hipertóniás infúzióval
A Starling-effektus
Dialízis
A Starling-effektus
• Dialízis: makromolekulák ozmózison alapuló szétválasztása. Celofán: <10 kD-t enged át, „vágó membránok” • Hemodialízis: kiszűri a véráramból az oldható salakanyagokat membrán nyomásszabályozók dializáló oldat
ultraszűrő vérpumpa
vénás visszavezető ág
Fordított ozmózis •Ha az ozmózis ellen ható nyomás meghaladja az ozmotikus nyomást, az oldószer a hígabb oldat felé áramlik
tiszta H2O
tengervíz sótalanítása
A vérplazma fehérjéi (albumin, globulinok, fibrinogének) képesek az ozmotikus nyomást szabályozni, kihatnak a szervezet vízháztartására. Nyomásviszonyok a kapillárisban vérplazma artériás vég vénás vég vérplazma
35 Hgmm 25 Hgmm
2 Hgmm 0 Hgmm 8 Hgmm
Bal szívfél hibája: a tüdőkből a szívbe menő vénában pang a vér → nő a nyomás a tüdő ereiben → tüdő-ödéma Ödéma további okai: hipoproteinémia: (alacsony fehérje-tartalmú étrend; májbetegség, vesegyulladás – kevés albumin)
hidrosztatikai 15 Hgmm fehérjék ozm. 25 Hgmm kötőszöveti folyadék hidrosztatikai 1 Hgmm fehérjék ozm. 3 Hgmm nettó nyomás 8 Hgmm
vérplazma
Jobb szívfél hibája: a testből a szívbe vezető vénákban pang a vér → nyomásnövekedés az erekben → végtagi ödéma
tüdők B J szív test
