2016.10.25.
DNS klónozása DNS klóntárak előállítása és szűrése
Lontay Beáta 2016.
Klónozás:
A genetikai információt az egyik élőlényből (állat, növény, mikroorganizmus) mesterségesen visszük át egy másik organizmusba. angol megfelelője: „genetic engineering”
A klón és a klónozás
Genomklónozás: A genom‐klón csupa azonos genommal rendelkező egyedből áll ‐embriódarabolás ‐maganyag átvitel
A DNS vagy génklónozás: egyetlen gén élőlény által több példányban való előállítását jelenti
1
2016.10.25.
Az embrió fejlődése
embriódarabolás: • 2‐4 felé vághatók • egyszerű (de korlátozott számú) • valódi klónok, teljesen identikusak
Nukleáris transzfer (maganyag átvitel) ‐Sejtmagtól megfosztott petesejtbe idegen sejtmagot ültetnek, sejtmag újraprogramozódik ‐hatásfok 1‐2% ‐embrionális és újszülöttkori halálozás nő (large offspring syndrome) Típusai: ‐1. Trophoblast sejtből petesejtbe ‐2. Szomatikus sejtből petesejtbe Wilmut 1996 (Dolly),
2
2016.10.25.
DNS vagy génklónozás In vivo technika, amellyel egy adott DNS fragmentum nagy mennyiségben előállítható.
A DNS klónozás fő lépései 1. A klónozandó gént tartalmazó DNS előállítása 2. A megfelelő vektor kiválasztása 3. Rekombináns vektor konstrukciója 4. A rekombináns vektor megfelelő gazdasejtbe juttatása 5. A rekombinánst tartalmazó sejt szelektív tenyésztése 6. A rekombináns izolálása és jellemzése
A klónozás minden egyes lépése több alternatíva közötti választást jelent, a klónozási stratégiánk ezen alternatívák célszerű kombinációját jelenti.
1. A klónozandó gént tartalmazó DNS előállítása
Genomi DNS
DNS, gén forrása:
mRNS Előnye: ‐ Intron nélküli ‐ gyakran csak 1 gén
Reverz transzkriptázzal
Szaporítás PCR‐rel, lásd később..
3
2016.10.25.
2. A megfelelő vektor kiválasztása Klónozó vektor: olyan DNS molekula, amelybe idegen DNS fragmentum (inzert) építhető be. A vektor molekuláris szállítóként működik, a DNS inzertet gazdasejtbe juttatja, ahol az a replikáció révén szaporodik.
Rekombináns vektor: idegen DNS inzertet tartalmazó vektor DNS. A vektor és az inzert kovalensen összekapcsolva.
Vektorok alapvető komponensei Replikációs origó: A vektor önálló replikációját teszi lehetővé, a genomi DNS‐ től függetlenül (plazmid, cosmid) vagy a genomival együtt (mesterséges kromoszóma)
Szelekciós marker: pl antibiotikum rezisztenciáért felelős gén vagy sérült anyagcsereutak esetén a hiányzó fehérje biztosítása pl.: triptofán auxotróf élesztő képessé tétele triptofán bioszintézisre
Többszörös klónozó hely: Számos restrikciós enzim hasítási helyét tartalmazza
4
2016.10.25.
Egy mesterséges plazmid általános szerkezete
Napjainkban számtalan, in vitro rekombináns DNS technikával mesterségesen "összeállított„ plazmid létezik.
Vektorok A plazmid vektor max 4000 bp‐túl kicsi inzert és
transzformálás Bakteriofág vector: 20 kb‐fág infekció Kozmid: plazmid és bakteriofág l tulajdonságainak ötvözése : 40‐45 kb inzert, fág infekció, de plazmid‐típusú szaporodás BAC: bacterial artificial chromosome: 100‐300 kb inzert YAC: yeast artificial chromosome (0,‐1,2 Mb) A nagy inzerteket tartalmazó könyvtár nem stabil: rekombináció/deléció
5
2016.10.25.
Vectorok Plazmid
Bakteriofágok, vírusok
Inzert: max 10 kb
Inzert: max 20 kb
Cosmid
Mesterséges kromoszóma
Inzert: max 50 kb
Inzert: 200‐1000 kb
Plazmidok ‐A baktériumok citoplazmájában természetesen előfordulnak ‐Kettős szálú, kis méretű (1‐20 kb) gyűrűs DNS molekulák ‐Önálló replikációra képesek. ‐ Ált. különleges tulajdonságokat kódoló géneket hordoznak (pl. antibiotikum rezisztenica) ‐ Kicsi vagy nagy kópiaszám (néhánytól‐több százig) ‐ A baktériumok egymás között plazmidokat cserélhetnek: Konjugáció
6
2016.10.25.
Bakteriofágok ‐ Vírusfertőzés a baktériumokon ‐ Csak genomjukat juttatják a gazdasejtbe ‐ Baktérium specificitás Litikus ciklus (fágok összeszerelése, kijutása) Lizogenikus ciklus (beépül a genomba)
Bakteriofág lítikus és lizogén infekciós ciklusa
14 Figure 2.19 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
7
2016.10.25.
Bakteriofág Lambda vektorok
Lizogén szaporodás: a fág DNS beépül a baktériumkromoszóma egy adott pontjára és a fág DNS a baktérium DNS‐sel egyidőben, annak részeként replikálódik vagy a kromoszómától függetlenül, a plazmidokhoz hasonlóan replikálódik és így alakít ki lizogén állapotot. Lítikus fágszaporodáskor a fágfertőzés után a fág DNS replikálódik a gazda kromoszómától függetlenül, szintetizálódnak előbb a korai majd a késői fágfehérjék és az elkészült fágrészecskék, általában a baktériumsejt lízise útján, kiszabadulnak a 15 baktériumból. Ezt követően ismételten fetőznek.
Klónozás inzerciós vektorral
16 Figure 2.21 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
8
2016.10.25.
DNS fragmentjeinek fág vektorba történő klónozása
17
Kozmid vektor
‐A plazmidok és lambda fág genetikai elemeinek és ezzel tulajdonságainak kombinációjával fejlesztették ki ‐Mint fágok juttathatók be a sejtbe, de ott mint plazmidok replikálódnak. A lambda alapú vektorok nagy előnye, hogy velük viszonylag nagyobb DNS darabok rendkívül hatékonyan sejtbe juttathatók. Lambda alapú vektorokba és cosmidokba épített DNS sejtbe juttatásához a DNS‐t kémcsőben fág fehérjékbe csomagolják ‐in vitro pakolás és a természetes fágfertőzésnek megfelelően juttatják a sejtekbe. 18 Figure 2.23 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
9
2016.10.25.
Élesztő mesterséges kromoszóma, YAC
19 Figure 2.25a Genomes 3 (© Garland Science 2007)
20 Figure 2.25b Genomes 3 (© Garland Science 2007)
10
2016.10.25.
Vectorok I. Vektor
Gazda
Jellemzők
Inzert mérete
Plazmid
Baktérium, élesztő
Kisméretű, gyűrűs DNS
max ~10 kb
Bakteriofág lambda vagy fág lambda
baktérium
Lineáris virális DNS
max ~20 kb
Kozmid
baktérium
Plasmid és fág hibridje
max ~50 kb
élesztő
Élesztő centromert, telomert és replikációs origót tartalmazó DNS
~200 ‐ ~1000 kb
Élesztő mesterséges kromoszóma, YAC
21
3. Rekombináns vektor konstrukciója
Az idegen DNS‐t (inzertet), restrikciós endonukleázzal emésztjük, majd az ugyanezen restrikciós enzimmel linearizált vektor kompatibilis végződéseivel ligáljuk. 22
11
2016.10.25.
Azonos restrikciós enzimmel létrehozott DNS fragmentumok ligálása A A
A
A
vektor
a ligálás lehetséges termékei
A
A
A
A
Rekombináns
Nincs inzert, Inzert Nincs ligálás önligálódás fragmentumok
23
4. A rekombináns vektor megfelelő gazdasejtbe juttatása
Mesterségesen
‐ Mikroinjekciózás ‐ Génpuska
Természetes(hez közelítő) módon ‐ transzformáció ‐ elektroporáció ‐ fágfertőzés, vírusfertőzés
12
2016.10.25.
Mikroinjekciózás munkaigényes, drága, lassú, random integráció a genomba (kiküszöbölés: minigén‐ konstrukciókkal) Fehérjeexpresszió alacsony fokú
Génpuska A DNS‐t mikrométeres átmérőjű arany vagy wolfram szemcsékre kötik, majd nagy nyomású nitrogén vagy hélium gáz segítségével egy csőben felgyorsítják, amit egy vákum kamrába vezetnek. A felgyorsított szemcséket egy stoplemez lelassítja, majd azok szétszóródva becsapódnak az előkészített szövetek sejtjeibe. A DNS elméletileg minden élő szövetbe, sejtbe bejuttatható. A gén bejutásának hatékonysága kicsi: 3‐5%. Belövést követően a gén beépülése nem szabályozható. Főleg egyszikűeknél terjedt el.
Transzformálás I. (baktériumok, élesztők, növények esetén alkalmazható) Baktérimok példáján bemutatva:
Az E. coli baktérium klónozásra igen alkalmas, mert: ‐optimális körülmények között 22 percenként duplázódik. ‐jól ismert genetikai környezetet nyújt. ‐az idegen DNS‐t sajátjának tekinti
26
13
2016.10.25.
Transzformálás II. 1. Lépés A baktérium sejtek kompetenssé (transzformálásra alkalmassá) tétele: például sókezeléssel (CaCl2) 2. Lépés Maga a transzformálás: A rekombináns plazmid és a kompetens sejtek elegyének alacsony‐ magas‐alacsony (4‐42‐4 C) hőmérsékleten történő inkubálása. (A baktériumok, nem ismert módon, felveszik a plazmidot
Figure 2.15 (part 2 of 3) Genomes 3 (© Garland Science 2007)
A transzformálás lépései
Jeges vízben inkubáljuk a kompetens E. coli és a ligált DNS (vektor és inzert) elegyét.
Hősokk 42 oC‐on.
A baktériumot gazdag, folyékony táptalajban tenyésztjük.
Szilárd táptalajra szélesztünk.
Jeges vízben lehűtjük az elegyet.
14
2016.10.25.
Elektroporáció ‐Lényegileg a transzformációnak egy változata. ‐A baktériumokat egy elektromos sokkal (2,5 kV, 200 ohm) teszik a DNS felvételre képessé. ‐ A felvétel pontos mechanizmusa nem ismert. ‐Elektroporációval egy‐két nagyságrenddel jobb a DNS bejuttatásának hatékonysága.
Legfontosabb vektorok
Bejuttatási módszerek
plazmid, bakteriofág, cosmid, bakteriális mesterséges kromoszóma (BAC).
transzformáció, elektroporáció, fágfertőzés
Élesztő
plazmidok, élesztő mesterséges kromoszóma (YAC)
transzformáció
Növényi sejtek
plazmid, vírus
transzformáció, fertőzés, génpuska
Állati, (emlős) sejtek
plazmid, DNS és RNS vírusok, mesterséges kromoszóma
transzfekció, (kalcium foszfáttal, lipidekkel) vírus fertőzés, elektroporáció, mikroinjektálás
Prokarióták
15
2016.10.25.
5. A rekombinánst tartalmazó sejt szelektív tenyésztése
Figure 2.15 (part 3 of 3) Genomes 3 (© Garland Science 2007)
A transzformálás lehetséges eredményei
Baktérium
Plazmid inzerttel Ampicillin rezisztens baktérium
Genomi DNS
Plazmid inzert nélkül Ampicillin rezisztens baktérium
Nincs plazmid Nincs ampicillin rezisztencia
32
16
2016.10.25.
A DNS klónozás fő lépései 1. A klónozandó gént tartalmazó DNS előállítása 2. A megfelelő vektor kiválasztása 3. Rekombináns vektor konstrukciója 4. A rekombináns vektor megfelelő gazdasejtbe juttatása 5. A rekombinánst tartalmazó sejt szelektív tenyésztése 6. A rekombináns izolálása és jellemzése
33
Felhasználás • Genomot reprezentáló könyvtár készítése
• klónozott DNS fragmentum szekvenálása • a szaporított DNS inzert felhasználása templátként vagy próbaként, • fehérje termelés: ‐ kutatási céllal ‐ gyógyászati, élelmezési céllal
17
2016.10.25.
A rekombináns DNS terápiás felhasználási lehetőségei… inzulin a cukorbetegek számára factor VIII a hemophilia A‐ban szenvedő férfiaknak factor IX a hemophilia B kezelésére human növekedési hormon (GH) erythropoietin (EPO) az anemia kezelésére Interferonok 3 típusa számos interleukin granulocyta‐makrophag kolónia‐stimuláló faktor (GM‐CSF) a csontvelő transzplantáció után a velő stimulálására szöveti plazminogén aktivátor (TPA) a vérrögök feloldására adenosine deaminase (ADA) a súlyos kombinált immundefektus (SCID) néhány típusának kezelésére angiostatin és endostatin a rákellenes gyógyszerek kísérleteihez mellékpajzsmirigy hormon (parathormon) leptin
GMO – bioreaktor állatok tiszta formában, aránylag magas (35 g/l) koncentrációban termeltethetők idegen fehérjék a tejben ‐ humán antitrombin III (ATIII) ‐ α1‐antitripszin ‐ szöveti plazminogén aktivátor (tPA) ‐ α‐glukozidáz ‐ laktoferrin ‐ VIII. véralvadási faktor (hFVIII)
18
2016.10.25.
Biosteel: pókháló‐fehérje ‐5 g/l protein (űrtechnikai és ipari alkalmazásra ‐105 J/kg szilárdságú, (hajlítószilárdsága 10 x erősebb az acélnál) ‐ Sebzárásra, vérzéscsillapításra is jó
DNS klóntárak előállítása és szűrése
19
2016.10.25.
Mi a DNS könyvtár? Reprezentatív DNS fragmentumok önreplikációra képes vektorba klónozott gyűjteménye, amely megfelelő gazdasejtben szaporítható. Célja: izolálni/klónozni DNS géneket/ szekvenciákat
20
2016.10.25.
DNS könyvtárak típusai Genomi DNS könyvtár: DNS bank, ami egy specifikus sejt, élőlény, fajgenomját tartalmazza cDNS könyvtár: cDNS bank, ami egy specifikus sejt mRNA állományát reprezentálja linker könyvtárak a PCR‐on alapuló klónozásra Marathon könyvtár
A genomi és cDNS könyvtárak információ tartalma nem azonos
21
2016.10.25.
Genomi DNS könyvtár Exont, intront és a szabályozó szekvenciákat is tartalmaz Bármely (szomatikus) szövetből származó genomi DNS könyvtár azonos A kópiák között nincs mennyiségi különbség Humán genom project Egy emlős DNS könyvtár 1 millió bakteriofág vagy 500 ezer kozmid klónja Kereskedelmi forgalomban kapható könyvtárak
Genomi DNS könyvtár tulajdonságai Fontos: valamennyi fragment jelen legyen azonos méretű fragmentek‐a restrikciós enzimmel emésztett genomi DNS méret szerinti frakcionálása Előnye: Egymást átfedő fragmenteket tartalmaz. Az egyik inzert DNS próbaként használható az könyvtárszűréshez Kódoló‐nem kódoló jelen van Nincs mennyiségbeli különbség a fragmentek számában
Problémák: Teljes emésztés: túl kicsi fragmentek‐egymással ligálódhatnak Részleges emésztés: túl hosszú fragmentek: beépülnek a vektorba gátolva annak szaporodását Szomatikus mutációk
22
2016.10.25.
cDNS könyvtárak Az RNS másolata Csak a kódoló szekvenciát tartalmazza Következtethető belőle a fehérje aminosav szekvenciája Általában 2‐4 kb hosszú Az mRNS relatív gyakoriságát adja meg (ami
nagymértékben gyakori az ~10%)‐minél gyakoribb egy mRNS, annál több klón A könyvtár mérete a transcriptek gyakoriságától függ
A cDNS könyvtár típusai Oligo dT primerrel Random primer hexamerrel Könyvtár a szűréshez hibridizációval Expressziós könyvtárak‐a kódoló régió kifejezése Substracted cDNA kibraries: az indukált és nem‐inukált
gének azonosítása
23
2016.10.25.
Reverse Transcriptase 1. RNS függő, DNS szintézis 2. RNS degradáció 3. DNS függő, DNS szintézis.
Error Rate: 1 in 20,000 nucleotides.
cDNA
24
2016.10.25.
Különböző vektorokba klónozott humán genomi könyvtárak mérete
50 Table 2.4 Genomes 3 (© Garland Science 2007)
25
2016.10.25.
Könyvtárszűrés lépései A könyvtár ( rekombináns fággal fertőzőtt
baktériumtenyészet) szélesztése szilárd hordozón Plakkok, tarfoltok alakulnak ki a baktérium szőnyegen Lenyomat készítése a felületről nitrocellulóz membránra A keresett klónt hibridizációval azonosítjuk Autoradiogram készítése A pozitív jelet adó plakk azonosítása
26
2016.10.25.
DNS könyvtárszűrés
nagyszámú rekombináns klón közül egyetlen, a minket érdeklő klón kiválasztása.
53
27
