Igazságügyi Genetikai vizsgálatok
Szemes Áfonya Bűnügyi Szakértői és Kutatóintézet 2014.10.07.
DNS – összehasonlító vizsgálati módszer Minta gyanúsítottól Helyszíni minták:
Vér Ondó Nyál Köröm (alatti hám) Hajhagymás haj Egyéb szövetek (pl. abortum, vizeletben hám) LCN (Low Copy Number)
Egyezés?
Rokonsági kapcsolatok?
Szájnyálkahártya-törlet Folyékony vér sértettől, eliminációs minták: Szájnyálkahártya-törlet Folyékony vér
Eltűnt személyek mintái: Azonosítatlan személyek, holttestek: Vér Szövet Csontminta
Egyezés? Rokonsági kapcsolatok? DNS-profil nyilvántartás
Személyes tárgyak (fogkefe, borotva, ékszer, óra, protézis stb.) Rokonok mintái
Honnan vegyünk mintát? Vizsgálat Ultra Viola fényben Fluorescencia UV
fehér fény
UV
sötét folt Elnyeli az UV-t, csak hő szabadul fel
Hő szabadul fel Ondófolt
Vér
Kémiai vérelőpróbák Benzidin Hemoglobin „pszeudoperoxidáz” aktivitásán alapszik pillanatszerű sötétkék színreakció preparálás: benzidin + ecetsav + etanol + 3% H2O2 érzékenység: 1 : 300 000 – 500 000 karcinogén fals pozitív reakciók; nem specifikus humán vérre!
Luminol: chemilumineszcens reakció: vér esetén kékes-fehér fény preparálás: luminol + Na2CO3 + H2O2 v. Na2BO4 utólagos DNS vizsgálatot nem befolyásolja érzékenység: 1 : 5 000 000
Nyál kimutatása Nyál -amiláz (ptyalin) kimutatása: – a nyál szárazanyagtartalmának 60%-a amiláz mucin – egyéb biol. anyagban is (vérszérum, tej, ondó, hüvelykenet, verejték, széklet, de igen kis mennyiségben!!!) Phadebas amylase teszt: nem vízoldékony keményítőhöz kötött kék festékanyagot tartalmaz. Amiláz jelenlétében a keményítő bomlása miatt a kék festék felszabadul, az oldatot kékre színezi.
Ondó kimutatása – Ondóalkotók: foszforil-kolin, savanyú-foszfatáz, citromsav, fruktóz, spermium (kivéve sterilitás esetén) – Savanyú-foszfatáz (ACP) vizsgálat: – alifás és aromás ortofoszforsav-észtereket hidrolizálja gyengén savanyú (pH=5) közegben – az enzim nagyságrendekkel nagyobb koncentrációban van jelen az ondóban (prosztata eredetű), mint egyéb testváladékban (pl. hüvelyváladék) – érzékenység 1 : 1000 – nem specifikus! – a savanyú foszfatáz az alfa-naftil foszfátot hidrolizálja, a keletkező naftol reagál az o-dianisidinnel, ennek következtében egy lila színű festék szabadul fel – Phosphatesmo KM tesztcsík
Immunológiai tesztek Ondó teszt: PSA=Prosztata specifikus antigénre specifikusak (prosztatában termelődik, ondóra specifikus kiv. prosztata daganatban szenvedő férfiak (vér, vizelet), Semelogeninre specifikusak Azoospermiás ondó (férfiak 1-9 %-a) kimutatása!
Csepp
T
Vérteszt: Hemoglobinra specifikus (pl. Hexagon OBTI) Terhességi teszt: hasonló elv
Csepp
T
Festett kenet Kernechtrot-Picroindigocarmine (AlSO4, Nuclear Fast Red, Pikrinsav, Indigókármin) (balra) Sperm Hy-liter (Fluorescens) (lent)
DNS felszabadítása lineáris folyamat, egymásra épülő lépések
SEB – SDS sejthártya felszabadítása (hétköznap: mosószer) U.a. mint a lízis puffer Proteinase K sejtet körülvevő ill. DNS-t rögzítő fehérjék emésztése, kicsapása (hétköznap: húspuhító enzim) DTT Dithiothreitol diszulfid hidakat tartalmazó fehérjék bontása – spermiumokban, hajban van ilyen
DNS tisztítása •
Van az oldatunkban DNS + sejttörmelék, fehérje és sejthártya lebontva. Gátló anyagoktól meg kell tisztítani a DNS-t! •
Oldhatóság különbsége alapján (felület…)
•
•
Tris-EDTA szerepe: Endogén nukleázok inaktiválása
Mágnesgyöngyhöz kötjük a DNSt
Egy különleges lehetőség: spermium és hám differenciált feltárása SDS, EDTA és proteináz K (sejt lízis puffer) Inkubálás 37oC-on Centrifugálás
Elkövető spermium sejtjei az áldozat hámsejtjeivel keveredve
spermium üledék
SDS, EDTA és proteináz K + DTT
“Férfi Frakció”
Felülúszó: hámsejtekből származó DNS
DTT: a spermium sejtfal lebontása
spermium üledék
“Női Frakció”
Figure 3.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
Mit tudunk a DNS-ről? Dezoxiribonukleinsav Savgyök milyen töltésű?
Mit tudunk a DNS-ről? •
Örökítő anyag – Kódoló szakaszok (humán genom kb. 25 %-a) – Nem kódoló, „junk DNA” „szemét DNS” – ismétlődő, repeat régiók. STR: short tandem repeat
•
Minden személy DNS-e egyedi, kivéve az egypetéjű ikreket (bár itt is vannak / lehetnek eltérések)
PCR (polimeráz láncreakció)
•
Kary B. Mullis és a hőforrásban élő baktériumok (Thermus aquaticus) polimeráz enzime
•
Hot start!
Thermus aquaticus
Kary B. Mullis
PCR Hőmérséklet
94 oC 72 oC 60 oC
Idő
Denatruáció
94 oC
94 oC
94 oC 72 oC 60 oC Egy Ciklus
72 oC 60 oC Általában 25-35 ciklus a PCR típusától függően
Real-time PCR – DNS mennyiség mérése
•
A PCR optimális működéséhez 0,5-1 ng DNS bevitelre van szükség!
Gélelektroforézis •
DNS molekulák futóversenye egy „pókhálószövedéken” át – Agaróz, vagy akrilamid közegben
•
A több ismétlődő egységből (repeat) álló molekulák lassabban futnak!
-
+ Kiindulási állapot
-
+ Kb. 1 óra múlva
Gélelektroforézis
Gélelektroforézis
Gélelektroforézis kiértékelése
Gélelektroforézis kiértékelése
Gélelektroforézis kiértékelése
Eltérő öröklődési mintázatok Leszármazási markerek
Autoszómás marker (az összes felmenőnktől örököljük részletekben)
Y-kromoszóma
Mitokondriális DNS
(csak a fiú gyermekek öröklik apjuktól)
(minden gyermek az édesanyjától örökli)
PAR1 X
Y
PAR2 From David C. Page
Figure 9.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
Női DNS-profil
Y-haplotípus
Definíciók •
Nukleotid: DNS alegysége (dezoxiriboz, foszforsav, N-tartalmú bázisok: adenin/A, Timin/T, Guanin/G,Citozin/C)
•
A DNS által kódolt információ a nukleotidok sorrendjében rejlik, ez a DNS-szekvencia
•
Genom: szervezet teljes örökítő információját jelenti, amely a DNS-ben van kódolva
•
Gének: olyan nukleinsav-szakaszok a sejtek magjainak kromoszómáiban, melyek a szervezet működését és növekedését befolyásoló fehérjék szabályozásához és előállításához szükséges információkat tartalmazzák
•
Lokusz: a DNS-lánc egy kitüntetett helye, mely változatosságot (polimorfizmus) mutathat.
•
Polimorfizmus: A DNS-lánc egy kitüntetett helyén mutatkozó egyedi változatosság
•
Egy konkrét változat neve: allél
•
DNS- profil: A személy/egyed vagy biológiai minta örökítő anyagának polimorf genetikai lokuszain (markerein) megállapított allélok összessége (DNS-mintázat, genotípus, haplotípus)
A DNS vizsgálat eredménye
•
Egyezés – Az összevetett STR profilok csúcsai ugyanazt a genotípust mutatják és a profilok között nincsen megmagyarázhatatlan eltérés.
A szakértői véleményben az egyezés fokát statisztikai értékeléssel, valószínűsítő véleményadással is alá kell támasztani. •
Kizárás (nincs egyezés) – A mintákból kimutatott DNS-profilok összehasonlítása olyan genotípusbeli különbözőséget mutat, ami csak a minták különböző eredetével lehet megmagyarázni.
•
Inkonkluzív – Az adatok kiértékelése során nem állapítható meg, hogy a profilok megegyeznek-e egymással.
Statisztika: a vád és a védelem hipotézise Helyszíni
Összehasonlító
Annak az esélye, hogy a biológiai nyom XY-on kívül más személytől származhatott:
Gyanúsított ♂
Gyanúsított ♂
1 : 8*1018
Gyanúsított + Sértett ♀
Gyanúsított ♂
1 : 6*1016
Gyanúsított ♂
1 : 1*1011
Gyanúsított + nem teljes profil
Gyanúsított ♂
1 : 1*1015
Gyanúsított + Sértett ♀
Gyanúsított ♂
1 : 2*1014
Gyanúsított ♂
1 : ~2*104
(sértett profilja ismert)
Gyanúsított + Vétlen ♀ (vétlen profilja ismeretlen)
(sértett profilja ismert)
+ nem teljes profil Gyanúsított Y-kromoszómás vizsgálat ♂
0 a 69 064-ből
A DNS vizsgálat korlátai, befolyásoló tényezők •
A biztosított minta DNS tartalma
(mennyiség és minőség: detektálási küszöb) •
A biztosított minta degradálódása, bomlási folyamatok - enzimatikus (endogén és exogén. Nedves környezetben: pár nap!) - ultraibolya sugárzás
•
Gátló anyagok jelenléte
•
Kontamináció (detektálási küszöb csökkenése!!!) – Extrém elővigyázatosság (egyszerhasználatos maszk, öltözetek, kesztyűcsere bűnjelek közt, felületek és eszközök DNS-mentesítése. Egyszerre egy bűnjel vizsgálata, egy nyitott mintatároló cső, referenciaminták vizsgálata más helyiségben, vagy a helyszíni minták után, eliminációs adatbázis a rendőrségi, szakértői dologzóktól.
•
Időbeniség nem meghatározható
•
Másodlagos transzfer
•
Feltételrendszer (anyag, eszköz, személy, költség)
Példaesetek
Az 1613 óta uralmon lévő Romanov orosz cári dinasztia bukását a polgári forradalom hozta el: 1917 márciusában lemondatták II. Miklós cárt, és családjával együtt őrizetbe vették. 1918 áprilisában a kommunista hatalomátvétel után a szovjet kormány parancsára Jekatyerinburgba hurcolták őket. 1918. július 16-ról 17-re virradó éjszaka itt, az Ipatyev-ház alagsorában gépfegyvertüzet zúdítottak II. Miklós cárra, feleségére, Alekszandra cárnéra, öt gyermekükre: Máriára, Tatyjanára, Anasztáziára, Olgára és a trónörökösre, Alekszejre, és kivégezték a balsorsukban is velük tartó néhány cselédjüket, köztük a család orvosát is. Holttestüket savval öntötték le, és a közeli erdőben, névtelen sírokba temették. Az Orosz cári család beazonosítása
Szélhámos örökös-jelöltek A cár halálhírét már másnap világra hozták, ám a többi rokonról ekkor még azt állították, hogy biztonságosabb helyre szállították. Ez az álhír adott később alapot arra, hogy az elkövetkező években szélhámosok egész sora adja ki magát a cári család túlélőjének, a szenzációs menekülésről szóló történetek és a gazdag rokonság által biztosítva megélhetését. Anna Anderson (jobbra), volt a legügyesebb szélhámos, aki Anasztáziának (balra) adta ki magát. A megdöbbentő hasonlóság mellett a család belügyeit is kimerítően ismerte.
DNS vizsgálattal azonosították a maradványokat •
Egy családhoz tartoznak? – STR-analízis autoszómás markereken: – a cár, felesége és 5 gyermekük kapcsolatát igazolta – cselédeiket a családtól függetlenként azonosította
•
Valóban a cári család csontjait fedezték fel? – Miklós cár: 1891., Japán: szablyával támadtak a cárra, véres ingét relikviaként őrizték => egyezés – Alexandra cárné és 5 gyermeke: Mitokondriális DNS-sel azonosították • Fülöp edinburgh-i herceg (II. Erzsébet királyné férje) anyai ágon rokona Alexandra cárnénak • Anna Andersont kizárták
A cári család és Fülöp herceg rokonsága. A kék szín a közös mitkondriális DNS leszármazását jelzi.
Ismeretlen holttest azonosítása •
•
Ismeretlen holttestből égett csontmintából
Eltűnt által használt borotvából
•
Eltűnt lányának szájnyálkahártya-törletéből
Ismeretlen holttest azonosítása •
Borotva és csontminta függetlenek vs azonos személytől származnak: –
•
1 : 53,4 trilliárdhoz
NN férfi (csontminta) az eltűnt lányának biológiai apja, vs NN férfi (csontminta) az eltűnt lányával nem áll rokonságban: – 29,5 millió : 1, ami a kérdéses rokoni kapcsolatra vonatkozóan 99,999997 %-os posteriori valószínűségi értéknek felel meg.
Szexuális erőszak (volt feleség ellen) •
Bugyiból, férfi frakció
•
Bugyiból, női frakció
•
Gyanúsított férfi profilja DNS Nyilvántartásból AMEL
D8S1179
D21S11
D18S51
X/ Y
14/ 15
28/ 30
15/ 17
Szexuális erőszak (volt feleség ellen)
•
Bugyiból, női frakció és férfi frakció eredménye (megegyezik)
Apa, anya 6 gyermek
Statisztika értelmezés
Vád szerint allélbees és
Vád szerint allélkies és
Vád
Védelem 1
Védelem 2
Védelem 3
Lánygyermek + APA
APA + NN
Lánygyermek + NN
NN + NN
7
ANYA + APA
APA + NN
ANYA + NN
NN + NN
Lánygyermek + Fiúgyermek
Lánygyermek + NN
Fiúgyermek + NN
Lánygyermek + APA + ANYA
Lánygyermek + APA + NN
Lánygyermek + ANYA+ NN
1
2
0
25,2
426,9
0
2
4,06E+14
3,24E+17
NN + NN
8
0
6,8
0,1
NN + NN csak 2!
0
2
1,57E+11
7,15E+13
És az ikrekkel mi a helyzet?
És az ikrekkel mi a helyzet?
Köszönöm a figyelmet!
