IDENTIFIKASI PERUBAHAN LUAS ERITROSIT DOMBA AKIBAT LARUTAN HIPOTONIS MENGGUNAKAN SOFTWARE IMAGE-J
ETRI MARDANINGSIH
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Perubahan Luas Eritrosit Domba Akibat Larutan Hipotonis Menggunakan ImageJ adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, September 2014 Etri Mardaningsih NIM B04100011
ABSTRAK ETRI MARDANINGSIH. Identifikasi Perubahan Luas Eritrosit Domba Akibat Larutan Hipotonis Menggunakan ImageJ. Dibimbing oleh KOEKOEH SANTOSO dan MOKHAMAD FAHRUDIN. Penggunaan imageJ dalam analisis gambar digital telah digunakan secara luas dalam bidang kesehatan dan biologi. Penelitian ini bertujuan mengetahui perubahan luas eritrosit domba secara kuantitatif setelah dipapar pada berbagai konsentrasi larutan hipotonis dengan menggunakan imageJ. Analisis luas sel dilakukan pada dua belas sampel, yaitu darah tiga ekor domba dan masing-masing diberi larutan NaCl dengan konsentrasi 0.6%, 0.7%, 0.8%, dan 0.9%. Darah domba dibuat preparat natif kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 920 kali. Gambaran eritrosit di bawah mikroskop diamati melalui komputer dengan bantuan kamera Dino-Eye. Luas eritrosit pada gambar dihitung menggunakanan imageJ. Hasil penelitian ini menunjukkan dilihat bahwa rata-rata luas eritrosit domba yang dipapar dengan konsentrasi NaCl 0.8% meningkat dari 17.25±2.01µm2 (p<0.05) menjadi 20.13±2.29 µm2 (p<0.05), pada konsentrasi NaCl 0.7% meningkat menjadi 20.62±2.18 µm2 (p<0.05), dan pada konsentrasi NaCl 0.6% menjadi 21.24±2.42 µm2 (p<0.05). Kesimpulan dari penelitian ini adalah imageJ dapat digunakan untuk mengukur luas eritrosit domba yang diberi perlakuan hipotonis secara kuantitatif. Kata kunci: eritrosit domba, imageJ, larutan hipotonis
ABSTRACT ETRI MARDANINGSIH. Identification of Sheep’s Erythrocytes Size Change in Hipotonic Solution Using ImageJ Software. Supervised by KOEKOEH SANTOSO and MOKHAMAD FAHRUDIN. ImageJ has been widely used in biological and medical field for analyzing digital image. This research was conducted to examine the quantitative changes of erythrocytes size after exposure to various concentration of hypotonic solution using imageJ. Analysis of cell size was experimented for twelve samples, blood smear from three sheeps and each was given NaCl solution with concentration of 0.6%, 0.7%, 0.8%, and 0.9%. Blood smear was observed using a light microscope with 920 times magnification. Erythrocytes’s image in microscope was observed through a computer (computerized) using Dino-Eye camera. Erythrocytes image then measured using ImageJ. The result of this research showed that eritrocyte’s size in NaCl solution with 0.9% concentration was 17.25±2.01 µm2 (p<0.05), in 0.8% concentration was 20.13±2.29 µm2 (p<0.05), 0.7% concentration was 20.62±2.18 µm2 (p<0.05), and 0.6% concentration was 21.24±2.42 µm2 (p<0.05). It was concluded that sheep’s erythrocytes size in hipotonis solution could measured using software imageJ. Keywords: hipotonic solution, ImageJ software, sheep’s erythrocytes
IDENTIFIKASI PERUBAHAN LUAS ERITROSIT DOMBA AKIBAT LARUTAN HIPOTONIS MENGGUNAKAN SOFTWARE IMAGE-J
ETRI MARDANINGSIH
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2014 hingga April 2014 ini ialah fisiologi darah, dengan judul Identifikasi Perubahan Luas Eritrosit Domba Akibat Larutan Hipotonis Menggunakan ImageJ. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ayahanda tercinta M. Limis dan Ibunda tercinta Elmarnis serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Dr Drh Koekoeh Santoso dan Bapak Dr Drh Mokhamad Fahrudin selaku pembimbing serta Ibu Drh Titik Sunartatie, MSi selaku dosen pembimbing akademik. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada staf Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor yang telah membantu selama pengambilan sampel dan pengumpulan data. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada teman seperjuangan Anisa Rahma dan Rendi Rifano yang selalu bekerjasama dalam suka dan duka, serta untuk sahabat-sahabat terbaik, Fitri Susana, Susan Fasella, Riena Carlina, dan Ninditya Anggie yang telah memberikan semangat kepada penulis. Terima kasih penulis ucapkan kepada Esdinawan Carakantara Satrija dan Meta Anggistia yang telah membantu dalam penulisan skripsi. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2014 Etri Mardaningsih
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Perumusan Masalah
2
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
Ruang Lingkup Penelitian
2
METODE
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Penelitian
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Hasil
Error! Bookmark not defined.4
Pembahasan
Error! Bookmark not defined.4
SIMPULAN DAN SARAN
8
Simpulan
8
Saran
8
DAFTAR PUSTAKA
9
LAMPIRAN
11
RIWAYAT HIDUP
14
DAFTAR TABEL 1 Luas eritrosit domba yang diberi perlakuan hipotonis
5
DAFTAR GAMBAR 1 Hubungan tekanan osmotik dan luas sel 2 Citra Greyscale Citra biner hitam putih hasil segmentasi 3 Filling holes dan watershed 4 Eritrosit yang diberi label
6 7 7 7 8
DAFTAR LAMPIRAN 1 Metode perhitungan luas eritrosit menggunakan imageJ 2 Hasil uji statistika hasil pengolahan citra
11 12
PENDAHULUAN Latar Belakang Eritrosit (sel darah merah) merupakan salah satu sel darah yang berfungsi untuk mentransportasikan berbagai macam zat yang dibutuhkan tubuh, seperti oksigen, nutrisi, karbondioksida, hormon, dan hasil metabolisme (Soepraptini et al. 2011). Eritrosit mamalia berbentuk bikonkaf dan tidak memiliki inti sel. Ukuran eritrosit mamalia berbeda-beda tergantung pada jenis hewan. Diameter eritrosit yang dimiliki oleh hewan pelihara antara lain, domba 4.8 µm, sapi 6.0 µm, kambing 3.2 µm, anjing 6.9 µm, kucing 5.4 µm, babi 4.0 µm, dan kuda 5.6 µm (Gregory 2004). Ukuran eritrosit dapat mengalami perubahan. Perubahan ukuran eritrosit diakibatkan oleh faktor genetik, lingkungan (stres osmotik, toksin, dan radioaktif), infeksi mikroorganisme, dan iatrogenik. Faktor genetik dapat menyebabkan kelainan pada eritrosit, seperti thalassemia major dan sickle cell anemia (Dewi 2014). Faktor lingkungan, infeksi mikroorganisme, dan iatrogenik pada umumnya menyebabkan hemolisis dan hemoragi sehingga terjadi kelainan, seperti anemia makrositik, anemia mikrositik, dan anemia normositik (Ford 2013). Eritrosit yang terpapar oleh larutan hipotonis ataupun larutan hipertonis akan mengalami perubahan morfologi. Secara kualitatif, larutan hipotonis mengakibatkan eritrosit menggembung sampai terjadi hemolisis sedangkan larutan hipertonis mengakibatkan sel mengerut (Mills et al. 2004). Oleh karena itu, perlu dilakukan evaluasi dini terhadap perubahan morfologi eritrosit. Evaluasi perubahan morfologi eritrosit dapat dilakukan melalui pemeriksaan sampel darah menggunakan preparat natif. Analisis ini memiliki hambatan karena hasil analisis yang dilakukan berdasarkan preparat darah tidak selalu sama (Fifin 2010). Ketelitian dan konsentrasi pemeriksa sangat menentukan hasil analisis. Perkembangan teknologi dunia medis sangat diperlukan untuk mengatasi hambatan ini, terutama untuk mengukur perubahan luas eritrosit secara kuantitatif. Salah satu perkembangan teknologi dunia medis adalah teknologi pencitraan melalui pengolahan citra (image processing) (Hartadi 2004). Pengolahan citra digital adalah cara pemrosesan citraan dengan menggunakan perangkat komputer agar mudah diinterpretasi oleh manusia atau mesin. Analisis citra yang dilakukan dalam hal ini adalah perhitungan luas eritrosit (Habibzadeh 2011). Saat ini, telah berkembang perangkat lunak untuk mempermudah pengolahan citra dalam bentuk open source. Perangkat lunak pada open source ini adalah imageJ yang dikembangkan oleh National Institute of Health (NIH) di Bethesda, Amerika Serikat (Àbramoff et al. 2004). ImageJ adalah sebuah perangkat lunak untuk menganalisis gambar biomedical (Reinking 2007). Fungsi utama dari imageJ, yaitu input, operasi dasar, dan analisis gambar. Input pada imageJ dapat berupa gambar, gambar dalam bentuk potongan-potongan, dan video. Operasi dasar yang dimiliki imageJ, seperti mengubah gambar berwarna menjadi keabuan, operasi histogram, dan menyaring gambar. Analisis gambar, diantaranya pengaturan skala dan analisis kuantitaf secara manual ataupun otomatis (Mea 2004). Perangkat lunak ini juga dapat digunakan untuk menghitung jumlah dan ukuran sel secara otomatis (Sharif 2012).
2 Perumusan Masalah Evaluasi perubahan luas eritrosit melalui pemeriksaan manual pada preparat darah natif memiliki hambatan karena hasil analisis tidak selalu sama dan membutuhkan waktu yang lama untuk menganalisis. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi perubahan luas eritrosit secara kuantitatif pada berbagai konsentrasi larutan hipotonis NaCl dengan menggunakan imageJ. Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan bisa memberikan kontribusi dan inovasi di bidang teknologi kedokteran. Inovasi tersebut berupa teknologi pengolahan citra untuk melakukan analisis eritrosit terutama pada perhitungan ukuran eritrosit. Analisis pencitraan ini bisa memberikan hasil pengukuran secara otomatis, tingkat ketelitian, dan konsentrasi yang tinggi sehingga hasil diagnosa tidak berbeda.
Ruang Lingkup Penelitian Ruang lingkup dari penelitian ini difokuskan pada penggunaan imageJ untuk menghitung perubahan luas eritrosit domba akibat pemberian larutan NaCl dengan konsentrasi 0.6%, 0.7%, 0.8%, dan 0.9% secara kuantitatif.
METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret 2014 sampai April 2014. Pengambilan sampel darah domba dilakukan di Unit Reproduksi dan Rehabilitasi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Pengamatan pengaruh larutan hipotonis terhadap perubahan luas eritrosit dilakukan di Laboratorium Fisiologi Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah eritrosit domba, larutan natrium klorida (NaCl) (Darmstadt, Germany) dengan konsentrasi 0.6%, 0.7%, 0.8%, dan 0.9%, minyak emersi (VWR International, USA), xylol (Recochem USA), antikoagulan ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) (BDH, England), alkohol 70% (Ciubros Farma, Indonesia), tisu, dan kapas. Hewan uji yang
3 digunakan adalah tiga ekor domba garut yang dipelihara di Unit Reproduksi dan Rehabilitasi FKH IPB.
Alat Alat yang digunakan untuk penelitian ini adalah mikroskop cahaya (tipe Nikon YS 100, Nikon Instrument Inc, Japan), kamera Dino-Eye (tipe AM4023X, AnMo Electronic Co, Taiwan) yang memiliki resolusi 1.3 mega pixel, software imageJ (versi 1.46r, NIH, USA), laptop (Toshiba tipe Satellite L645, Toshiba, China), disposable syringe 1 ml dengan jarum suntik ukuran 26 G, tabung reaksi, kaca objek, kaca penutup, pipet eritrosit, dan mikrometer objektif untuk kalibrasi. Prosedur Penelitian Pembuatan preparat natif Pembuatan preparat ulas darah diawali dengan pengambilan darah secara aseptis dari tiga ekor domba yang digunakan dalam penelitian. Darah diambil dari 1/3 vena jugularis dengan jarum suntik ukuran 26 G yang dihubungkan dengan disposable syringe. Darah diambil sebanyak 1 ml dari masing-masing domba. Darah tersebut dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi EDTA. Sampel darah dihomogenkan dengan EDTA sebelum dibawa ke laboratorium. Sampel darah diencerkan menggunakan larutan NaCl 0.6%, 0.7%, 0.8% dan 0.9% dengan langkah sebagai berikut: darah dihisap menggunakan pipet eritrosit sampai batas angka satu kemudian ujung pipet dibersihkan dari noda-noda darah yang menempel dengan menggunakan tisu. Ujung pipet dicelupkan ke dalam cairan pengencer (NaCl 0.6%, 0.7%, 0.8% dan 0.9%) dan cairan tersebut dihisap sampai batas sebelas. Pipet diangkat, lalu ditutup ujungnya menggunakan jari lain dan pangkalnya ditutup dengan jari tengah. Campuran larutan hipotonis dengan darah dihomogenkan dengan cara membuat gerakan angka delapan mendatar. Darah dicampurkan di dalam larutan hipotonis selama lima menit sebelum digunakan untuk preparat natif. Pembuatan preparat natif darah dilakukan dengan meneteskan sampel darah yang telah diencerkan pada permukaan kaca preparat dan kemudian ditutup menggunakan kaca penutup objek. Dalam penelitian ini dibuat tiga preparat natif dari masing-masing sampel darah untuk setiap perlakuan konsentrasi NaCl. Pengambilan gambar eritrosit Preparat natif darah diamati di bawah mikroskop dengan lensa objektif 40 kali dan lensa okuler 10 kali. Komputer yang telah dilengkapi dengan software DinoCapture kemudian dihubungkan dengan mikroskop menggunakan kamera Dino-Eye. Dino-Eye pada mikroskop untuk menggantikan fungsi lensa okuler. Gambaran preparat natif darah dapat diamati pada layar komputer dengan perbesaran 920 kali (perbesaran lensa objektif 40 kali dan perbesaran digital DinoEye 23 kali). Setelah mendapatkan gambaran sel darah yang jelas, maka gambar difoto menggunakan DinoCapture. Gambar eritrosit disimpan untuk diolah menggunakan imageJ (Alfitri 2013).
4 Perhitungan luas eritrosit menggunakan software imageJ Hal pertama yang dilakukan untuk menghitung luas eritrosit dengan menggunakan imageJ, yaitu mengalibrasi ukuran gambar. Kalibrasi dilakukan dengan menggunakan gambar yang telah diketahui ukurannya. Dalam penelitian ini, kalibrasi skala gambar dilakukan dengan gambar skala mikrometer (ukuran 100µm) kemudian angka kalibrasi ini digunakan untuk mengukur luas eritrosit yang teridentifikasi oleh DinoCapture (Jacqui 2012). Pengolahan citra dimulai dengan membuka gambar eritrosit yang telah difoto menggunakan imageJ. Gambar eritrosit tersebut ditampilkan dalam bentuk citra red, green, blue (RGB). Citra RGB disederhanakan menjadi citra greyscale yang hanya memiliki warna keabuan. Citra greyscale kemudian disegmentasi menggunakan threshold untuk memisahkan warna objek dengan warna latar belakang sehingga diperoleh citra hitam dan putih. Setelah itu, dilakukan evaluasi terhadap eritrosit yang telah disegmentasi. Jika ada gambar eritrosit yang berlubang (warna di tengah eritrosit sama dengan warna latar belakang), maka ditutup menggunakan fill holes dan jika ada eritrosit yang berdempet, maka dipisahkan menggunakan watershed. Luas eritrosit dapat dihitung melalui ROI manager atau analyze particle (Reinking 2007).
Analisis Data Pengaruh larutan hipotonis terhadap luas eritrosit domba secara kuantitatif dihitung menggunakan imageJ (versi 1.46r, NIH, USA). Rata-rata luas eritrosit dihitung menggunakan Microsoft Excell 2007 (Microsoft, USA). Data yang diperoleh diolah menggunakan SPSS (versi 14.0 Softonic Co, Spain) yaitu dengan uji ANOVA satu arah dan dilanjutkan dengan uji Duncan dengan selang kepercayaan 95%. Hubungan antara tekanan osmotik dan luas eritrosit dihitung menggunakan regresi linear sederhana. Data disajikan dalam bentuk rerata dan standar deviasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN Volume darah terdiri atas 40–50% eritrosit (Bransky et al. 2006). Eritrosit mempunyai membran yang kuat untuk menampung bahan material di dalamnya. Membran sel merupakan bagian yang terletak di luar sitoplasma. Membran sel menjadi komponen yang sangat penting karena berfungsi membungkus organelorganel sel, menjaga aktivitas sel tetap berlangsung, menyeleksi zat atau benda yang akan masuk ke dalam sel, tempat terjadinya beberapa reaksi kimia tertentu, dan penghubung antara bagian luar dan dalam sel (Shahib 2005). Struktur membran eritrosit terdiri atas lipid bilayer, membran protein, dan karbohidrat (Soerodikoesoemo dan Hartiko 1989). Permeabilitas membran eritrosit akan mengalami peningkatan apabila terpapar pada larutan NaCl hipotonis sehingga cairan pelarut mudah masuk ke dalam sel. Kondisi ini bisa menyebabkan perubahan morfologi eritrosit (Sacher dan Pherson 2002). Jenis perubahan morfologi eritrosit berbeda pada tiap konsentrasi larutan hipotonis. Perubahan tersebut meliputi perubahan bentuk dan
5 luas eritrosit. Perubahan luas eritrosit pada tiap konsentrasi larutan NaCl yang diberikan dapat diolah menggunakan pengolahan citra digital. Teknologi pengolahan citra yang digunakan pada penelitian ini, yaitu imageJ. Hasil pengolahan citra perubahan luas eritrosit menggunakan imageJ dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Luas eritrosit domba yang diberi perlakuan hipotonis (µm2) Konsentrasi NaCl (%) 0.9 0.8 0.7 0.6 Domba 1 15.57±1.95a 18.96±2.54b 19.20±1.97b 20.19±2.56 b 2 17.38±1.75a 19.66±2.16b 20.66±2.19b 21.31±2.03 b a b b 3 18.80±2.33 21.78±2.18 22.00±2.41 22.20±2.68 b Rata-rata 17.25±2.01 20.13±2.29 20.62±2.18 21.24±2.42 Keterangan: Superscript yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada (p<0.05).
Pada Tabel 1 dapat dilihat bahwa rata-rata luas eritrosit domba yang dipapar dengan konsentrasi NaCl 0.8% meningkat dari 17.25±2.0 µm2 (p<0.05) menjadi 20.13±2.29 µm2 (p<0.05), pada konsentrasi NaCl 0.7% meningkat menjadi 20.62±2.18 µm2 (p<0.05), dan pada konsentrasi NaCl 0.6% menjadi 21.24±2.42 µm2 (p<0.05). Eritrosit pada ketiga domba yang dipapar dengan konsentrasi NaCl 0.8%, 0.7%, dan 0.6% tampak menggembung namun secara statistik tidak terdapat perbedaan yang nyata luas eritrosit pada ketiga konsentrasi NaCl. Penyebab menggembungnya eritrosit adalah pada larutan hipotonis, air banyak masuk ke dalam sel sebagai respon dari gradient osmosis melalui aquaporin. Aquaporin merupakan bagian dari protein integral yang menyusun protein membran dan bersifat hidrofilik (Pribush et al. 2002). Air yang banyak terakumulasi di dalam sel menyebabkan eritrosit menggembung sehingga luas eritrosit meningkat (Horne 2001). Eritrosit domba satu, dua, dan tiga pada pemaparan konsentrasi NaCl 0.8%, 0.7% dan 0.6% masih bisa mempertahankan kestabilan membran sehingga tidak terjadi hemolisis. Hal ini terjadi karena eritrosit memiliki toleransi osmotik dan dilengkapi dengan sitoskleton khusus untuk memberikan stabilitas mekanik dan fleksibelitas (Li et al. 2007). Menurut Setiowati (2007), sitoskeleton merupakan filamen-filamen yang teranyam membentuk suatu rangka. Sitoskeleton berinteraksi dengan protein integral untuk menjaga integritas membran. Sitoskeleton berfungsi memberi bentuk dan mempertahan struktur sel, penempatan berbagai organ dalam sel, motilitas sel, pergerakan materi-materi dalam sel, dan mengatur aktivitas biokimia sel. Sitoskeleton berdasarkan struktur dan garis tengahnya dikelompokkan menjadi tiga kelompok, yaitu mikrotubulus, mikrofilamen, dan filamen intermediet. Sitoskeleton bisa mengikat compleks junctional (JC) yang terdiri dari F-aktin, protein 4,1, dan protein aktin-mengikat dematin, adducin, tropomiosin, dan tropomodulin untuk memelihara keutuhan eritrosit (Smith 1987). Perubahan luas eritrosit domba dan penurunan konsentrasi NaCl memiliki hubungan yang linear. Hubungan ini bisa dilihat pada Gambar 1.
6 Grafik pengaruh konsentrasi NaCl terhadap luas eritrosit domba 35
Domba 1 Domba 2 Domba 3
Luas Eritrosit (um^2)
30
25
20
15
10 0.60
0.65
0.70 0.75 0.80 Konsentrasi NaCl (% )
0.85
0.90
Gambar 1 Hubungan antara konsentrasi NaCl dan luas eritrosit domba. Data tersebut menunjukkan adanya hubungan negatif antara penurunan konsentrasi NaCl dan peningkatan luas eritrosit. Hubungan antara penurunan konsentrasi NaCl dan peningkatan luas eritrosit dihitung menggunakan analisis regresi linear sederhana yang menggambarkan hubungan antara konsentrasi NaCl sebagai peubah bebas (x) dan luas eritrosit sebagai peubah tak bebas (y). Hubungan kedua peubah tersebut digambarkan sebagai suatu garis lurus (Mattjik dan Sumertajaya 2006). Korelasi yang dihasilkan oleh data penelitian pada domba satu memiliki koefisien determinasi (R2) adalah 0.268 dengan persamaan garis y= 28.9-13.8x yang berarti besarnya perubahan luas eritrosit (y) jika terjadi perubahan konsentrasi NaCl (x) satu satuan adalah 13.8 µm2. Domba dua memiliki koefisien determinasi (R2) sebesar 0.348. Persamaan garis regresi linear domba dua adalah y= 29.8-13.5x yang memiliki arti adalah besarnya perubahan luas eritrosit (y) jika terjadi perubahan konsentrasi NaCl (x) satu satuan adalah 13.5 µm2. Nilai R2 domba tiga adalah 0.183 dengan persamaan garis y= 30.111.7x. Berdasarkan nilai R2, penurunan tekanan osmotik dan peningkatan luas eritrosit belum terkorelasi sacara linear. Menurut Prasetyowati (2012), jika nilai regresi mendekati ± 1, maka peubah bebas dan tak bebas semakin terkorelasi secara linear. Pengolahan citra menggunakan imageJ dipengaruhi oleh kualitas gambar yang akan diolah. Gambar diambil eritrosit melalui kamera Dino-Eye yang memiliki resolusi 1.3 mega pixel. Dino-Eye merupakan mikroskop digital yang bisa dihubungkan dengan komputer untuk melihat gambar suatu objek. Dino-Eye adalah bagian penting dari proses pengolahan citra karena alat ini yang menjadi perantara dari sistem, yaitu bagian input gambar dan imageJ. Kualitas gambar yang dihasilkan oleh Dino-Eye dipengaruhi oleh resolusi, tipe, dan fokus kamera (Alfitri et al. 2013). Citra digital sebelum diolah perlu dikenali oleh sistem perangkat lunak yang dibuat dengan melakukan pembacaan terhadap citra sehingga citra digital dikenali sebagai matriks yang siap diolah untuk program selanjutnya. Citra red, green, and blue (RGB) diubah menjadi citra greyscale dengan kedalaman warna 8 bit. Citra RGB merupakan gambar yang menunjukkan warna yang sebenarnya dari suatu objek (true colour) sedangkan citra greyscale adalah derajat keabuan suatu objek. Tujuannya adalah memudahkan dalam konversi gambar menjadi citra biner hitam dan putih (Hidayat et al. 2013). Gambar eritrosit yang telah diubah dalam
7 bentuk citra greyscale akan disegmentasi. Segmentasi merupakan proses untuk memisahkan warna objek (eritrosit) dan latar belakangnya sehingga diperoleh citra area deteksi (Hartadi 2004). Perbedaan warna antara objek dan latar belakang sangat mempengaruhi hasil pengolahan citra. Warna yang kurang kontras antara objek dan latar belakang tidak bisa diolah oleh imageJ sehingga luas eritrosit tersebut tidak bisa dihitung. Proses segmentasi menghasilkan citra biner hitam putih. Konversi citra greyscale menjadi citra biner hitam putih dapat dilihat pada Gambar 2. A
B
Gambar 2 A. Citra greyscale, B. Citra biner hitam dan putih Pada pengolahan citra sering ditemukan lubang (holes) dan eritrosit yang bertumpuk. Lubang (holes) pada citra didefinisikan sebagai wilayah berlatar belakang yang dikelilingi oleh perbatasan pixel yang terhubung dengan objek. Lubang dan eritrosit yang bertumpuk bisa mengganggu hasil perhitungan. Oleh karena itu, lubang dapat ditutup dengan menggunakan fill holes dan eritrosit bertumpuk dapat dipisahkan dengan menggunakan watershed yang dapat dilihat pada Gambar 3. A
B
Gambar 3 A. Filling holes, B. Watershed Proses pengolahan citra digital diakhiri dengan tampilan deskripsi hasil pengolahan dalam bentuk tekstual. Deskripsi tekstual menampilkan luas eritrosit yang telah dipilih dan dihitung melalui ROI manager. Contoh eritrosit yang dipilih dan dihitung melalu ROI manager dapat dilihat pada Gambar 4.
8
Gambar 4 Eritrosit yang diberi label Pengolahan citra menggunakan imageJ pada penelitian ini memiliki beberapa kesulitan, diantaranya adalah penghitungan luas eritrosit menggunakan metode ini membutuhkan pixel kamera yang tinggi (Kurniawan et al. 2011). Kamera Dino-Eye yang digunakan pada penelitian ini memiliki resolusi 1.3 megapixel. Resolusi kamera 1.3 megapixel memiliki perbesaran digital 23 kali sehingga kerapatan gambar berkurang dan menghasilkan gambar yang kurang jelas menyebabkan pada saat segmentasi yang menggunakan threshold terjadi kesulitan dalam memperjelas batas membran sel dan latar belakang gambar. Akibatnya, luas sel tersebut tidak bisa dihitung menggunakan imageJ. Selain itu, diafragma mikroskop yang terlalu kecil menyebabkan bagian tepi gambar berwarna hitam, seperti yang terlihat pada gambar 1, 2, dan 3 sehingga eritrosit pada bagian tersebut tidak bisa dihitung. Kemudahan yang diperoleh dari penggunaan imageJ adalah perhitungan luas sel dapat dilakukan dengan cepat (Jambhekar 2011). Hasil penelitian ini menunjukkan, analisis perhitungan luas eritrosit menggunakan imageJ dapat melihat perbedaan ukuran eritrosit tiap konsentrasi NaCl yang diberikan sehingga dapat diketahui batas toleransi osmotik (batas konsentrasi medium tertentu sel belum mengalami lisis) suatu sel terhadap larutan hipotonis.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Perubahan morfologi (luas) eritrosit akibat perlakuan hipotonis dapat diidentifikasi secara kuantitatif melalui pengolahan citra menggunakan imageJ. Terdapat korelasi antara penurunan tekanan osmotik dengan peningkatan luas eritrosit. Pemberian larutan NaCl dengan konsentrasi 0.8%, 0.7%, dan 0.6% menyebabkan luas eritrosit meningkat dibandingkan larutan NaCl 0.9%.
Saran Pengambilan gambar sebaiknya menggunakan kamera yang memiliki resolusi yang lebih tinggi. Tujuannya supaya gambar yang yang dihasilkan memiliki kualitas yang lebih bagus sehingga memudahkan pada saat segmentasi menggunakan threshold. Hal lain yang perlu dilakukan adalah menemukan
9 metode threshold yang baik supaya yang terdeteksi dan yang teranalisis hanya sel yang menjadi objek penelitian serta bisa menghitung jumlah eritrosit secara otomatis. Mikroskop yang digunakan untuk penelitian ini sebaiknya adalah mikroskop yang memiliki energi panas yang sedikit.
DAFTAR PUSTAKA Àbramoff DM, Magalhàes PJ, Ram SJ. 2004. Image Processing with ImageJ. Lousiana (US): Laurin Publishing Co. Inc. Alfitri N, Hendrick, Yondri S, Anggraini T, Efrizon. 2013. Deteksi pestisida pada tomat dengan pengolahan citra menggunakan mikroskop digital. Seminar Nasional Teknologi Informasi dan Komunikasi 2013. Teknik Elektro Politeknik Negeri Padang; Padang, Indonesia. Padang (ID). [diunduh 2014 Juni 24]. Tersedia pada: www.politekniknegeripadang.ac.id Bransky A, Korin N, Nemirovsky Y, Dinnau U. 2006. Correlation between erythrocytes deformability and size: a study using a microchannel based cell analyzer. Microvascular research. 73: 7-13. Dewi TS. 2014. Pengaruh Penyakit Thalassemia terhadap Pertumbuhan Rahang [internet]. [diunduh 2014 Agustus 23]. Tersedia pada: academia.edu. Fifin. 2010. Pengenalan pola citra leukosit dengan metode ekstraksi fitur citra. Jurnal Pendidikan Fisika Indonesia. 6: 133-137. Ford J. 2013. Red blood cell morphology. Int J Lab Hematol. 35(3): 351-7. Gregory TR. 2004. Mammal Erythrocytes Size [internet]. [diunduh 2014 Agustus 23]. Tersedia pada: www. mammals.htm. Habibzadeh M. 2011. Counting of RBCs and WBCs in noisy normal blood smear microscopic images. Medical Imaging. 79(63). Hartadi D, Sumardi I. 2004. Simulasi penghitungan jumlah sel darah merah. Transmisi. 8(2) : 1 – 6. Hidayat A, Alfitri N, Hendrick, Ramiati, Bakhtiar B. 2013. Aplikasi Pengolahan Citra Mikroskopis untuk Pendeteksi Kandungan Formalin pada Tahu menggunakan Kamera CCD (Charge Couple Device). Seminar Nasional Teknologi Informasi dan Komunikasi 2013. Teknik Elektro Politeknik Negeri Padang; Padang, Indonesia. Padang (ID). [diunduh 2014 Juni 24]. Tersedia pada: www.politekniknegeripadang.ac.id. Horne M. 2001. Keseimbangan Cairan, Elektrolit, Asam dan Basa Ed ke- 2. Jakarta (ID): EGC. Jacqui R. 2012. ImageJ: Introduction to Image Analysis [internet]. [diunduh 2014 Agustus 22]. Tersedia pada: http://microscopy. Berkeley. Edu/courses/dib/section. Jambhekar ND. 2011. Red blood classification using image processing. Science Research Reporter. 1 (3): 151-154. Kurniawan C, Waluyo TB, Sebayang P. 2011. Analisis ukuran partikel menggunakan free software imageJ. Seminar Nasional Fisika 2011. Pusat penelitian Fisika (LIPI); 2011 Jul 12-13; Serpong, Indonesia. Serpong (ID). [diunduh 2014 Maret 14]. Tersedia pada: http://www.opi.lipi.go.id.
10 Li J, Lykotrafitis G, Dao M, Suresh S. 2007. Cytoskelatal dynamic of human erythrocyte. PNAS. 104(12): 4937-4942. Mattjik AA, Sumertajaya M. 2006. Perancangan Percobaan: dengan Aplikasi SAS dan MINITAB. Bogor (ID): IPB Pr. Mea VD. 2004. Basic Functioning of ImageJ with Pratical Exersice 1[internet]. [diunduh 2014 Juni 28]. Tersedia pada: www.dimi.uniud.it. Mills JP, Qie L, Dao M, Lim CT, Suresh S. 2004. Nonlinear elastic and viscoelastic deformation of the human red blood cell with optical tweezers. MCB. 1(3): 169-180. Prasetyowati R. 2012. Regresi Linear [internet]. [diunduh 2014 Juni 29]. Tersedia pada: www.uny.ac.id. Pribush A, Meyerstein D, Meyerstein N. 2002. Kinetics of swelling and membrane hole formation in hypotonic media. Elsevier: 1558(2): 119-132. Reinking L. 2007. ImageJ Basic [internet]. [diunduh 2014 Juni 28]. Tersedia pada: www.melville.ch.cam.ac.uk. Sacher R Pherson R. 2002. Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Brahm, penerjemah. Jakarta (ID): EGC. Terjemahan dari: Widmann’s Clinical Interpretation of Laboratory test. Ed ke-11. Setiowati T, Deswanti F. 2007. Biologi Interaktif. Jakarta (ID): Azka Pr. Shahib. 2005. Membran sel [internet]. [diunduh 2014 Februari 6]. Tersedia pada: http://file.upi.edu. Sharif. 2012. Rekayasa Perangkat Lunak [internet]. [diunduh 2014 Februari 2006]. Tersedia pada: etd.ugm.ac.id. Smith JE. 1987. Erythrocyte membrane: structure, function, and pathophysiology. Vet Pathol. 24:471-476. Soepraptini J, Widyayanti K, Estoepangatie ATS. 2011. Perubahan bentuk eritrosit pada hapusan darah anjing sebelum dan sesudah penyimpanan dengan menggunakan citrate phosphate dextrose. JIKH.4(1). Soerodikoesoemo W Hartiko H. 1989. Biologi molekuler . Yogyakarta (ID): Universitas Gajah Mada Pr.
11 Lampiran 1 Meode perhitungan luas eritrosit menggunakan imageJ Kalibrasi gambar dengan skala mikrometer
1. Gambar eritrosit yang telah difoto dibuka dari folder penyimpanan dalam bentuk citra red, green, and blue (RGB)
2. Citra RGB disederhanakan menjadi citra greyscale
4. Citra greyscale disegmentasi menjadi citra biner hitam dan putih
5. Perhitungan luas eritrosit melalui ROI manager
12
6. Hasil perhitungan luas eritrosit
Lampiran 2 Hasil uji statistika pengolahan citra Hasil uji ANOVA NaCl .60 .70 .80 .90
N 3 3 3 3
Dependent Variable: respon Source
Type III Sum of Squares 28.082(a) 4708.564 28.082 15.507 4752.152 43.588
Corrected Model Intercept NaCl Error Total Corrected Total
df
Mean Sguares
F
Sig.
3 1 3 8 12 11
9.361 4708.564 9.361 1.938
4.829 2429.20 4.829
.033 .000 .033
Hasil uji Duncan NaCl
N
.90 .80 .70 .60
3 3 3 3 Sig
Subset 1 17.2471
1.000
2 20.1334 20.6171 21.2369 .379
13 Analisis Regresi linear Domba 1 S = 2.40441 R-Sq = 28.6% R-Sq(adj) = 28.3% Y= 28.9 - 13.8x Predictor Constant NaCl
SE Coef T P Coef 28.909 1.113 25.97 0.000 -13.844 1.469 -9.43 0.000
Domba 2 S = 2.05273 R-Sq = 34.8% R-Sq(adj) = 34.5% Y= 29.8 - 13.5x SE Coef T P Predictor Coef Constant 29.8451 0.9630 30.99 0.000 NaCl 2 -13.459 1.240 -10.85 0.000 Domba 3 S = 2.46838 R-Sq = 18.3% R-Sq(adj) = 17.8% Y= 30.1 - 11.7 Predictor Constant NaCl 3
SE Coef T P Coef 30.135 1.524 19.77 0.000 -11.71 1.969 -5.95 0.000
14
RIWAYAT HIDUP Penulis bernama lengkap Etri Mardaningsih. Penulis lahir di Payakumbuh pada tanggal 13 Maret 1992. Penulis merupakan anak pertama dari pasangan Bapak M. Limis dan Ibu Elmarnis. Penulis telah menamatkan pendidikan formal di SDN 03 Durian Tinggi pada tahun 2004, SMPN 02 Kecamatan Kapur IX tahun 2007, dan SMAN 01 Kecamatan Kapur IX tahun 2010. Penulis meneruskan pendidikannya di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor Melalui Undangan Seleksi Masuk Institut Pertanian Bogor (USMI). Penulis aktif dalam organisasi Himpunan Minat Profesi Ruminansia (2011-2013), tergabung dalam Lembaga Kemahasiswaan Steril (2011-2012), serta menjadi pengurus Ikatan Mahasiswa Kedokteran Hewan Indonesia cabang IPB (2011-2014) selama perkuliahan.
