IDENTIFIKASI BAKTERI PENGHASIL FITASE DAN KARAKTERISASI FITASE DARI KAWAH SIKIDANG DIENG. Mahasiswa Prodi Biosain Pascasarjana UNS

EL-VIVO Vol.1, No.1, 2013 (hal 34 – 44), September 2013

ISSN: 2339-1901 http://jurnal.pasca.uns.ac.id

IDENTIFIKASI BAKTERI PENGHASIL FITASE DAN KARAKTERISASI FITASE DARI KAWAH SIKIDANG DIENG Evy Novita Sari1, Sajidan2, Sugiyarto3 1 2 3

Mahasiswa Prodi Biosain Pascasarjana UNS

Dosen Pembimbing I Program Studi Biosain Pascasarjana UNS Dosen Pembimbing II Program Studi Biosain Pascasarjana UNS ( e-mail: [email protected] )

ABSTRAK - Asam fitat merupakan bentuk utama penyimpanan fosfat di dalam bahan makanan yang tidak dapat dihidrolisis dalam saluran pencernaan hewan monogastrik, yang berasosiasi dengan protein dan garam mineral membentuk senyawa kompleks yang tidak larut sehingga menghambat penyerapan fosfat, protein dan mineral di dalam tubuh. Fitase atau mio inositol heksakisfosfat fosfohidrolase adalah enzim yang dapat menghidrolisis ikatan fosfoester pada asam fitat, menghasilkan inositol, fosfat anorganik, protein dan mineral, sehingga fosfat, protein dan mineral mudah diserap oleh usus, dapat meningkatkan kualitas nutrisi dan mengurangi polusi fosfat. Tujuan dari penelitian ini yaitu: 1). Menguji adanya bakteri dengan aktivitas fitase pada air dan lumpur kawah Sikidang Dieng. 2). Mengidentifikasi bakteri penghasil fitase tersebut berdasarkan morfologi dan gen 16S rRNA. 3). Mengkarakterisasi ekstrak kasar fitase yang diperoleh dari hasil isolat terpilih. Bakteri diisolasi dari sampel air dan lumpur kawah Sikidang Dieng, kemudian diseleksi dalam media Luria bertani + fitat + bekatul. Aktivitas fitase diukur dengan spektrofotometer dengan kalibrasi KH2PO4. Tiga isolat bakteri dengan aktivitas fitase terbesar identifikasi berdasarkan morfologi dan gen 16S rRNA, sedangkan fitase yang dihasilkannya dikarakterisasi lebih lanjut meliputi suhu optimum, pH optimum, stabilitas suhu dan pH, dan pengaruh ion logam terhadap aktivitas fitase. Hasil penelitian diperoleh 3 isolat yang memiliki aktivitas fitase tertinggi yaitu Bacillus cereus EN 10, Bacillus cereus EN 16, dan Bacillus sp EN 6 dengan aktivitas fitase sebesar 0,32893 U/ml, 0,324953 U/ml, dan 0,32182 U/ml. Fitase dari ketiga bakteri tersebut memiliki suhu optimum 60ºC, 50ºC, dan 60º; dan memiliki pH optimum 4, 6, dan 6. Aktivitas fitase mengalami peningkatan karena penambahan ion Ca2+ dan Mg2+, dan mengalami penurunan karena penambahan ion Fe2+ dan Zn2+. Kata kunci: asam fitat, fitase, karakterisasi fitase, 16S rRNA

PENDAHULUAN

menghambat

Asam fitat merupakan bentuk utama

dalam tubuh. Kekurangan mineral di

penyimpanan fosfat di dalam tanaman

dalam

biji-bijian, sereal dan leguminose, yang

gangguan

digunakan

menyebabkan berbagai jenis penyakit.

dalam

bahan

makanan

manusia maupun makanan ternak. Asam fitat

tidak

dapat

dapat

metabolisme

mineral

di

menyebabkan yang

dapat

Asam fitat yang tidak dapat di-

dalam

hidrolisis tersebut tidak dapat dicerna di

saluran pencernaan hewan monogastrik,

dalam saluran pencernaan sehingga akan

dan asam fitat tersebut akan berasosiasi

diekskresikan melalui kotoran. Kotoran

dengan garamnya membentuk senyawa

yang mengandung gugus fosfat tersebut

kompleks

dapat mencemari tanah dan perairan di

yang

dihidrolisis

tubuh

penyerapan

tidak

larut

sehingga 34


sekitarnya.

Untuk

menanggulangi


hidup pada suhu 45-80ºC (Vieille dan

masalah pencemaran tersebut, biasanya

Zeikus,

pada pakan ternak ditambah dengan

panas dapat diperoleh pada sumber air

senyawa fosfat anorganik atau enzim

panas atau kawah gunung berapi. Oleh

fitase.

karena itu, pada penelitian ini mengambil

Fitase

atau

Mikroorganisme

tahan

inositol

air kawah Sikidang Dieng untuk di-

adalah

identifikasi dan dikarakterisasi bakteri

enzim yang dapat menghidrolisis ikatan

yang dapat menghasilkan enzim fitase,

fosfoester pada asam fitat, menghasilkan

agar enzim tersebut dapat dimanfaatkan

fosfat anorganik dan ester fosfat. Fitase

lebih baik di bidang industri pangan dan

terdapat

pakan ternak.

heksakisfosfat

mio

2001).

fosfohidrolase

di

dalam

mikroorganisme.

tumbuhan

dan

Fitase

dari

mikroorganisme yang telah diteliti oleh

METODE PENELITIAN

para

Waktu dan Tempat Penelitian

ahli

antara

Aspergillus

niger

lain:

fitase

(Nagashima,

dari

Penelitian

1999),

laboratorium

dilaksanakan

Aspergillus ficuum (Irving et al., 1972)

mulai bulan Oktober 2011 sampai April

Bacillis subtilis (Kerouvo et al., 2000),

2012. Sampel lumpur dan air kawah

Eschercia coli (Greiner et al., 1993), dan

Sikidang

Klebsiella

kultur

pneumonia

(Sajidan

et

al.,

diambil bakteri,

dilaksanakan

2004).

dari dan di

Dieng.

Isolasi,

karakterisasi Laboratorium

Mikrobiologi FKIP Biologi, Laboratorium

Fitase banyak dimanfaatkan dalam pakan

ternak.

Biologi FMIPA, dan UPT Laboratorium

bahan

pangan

Pusat MIPA Universitas Sebelas Maret

dalam

Surakarta. Sedangkan sequencing DNA

pencernaan asam fitat, sedangkan fitase

dilaksanakan di Laboratorium 1st Base

pada

Singapura.

industri

pangan

Adanya

fitase

manusia

pada

akan

memudahkan

bahan

meningkatkan

dan

pakan

ternak

akan

kualitas

nutrisi

pakan

ternak dan mengurangi polusi fosfat.

Alat dan Bahan

Pemanfaatan

industri

Alat-alat yang digunakan terdiri dari:

tinggi

tabung reaksi, rak tabung reaksi, cawan

dalam pengolahannya, sehingga dibutuh-

petri, gelas beker, gelas benda, jarum ose,

kan

tahan

pipet mikro (20l, 200l, 1000l), tip

terhadap suhu tinggi. Fitase yang dapat

(20l, 200l, 1000l), ependorf (100l,

tahan

1,5ml),

tersebut

fitase

dalam

membutuhkan

enzim

fitase

terhadap

diperoleh

dari

yang suhu

suhu dapat tinggi

dapat

mikroorganisme

bunsen,

sentrifuge,

yang

vortex,

autoklaf,

neraca,

sarung

tangan,

dapat hidup di daerah dengan suhu

masker, inkubator, lemari es, Laminar Air

tinggi

Flow

pula.

Mikroorganisme

tersebut 35

Cabinet,

Waterbath,

Digital



Mikroskop, PCR, Spektofotometer UV-VIS,

yang terdiri dari 2,5% bekatul, 0,5% yeast,

Elektroforesis DNA horizontal, Gel Doc,

1% NaCl, 0,25% glukosa, dan 2% bacto

dan DNA sequencer.

agar. Bakteri diinkubasi pada suhu 37ºC

Bahan-bahan yang digunakan antara

selama

24

jam.

Bakteri

yang

dapat

lain: tripton 1%, NaCl 1%, yeast extract

tumbuh pada media tersebut berarti

0,5%, bacto agar 2%, glukosa 2,5%, Na-fitat

memiliki

0,4%, bekatul 2,5%, aquades, kristal violet,

Penggunaan bekatul sebagai bahan dalam

iodium, safranin, CaCl2, NH4NO3, KCl,

media seleksi mengacu pada penelitian

MgSO4.7H2O,

Rosmimik et al., (1998), bahwa Bacillus

FeSO4.7H2O,

KH2PO4,

MnSO4.H2O,

Ammonium

molibdat,

kemampuan

coagulans

EI.4.4

aktivitas

yang

fitase.

menghasilkan

Ammonium metavanadat, HNO3, Natrium

fitase mampu menghidrolisis fitat pada

asetat,

70%,

bekatul. Bakteri kemudian di subkultur-

isopropanol, agarosa, DNA kit (Promega),

kan lagi pada media LB padat tanpa

buffer

bekatul, lalu dipindahkan ke media LB

HCl, TBE,

NaOH, EDTA,

alkohol

lisozym,

etidium

bromida, loading dye, master mix PCR

cair.

(Gotaq green), ddH2O, marka DNA 1kb, primer

forward

(5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’), primer

reverse

27f

c. Penentuan aktivitas Fitase

dan

Satu ml kultur hasil skrening pada LB cair

765r

kemudian disentrifus dengan kecepatan

(5’CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC 3’).

4000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang

Prosedur Penelitian a. Pengayaan air

dan dan

kemudian

ditentukan

aktivitas fitasenya. Penentuan aktivitas Pemurnian

Fitase dilakukan dengan metode Sajidan

Mikroorganisme Sampel

diperoleh

(2002), yaitu dengan 150l filtrat enzim + lumpur

diencerkan

750l substrat (0,4% Na-fitat dalam 0,82%

sampai 10-8 lalu diinokulasikan pada

larutan

media Luria Bertani (LB) padat yang

diinkubasi pada suhu 37ºC selama 1 jam.

terdiri dari: 1% tripton, 0,5% yeast, 1%

Kemudian

NaCl, dan 2% bacto agar, yang diinkubasi

penambahan 2400l larutan stop yang

selama 24 jam pada suhu 37ºC. Koloni

terdiri dari larutan Amonium molibdat

tunggal yang tumbuh pada media LB

(2,352 g ammonium molibdat + 2 ml

selanjutnya

HNO3 + 100 ml aquades), HNO3, aquades,

dimurnikan

dengan

cara

melakukan subkultur beberapa kali.

Na-asetat

pada

reaksi

pH

dihentikan

5)

yang

dengan

dan 10% Amonium metavanadat dengan perbandingan 1,5 : 1 : 2 : 1,5. Absorbansi

b. Seleksi bakteri penghasil Fitase

diukur

Koloni tunggal yang diperoleh kemudian

spektrofotometer UV-VIS pada panjang

diinokulasikan pada media seleksi padat

dengan

gelombang 415 nm. 36

menggunakan


d. Karakterisasi ekstrak kasar Fitase Karakterisasi

ekstrak

kasar


e. Identifikasi isolat terpilih

fitase

Identifikasi

isolat

bakteri

meliputi penentuan suhu optimum fitase,

meliputi

pH optimum fitase, stabilitas suhu dan

identifikasi molekuler dengan penanda

pH

gen 16S rRNA. Ekstraksi DNA bakteri

fitase,

dan

pengaruh

ion

logam

pewarnaan

terpilih

menggunakan

optimum fitase dilakukan dengan cara

Promega, kemudian DNA diamplifikasi

menentukan

pada

dengan

menggunakan

sedangkan

primer,

dengan

rentang

suhu

30-90

enzim ºC,

ekstraksi

dan

terhadap aktivitas fitase. Penentuan suhu aktivitas

kit

gram

PCR

primer

dari

universal

forward

27f

penentuan pH optimum fitase dilakukan

(5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’), dan

dengan cara menentukan aktivitas enzim

primer

pada rentang pH 3-9.

(5’CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC3’)

Penentuan dilakukan enzim

stabilitas

dengan

pada

suhu

suhu

cara

reverse

765r

fitase

(Sajidan, 2004). Reaksi PCR terdiri dari

memanaskan

12,5 l master mix PCR (Gotaq green),

optimumnya

pada

2l DNA, 0,5l primer f, 0,5 l primer r,

selang waktu tertentu dan ditentukan

dan

aktivitasnya

volumenya adalah 25 l. Siklus PCR

sampai

memperlihatkan

enzim

tidak

aktivitas

secara

l

9,5

meliputi

3

ddH2O, tahap

sehingga

yaitu:

total

denaturasi,

signifikan. Penentuan stabilitas pH fitase

anneling,

dilakukan dengan cara melarutkan enzim

sebanyak 30 siklus. Denaturasi awal

dalam larutan buffer dengan berbagai pH

pada suhu 94ºC selama 2 menit, dilanjut

3-9.

dengan 30 siklus denaturasi 94ºC selama

Masing-masing

pada

suhu

reaksi

optimum

diinkubasi

selama

1

jam.

1

dan

menit,

extention,

anneling

pada

dilakukan

suhu

58ºC

Kemudian dilakukan penentuan aktivitas

selama 45 detik, extention pada suhu

enzim pada pH optimum dan suhu

72ºC selama 90 detik, kemudian extra

optimum.

extention pada suhu 72ºC selama 5

Penentuan

pengaruuh

ion

logam

menit, yang terakhir disimpan pada suhu

terhadap aktivitas fitase dilakukan pada

4ºC. Pita DNA hasil PCR diamati dengan

kondisi pH dan suhu optimum fitase. Ion

agarose gel 1%, diletakkan pada marka

logam yang digunakan berasal dari garam

1kb, kemudian

ZnCl2, FeCl2, MgCl2 dan CaCl2, masing-

untuk

masing dengan konsentrasi 10 M. 150l

DNAnya, yang kemudian akan dibuat

enzim + 750l substrat + 30l efektor

konstruksi

logam diinkubasi pada suhu dan pH

dibandingkan dengan sekuens dari gen

optimum fitase selama 1 jam, kemudian

bank.

-3

ditentukan aktivitasnya. 37

dilakukan

mengetahui pohon

sequencing

susunan filogenetik

basa yang



Analisa Data

bergelombang,

tepi

Data yang diperoleh dari uji aktivitas

tebal, dan koloni tipis.

bergerigi,

koloni

fitase adalah jumlah kandungan fosfat

Hasil seleksi fitase diperoleh 28

anorganik yang dihasilkan ketika terjadi

isolat bakteri yang terdiri dari 16 isolat

rekasi enzimatis antara ekstrak kasar

bakteri yang berasal dari sampel air

fitase dengan substrat yang mengandung

kawah dan 12 isolat bakteri yang berasal

asam fitat. Satu unit aktivitas enzim

dari sampel lumpur kawah. Hasil ke-

fitase didefinisikan sebagai jumlah enzim

seluruhan uji aktivitas fitase dari 28

yang mengkatalisis reaksi yang meng-

isolat

hasilkan 1 mol fosfat organik per menit

aktivitas

pada

Penentuan

sampai dengan 0,3250933 U/ml. Dari 28

konsentrasi fosfat anorganik dilakukan

isolat tersebut kemudian diambil 3 isolat

dengan

bakteri yang memiliki aktivitas fitase

kondisi

optimum.

menggunakan

ammonium

bakteri fitase

menunjukkan antara

kisaran

0,30088

U/ml

diukur

yang terbesar, untuk dikarakterisasi lebih

menggunakan

lanjut. Tiga isolat bakteri yang dapat

spektrofotometer UV-VIS. Untuk pem-

menghasilkan enzim fitase tertinggi yaitu

buatan kurva kalibrasi digunakan larutan

isolat EN 10, EN 16, dan EN 6.

molibdat-vanadat, absorbansinya

kemudian

dengan

100–1000

Uji aktivitas fitase akhirnya diperoleh

ppm. Tiga isolat bakteri yang memiliki

3 isolat bakteri yang dapat menghasilkan

aktivitas fitase terbesar kemudian di-

enzim fitase tertinggi yaitu fitase dari

identifikasi dan dikarakterisasi enzimnya

isolat EN 10, EN 16, dan EN 6. Aktivitas

lebih lanjut.

fitase dari isolat EN 10 sebesar 0,32893

KH2PO4 dengan

konsentrasi

Data karakterisasi enzim meliputi:

U/ml, aktivitas fitase dari isolat EN 16

suhu optimum fitase, pH optimum fitase,

sebesar 0,324953 U/ml, dan aktivitas

stabilitas

dan

fitase dari isolat EN 6 sebesar 0,32182

pengaruh ion logam terhadap aktivitas

U/ml (Gambar 1). Satu U = 1 μmol fosfat

fitase

anorganik yang dibebaskan pada kondisi

suhu dianalisis

dan

pH

fitase,

secara

deskriptif

optimum selama 1 menit.

kualitatif. Data yang diperoleh. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dari sampel air diperoleh 104 koloni bakteri, sedangkan isolasi dari sampel

lumpur

diperoleh

30

koloni

bakteri. Dilihat secara morfologi, ada tipe koloni bakteri yang memiliki permukaan Gambar 1. Diagram batang hasil uji aktivitas

mengkilat dan tampak licin, permukaan

fitase dari 3 isolat tertinggi.

tidak mengkilat, tepi rata halus, tepi 38


Aktivitas fitase dari ketiga isolat ini


memiliki suhu optimum 41ºC (Yuanita et

masih lebih tinggi daripada fitase Bacillus

al., 2010).

cereus RW Sm A 0,1071 U/ml, fitase B.

Isolat EN 10 menghasilkan aktivitas

aryabhattai RW Sm C 0,102 U/ml, fitase

fitase yang optimal pada pH 4, sedangkan

B.

U/ml

isolat EN 16 dan EN 6 menghasilkan

(Wulandari, 2011), fitase Bacillus sp AP-17

aktivitas fitase yang optimal pada pH 6.

0,0296 U/ml (Kusumadjaja, 2009), fitase

Hasil ini berbeda dengan yang dinyatakan

B. subtilis 0,044 U/ml (Shimizu, 1992),

oleh Keruovo (2000) bahwa pH optimum

fitase B. subtilis HG 0,283 U/ml (Yuanita

untuk bakteri penghasil fitase, khususnya

et al., 2010), dan fitase Bacillus sp. KHU-

yang

10 0,2 U/ml (Choi et al., 2001), namun

mamiliki pH optimum antara 6,5 sampai

lebih rendah daripada fitase B. cereus

7,5. B. subtilis HG memiliki pH optimum

ASUIA260 1,160 U/ml (Shobirin et al.,

antara

2009). Artinya bahwa isolat EN 10, EN 16

Bacillus sp KHU-10 memiliki pH optimum

dan EN 6 memiliki kemampuan meng-

antara 6-8 (Choi et al., 2001), sedangkan

hasilkan enzim fitase yang dapat di-

B. amyloliquefaciens DS11 memiliki pH

manfaatkan sebagai sumber penghasil

optimum antara 7-8 (Kim et al., 1998). pH

enzim fitase yang baru.

sangat berpengaruh terhadap aktivitas

cereus

RW

Sl

5

0,0874

Suhu optimum untuk enzim fitase

berasal

enzim

6,5–7

karena

dari

kelompok

(Yuanita

et

Bacillus

al.,

perubahan

2010),

pH

dapat

hasil dari isolat EN 10 dan EN 6 adalah

menyebabkan perubahan muatan pada

60ºC, sedangkan suhu optimum untuk

residu

enzim fitase hasil dari isolat EN 16

menyusun pusat aktif enzim, sehingga

adalah 50ºC. Suhu optimum fitase dari

akan

ketiga isolat ini lebih rendah bila di-

konformasi enzim, daya katalitik, dan

bandingkan dengan fitase yang dihasil-

efisiensi

kan oleh Bacillus sp. strain DS11 yang

(Nelson dan Cox, 2000).

memiliki suhu optimum 70ºC (Kim et al., 1998),

dan

memiliki

Bacillus suhu

(Kusumadjaja,

sp

AP-17

optimum

2009);

sama

asam

amino,

berpengaruh pengikatan

terutama pula

yang

terhadap

substrat-enzim

Setelah mencapai aktivitas optimum,

yang

ketiga isolat akan mengalami penurunan

75ºC

aktivitas fitase. Isolat EN 10 mengalami

dengan

penurunan

aktivitas

fitase

menjadi

Bacillus sp KHU-10 dan B. subtilis CH92

88,98% setelah dipanaskan selama 1 jam

yang memiliki suhu optimum 60ºC (Choi

dan aktivitasnya menjadi 36,83% setelah

et al., 2001; Hong et al., 2010); namun

dipanaskan selama 5 jam. Isolat EN 16

lebih tinggi bila dibandingkan dengan

mengalami penurunan aktivitas fitase

fitase yang dihasilkan oleh B. cereus RW

menjadi

Sm A yang memiliki suhu optimum 40ºC

selama 1 jam dan aktivitasnya menjadi

(Wulandari, 2010), dan B. subtilis HG yang

29,11% setelah dipanaskan selama 5 jam. 39

83,08%

setelah

dipanaskan


Isolat

EN

6

mengalami

penurunan


731bp, isolat EN 16 menghasilkan 717bp,

aktivitas fitase menjadi 89,84% setelah

dan isolat EN 6 menghasilkan 709bp.

dipanaskan selama 1 jam dan aktivitasnya menjadi 27,80% setelah dipanaskan selama 5 jam.

EN 6 EN 10 EN 16

2000 bp 1500 bp 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp

Ketiga isolat mengalami kenaikan aktivitas karena adanya penambahan ion Ca2+. Ion Mg2+ juga dapat meningkatkan aktivitas fitase, namun peningkatanya lebih sedikit bila dibandingkan dengan ion Ca2+. Penambahan ion Zn2+ dapat

Gambar 2. Foto pita DNA hasil elektroforesis

menurunkan aktivitas fitase dari ketiga

setelah di PCR.

isolat, namun penambahan ion Fe2+ hanya

Sekuens

dapat menurunkan aktivitas fitase pada morfologi

dari

sederhana,

bakteri

homologi

bulat

isolat terpilih dengan sekuens yang ada pada

berwarna

Sekuens

tunggal DNA yang berukuran sekitar

kemudian

700bp. Produk PCR tersebut kemudian

dengan

mendapatkan

dari

ketiga

dibandingkan sekuens

DNA

isolat

ini

kemiripannya dari

bakteri

(no. akses JQ740157.1); B. subtilis strain

program Peak Trace untuk memperbaiki kemudian

DNA

yaitu: fitase B. amiloliquefasciens AP-17

DNA kemudian dimasukkan ke dalam DNA,

bahwa

penghasil fitase yang lain dari gen bank,

susunan basa DNAnya. Susunan basa

sekuens

menunjukkan

EN 6 adalah jenis bakteri Bacillus sp.

Hasil PCR menunjukkan satu pita

kualitas

bank

bakteri Bacillus cereus, sedangkan isolat

5m.

untuk

gen

isolat EN 10 dan EN 16 adalah jenis

putih. Ukuran panjang bakteri antara 2-

disekuensing

bakteri

Berdasarkan hasil kemiripan sekuens

dengan warna ungu, dan memiliki banyak berbentuk

spesies

BLAST dari NCBI.

termasuk

bakteri gram positif, yang ditunjukkan endospora

dengan

tertentu, dengan menggunakan program

pewarnaan

tersebut

isolat

bank NCBI, untuk mencari kemiripan/

bahwa semua isolat sel bakteri berbentuk Berdasarkan

ketiga

sekuens DNA yang terdapat pada gen

sel

bakteri penghasil fitase menunjukkan basil/batang.

dari

tersebut kemudian dibandingkan dengan

isolat EN 6 dan EN 16. Pengamatan

DNA

CF92 (no. akses HQ127622.1); B.cereus

di

(no. akses JQ993365.1); Bacillus sp. 1052

alignment untuk mendapatkan sekuens

(no. akses JX566534.1); B. aryabhattai RW

yang utuh dengan menggunakan program

SM C dan B. cereus RW SM A (Wulandari

Bioedit. Sekuens yang dihasilkan oleh 3

2011). Kumpulan sekuens tersebut di

isolat yaitu: isolat EN 10 menghasilkan 40



sejajarkan dengan cara multiple sequen

Fitase Bacillus

alignment.

Hasil identifikasi bakteri menunjukkan

Kumpulan sekuens yang telah di

bahwa

ketiga

isolat

yang

memiliki

alignment kemudian dibuat konstruksi

aktivitas fitase tertinggi adalah Bacillus

pohon filogenetik untuk menunjukkan

cereus EN 10, B. cereus EN 16, dan

hubungan kekerabatan antara fitase yang

Bacillus sp. EN 6. Ketiga bakteri tersebut

dihasilkan dalam penelitian ini dengan

memiliki genus yang sama yaitu Bacillus.

fitase dari spsesies Bacillus yang lain

Fitase yang berasal dari kelompok bakteri

(Gambar 3). B. cereus EN 10 dan EN 16

Bacillus

secara homologi memiliki kemiripan yang

Alkalin β-Propeler. Alkaline ß-propeller

besar dengan Bacillus sp 1052 (no. akses

phytase (BPP) merupakan metalo enzim

JX566534.1) dan B. cereus (no. akses

dengan dua sisi pengikat kalsium yang

JQ993365.1),

berbeda (3 sisi pengikatan ion kalsium

filogenetik

dan juga

berdasarkan memiliki

pohon

hubungan

dengan

merupakan

afinitas

kelompok

tinggi

dan

fitase

3

sisi

kekerabatan yang dekat pula. B. cereus

pengikatan ion kalsium dengan afinitas

EN 10 dan EN 16 memiliki hubungan

rendah),

kekerabatan yang dekat dengan B. cereus

bedaan bentuk hidrolisis fitase.

sehingga

menyebabkan

per-

RW SM A yang juga merupakan bakteri

Struktur fitase β-propeller terdiri dari

penghasil fitase, dan ketiga bakteri dari

lembaran β pada 6 bilah yang tersusun

penelitian ini (B.cereus EN 10, B. cereus

seperti

EN 16, dan Bacillus sp EN 6) juga masih

sempit dan sangat bermuatan negatif di

memiliki kekerabatan yang dekat dengan

bagian atas molekul enzim (Gambar 4).

B. alimoliquefasciens AP-17 dan B. subtilis

Setiap

CF92, tetapi berkerabat jauh dengan B.

propeller terdiri dari 4-5 strand β anti

aryabhattai

parallel. Strand keempat dari setiap bilah

RW

SM

C

yang

juga

merupakan bakteri penghasil fitase.

baling-baling

bilah

dari

dengan

molekul

belahan

fitase

β-

dihubungkan dengan strand pertama dari bilah berikutnya yang bersilangan dengan ujung atas molekul enzim. Bilah keenam terletak sepanjang poros pusat propeller, merupakan sebuah saluran pusat yang terisi dengan molekul-molekul air yang terikat erat. Bilah keenam ini terdiri dari strain 1β dari akhir ujung-N dan strain 3β dari

akhir

ujung-C

menggabungkan

Gambar 3. Pohon filogenetik dari B. cereus EN

dua

molekul

protein,

ujung

molekul

10, B. cereus EN 16, Bacillus sp. EN 6 dan

enzim, dan menjaga stabilitas enzim.

beberapa jenis Bacillus lain penghasil fitase.

Strain β ekstra pada ujung-N dari molekul 41



protein menghubungkan bilah keenam

jenis Bacillus menunjukkan bahwa fitase

dan

yang dihasilkan oleh Bacillus memiliki

kelima,

terhadap

yang

juga

stabilitas

berkontribusi

enzim.

Ini

juga

kisaran suhu optimum dan pH optimum

disebut dengan struktur “jepitan ganda”

yang luas, yaitu dengan suhu optimum

bersama dengan 3 ion kalsium pada sisi

antara 40-75ºC, dan pH optimum antara

pengikat kalsium yang memiliki afinitas

4-8 (Tabel 1).

tinggi, yang bertanggung jawab pada termostabilitas propeller

tinggi

Bacillus

pada

fitase

Kelompok bakteri Bacillus merupakan

β-

mikroorganisme

yang

disebut

amyloliquefaciens

sebagai GRAS “generally recognized as

DS11. Tiga pengikat ion kalsium yang

safe” oleh American Food and Drug

berafinitas rendah yang ditemukan untuk

Administration karena mikroorganisme

berkoordinasi di dalam sisi aktif TS-phy

ini

dari fitase B. amyloliquefaciens DS11,

suplemen pangan yang aman (Hong et al.,

bersama dengan rantaian sisi di sekitar

2011). Fitase dari kelompok Bacillus ini

asam amino, memiliki sebuah fungsi

sangat

katalis (Ha et al., 2000).

suplemen pakan ternak karena memiliki

digunakan

cocok

secara

luas

sebagai

dimanfaatkan

pada

suhu optimum yang tinggi sehingga tidak mudah

terdenaturasi

selama

proses

pengolahan. Adanya penambahan fitase pada pakan ternak dapat meningkatkan kecernaan fosfat dan menurunkan polusi fosfat pada area sekitar peternakan. Tabel 1. Suhu optimum dan pH optimum dari beberapa spesies Bacillus. Suhu optimum 60ºC 60ºC 50ºC

pH optimum 6 4 6

60ºC

6

50ºC

5

B. cereus RW SL 5

50ºC

5

Bacillus sp

55ºC

4,5 - 6

yang berbeda-beda, begitu pula dengan

Bacillus sp KHU-10

60ºC

6–8

karakteristik enzim fitase. Fitase dari

B. Amyloliquefaciens DS11 B. subtilis N-77 B. subtilis CF92

70ºC

7–8

60ºC 60ºC

6 – 6,5 7

B. subtilis HG

41ºC

6,5 - 7

B. subtilis AP-17

75ºC

6

Spesies Bacillus sp EN 6 Bacillus sp EN 10 Bacillus cereus EN 16 B.aryabhattai RW SM C B. cereus RW SM A

Gambar 4. Skema struktur fitase β propeller (Ha et al., 2000)

Setiap individu memiliki karakteristik

kelompok Bacillus memiliki karakteristik suhu optimum dan pH optimum yang berbeda-beda. Dari data suhu optimum dan pH optimum fitase dari beberapa 42

Pustaka Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini Wulandari, 2011 Wulandari, 2011 Wulandari, 2011 Pandey et al., 2001 Choi et al., 2001 Kim et al., 1998 Shimizu, 1992 Hong et al., 2011 Yuanita et al., 2010 Kusumadjaja, 2009


KESIMPULAN

Ha, N.C, Oh B.C, Shin S, Kim H.J, Oh T.K, et al. 2000. Crystal structures of a novel, thermostable phytase in partially and fully calcium-loaded states. Nat Struct Biol 7: 147-153. Hong, S.W, In H.C, Kun S.C. 2011. Purification and Biochemical Characterization of Thermostable Phytase from Newly Isolated Bacillus subtilis CF92. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 54 (1): 89-94. Irving, G.C.J and D.J. Cosgrove. 1972. Inositol Phosphate Phosphatases of Microbiological Origin: the Inositol Pentaphosphate Products of Aspergillus ficuum Phytases. J.Bacteriol 112 (1) : 434-438. Kerovuo, J. 2000. A novel phytase from Bacillus: Characterization and production of the enzyme, Ph.D dissertation, Univ. Helsinki, Finland Kim, O.H, Kim Y.O, Shim J.H, Jung Y.S, Jung W.J, Choi W.C, Lee H, Lee S.J, Auh J.H and Kim K.K. 2010. βPropeller phytase hydrolyzes insoluble Ca2+-phytate salts and completely abrogates the ability of phytate to chelate metal ions. J.Biochemistry 49: 10216–10217. Kusumadjaja, A.P. 2009. Skrening dan Karakterisasi Enzim Fitase Termofilik Hasil Isolasi dari Bakteri Kawah Ijen Banyuwangi. Laporan Hibah Penelitian Program Doktor Universitas Airlangga. Liu, J., D.R. Ledoux and T.L. Veum. 1997. In vitro procedure for predicting the enzymatic dephosphorylation of phytate in corn-soybean meal diets for growing swine. J. Agric. Food Chem. 45: 2612-2617 Marlinda, Y. 2001. Isolation and Purification of Raw Starch Degrading Enzyme from Acremonium endophytic Fungus and Its Aplication for Glucosa Production. Dissertation of Doctoral at University Putra Malaysia. Malaysia. Mullaney, E.J. and A.H.J. Ullah. 2003. The term phytase comprises several different classes of enzymes. Biochem Biophys Res Comm 312: 179-184.

Isolat bakteri yang berasal dari air kawah Sikidang Dieng memiliki potensi sebagai sumber

enzim

Fitase,

yaitu


dari

kelompok bakteri Bacillus. Jenis dari bakteri tersebut adalah Bacillus cereus EN 10, Bacillus cereus EN 16, dan Bacillus sp. EN 6. Karakterisasi bakteri penghasil enzim Fitase dari air kawah Sikidang Dieng yang memiliki 3 aktivitas Fitase terbesar yaitu: 1. Bacillus sp EN 10 dengan aktivitas sebesar 0,32893 U/ml, memiliki suhu optimum 60ºC, memiliki pH optimum 4, aktivitas Fitase dapat ditingkatkan dengan penambahan ion Ca2+ dan Mg2+, dan dihambat oleh ion Zn2+. 2. Bacillus cereus EN 16 dengan aktivitas sebesar 0,324953 U/ml, memiliki suhu optimum 50ºC, memiliki pH optimum 6, aktivitas Fitase dapat ditingkatkan dengan penambahan ion Ca2+ dan Mg2+, dan dihambat oleh ion Zn2+ dan Fe2+. 3. Bacillus sp EN 6 dengan aktivitas sebesar 0,32182 U/ml, memiliki suhu optimum 60ºC, memiliki pH optimum 6, aktivitas Fitase dapat ditingkatkan dengan penambahan ion Ca2+ dan Mg2+, dan dihambat oleh ion Zn2+ dan Fe2+. DAFTAR PUSTAKA Choi, Y.M, Hyung J.S, Jin M.K. 2001. Purification and Properties of Extracellular Phytase from Bacillus sp. KHU-10. Journal of Protein Chemistry 20 (4): 287-292.

43


Nelson, D.L. and M.M. Cox. 2000. Lehninger Prinsiples of Biochemistry. 3rd edition. Wort Pub: New York. Rosmimik, Widowati S. Andriani U, Indarwati S. Damardjati US. 1998. Skrining bakteri penghasil fitase dan pengujian aktivitasnya pada media PSM dan bekatul. Prosiding Temu Ilmiah Bioleknologi Pertanian. Bogor, 26 Mar 1998. hlm 43-48. Sajidan, A. farouk, R. Greiner, P. Jungblut, E.C. Muller, R. Borriss. 2004. Molecular and physiological characterization of a 3-phytase from soil bacterium Klebsiella sp ASR1. Appl Microbiol Biotechnol. 65 (1):110-118. Shimizu, M. 1992. Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (natto) N-77. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56, 1266-1269. Syahbirin G, Syatria A. Ambarsani L, Widowati S. 2000. Optimasi dan karakterisasi enzim fitase dan Bacillus coagulans. Di dalam: Mikrobiologi, Enzim, dan Bioleknologi dalam Perspekuf Ekonomi dan Industri. Prosiding Seminar Naslonal Industri dan Bioteknologi. Jakarta, 15-16 Feb 2000. hlm 361-369. Vieille, C., and G.J. Zeikus. 2001. Hyperthermophilic Enzymes: Sources, Uses, and Molecular Mechanisms for Thermostability. Microbio and Molecular Bio 64 (1): 143. Wulandari, R. 2011. Analisis Gen 16S rRNA pada Bakteri Penghasil Enzim Fitase. Tesis Universitas Sebelas Maret Surakarta. Yuanita, L., Aline P., Suzana S., Sri H., Farid A.A., dan Arif B. 2010. Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Fitase Bacillus subtilis dari Holiwood Gresik. Berk. Penel. Hayati 15:113119.

44


IDENTIFIKASI BAKTERI PENGHASIL FITASE DAN KARAKTERISASI FITASE DARI KAWAH SIKIDANG DIENG. Mahasiswa Prodi Biosain Pascasarjana UNS

Recommend Documents