Semmelweis Egyetem, Gyógyszerészi Kémiai Intézet „Műszeres gyógyszeranalízis” speciálkollégium (2013)
Kapilláris elektroforézis a gyógyszeranalízisben I. dr. Szakács Zoltán Richter Gedeon Nyrt. Fizikai-kémiai alapok, a CE berendezés felépítése Ionok elválasztására alkalmas CE módszerek Semleges molekulák elválasztására alkalmas technikák Biopolimerek és -oligomerek elválasztására alkalmas technikák Királis analízis Kapilláris elektroforézis a gyógyszerkönyvben
I. A kapilláris elektroforézis fizikai alapjai
grafika: microfluidics.technion.ac.il
3.
Elektroforézis, ionvándorlás (migráció)
Anód Katód • Elektroforézis: különböző ionok eltérő irányú v. sebességű elmozdulása, vándorlása (transzportja) folyadékban (vizes pufferben) elektromos tér hatására • Elektromos erő gyorsítja,
a közegellenállás („súrlódás”) lassítja az iont: 0 F s =k⋅η⋅v
U F e=q⋅E= ze 0⋅ l
: az oldat dinamikai viszkozitása (cP: 10-3 Pa s) q : az ion töltése [C] v0: ion vándorlási sebessége [cm s1] z : az ion (előjeles) töltésszáma e0 = 1,6·1019 C az elemi töltés Stokes törvény (merev gömb, híg oldatban) 1 E : elektromos térerősség [V cm ] rH: az ion hidrodinamikai sugara [cm] U : elektr.potenciálkülönbség [V] H l: elektródok távolsága [cm] 0 Ellentétes irányú erők egyensúlya: q⋅E=6π⋅η⋅r H⋅v
k =6π⋅r
Az ion vándorlási sebessége:
4.
v 0=
e0
z 1 ⋅ ⋅ ⋅E 6π r H η
[cm s1]
Ionok abszolút elektroforetikus mozgékonysága
• Abszolút elektroforetikus mozgékonyság (mobilitás): v0 e z 1 μ0 = = 0 ⋅ ⋅ [cm2 V1 s1] E 6π r H η • Az ionra jellemző, egyedi fizikai „állandó” (adott oldószerben és hőmérsékleten: hőmérsékletfüggése: 2-3% / °C !!) • Arányos az ion fajlagos töltésével (z / rH) • Végtelen híg oldatra extrapolált érték diffúziós együtth. (Nernst-Einstein)
0
RT μ D= ⋅∣ ∣ F z
[cm2 s1]
[S cm2 mol1]
krist. r ion / Å
rH / Å
μ 0 / 10-5 cm 2 V-1 s-1
0,76 1,02 1,38 1,45
3,40 2,76 2,32 1,88
362,5 40,1 51,9 76,2 76,2
+
H + Li Na+ + K NH4+ Rb + Cs+ + (C3H7)4N 2+
ion moláris fajlagos vezetése:
λ 0=∣z∣⋅F⋅μ0
Kation
Mg Ca2+ 2+ Sr Ba2+ 2+ Fe 2+ Cu Ag+ 2+ Pb 3+ Al
1,52 1,67 0,72 1,00 1,18 1,35 0,61 0,73 1,15 1,19 0,54
80,6 80,1 23,8 3,45 3,08 3,08 2,88
4,39
55,0 61,7 61,6 66,0 56,0 55,6 64,5 72,0 63,2
5.
Az ion effektív elektroforetikus mozgékonysága
• A valóságban nem végtelenül híg pufferoldatban dolgozunk elektrosztatikus kcsh. ellenionok felhője (az ionatmoszféra) leárnyékolja az ion töltését, lassítja migrációját
κ= ionatmoszféra „sugara”:
F⋅√ 2I ε RT
r
δ = κ−1
(ld. elektrokémia: Debye, Hückel, Onsager elmélete) pl. I = 0,1 mM I = 10 mM
•
δ = 30 nm δ = 3 nm
δ = κ−1
Effektív elektroforetikus mozgékonyság (ep vagy eff alsó indexszel is szerepel)
μ=
e 0 Q eff 1 ⋅ ⋅ 6π r eff η
[cm2·V1·s1]
reff r + : effektív ionsugár [cm] Qeff : az ion effektív töltése z : az ion (előjeles) töltésszáma e0 = 1,6·1019 C az elemi töltés E : elektromos térerősség [V·cm1] U : elektr.potenciálkülönbség [V]
- az ionra jellemző empirikus adat, az adott pufferoldatban mérhető mennyiség - becslésére léteznek félempirikus összefüggések (lásd Offord képlet később...)
6.
Az effektív mozgékonyság változtatásának alapelvei
• Nem hidrolizáló anionok (pl. Cl-) és kationok (pl. Na+): töltés / méret arány kismértékben változtatható a puffer ionerősségével
• Gyenge savak anionjai (pl. acetát), gyenge bázisok kationjai (pl. ammóniumion): a pufferoldat pH-jával igen érzékenyen változtatható, akár meg is szüntethető a töltés a disszociáció gyors a migráció időskáláján, ezért a látszólagos (apparent) mozgékonyság a részecskék egyedi járulékainak átlaga (Tiselius, 1930) • Komplexképzéssel az ion mérete is, töltése is jelentősen változhat, ez a folyamat általában gyors a CE időskálán (átlagolt effektív mozgékonyság) de kinetikailag inert komplexek külön zónákban vándorolnak (egymástól is elválaszthatók)
7.
Az elektroforézis története dióhéjban
• 1850-1900.
Hittorf, Kohlrausch, Hardy: fizikai-kémiai alapok (elektrolitok vezetése, átviteli szám, mozgó határfelület)
• 1920-1940. 1948.
Svedberg, Tiselius: moving boundary electrophoresis of proteins Tiselius: Nobel-díj (részben az elektroforézisért)
• 1950-
papírelektroforézis, „makroméretű” lap gélelektroforézis (fehérjék, nukleinsavak)
• 1981. 1983. 1984. 1985. 1991. 1991.
Jörgenson, Lukacs Hjertén, majd Karger Terabe Hjertén Knox, Grant Watarai
kapilláris zóna elektroforézis (CZE) fused silica kapilláris kapilláris gél elektroforézis (CGE) micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) kapilláris elektrokromatográfia (CEC) mikroemulziós elektrokinetikus kromatográfia (MEEKC)
• 1990- kereskedelmi CE készülékek & újabb és újabb detektorok fejlesztése CE rohamos elterjedése, alkalmazások százai, külön folyóiratok, konferenciák • 1999- kereskedelmi mikrochip CE készülékek (mikrofluidika, „lab-on-a-chip”)
8.
Gél lap elektroforézis (SDS-PAGE)
• Na-dodecil-szulfát jelenlétében poliakrilamid gél elektroforézis fehérjék preparatív (ng - g) elválasztására • Denaturált fehérjét a DS anionok „beburkolják” (kifelé negatív töltésű polipeptidlánc), méret szerinti elválasztás a gél pórusaiban
www.clinicalmolecularallergy.com
9.
Joule-hő, konvekció
1825-27. Ohm-törvény 1841. Joule I. törvénye: áramvezetés során hő termelődik: NR: nem redukáló, R: redukáló körülmények között
térfogat:
20 – 80 ml
felület:
200 - 800 cm2
Elfo idő:
55min 3,5h 3,5h
rekombináns heterodimer glikoprotein denaturálódása, bomlása
Joule-hő: 150 V * 30 mA = 5 W térerősség: 10 - 20 V cm
A nem megfelelő hőelvezetés hőmérséklet- és sűrűséggradienshez, konvekcióhoz, a szétválasztott zónák elmosódásához, keveredéséhez vezethet www.dddmag.com/protein-electrophoresis-method.aspx
10.
Elektroforézis kapillárisban: hatékonyabb hődisszipáció
• Virtanen (1969), Everaerts (1970), Jorgenson & Lukacs (1981) • üres olvasztott kvarc (bare fused silica) kapilláris
fused silica
térfogat:
2 – 8 l
jóval nagyobb ellenállás
felület:
0,4 - 3 cm2 hatékonyabb hőelvezetés
Joule-hő: 30 kV * 50 A = 1,5 W térerősség: 200 – 600 V cm Ltot = 25 – 100 cm poliimid bevonat (15 m) – hajlékony, flexibilis 25 – 75 m Inner Diameter 300 – 400 m Outer Diameter
• jobb felület / térfogat arány nagyobb feszültség használata (kis térfogat) nagyobb térerősség gyorsabb, élesebb (nagyobb hatékonyságú) elválasztások
11.
Töltött kapillárisfal elektroozmotikus áramlás (EOF) δ=κ−1 x + +
+ N
+
+
+
+
+
SiO + H+
• diffúz elektrokémiai kettősréteg: elmozdulhat ellenion konc.gradiens tömbfázisbeli értékig
+ +
+
• Gouy-Chapman réteg (külső határa a zeta-potenciál, ) az ellenionok dominálnak
+
N
SiOH
• Stern réteg (St): merev, erősen adszorbeált ellenionokból
+
+
• felületi neg. töltés(0):
kettősréteg „vastagsága” (Debye-length): +
• Helmholtz-Smoluchowski egyenlet (1903):
+ N
κ−1 ≃3,3/ √ I
μeo =−
0 St potenciál
εζ 4 πη
−κ⋅x
ψ=ψ St e
• Elektroozmózis: a diffúz réteg ellenionjai „magukkal ragadják” az oldat egészét (electroosmotic flow) és makroszkopikus oldatáramlást hoznak létre a kapillárisban (EOF) (negatívan töltött szilikafelület esetén katódos EOF)
anód
12.
+
v eo=μ eo⋅E
+
katód
EOF: dugószerű áramlási profil
HPLC: nyomás hajtotta eluensáramlás
detektorjel
+
HPLC
CE: elektrokinetikusan hajtott oldatáramlás
CE: szűkebb zónák, éles csúcsok, ez a nagy hatékonyság egyik oka
retenciós idő
migrációs idő
13.
Az EOF sebességének szabályozása a puffer pH-jával SiOH
• a zeta-potenciál pH-függő:
SiO + H+
pKa ~ 3 - 5
eo [10-5 cm2 V1 s1]
v eo=μ eo⋅E
60
fused silica
veo = 2 mm s1
50
500 nl min1
40
pyrex
(egy adott kapillárisban)
30
20
teflon
veo = 0,2 mm s1 50 nl min1
10
0 2
3
4
5
6
7
8
9
10
pH
14.
Az EOF szabályozásának további lehetőségei
v eo=μ eo⋅E=−
εζ ⋅E 4 πη
Változó
Eredmény
Megjegyzés
Elektr. térerősség
EOF arányosan változik
Joule-hőfejl. megnőhet
Puffer ionerőssége (koncentrációja)
Növelésével csökken a zeta-potenciál és az EOF
Növelésével nő az áramerősség és a Joule-hő
Szerves oldószerkomponens
Csökkenti a zeta-potenciált és az EOF-et
Komplex hatása van
Tenzid hozzáadása
Adszorbeálódik a kap.falra hidrofób vagy ionos kcsh.-sal
Anionos tenzid: EOF nő Kationos tenzid: EOF csökken szelektivitás!
Semleges hidrofil polimer hozzáadása
Adszorbeálódik a kap.falra hidrofób kölcsönhatással
Felületi töltés árnyékolásával csökkenti EOF-et, növeli a viszkozitást
Semleges polimer hozzáadása
Növeli a viszkozitást a kapillárisfalnál
pl. polivinilalkohol
Kovalens borítás
A kapillárisfal kémiai bevonata
Sokféle lehetőség, stabilitás?
Hőmérséklet
Viszkozitás érzékenyen változik 2-3% / °C
Könnyű kontrollálni
15.
A kapilláris elektroforézis (CE) készülék felépítése, működése
detektor
termosztát egység
kapilláris Pt-Ir elektród +/- 30 kV
minta
nagyfeszültségű tápegység Pt-Ir elektród 0V
kimeneti (outlet) puffer
bemeneti (inlet) puffer
www.scitopics.com/Capillary_Electrophoresis.html
16.
Kereskedelmi CE készülékek
www.spectralabsci.com/images/HP-3D-CE-G1600AX.jpg http://www.dddmag.com/uploadedImages/Articles/2011_06/CESI8000.jpg
17.
A CE általános jellemzői
miniatürizált („microscale”) elválasztástechnika, anyagtakarékos ! vizes pufferoldatok (környezetbarát), UV átlátszóság (190-210 nm: érzékenység!) nincs külön detektorcella, „on-column” detektálás (kivétel: kapcsolt technikák) HPLC-nél több paraméter, gyorsabb, flexibilisebb módszerfejlesztés gyors analízis (mikrochipen még gyorsabb), kitűnő elválasztás nagyfokú automatizáltság, sorozatanalízisek lehetősége ugyanazon a készüléken több elválasztási módszer megvalósítható: töltettel, hordozóval segített
töltetlen kapillárisban
CZE CITP ionok elválasztására
MEKC
CD-EKC CIEF
CGE
biomakromolekulák, oligomerjeik elválasztására
MEEKC CEC semleges molekulák elválasztására
II. Ionok elválasztására alkalmas módszerek
19.
Kapilláris zóna elektroforézis Capillary Zone Electrophoresis (CZE) Kationok és anionok elválasztása effektív mozgékonyságuk különbsége alapján (semleges molekulák elválasztására nem alkalmas)
a legtöbb ionra:
∣μ∣<μeo
grafika: Agilent
20.
detektorjel
Kationok és anionok teljes mozgékonysága: elektroforetikus + EOF szuperpozíciója
elektroferogram
„electroosmotic hold-up time”: teo
tm : az ion migrációs ideje
v tot =v ep +v eo =Leff /t m
v eo= Leff /t eo
E=U / L tot
μeo =
v eo E
=
idő
Leff Ltot
μ tot =μ+ μ eo=
t eo U
Leff L tot Ut m
+
Leff Ltot Ut eo
az ion (kísérleti) elektroforetikus mozgékonysága:
Leff: kapillárishossz injektálástól a detektorig [cm] Ltot: kapilláris teljes hossza = elektródok távolsága [cm]
μ=
L eff L tot U
(
⋅
1 1 − t m t eo
)
[cm2 V s]
IUPAC terminológia: Pure Appl. Chem. 2004, 76: 443-451.
21.
„Mintadugó” injektálása a kapillárisba - alapelvek
• Hidrodinamikus inj. +p
• Vákuum inj.
vagy
p
minta
kimeneti puffer
• Gravitációs inj. („siphoning”)
minta
h
kimeneti puffer
• Elektrokinetikus inj. +
-
U minta
22.
kimeneti puffer
Hidrodinamikus injektálás +p
minta
• injektált mintatérfogat: p nyomáskülönbség [Pa] t
injektálás ideje [s]
Hagen-Poiseuille egyenlet:
103 π d 4 V inj = ⋅ ⋅Δp⋅t 128 Ltot η d Ltot
[ml]
kapilláris belső átmérője [cm] kapilláris teljes hossza [cm] minta viszkozitása [cP = 103 Pa s]
• a leggyakrabban használt injektálási mód, a minta ionjaira nem diszkriminatív • kapilláris gélelektroforézisben és mikrochipen nem használható • pl. egy d = 75 m, Ltot = 80 cm kapilláris teljes térfogata: hidrodinamikus injektálás 30 mbar 10 s az injektált mintadugó hossza:
3,5 l 33 nl 16 mm (2%)
3-4%-nál hosszabb mintadugó injektálása már csúcsdiszperziót okozhat: inj • 33 nl injektálás 1 mM oldatból: 33 pmol ha Mt = 100: 3,3 ng
23.
Kvantitatív analízis belső standard módszerrel
• CZE-ben a zónák különböző sebességgel haladnak át a detektoron csúcsterület normálása: A’ = A / tm • a nanoliteres hidrodinamikai injektálás ismételhetősége a kapilláris elektroforézis módszerek validálásának egyik gyenge pontja belső standard (IS) hozzáadásával kiküszöbölhető 160 140
kalibráló oldatokra mért adatpontok
A’x / A’IS
120 100 80
ismeretlen mintára kapott relatív csúcsterület és koncentráció leolvasása
60 40 20 0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
koncentrációx
24.
Elektrokinetikus injektálás
• injektált „x” anyagmennyisége:
nx =
d: kapilláris belső átmérője [cm] U: injektálási feszültség [V] eo: EOF mozgékonyság a pufferben [cm2/Vs] BGE: a puffer vezetőképessége [S/cm]
κ d 2 π Ut ( μ eo + BGE μ x )⋅c x 4L tot κ minta
kimeneti puffer [mmol]
Ltot: kapilláris teljes hossza [cm] t: injektálás ideje [s] x: x effektív mozgékonysága [cm2/Vs] minta: a minta vezetőképessége [S/cm] cx : x koncentrációja a mintában [mol/dm3]
• igen érzékeny injektálási mód (field-amplification, ld. sample stacking) • kapilláris gélelektroforézisben ez az általános • mátrix torzítás (minta) • diszkriminatív injektálás (minden ionra más)
nehéz a kvantifikálás (speciális külső v. belső standard kell)
Külső standard módszer nyomanalízisre híg mintákból: A Gáspár, L Gábor, J. Chromat. A 2005, 1091, 163-168. Univerzális belső standard kalibrálás: A Gáspár, E Dudás, J. Chromat. A 2006, 1110, 254-260.
25.
A legfontosabb CE detektorok Detektálási
Kimutatási határ
módszer
koncentráció (mol / dm ) -8
10
-13
- 10
-16
! kromofór csoport kell (>190 nm) vagy származékképzés + DAD: korlátozott szerkezeti info
-7
-9
10
-15
- 10
-17
! fluorofór csoport kell, leggyakrabban származékképzés
-16
10
-18
- 10
-20
! fluorofór csoport kell, leggyakrabban származékképzés - drága
-11
10
-18
- 10
-19
! elektroaktív csoport kell ! speciális hardver, kapilláris kell
-9
10
-15
- 10
-16
+ univerzális ! speciális hardver, kapilláris kell
10 - 10
Fluoreszcencia
10 - 10
Lézer-indukált fluorszcencia (LIF)
10
-14
- 10
Amperometria
10
-10
- 10
Indirekt UV, fluoreszcencia, amperometria Kapcsolt technikák
Előnyök / hátrányok
abszolút (mol)
-5
UV-látható fényelnyelés
-7
10 - 10
Vezetőképesség
10-100x rosszabb, mint a direkt
+ univerzális
(hyphenated techniques)
Tömegspektrometria (ESI-MS) Mágneses magrez. spektroszkópia (NMR)
26.
Kimutatási határ 3
-8
-9
10 - 10
kb. 10-4 - 10-6
10
-16
- 10
-17
10-12 - 10-14
+ univerzális n + szerkezeti információt nyújt (MS ) - drága, problematikus + legrészletesebb szerkezeti info - csak CH csoportokról - drága, keresked.nem elérhető
Megoldások az UV-érzékenység növelésére
•
UV-detektor érzékenységi korlátja: optikai úthossz = kapilláris átmérője = 25-75 m
•
megnövelt úthosszú kapillárisok (Agilent), minimális csúcsdiszperzió „buborékcella”
3-5 érzékenység
„Z-cella”
8 - 10 érzékenység
képek forrása: Agilent CE brosúrák
27.
A CE nagy felbontása nagy hatékonyságán alapul
• „Ürescső” CE (Free Solution CE, Open Tubular CE) esetén a van Deemter egyenletben:
B HETP= A+ +C⋅u u A=0
mert nincs töltet, amelyben többféle útvonalon (multiple path) vándorolna az elválasztandó komponens
C=0
mert nincs állófázis, amelybe fázistranszfer történhetne
B>0
elvileg a hosszirányú (longitudinális) diffúzió a csúcsszélesedés (diszperzió) egyetlen forrása
• az EOF éles, „dugószerű” profilja is alig szélesíti a csúcsokat
σ tot
a gyakorlatban számos tényező ronthatja a hatékonyságot:
2
2
2
2
2
2
2
σ tot =σ long .diff + σ inj +σ temp +σ wall-ads +σ det + σ EMD +. . . EMD: electromigration dispersion (puffer ko-ion vezetőképessége...)
28. detektorjel
Az elválasztás analitikai paraméterei
σ
w1/2 wA
wB
tA
tB
w 4
• a (Gauss) csúcs std.deviációja:
σ=
• longitudinális diffúzió dominál:
σ 2tot ≃σ 2long . diff =2 Dt=2D
• elméleti tányérszám:
• felbontás:
N=
Rs=
L 2eff σ 2tot
=
idő
Leff Ltot ( μ eo +μ )U
( μ+ μ eo )ULeff t2 =5 . 54 2 2 DL tot w1 /2
2 ( t B −t A ) Δμ⋅√ N Δμ = ∝ w A + wB 4⋅( ̄μ + μeo ) √ μ̄ + μ eo
> 105 is lehet !
29.
A pH-függő átlagos töltés kiszámítása (disszociáció) I.
Q
0
Q zHA xHA z A xA
-0,2 -0,4
pKa
-0,6
Q
-0,8
0 10 pK a pH 1 10 pK a pH 1
-1 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 pH
Ka
[ A ][H ] [ HA]
xA
[A ] 1 [HA] [ A ] 1 10pK pH
1
HA
móltört
0,8 0,6
A
COOH
pKa
0,4 0,2
xHA
0 1
30.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
[HA] 10pK pH [HA] [ A ] 1 10 pK pH
pH
Gyenge savak vagy bázisok elválasztása CZE-vel
• a gyógyszermolekulák legalább 80%-ában van ionizálható funkciós csoport => megfelelő pH-jú pufferben disszociált, ionos állapotba kell hozni őket ! • gyenge bázisok elválasztásakor savas pufferben kapunk kationokat: pl. 20-50 mM foszfát alapú puffer, pH 2-3 • gyenge savak elválasztására lúgos puffert érdemes választani: pl. 15 mM Na2B4O7 * 10 H2O, pH 9-10
+dinamikus komplexképzés vicinális diolokkal, pl. szénhidrátokkal: • ha a disszociált ionok töltésszáma azonos is, különböző méretük alapján mozgékonyságuk (töltés / méret) különböző, így elválaszhatók CZE-vel...
31. 16 16
Karbonsav izotopológok elválasztása Q 0
COOH
pKa 4,190
1 18 18
2
-0,5
pKa 4,199
COOH
r = Ka / Ka = 1,02
Q ( r 1)[ H ]K a1/2 Q ([ H ] K a )3 / 2
Rs
-1 2,7
3,7
4,7
5,7
pH
pH(optimum) = pKa log 2 = 3,90
• Rs maximuma:
• puffer: 50 mM acetát, 0,1% Hidroxipropilcellulóz (EOF elnyomás), elfo +40 kV 87% 100 cm 115 cm 6,0 A
det: 67% Leff 50 cm Ltot 75 cm i 10,5 A
91% 150 cm 165 cm 4,2 A
• 50 m ID FS kapillárisok
Leff Ltot
Rs
S Terabe, et al., Anal. Chem. 1988, 66, 1673-1677.
32.
Q
A pH-függő átlagos töltés kiszámítása (disszociáció) II.
1,0
pK1
0,5 0,0
pI izoelektromos pont
+
NH3
-0,5
C
pK2
O
HO
-1,0
pK3
-1,5 HO
-2,0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
10
11
pH
1,0
móltört
0,8 0,6
pK1
pK2
pK3
0,4 0,2 0,0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
pH
33. Effektív mozgékonyságra (töltés/méret arányra) vonatkozó
néhány félempirikus modell Adott vegyületcsaládra, adott körülmények (puffer, hőmérséklet) között érvényesek ! • 1966. Offord: peptidek papír-zónaelektroforézissel mért mozgékonyságai alapján - a hidratált peptidek modellje: azonos sűrűségű merev gömbök - a súrlódási ellenállás a molekula kör keresztmetszetével arányos
V
Q M 4 3 2 2/3 R R M 1/ 3 A R M becsült k1 2 / 3 3 M
becsült k1
• 1991. Compton:
becsült k 1
• 1994. Cifuentes, Poppe:
k2 M
1/ 3
Q k3 M 2 / 3
ln(1 k2Q ) M 0, 411
Review: S Mittelmayr, A Guttman, Trends Anal Chem 2008, 27, 407.
• 2002. Miller (gyógyszermolekulákra, egyéb aromás szerves ionokra) anionok:
becsült 0,1853
Q
kationok:
n 0, 492
becsült 0,3888
Q M 0,633
J M Miller, et al. Electrophoresis 2002, 23, 2833-41.
34.
Az optimális puffer pH megválasztása a pKa ismeretében +
H3N
pKa
O
HS
OH
becsült
̄/M μapp =Q
1,94 8,60 10,28
Cys 0,02
0
4,19
BzOH
-0,02
S
μ becsült
PTS
eff, MES−
-0,04
OH H3C
←Offord-képlet a mozgékonyság becslésére
0,04
O OH
2/ 3
O
<0
HO
NH2
O
-0,06
-0,08 2
3
4
5
6
7
8
9
Elektromigrációs diszperzió EMD !!
pH
PTS Cys
15 mM HCl
BzOH
PTS
Cys
pH 8,3 puffer: 40 mM TRIS és 15 mM „sav”
10
15 mM MES O S O
N
O
OH
11
μ becsült− eff, Cl
BzOH
1
OH HO
35.
Elektromigrációs diszperzió (EMD)
mintazóna a puffernél: jobban vezet
azonos vezetőképességű
+ -
+ -
-
kisebb vezetőkép.
+
térerősség a „mintadugóban”
katód(-)
detektor
„fronting”
„tailing”
koncentr.profil a „mintadugóban” (elektroferogramon ellentétes irányú torzulás)
kapilláris EOF
injektálás
idő az elektroferogramon
• A puffer ko-ionjának effektív mozgékonysága közelítse a mérendő ionokét, különben azok csúcsalakja háromszög alakú torzulást szenved (minél jobban összemérhető a minta koncentrációja a pufferével, annál inkább jelentkezik ez a torzítás)
A CE-ben leggyakrabban használt pufferkomponensek
O
N H
HO
NH2
-Ala: 10,24
HO
CHES: 9,55
O
TRIS: 8,08
H2N
H3BO3: 9,23 NH4+: 9,25
H2PO4-: 7,21 MES: 6,10
-Ala: 3,43
H3PO4: 2,16
Ecetsav: 4,76
pKa
HEPES: 7,50
36.
O
-
O S
+
OH O
+
NH
HO +
HO
O
S O
N
O
NH2
-
O
S
O -
O
„Good” típusú (biológiai) pufferek: kisebb vezetőképesség, de UV-elnyelés 210 nm-ig !
pH
37.
Fémionok elválasztása (CZE, indirekt detektálás) +
K
+
Na Cd2+ 2 Li+ Pb2+La3+ Sr + 2+ 2+ Ca Mn Co2+Zn2+ Pr3+ Gd3+ 2+ 3+ Ba Mg2+ Ni2+ Ho3+ Sm
Nd3+
Lu3+ ... Yb3+ Tm3+
• BGE: 15 mM tejsav 8 mM 4-metilbenzilamin pH 4,25 5% metanol
Y Shi, JS Fritz, J Chromatogr. 1993, 640, 473.
38.
Mozgékony anionok elválasztása, az EOF szerepe bemeneti puffer (inlet) anód
e
tot
kimeneti puffer (outlet) katód
EOF
injektálás helye
detektor
szokásos polaritás: a kapillárisfal negatív töltésű (disszociált SiOH-csoportok), az elektroozmózist (EOF) pozitív ionok hajtják (katódos EOF) EOF sebessége (mozgékonysága, ):
v EOF =μEOF⋅E> 0
anion saját (elektroforetikus) sebessége:
v e=−∣μe∣⋅E<0
anion bruttó sebessége:
v tot =v EOF −∣v e∣=( μEOF −∣μe∣)⋅E
probléma kisméretű, mozgékony anionoknál ha e EOF az anion nem a detektor felé vándorol, nem is halad át a detektoron!
∣μ ∣>μ
grafika: HP CE Partner
39.
Mozgékony anionok elválasztása, az EOF megfordítása bemeneti puffer (inlet) anód
e
tot
kimeneti puffer (outlet) katód
EOF
injektálás helye
detektor
a megoldás: az EOF-et el kell nyomni (kapillárisfal borítása, coating) és polaritáscsere bemeneti puffer (inlet) katód
kimeneti puffer (outlet) anód
eff tot injektálás helye
detektor
vagy az EOF-et meg kell fordítani (kapillárisfal borítása kationos tenziddel, CMC alatt!), ekkor az EOF és az anion sebessége összeadódik, így az anion áthalad a detektoron:
bemeneti puffer (inlet) katód
eff
EOF injektálás helye
grafika: HP CE Partner
tot detektor
kimeneti puffer (outlet) anód
40. Foszfonát hatóanyagok CZE gyors elválasztása indirekt UV detektálással
BGE:
• 30 mM benzoesav + 5 mM szalicilsav (+TRIS pH 3,8 beállításához) (állandó UV háttérelnyelés + pH puffer) • 0,5 mM cetil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB, az EOF megfordítására) -
H3C
Br
H3C
+
N
CH3
CH3
• -30 kV, 30 °C, indirekt UV 220 nm B Prutthiwanasan, L Suntornsuk J Sep Sci 2010, 33, 228-234.
41.
Induktív csatolású plazma ICP-MS és csatolása CE-hez
• ICP: atmoszférikus nyomású argon plazma (6000-8000 K) a bevezetett mintát elpárologtatja, atomizálja és ionizálja • ICP-MS: ionoptika vezeti át az ionokat a tömegspektrométerben nagyvákuumába • előnye: alkalmas több elem egyidejű mérésére, széles linearitási tartományban • egy lehetséges csatolás (interfész) kapilláris elektroforézishez:
42.
Citosztatikum célbajuttató rendszer: PEGilált liposzóma
TTTN Nguyen, J Ostergaard, S Stürup, B Gammelgaard, Anal Bioanal Chem 2012, 402, 2131-2139.
43. Oxaliplatin mérése liposzómás formulációból CZE-ICP-MS-sel • kapilláris: 50 cm, 50 um ID • BGE: 10 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM NaCl, 1 mM SDS • minta: liposzóma törzsoldat hígítva BGE-vel: 4 mg/ml liposzóma, 1,3 mg/ml oxaliplatin • hidrodin. inj. után 30 kV elfo, 25 ºC • 1-jódbután: EOF marker • 50 ug/L In a make-up oldatba (porlasztási fluktuációk miatti intenzitásváltozások korrigálására) •
oxaliplatinra LOD: 59 ng/mL
TTTN Nguyen, J Ostergaard, S Stürup, B Gammelgaard, Anal Bioanal Chem 2012, 402, 2131-2139.
44.
Hatóanyag felszabadulás in vitro monitorozása (CZE-ICP-MS)
• liposzómák szonikálása: kb. 89% oxaliplatin szabadul fel (2 perc alatt), utána sem több
szabad oxaliplatin oxaliplatin bomlásterméke
• liposzómák inkubálása: 10 mM HEPES pufferben (pH 7,5), 41 ºC-on, foszfolipáz A2 enzim (3,5 uM) jelenlétében (+5 mM CaCl2 aktiválja) és anélkül
TTTN Nguyen, J Ostergaard, S Stürup, B Gammelgaard, Anal Bioanal Chem 2012, 402, 2131-2139.
45.
Enzimek CZE elválasztása borított falú kapillárisban bare (uncoated) fused silica = borítatlan falú szilika kapillárisban:
borított falú kapillárisban: dinamikus: ikerionos puffer OH-alkil-cellulóz ... statikus:
atenolol
Nemvizes kapilláris elektroforézis (NACE): -blokkolók elválasztása metanolban metabolitja
46.
teflon
• 0,5 ml szűrt humán vizeletminta, SPE (Oasis HLB) dúsítás, • BGE: 40 mM AcOH/NaOAc (pK 9,7); pH 8,9 MeOH lemosás, bepárlás • 58,5 (Ld=50) cm FS kapilláris (50m)
• std.minta: 10 g/ml -blokkolók MeOH-ban
• minta: 0,5 ml metanolban
• elfo: +30 kV (10 A), UV detektálás 200 nm • spike: 20 g/ml atenolol standard H Sirén, R Kuldvee, T Karla, T Ekström, ML Riekkola, J Chromat A 2005, 1068, 89-97.
47.
Minta injektálása hígított pufferből (sample stacking)
pufferrel készült minta
hígított pufferrel készült minta U
U
minta
detektor
E
ki minta
detektor
ki
E komponensek feldúsulnak a mintadugó határán !
R ellenállású oldaton eső feszültség (i = const., Ohm-törvény): U R·i térerősség (V/cm):
48.
E
dU dx
a mintadugóban nagyobb az ellenállás nagyobb feszültség és térerősség nagyobb sebességre gyorsul v E a mintakomponensek felhalmozódnak a zóna elején (stacking), önélesítő hatás
A sample stacking zónaélesítő hatása inj.minta foszfáttartalma:
25 mM 15 mM 10 mM 5 mM
kísérleti elektroferogramok egy pozitív töltésű peptid dúsítására BGE: 30 mM nátrium-foszfát, pH 7.0
• akár 1000 dúsítás is elérhető (Zhang, et al. Anal. Chem. 1996, 68, 2523-2532)
49. Imatinib koncentrálása (hosszú inj. + sample stacking) CZE előtt 1
3
2 4
• 60 (52) cm FS kapilláris (50μm)
Érzékenységnövelés eszközei:
• BGE: 10 mM NaH2PO4 (pH 2,0) 5 mM HP-β-CD
• Field Amplified Sample Stacking: a törzsoldatokat nem hígított pufferrel, hanem 0,5 mM-os sósavas metanollal híg.
• 1 mg-os minta törzsoldatok: metanol/0,1 M HCl (6/4)-ban
• Nagytérfogatú elektrokinetikus inj.: 15 kV x 60 sec
• elfo: +20 kV (10 μA), UV 267 nm
• linearitás: 5 - 50 ng / ml
J Li, Y Huang, L Huang, L Ye, Z Zhou, G Xiang, L Xu, J Pharm Biomed Anal 2012, 70, 26-31.
50.
inj.molekulák száma:
LIF: meg lehet-e pillantani egyedi molekulákat?
15 • B-fikoeritrin: fluoreszcens festék
30
• 2-mW zöld 543,5 nm HeNe lézer fénye mikroszkóppal 30 m foltra fókuszálva 20 m-re a kapilláris kimeneti végétől, 60 mikroszkóp-objektív gyűjti a fluoreszcens jelet
300
• egyre hígabb festékoldatok EK injektálása: 1 kV, 5 sec • kb. 10 000 molekula alatt a csúcs migrációs ideje, félértékszélessége elmosódottá válik
3 000
• sztochasztikus fluktuációk, „molecular shot noise” az analitikai kémiai detektálás végső határa
30 000 (50 zmol)
DY Chen, NJ Dovichi, Anal. Chem. 1996, 68, 690-696.
51.
CZE összefoglalás: a futtatópuffer (BGE) szerepe
• Megfelelő pufferkapacitás (>10 mM / pH) biztosítása:
pKa – 1,5 < pH < pKa + 1,5 megfelelő koncentráció • Koncentráció (tipikusan 5-50 mM): megfelelő vezetőképesség (az áramvezetés a BGE feladata!), de még nem túl nagy Joule-hő ionerősség: 10-50 mM
forrás: Gerd Vanhoenacker, www.richrom.com
• Direkt UV detektálás esetén a puffer lehetőleg ne abszorbeáljon (akár 190-210 nm !) • Indirekt UV detektálás esetén abszorbeáló komponens is kell • CE-MS esetén illékony puffer kell (ecetsav, hangyasav, ammóniumsók...) • Szelektivitás növelése:
• EOF elnyomás:
szerves módosító (oldószer: MeOH, ACN, iPrOH...) szelektív komplexképző királis szelektor ...
hidrofil polimer (pl. hidroxietil-cellulóz) vagy kationos tenzid (konc.
Kapilláris izotachoforézis Capillary Isotachophoresis (CITP) Kationok vagy anionok elválasztása effektív mozgékonyságuk különbsége alapján (semleges molekulák elválasztására nem alkalmas)
azonos sebességgel haladó zónák, „ITP-vonat”
53.
A kapilláris izotachoforézis (CITP) elve I.
a be- és kimeneti puffer más összetételű! az áram bekapcsolásának pillanatában: ABC BAC CAB
T
egy későbbi időpillanatban: B T C B A BA C BA
L
minta
detektor
ki E
E
L: vezető ion (leading ion)
minta
detektor
ki
feltétel a mozgékonyságokra:
T C B A L
A, B, C: elválasztandó komponensek
emiatt a zónák ellenállása:
T: záró ion (terminating ion)
54.
L
RT RC RB RA RL
A kapilláris izotachoforézis (CITP) elve II.
a be- és kimeneti puffer más összetételű! az áram bekapcsolásának pillanatában:
T
ABC BAC CAB minta
E
egy még későbbi időpillanatban:
T
L
detektor
ki
minta
C B A C B A C B A
L
detektor
E
azonos sebességgel haladó zónák:
v T ET C EC ... L EL
zónaélesítő hatás a mozgó határfelületnél (moving boundary)
ki
55. • • • •
A kapilláris izotachoforézis (CITP) gyakorlata (1923. J. Kendall: ritkaföldfémionok és savanionok elválasztása) Kezdetben 500-800 m Teflon kapillárisokban 1971. kapillárisban: Everaerts, majd Bocek, Prusik, Kasicka „makroméretű” ITP: LKB Tachophor, Shimadzu IP-1B, Spisska Nova Ves
• EOF-et előnyös visszaszorítani (antikonvektív közeg), pl. 0.1% hidroxipropilcellulóz • pufferrendszer (L, T) választása (pH, koncentráció, adalék, pl. Brij35) kationos ITP
anionos ITP
leading ion (L)
K+, NH4+, Na+
pl. Cl
terminating ion (T)
H+ (gyenge savból!)
pl. 4-nitrofenolát, MES, OH
ellenion
pl. acetát, MES,
pl. -alanin, His, kreatinin, ...
pH
olyan, hogy a mintakomponseknek legyen töltése
• gyakran állandó áramerősséggel végezzük az analízist • detektálás: kvantitatív munkához a zóna elejét és végét detektálni kell konduktivitás, UV, MS, NMR! • alkalmazások - kis ionerősségű, híg minták koncentrálása (több 100 nl injektálható) - akár 100 koncentrálás is elérhető (ITP előkoncentrálás után CZE elválasztás) - nagy csúcskapacitás, mikropreparatív eljárások
56.
Kationos CITP: ritkaföldfém-ionok elválasztása HIBA: -hidroxiizovajsav leading kation: ammónium Terminating: H+ (karnitin)
O
-
H3C
CH3
+
N
O
i = 40 A = const.
HO
univerzális detektálás: a zónák vezetőképesség-arányát méri
RE
E x L L EL X x
E : térerősség az adott zónában
: adott zóna fajlagos vezetése : adott zónát alkotó ion (effektív) mozgékonysága Q. Mao, T. Hirokawa, et al. J. Chromatogr. A 802 (1998) 203-210
CH3
57. Fluorokinolonok (SPE) ITP-CZE-UV analízise sertés plazmamintákból • L: 10 mM Na2HPO4, 5 mM NaCl, pH 9,0 • 30% hosszú mintadugó hidrodin. injektálása EOF -10 kV, +50 mbar (1 min)
• T: 10 mM NH2-CH2-CH2-COO- Na+, pH 9,0 • ITP alatt L-nél gyorsabb és T-nél lassabb ionok (semlegesek és kationok is) elhagyják a kapillárist, a biológiai mátrix zavarása csökken!
-10 kV (3 min)
• L választása CZE futtatópuffernek előnyös • kritikus a CZE-re átkapcsolás időzítése! amikor az áram 90% a tiszta L kapillárishoz képest
EOF +15 kV CZE, 8 mg/l ITP-CZE, 0,2 mg/l
• ciprofloxacin, enrofloxacin és flumequine • linearitás: 0,1-1,5 mg/l, LOD 0,05 mg/l csúcsterület: 0,6-2,9 RSD% belső standard: lomefloxacin visszanyerések: >90%
ITP: 40x koncentrálás M Hernández, C Aguilar, F Borrull, M Calull J Chomat B 2002, 772, 163-172.
