Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2010 – 2011
Hoogwaardige microbiële lipiden uit secundaire grondstofstromen
Tom Sieprath Promotor: Prof. dr. ir. Willy Verstraete Tutor: Dr. ir. Tom Hennebel
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: cel- en genbiotechnologie
i
“De auteur en promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
“The author and promotors give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis.”
Gent, juni 2011
Prof. dr. ir. Willy Verstraete
Dr. ir. Tom Hennebel
Tom Sieprath
ii
Woord vooraf Enerzijds ben ik zeer blij en opgelucht dat ik dit stukje tekst kan schrijven, want het is een hectisch jaar geweest! Maar anderzijds is het ook spijtig, het is het einde van een mooi deel van mijn leven, student zijn heb ik altijd fijn gevonden. Ook dit jaar heb ik, ondanks alle drukte, genoten. Zonder de steun en de hulp van mijn promotor, Professor Willy Verstraete, en mijn begeleider doctor Tom Hennebel zou deze masterproef echter nooit uitgegroeid zijn tot wat hij nu is. Professor, bedankt voor de onaflatende steun en het optimisme dat er altijd van u uitging. De gesprekken die we hadden waren altijd geanimeerd en ik heb er veel dingen uit geleerd waarvan ik denk dat ik ze later nog ga kunnen gebruiken. Tom, ondanks het feit dat je het zelf enorm druk had dit jaar kon ik toch altijd op je rekenen als ik iets nodig had, of met een vraag zat. Ik wil ook graag Mike en Simon bedanken, jullie hebben mij meerdere malen uit de nood moeten helpen als ik weer eens een pomp nodig had; of stalen moest gaan nemen. En ook David verdient een dikke merci voor de hulp bij de PHB analyses. Aan alle andere mensen van LabMET, eveneens bedankt omdat het nooit teveel gevraagd was om even tijd te maken als ik ergens een klein probleem had. Natuurlijk mag ik Pieter-Jan niet vergeten, mijn Limburg- en kotgenoot. Bedankt voor de fijne tijden die we samen hebben beleefd en voor de „5-minute-breaks‟ als we er even geen zin meer in hadden. Mama en papa, natuurlijk wil ik jullie bedanken voor de kans die jullie mij geboden hebben om te studeren wat ik wilde, en waar ik wilde. Bedankt ook voor jullie onvoorwaardelijke steun en interesse in alles wat ik doe en nog wil doen, ook al staat het soms ver van jullie eigen leefwereld. Amelie, toen ik drie jaar geleden naar Gent vertrok zeiden veel mensen, “die twee blijven niet samen”, maar we hebben ze toch maar mooi het tegendeel bewezen. Onze band is er alleen nog maar sterker door geworden! Bedankt voor zo oneindig veel geduld en begrip, ik kan moeilijk met woorden beschrijven hoe hard jouw steun mij door dit zware laatste jaar geholpen heeft. Elke keer ik dreigde de moed te verliezen was jij er voor me, en elke keer ik mijn stress weer op jou afreageerde onderging je dit met de glimlach. Ik zal dit nooit vergeten.
iii
Samenvatting Door de wereldwijde stijging van de consumptie, neemt de afval- en afvalwaterproductie eveneens overal toe. Anderzijds is er een groeiende bewustwording over de zorg voor het milieu, over „global warming‟ en over het besef dat grondstoffen niet onuitputtelijk zijn. Hierdoor wordt de regelgeving voor de verwerking van afval steeds strenger en komt men in deze sector voor grote uitdagingen te staan. Een van deze uitdagingen is de verwerking van spuislib uit de waterzuiveringsindustrie. In volume uitgedrukt vormt deze waterige slurry het grootste nevenproduct dat in deze industrie gevormd wordt. De verwerking ervan brengt hoge kosten met zich mee aangezien het een zeer groot volume betreft met een hoog watergehalte, bovendien is het ook rijk aan vervuilende-, toxische- en pathogene stoffen. Omdat er vaak nog hoogenergetische verbindingen in het spuislib aanwezig zijn wordt vergisting ervan, met de productie van biogas, op grote schaal toegepast. Ook verwerking van het slib tot meststof voor in de landbouw industrie is een veelvoorkomende praktijk. In deze masterproef echter werd onderzocht of het mogelijk is om in de plaats van „afvalslib‟, een slib te produceren dat waarde heeft en vermarkt kan worden. Er werd geprobeerd om de energie en de bouwstenen die aanwezig zijn in afvalwater te recycleren in een bruikbare vorm met behulp van bacteriën die reeds in waterzuiveringsinstallaties aanwezig zijn. Eerst werd geprobeerd om een actief slib te creëren dat aangerijkt was aan bacteriën die mycolinezuren produceren (Mycolata). Mycolinezuren zijn hoogwaardige lipiden die toegepast kunnen worden als grondstof voor de productie van biobrandstoffen of biosurfactantia. Het is ook geweten dat Mycolata, door de productie van deze vetzuren, een rol spelen in de fenomenen van schuimvorming en drijvend slib, in beluchtingsbekkens van waterzuiveringsinstallaties. Dit is een wereldwijd probleem dat vaak voorkomt in zuiverinsinstallaties waar vetrijk afvalwater behandeld wordt, en waarvoor momenteel nog geen definitieve oplossing bestaat. Het doel was om de rollen om te draaien, en schuimvorming en flotatie te stimuleren. Het schuim en het drijvend slib, die rijk zijn aan de gewenste mycolinezuren zouden dan afgeoogst en verkocht kunnen worden als een product. Op deze manier wordt tegelijkertijd een oplossing geboden voor de behandeling van spuislib en voor het schuimvormingsprobleem. In sequencing batch reactoren (SBR‟s) werd door gebruik te maken van afvalwater met een hoog vetgehalte, en door op verschillende manieren selectief floterende bacteriën in het systeem te bevoordelen, geprobeerd om flotatie en schuimvorming van het actief slib te stimuleren. Uit de experimenten bleek echter dat flotatie of schuimvorming, van meer parameters afhankelijk zijn dan deze die in een SBR opzet gecontroleerd konden worden. Hieruit kon geconcludeerd worden dat schuimvorming een complexer probleem is dat mogelijk ook afhangt van andere meer dynamische omgevingsparameters zoals pH- en temperatuursveranderingen, of schommelingen in de samenstelling van het afvalwater etc.
iv
Er werd ook geprobeerd om een actief slib te creëren dat aangerijkt was aan bacteriën die polyhydroxyalkanoaten (PHA‟s) produceren. PHA‟s zijn een familie van polyesterverbindingen van hydroxyalkanoaten. Ze zijn een belangrijke grondstof voor de productie van verschillende bioplastics en andere biopolymeren. Daarnaast zijn ze ook een grondstof voor de productie van biobrandstoffen en hebben ze potentieel als prebioticum. Ze worden intracellulair, als granules, door bacteriën gesynthetiseerd wanneer deze blootgesteld worden aan fysiologische stress zoals beperkte aanwezigheid van bepaalde nutriënten, terwijl er een overmaat is aan koolstofbronnen (bij voorkeur korte keten vetzuren). Fosfaat accumulerende organismen (PAO) zijn een bepaalde groep PHA-producerende bacteriën die een belangrijke rol spelen in het biologisch fosfaatverwijderingsproces. Dit proces bestaat uit twee fases, een anaerobe fase waarin het slib onder nitraatarme omstandigheden in contact komt met vers afvalwater (de voeding). Tijdens deze fase wordt het PHB geproduceerd. Tijdens de aerobe fase wordt het gesynthetiseerde PHB opnieuw afgebroken en wordt er fosfaat uit het water verwijderd. Er werd nagegaan of het mogelijk was om de PHA productie van zo een systeem op te drijven tot een economisch interessant niveau waarbij dan PHA-rijk slib afgeoogst en verkocht kon worden. Uit de uitgevoerde experimenten is gebleken dat dit inderdaad mogelijk is. Met influent van een echte waterzuiveringsinstallatie werd een PHA concentratie van ca. 10% van het droge stof gehalte bereikt. Dit zou al genoeg zijn voor een opbrengst van 0.12€ per kg behandeld organisch afval. Dit moet echter niet gezien worden als een eindpunt maar als een bewijs van de mogelijkheden van dit systeem, mits optimalisatie zou een hoger rendement zeker mogelijk moeten zijn. Als algemeen besluit kan gesteld worden dat de toepassing van actief slib processen voor de productie van hoogwaardige grondstoffen, voor verschillende takken van de industrie, uit afvalwaters, een heel interessante piste is. Verder onderzoek zal zowel fundamenteel, om de processen zoals schuimvorming te kunnen doorgronden en hierin gericht te kunnen ingrijpen, als toegepast, om de productie en downstream processing van gewenste producten te verhogen, omvatten.
v
Lijst met gebruikte afkortingen 3HAME 3HBME BM BZV BZV5 CZV DA DGGE DRANCO EA EM EVM GAO IA IM IMP KH2PO4
3-hydroxyalkanoaat methyl ester 3-hydroxybutyraat methyl ester Biologische zuivering van Imperial Meat Products Biologisch zuurstofverbruik Biologische zuurzstofvraag, gemeten over 5 dagen Chemisch zuurstofverbruik Denitrificatie van Agristo Denaturating gradient gel electrophoresis Dry anaerobic conversion Effluent van Agristo Effluent van Imperial Meat Products Effluent uit de vetflotatietank van Imperial Meat Products Glycogen accumulating organism Influent van Agristo Influent van Imperial Meat Porducts Imperial Meat Products Kaliumdiwaterstoffosfaat
NA NaAc NH4Cl NH4-N OSS PAO PHA PHB PHBV
Nitrificatie van Agristo Natrium acetaat Ammoniumchloride Ammonium-stikstof Waterzuiveringsstation Ossemeersen te Gent Phosphate accumulating organism Polyhydroxyalkanoaat Polyhydroxybutyraat Polyhydroxybutyraatvaleraat
PHV PO4-P SBR SM SORDISEP TAN
Polyhydroxyvaleraat Fosfaat-fosfor Sequencing batch reactor Slib uit de slibflotatietank van Imperial Meat Products Sorting, Digestion and Separiation Totale ammonium-stikstof
TSS VSS
Total suspended solids Volatile suspended solids
vi
Figurenlijst Figuur 1: Schematische weergave van de processen die gebruikt worden tijdens de waterzuivering en van de verschillende slib productie routes. ............................................................................................ 3 Figuur 2: Massabalans voor vaste stof en water tijdens verschillende ontwateringsmethoden. .................... 5 Figuur 3: Een selectie van een aantal verschillende mycolinezuren; a-d: α-mycolinezuren; e & f: geoxigeneerde mycolinezuren (Barry Iii et al., 1998). ................................................................... 8 Figuur 4: Chemische structuur van 3 veel bestudeerde PHA's: Polyhydroxybutyraat (PHB); Polyhydroxyvaleraat (PHV); Polyhydroxybutyraatvaleraat (PHBV). .......................................... 10 Figuur 5: Schematische weergave van de opzet en het doel van experiment 1: niet-geholpen flotatie ....... 21 Figuur 6: Resultaten van een DGGE- analyse van de influenten en het actief slib van Imperial Meat Products en Agristo met primers specifiek voor Actinomyceten. ................................................ 27 Figuur 7: Verhouding CZV/VSS uit de bovenste 200 mL van de Imhoff-kegel na 15 minuten bezinken aan het einde van elke cyclus. Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde Imhoffkegel, de foutenbalken geven de standaardfout op het gemiddeld weer. De rode rechthoek in het figuurtje rechtsboven toont schematisch de 200 mL waarop de analyse uitgevoerd werd. OSS = Ossemeersen; IMP = Imperial Meat Products. ............................................................................. 28 Figuur 8: De VSS in de bovenste 200 mL van de Imhoff-kegel na 15 minuten bezinken aan het einde van elke cyclus gedurende 4 cycli. Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde Imhoff-kegel, de foutenbalken geven de standaardfout op het gemiddelde weer. De rode rechthoek in het figuurtje rechtsboven toont schematisch de 200 mL waarop de analyse uitgevoerd werd. OSS = Ossemeersen; IMP = Imperial Meat Products. ..................................... 29
vii
Figuur 9: De CZV van het hele mengsel aan het begin en einde van elke cyclus (Start 1 = begin van cyclus 1; Eind 2 = Eind van cyclus 2). Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit hetzelfde mengsel, de foutenbalken geven de standaardfout op het gemiddelde weer. De rode rechthoek in het figuurtje rechtsboven toont schematisch het deel van het mengsel waarop de analyse uitgevoerd werd. OSS = Ossemeersen; IMP = Imperial Meat Products. ..................................... 29 Figuur 10: Flotatie van actief slib na toepassing van 100 mL dieselolie tijdens de laatste 10 minuten van de cyclus voor de sedimentatie. ......................................................................................................... 30 Figuur 11: De gemiddelde standaardfout op 6 PHB/VSS-metingen met elk 3 herhalingen. De foutenbalken stellen de standaardfout op deze gemiddelde standaardfout voor. De standaardfout op de meting zonder extra verdunning is significant lager dan deze met de extra verdunning met een p-waarde van 0.002. ...................................................................................................................................... 32 Figuur 12: Opgestelde standaardcurve voor de spectrofotometrische bepaling van het PHB-gehalte in slibstalen. De gemeten punten zijn aangeduid met een ruitje, de weergegeven lijn is de standaardcurve. De punten zijn het gemiddelde van drie onafhankelijke metingen. .................... 33 Figuur 13: Het acetaat- en fosfaatgehalte in de waterfase tijdens één anaerobe cyclus tijdens de eerste week dat de SBR actief was. Het acetaatgehalte moet afgelezen worden van de rechter as, het fosfaatgehalte van de linker as. De hoeveelheid PHB in de cellen wordt weergegeven als PHB/VSS (g/g) en moet afgelezen worden van de linker as. Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde SBR. Er zijn geen foutenbalken zichtbaar omdat deze te smal waren om weergegeven te worden................................................................................................................. 34 Figuur 14: Het PHB-gehalte per gram droge stof in functie van de tijd. De verschillende grafieken stellen elk één anaerobe cyclus voor met telkens een week ertussen. Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde SBR. De foutenbalken stellen de standaardfout voor. ........................... 35 Figuur 15: Het PHB gehalte per gram droge stof tijdens de anaerobe fase van de cyclus in functie van de tijd. Elke lijn stelt één anaerobe fase voor. Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde SBR. De foutenbalken stellen de standaardfout voor..................................................... 36
viii
Figuur 16: Maximale gPHB/gVSS tijdens een cyclus in functie van de looptijd van de SBR. Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde SBR. De foutenbalken stellen de standaardfout voor. ....................................................................................................................................................... 37 Figuur 17: Het fosfaatgehalte in de waterfase tijdens een anaerobe fase van een cyclus op dag 15 na de verandering van het influent. De hoeveelheid PHB/VSS (g/g). Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde SBR. De foutenbalken geven de standaardfout weer. ..................... 38 Figuur 18: Filamenteuze bacterie uit het actief slib na 2u anaerobe fase van de cyclus. a = een foto in zichtbaar licht waarin het filament zichtbaar is. b = een foto in het fluorescente spectrum bij 550 nm waarin de PHB-partikels zichtbaar zijn. c = Het samengestelde beeld van a en b. ................ 39
ix
Tabellenlijst Tabel 1: Bedrijven die PHA produceren of er onderzoek naar doen (wereldwijd) .................................... 10 Tabel 2: De plaatsen in de zuiveringsinstallaties waar de verschillende water- en slibstalen werden genomen, en de afkortingen die ervoor gebruikt worden in hoofdstuk III: Resultaten. ............... 20 Tabel 3: De slib en voeding combinaties in de verschillende sequencing batch reactoren (SBR's) die gebruikt werden tijdens Experiment 1. ......................................................................................... 22 Tabel 4: De verschillende testen die werden uitgevoerd bij elke sequencing batch reactor (SBR) tijdens experiment 2.................................................................................................................................. 23 Tabel 5: Een aantal belangrijke eigenschappen (COD-, N-, P-, Acetaat-, Propionaat-, Butyraat- en Valeraatgehalte) van de gebruikte influentwaters. IM staat voor Influent van „imperial Meat products‟; IA svoor Influent van Agristo. C/N en C/P zijn de respectievelijke verhoudigen van CZV/N en CZV/P. Alle waarden zijn het gemiddelde van 3 onafhankelijke metingen, en werden afgerond op 10 mg. ....................................................................................................................... 26
x
Inhoudstabel Woord vooraf ................................................................................................................................. iii Samenvatting.................................................................................................................................. iv Lijst met gebruikte afkortingen ...................................................................................................... vi Figurenlijst .................................................................................................................................... vii Tabellenlijst..................................................................................................................................... x I.
Inleiding .................................................................................................................................. 1 I.1.
Achtergrond ...................................................................................................................... 1
I.2.
Waterzuivering algemeen ................................................................................................. 2
I.2.1.
Voorbehandeling ....................................................................................................... 2
I.2.2.
Primaire zuivering – fysische en chemische processen ............................................ 3
I.2.3.
Secundaire zuivering – Biologische processen ......................................................... 4
I.2.4.
Tertiaire zuivering – Specifieke verwijdering van nutriënten .................................. 4
I.2.5.
Quaternaire zuivering – nazuivering ......................................................................... 4
I.2.6.
Slib behandeling........................................................................................................ 4
I.3.
I.3.1.
Oorzaken ................................................................................................................... 6
I.3.2.
Mycolata ................................................................................................................... 7
I.4.
Hoogwaardige microbiële lipiden .................................................................................... 7
I.4.1.
Mycolinezuren .......................................................................................................... 7
I.4.2.
Polyhydroxyalkanoaten (PHA‟s) .............................................................................. 9
I.5. II.
Schuimvorming ................................................................................................................ 6
Doel van dit eindwerk .................................................................................................... 13
Materiaal en Methoden ......................................................................................................... 15 II.1.
Analysemethoden ........................................................................................................... 15
II.1.1.
Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik (CZV) .............................................. 15
II.1.2.
Bepaling van het biologisch zuurstofverbruik (BZV) ............................................ 16
II.1.3.
Bepaling van de totale ammonium-stikstof (TAN) ................................................ 16
II.1.4. Bepaling van het zwevende stof gehalte en de vluchtige fractie hiervan - (Total suspended solids (TSS) en Volatile suspended solids (VSS)) .............................................. 17 II.1.5.
Ionenchromatografie ............................................................................................... 17
II.1.6.
Analyse van de vluchtige vetzuren ......................................................................... 17 xi
II.1.7.
Bepaling van het fosfaat-gehalte ............................................................................. 18
II.1.8.
Denaturating gradient gelelektroforese (DGGE) .................................................... 18
II.1.9.
Bepaling van het PHB-gehalte ................................................................................ 19
II.2.
Startmaterialen voor de experimenten............................................................................ 19
II.2.1.
Oorsprong ............................................................................................................... 19
II.2.2.
Analyses .................................................................................................................. 20
II.3. Experimenten betreffende de productie van hoogwaardige microbiële lipiden door selectie op slibflotatie en schuimvorming................................................................................. 21 II.3.1.
Experiment 1: Niet-geholpen flotatie...................................................................... 21
II.3.2.
Experiment 2: Geholpen flotatie ............................................................................. 22
II.3.3.
Experiment 3: Laag opgelost zuurstof gehalte........................................................ 24
II.4.
Experimenten betreffende de productie van PHA‟s ....................................................... 24
II.4.1.
Experiment 1: Synthetische voeding ...................................................................... 25
II.4.2.
Experiment 2: Voeding met effectief afvalwater .................................................... 25
III. Resultaten.............................................................................................................................. 26 III.1.
Analyse van de startmaterialen ................................................................................... 26
III.1.1. Chemische analyses ................................................................................................ 26 III.1.2. Moleculaire analyses ............................................................................................... 26 III.2. Experimenten betreffende de productie van hoogwaardige microbiële lipiden door selectie op slibflotatie en schuimvorming................................................................................. 27 III.2.1. Experiment 1: Niet-geholpen flotatie...................................................................... 27 III.2.2. Experiment 2: Geholpen flotatie ............................................................................. 30 III.2.3. Experiment 3: Laag opgelost zuurstof gehalte........................................................ 31 III.3.
Bepaling van het PHB-gehalte ................................................................................... 31
III.4.
Experimenten betreffende de productie van PHA‟s ................................................... 34
III.4.1. Experiment 1: Synthetische voeding ...................................................................... 34 III.4.2. Experiment 2: Voeding met effectief afvalwater .................................................... 35 III.4.3. Kwalitatieve bepaling van PHB .............................................................................. 38 IV. Bespreking ............................................................................................................................ 40 IV.1. Experimenten betreffende de productie van hoogwaardige microbiële lipiden door selectie op slibflotatie en schuimvorming................................................................................. 40 IV.1.1.
Economisch potentieel ........................................................................................ 41 xii
IV.2.
Bepaling van het PHB gehalte .................................................................................... 42
IV.3.
Experimenten betreffende de productie van PHA‟s ................................................... 43
IV.3.1. IV.4.
Economisch potentieel ........................................................................................ 44
Conclusie .................................................................................................................... 45
Referentielijst ................................................................................................................................ 47 Bijlage 1: DNA extraction from sludge and soil .......................................................................... 54 Bijlage 2: DGGE Ingeny protocol ................................................................................................ 56 Bijlage 3: Foto van de opstelling van de reactor voor de productie van PHB. ............................. 62
xiii
I. Inleiding In eerste instantie wordt in deze literatuurstudie kort de basis en de probleemstelling geschetst waaruit dit onderzoek is voortgekomen. Vervolgens wordt het basisproces van waterzuivering uitgelegd samen met het vaak voortkomend probleem van schuimvorming. Tenslotte volgt de bespreking van twee soorten hoogwaardige lipiden die gewonnen kunnen worden uit afvalwater zoals in dit eindwerk aangetoond. Verder worden ook hun mogelijke toepassingen en alternatieve productieprocessen besproken.
I.1. Achtergrond In deze tijd van economische- en ecologische crisis is het steeds meer aangewezen om duurzaam om te gaan met uitputtelijke grondstoffen zoals olie, gas, kolen en mineralen. Alternatieve energiebronnen zoals zonne-energie en windenergie winnen terrein maar voornamelijk de productie van bio-ethanol neemt een hoge vlucht. In de Verenigde Staten, de grootste speler op de huidige markt, is de productie sinds 2000 bijna vertienvoudigd, van 6 miljoen liter naar 50 miljoen liter per jaar (Renewable Fuels Association, 2011). De belangrijkste grondstoffen voor deze industrie zijn, ondanks veel onderzoek naar alternatieven, nog steeds suiker- en zetmeelgewassen zoals maïs, suikerbiet en suikerriet. Dit zorgt voor een ethisch dilemma, deze gewassen gebruiken als voedsel voor mens en dier, of als grondstof voor energieproductie (Eide, 2008). Een andere belangrijke eigenschap van de huidige tijd is de hoge graad van consumptie. Dit gaat gepaard met een toenemende vraag naar grondstoffen en een toenemende productie van afval en afvalwater. In de EU wordt per jaar ongeveer 6 ton vast afval geproduceerd per inwoner (Martin et al., 2010). Heel opmerkelijk is ook dat 20-30 % van het wereldwijd geproduceerde voedsel afgevoerd wordt als afval (De Standaard Online, 2011). In de waterzuivering vormt voornamelijk de behandeling van spuislib een belangrijke uitdaging. Spuislib is de vaste fractie die achterblijft na het waterzuiveringsproces. Dit slib is rijk aan nutriënten zoals stikstof, fosfor en organisch materiaal en het wordt vaak verwerkt tot meststof voor de landbouw. Maar er kunnen ook, afhankelijk van het te zuiveren water en de gebruikte zuiveringsmethoden, zware metalen, moeilijk afbreekbare stoffen en pathogene organismen in het slib aanwezig zijn (Fytili et al., 2008). Volgens Europese richtlijn 86/278/EEC over het gebruik van spuislib in de landbouw moeten deze toxische stoffen tot onder bepaalde grenswaarden gebracht worden alvorens het slib als meststof gebruikt mag worden. Dit brengt kosten met zich mee die soms hoger zijn dan de baten, met als gevolg dat een aanzienlijk deel van het spuislib verbrand wordt of gedumpt wordt op stortplaatsen. Na de invoering van Europese richtlijn 91/271/EEC met betrekking tot de behandeling van afvalwater zijn er ook veel waterzuiveringsinstallaties bijgekomen en is de hoeveelheid geproduceerd spuislib in de EU-15 van 7,7 naar 10,8 miljoen ton drooggewicht per jaar gestegen.
1
De toepassing als meststof wordt het meest gepromoot, maar deze afzet is beperkt. En aangezien verbranding van slib duur is (ca. 650€ per ton droge stof (persoonlijke communicatie met Prof. Verstraete)), en dumping op stortplaatsen aan banden gelegd wordt (tegen 2016 mag er nog slechts 35% van de hoeveelheid biodegradeerbaar afval dat in 1995 geproduceerd werd gedumpt worden op stortplaatsen (European Commission, 2002)), is de oplossing van het slib-probleem nog steeds een open vraagstuk. Door deze twee geschetste problemen te koppelen, met name de groeiende vraag naar duurzame energie- en grondstofbronnen (die niet in competitie staan met de voedselproductie), en de groeiende afvalproductie, kan een win-win situatie gecreëerd worden. Voor vast organisch afval kunnen het DRANCO-proces (Dry Anaerobic Conversion) en het SORDISEP-proces (Sorting, Digestion and Separiation) gebruikt worden. Hierbij worden zoveel mogelijk energie, en recycleerbare materialen uit de afvalstroom gewonnen, en wordt de hoeveelheid te storten materiaal geminimaliseerd (Six et al., 1992; Organic Waste Systems, 2008). Afvalwater is ook vaak rijk aan hoogenergetische verbindingen en mineralen. Afhankelijk van de oorsprong van het water en de gebruikte zuiveringsmethoden kan een deel hiervan herwonnen worden. Fermentatie van spuislib voor de productie van biogas wordt op grote schaal toegepast, evenals het gebruik van spuislib als meststof in de agro-industrie (Fytili et al., 2008). Het is echter ook mogelijk om in actief slib systemen specifieke processen te laten doorgaan waardoor bepaalde gewenste producten gevormd of afgebroken worden. Dit kan door de microbiële samenstelling in het slib aan te passen door de omgevingsomstandigheden (vb.: pH, slibverblijftijd, influent samenstelling) zo te maken dat gewenste bacteriën bevoordeeld- en ongewenste bacteriën benadeeld worden (Chua et al., 2003). Hierdoor verandert het slib van een afvalproduct in een verkoopbaar product met toegevoegde waarde.
I.2. Waterzuivering algemeen Een algemene schematische voorstelling van de grote processen in een waterzuiveringsinstallatie wordt weergegeven in Figuur 1 op de volgende bladzijde. De verschillende routes waarlangs slib geproduceerd wordt zijn ook aangegeven. Hierbij moet zeker opgemerkt worden dat niet alle beschreven stappen per se in elke waterzuiveringsinstallatie aanwezig zijn. Elke installatie is aangepast aan het soort water dat er dient gezuiverd te worden. I.2.1. Voorbehandeling In eerste instantie wordt het inkomend afvalwater voorbehandeld, dit gebeurt door middel van een aantal mechanische methoden zoals zeven en filteren. In deze stap worden grote deeltjes zoals vast afval dat in het water drijft, of zand en stenen, uit het water gehaald voordat ze de waterzuiveringsinstallatie beschadigen. Deze deeltjes worden meestal rechtstreeks gestort op stortplaatsen.
2
I.2.2. Primaire zuivering – fysische en chemische processen Na de voorbehandeling volgen de primaire zuiveringsprocessen. Dit zijn fysische en chemische processen die gesuspendeerde deeltjes uit het water verwijderen. Een veelgebruikte fysische techniek is sedimentatie (de verwijdering van deeltjes in suspensie doormiddel van de zwaartekracht). Een andere fysische techniek is flotatie, hierbij worden er fijne luchtbelletjes in het afvalwater gepompt, deze hechten zich vast aan gesuspendeerde deeltjes die zo beginnen drijven. De drijvende deeltjes kunnen dan door afroming uit het water verwijderd worden. Chemische technieken zijn coagulatie en flocculatie, deze technieken worden gebruikt om sedimentatie of flotatie te versnellen. Toevoeging van een coagulerende stof zorgt voor een neutralisatie van de ladingen van de deeltjes waardoor ze gaan aggregeren en sneller zullen sedimenteren of floteren. Dit aggregeren wordt flocculatie genoemd. Tijdens de voorbehandeling en de primaire zuivering kan 50-70% van de gesuspendeerde stoffen en 25-40% van de BZV5 uit het water verwijderd worden (Werther et al., 1999). Deze deeltjes vormen het primair slib.
Voorbehandeling
Residu
Fysische en Chemische processen
Primaire bezinktank
Biologische processen
Secundaire bezinktank
Secundair slib
Primair slib
Specifieke nutriënten verwijdering
Nazuivering
Tertiar slib
Gemengd slib Slib behandeling
Behandeld slib
Figuur 1: Schematische weergave van de processen die gebruikt worden tijdens de waterzuivering en van de verschillende slib productie routes.
3
I.2.3. Secundaire zuivering – Biologische processen Na de primaire zuiveringsprocessen komt het afvalwater in de secundaire zuivering terecht. Hier worden micro-organismen (voornamelijk bacteriën (Tchobanoglous, 1991)) gebruikt om het resterend organisch materiaal te verwijderen. De micro-organismen gebruiken een deel ervan voor energieproductie, een ander deel wordt omgezet in biomassa (Schultz, 2005). Deze biomassa kan opnieuw verwijderd worden door sedimentatie en wordt het secundair slib genoemd. I.2.4. Tertiaire zuivering – Specifieke verwijdering van nutriënten Tertiaire zuivering vormt een uitbreiding op de secundaire zuivering en spitst zich specifiek toe op de verwijdering van nutriënten uit het afvalwater. Als deze processen biologisch van aard zijn vinden ze meestal plaats in dezelfde reactoren als de secundaire zuivering waarin dan extra voorzieningen zijn aangebracht (recirculatiepompen, aerobe/anaerobe delen, …) De verwijdering van stikstof (N) kan door middel van het conventionele nitrificatie/denitrificatie proces (Gerardi, 2002) of via het recentere OLAND-proces dat gebruik maakt van de anammoxreactie (Pynaert et al., 2004). Fosfor verwijdering kan via een chemische precipitatiereactie met aluminium waarbij struviet gevormd wordt (Le Corre et al., 2009) of door een biologisch proces waarbij de overmaat aan fosfor door bacteriën wordt opgenomen en afgevoerd wordt met het slib (Oehmen et al., 2007). Dit proces bestaat uit twee fases en maakt gebruik van fosfor accumulerende organismen (PAO‟s). De eerste fase vindt plaats onder anaerobe en nitraatarme omstandigheden, de PAO‟s zullen aanwezige koolstofverbindingen opnemen en opslaan als polyhydroxybutyraat (PHB), een reservestof. De energie voor dit proces halen ze uit de afbraak van intracellulaire poly-P moleculen. Tijdens dit proces wordt fosfaat vrijgesteld in het water. Tijdens de tweede, aerobe, fase worden de PHB-moleculen terug afgebroken en gebruikt als energie- en koolstofbron. De bacteriën zullen tijdens deze fase ook terug hun poly-P voorraad aanvullen en zelfs méér fosfaat opnemen dan in de eerste fase werd vrijgesteld waardoor globaal gezien de fosfaatconcentratie in het afvalwater daalt. Het slib dat in deze processen wordt geproduceerd wordt tertiair slib genoemd. I.2.5. Quaternaire zuivering – nazuivering Soms wordt er nog een bijkomende doorgedreven zuivering uitgevoerd om heel zuiver water te verkrijgen of om specifieke verbindingen uit het water te halen. Zandfiltratie, ultrafiltratie, ozonisatie en UV-behandeling zijn voorbeelden van quaternaire zuiveringstechnieken (Liberti et al., 2000; Liberti et al., 2003). I.2.6. Slib behandeling In volume uitgedrukt is slib het grootste nevenproduct van de waterzuivering. De behandeling en afvoer ervan vormen een steeds groter probleem aangezien de normen waaraan het afgevoerde slib moet voldoen steeds strenger worden (zie o.a. Europese richtlijn 86/278/EEC met betrekking tot het gebruik van spuislib in de landbouw).
4
Het slib is meestal een zeer verdunde suspensie met 3-8 g droge stof per liter. Daarnaast zitten er ook een groot deel van de vervuilende, toxische en pathogene stoffen in die eerst in het afvalwater zaten (Tchobanoglous, 1991). De initiële behandeling is gericht op het verminderen van de geur en van de hoeveelheid organisch materiaal dat erin aanwezig is. Dit gebeurt door stabilisatie van het slib zodat rottingsprocessen tegengegaan worden. Dit kan onder meer biologisch door fermentatieprocessen of chemisch door toevoeging van kalk zodat de pH stijgt tot 12 of meer. Fermentatie zorgt voor de omzetting van het organisch materiaal in gas en een stabiel residu. Het gas dat gevormd wordt is methaan (CH4) en wordt meestal gebruikt voor de productie van elektriciteit en warmte voor de waterzuiveringsinstallatie zelf (European Commission, 2001). Tijdens dit proces worden aanwezige pathogene bacteriën ook vernietigd. In de EU is anaerobe vergisting het meest gebruikte proces. Het zorgt voor een sterke daling van de hoeveelheid slib (30-50% (persoonlijke communicatie met Prof. Verstraete) waardoor de kosten voor de afvoer dalen (European Commission, 2001). Ontwatering is een ander belangrijk proces tijdens de behandeling van slib. Hierdoor kan het volume drastisch worden teruggebracht waardoor de behandelings- en transportkosten sterk dalen. In Figuur 2 is de massabalans tussen vaste stof en water volgens Werther weergegeven (Werther et al., 1999).
Figuur 2: Massabalans voor vaste stof en water tijdens verschillende ontwateringsmethoden (Werther er al., 1999). Eerst wordt het slib ingedikt, dit gebeurt meestal gewoon in sedimentatietanks onder invloed van de zwaartekracht, het slib zinkt naar de bodem en de bovenste waterfase wordt afgenomen. Als de hoeveelheid droge stof van 5% naar 10% wordt gebracht is dit gelijk aan een halvering van het slibvolume. Verdere ontwatering kan op verschillende manieren. In warme gebieden kan men het slib door de zon laten uitdrogen, in koudere gebieden wordt voornamelijk gebruik gemaakt van duurdere mechanische ontwateringstechnieken zoals een filterpers of centrifugatie.
5
Conditionering is een manier om de ontwatering van het slib te verhogen, en om het slib te stabiliseren. Het slib kan chemisch geconditioneerd worden door toevoeging van polyelektrolyten. Dit resulteert in coagulatie van de vaste stoffen en vrijstelling van het water dat eerst tussen de slibvlokken zat. Er wordt slechts 8-10 mg polyelektrolyt per kg droge stof toegevoegd, dus de hoeveelheid geproduceerd slib wordt er niet door beïnvloed (Werther et al., 1999). Als chemische conditionering niet goed mogelijk is kan er ook gebruikt gemaakt worden van een thermisch conditioneringsproces (Tchobanoglous, 1991). Als laatste stap kan het slib ook nog volledig gedroogd worden, de hoeveelheid water wordt hierdoor tot op of onder 5% gebracht (Figuur 2). Hoewel gedroogd slib gemakkelijker kan opgeslagen en getransporteerd worden, moet men toch nagaan dat de baten groter zijn dan de energiekosten van het drogingsproces.
I.3. Schuimvorming I.3.1. Oorzaken Tijdens de secundaire zuivering wordt meestal gebruik gemaakt van een actief slib proces. Dit bestaat uit twee stappen, een biochemische stap (beluchtingsbekken) en een fysische stap (sedimentatiebekken). In het beluchtingsbekken wordt organisch materiaal verwijderd door actief slib. De diversiteit binnen dit slib is zeer hoog, het bestaat onder andere uit virussen, protozoa, algen, fungi en metazoa, maar bacteriën nemen het grootste deel ervan in en spelen de belangrijkste rol (Tchobanoglous, 1991). Een goede sedimentatie en compactatie van het slib in het sedimentatiebekken is noodzakelijk opdat het effluent van het actief slib proces van goede kwaliteit is (Martins et al., 2004). Soms zijn er echter problemen tijdens de bezinking van het slib. Door de aanwezigheid van filamenteuze bacteriën kan het slib een soort net vormen dat vuildeeltjes en luchtbelletjes kan vasthouden. Het zorgt er ook voor dat het slib geen compacte massa meer kan vormen. Hierdoor treedt er geen goede sedimentatie meer op en kan het slib zelfs beginnen drijven. In het beluchtingsbekken heeft dit veel drastischere gevolgen, de lucht die in het bekken gepompt wordt zorgt ervoor dat het slib begint te schuimen. Pijpleidingen waardoor het water van het ene bekken in het andere gepompt worden kunnen verstopt geraken en in het ergste geval kunnen hele bekkens overlopen zodat vuil water in het milieu terecht komt (Krhutkova et al., 2002). Groei van filamenteuze bacteriën wordt beïnvloed door verschillende parameters. Een daarvan is de nutriëntconcentratie in de bulk vloeistof. Als deze voor bepaalde essentiële nutriënten laag is hebben filamenteuze bacteriën een voordeel ten opzichte van niet-filamenteuze bacteriën omdat ze door hun morfologie vanuit de flocs in de bulkvloeistof steken (Martins et al., 2003) Een andere oorzaak van schuimvorming is de productie van biosurfactantia (zie ook I.4.1.1). Sommige bacteriën produceren deze stoffen als reactie op de aanwezigheid van hydrofobe verbindingen. Deze biosurfactantia zorgen voor een verlaging van de oppervlaktespanning en kunnen hydrofobe verbindingen in suspensie brengen. Hierdoor worden ze meer „biobeschikbaar‟ voor de bacteriën. Door de verlaging van de oppervlaktespanning worden 6
luchtbelletjes ook meer vastgehouden aan het wateroppervlak waardoor schuimvorming kan optreden (Pagilla et al., 2002). I.3.2. Mycolata Mycolata vormen een subgroep bacteriën binnen de Actinomycetes. Hierin zitten onder andere de genera Mycobacterium, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus en Gordonia (Chun et al., 1996). Met name leden van het genus Gordonia worden vaak teruggevonden in actief slib van reactoren waar schuimvorming optreedt (de los Reyes et al., 2002). Gordonia spp. zijn, én filamenteuze bacteriën, én ze produceren biosurfactantia (mycolinezuren, zie verder) (Arenskotter et al., 2004). Hun aanwezigheid en rol in schuimvorming is in veel artikels beschreven maar een echte oplossing voor het probleem is er nog steeds niet (Seviour et al., 2000; Oerther et al., 2001; Davenport et al., 2002; de los Reyes et al., 2002; Pagilla et al., 2002; Martins et al., 2004).
I.4. Hoogwaardige microbiële lipiden Met hoogwaardige lipiden worden, zoals de naam zegt, lipiden bedoeld met een hoge waarde. Dit kan zijn omdat ze grondstoffen vormen voor de productie van energie, plastics of andere producten (Lee et al., 2005; Xu et al., 2010). Maar dit kan ook door hun rol als voedingssupplement of prebioticum (De Schryver et al., 2010; Dinh et al., 2010). I.4.1. Mycolinezuren Mycolinezuren zijn lange keten vetzuren die voorkomen in de celwand van Mycolata. De zuren werden voor het eerst beschreven in 1938 door Stodola en Anderson met C88H172O4 of C88H176O4 als ruwe formule (Stodola et al., 1938). Hieruit kan al afgeleid worden dat het behoorlijk verzadigde moleculen betreft. Alle mycolinezuren hebben dezelfde basisopbouw met een βhydroxy keten en een langere α-alkyl keten (Asselineau et al., 1950). Elke molecule bevat tussen de 30 en de 90 C-atomen. Het exacte aantal varieert per soort binnen de Mycolata (Alshamaony et al., 1976a; Alshamaony et al., 1976b). Op de mycolinezuren kunnen verschillende functionele groepen aanwezig zijn zoals aangegeven in Figuur 3. Als er enkel desaturaties en/of cyclopropanaties aanwezig zijn wordt de naam α-mycolinezuren gebruikt, a-d in Figuur 3, e en f zijn voorbeelden van geoxigeneerde mycolinezuren, deze komen voor binnen de mycobacteriële Mycolata (Barry Iii et al., 1998). Binnen de niet-mycobacteriële Mycolata worden enkel αmycolinezuren aangetroffen, er komen zelfs enkel desaturaties voor als functionele groep (b. en d. in Figuur 3) (Barry Iii et al., 1998).
7
Figuur 3: Een selectie van een aantal verschillende mycolinezuren; a-d: α-mycolinezuren; e & f: geoxigeneerde mycolinezuren (Barry Iii et al., 1998). I.4.1.1.
Toepassingen
Biosurfactantia Dankzij het amfifiele karakter van α-mycolinezuren vormen zij goede biosurfactantia. Dit zijn stoffen die de oppervlaktespanning kunnen verlagen en emulsies kunnen stabiliseren. Ze spelen ook een rol in schuimvorming en zijn meer biodegradeerbaar dan chemische surfactantia (Muthusamy et al., 2008). Mede hierdoor worden biosurfactantia steeds belangrijker in verschillende industrieën. Onder andere in de petroleumindustrie voor verbeterde drainage van olie uit olievelden, in de farmaceutische industrie als antibacteriële agentia, in de landbouw als pesticides, in de cosmetische industrie als schoonmaakmiddel, in de downstreamprocessing van heel wat industriële fermentatieprocessen, in milieu-industrie als hulpmiddel bij remediaties van bodems die met olie of metalen verontreinigd zijn, in de voedingsindustrie als emulsificator/deemulsificator, … (Singh et al., 2006). Specifieke toepassingen van mycolinezuren als biosurfactantia situeren zich in de detergent-, petroleum-, en milieu-industrie (Lee et al., 2005; Lee et al., 2006) Energie Mycolinezuren bestaan voor een groot deel uit sterk gereduceerde koolwaterstofketens (Figuur 3), een toepassing als brandstof is dan ook geen absurd idee. Te meer omdat Steinbusch recent aantoonde dat de productie van biobrandstof uit vetzuren mogelijk is (Steinbusch, 2010). I.4.1.2. Productie Ondanks de stijgende interesse, worden biosurfactantia nog niet op grote schaal geproduceerd omdat de opbrengst van de huidige productieprocessen te laag ligt, en omwille van de hoge kosten van de grondstoffen en de downstream processing. De kost van de ruwe grondstoffen wordt op 10-30% van de totale proceskosten geschat (Cameotra et al., 1998). Die van de 8
downstream processing op 60% (Muthusamy et al., 2008). Het productieproces zelf is meestal een fermentatieproces waarbij genetisch gemodificeerde, zuivere culturen gebruikt worden (Muthusamy et al., 2008). Om de kost van de ruwe grondstoffen zoveel mogelijk te drukken kan gebruik gemaakt worden van verschillende goedkopere alternatieven zoals plantaardige olie of olieafvalstromen; zetmeel onder de vorm van effluenten uit aardappelverwerkende industrie, rijstwater, maïsweekwater, melasse; of dierlijke vetten en afvalstromen uit de vleesverwerkende industrie (Muthusamy et al., 2008). De downstream processing bestaat meestal uit een aantal conventionele technieken: zuur precipitatie, solvent extractie, kristallisatie, … (Desai et al., 1997). Dit zijn allemaal methoden die in batch worden toegepast en die gepaard gaan met het gebruik van toxische stoffen. Recent echter zijn er nieuwe goedkopere methoden ontwikkeld die op een continue manier kunnen werken en een hoge graad van zuiverheid kunnen bereiken zonder het gebruik van toxische verbindingen. Schuimfractionering oogst schuim af uit een fermentatiereactor. Biosurfactantia, en/of de bacteriën die deze produceren, migreren in dit schuim en worden zo mee afgeoogst (Davis et al., 2001). „Induced air flotation‟ wordt hier soms gebruikt om schuimvorming te bevorderen (Zlokarnik, 1998). Daarnaast worden ionenuitwisselingschromatografie en adsorptiedesorptie op polystyreen resines en op actieve kool gebruikt voor de opzuivering (Dubey et al., 2005). De huidige productiemethoden met genetisch gemanipuleerde pure culturen leveren opbrengsten tot 400 g biosurfactans per L met een schimmel (Candida bombicola) (Pekin et al., 2005), en tot 45 g biosurfactans per L met een bacterie (Pseudomonas sp) (Trummler et al., 2003). I.4.2. Polyhydroxyalkanoaten (PHA’s) PHA‟s zijn een familie van polyesterverbindingen van hydroxyalkanoaten. Ze worden intracellulair, als granules, door bacteriën gesynthetiseerd wanneer deze blootgesteld worden aan fysiologische stress zoals beperkte aanwezigheid van bepaalde nutriënten, en een overmaat aan koolstof (Anderson et al., 1990; Lee, 1996). Als er terug voldoende nutriënten aanwezig zijn worden de polyester ketens afgebroken en doen ze dienst als energie- en koolstofbron (Dawes et al., 1973). Poly-β-hydroxyalkanoaten zijn de meest voorkomende PHA‟s. Hun chemische structuur bestaat uit een alifatische C3-polyester ruggengraat met een alkylgroep op de β-positie, deze bepaalt de naam van de monomeer (Kadouri et al., 2005). Meer dan 150 verschillende types zijn reeds beschreven, allemaal met verschillende eigenschappen (Steinbuchel et al., 1995) Als de monomeer uit 3 tot 5 C-atomen bestaat wordt van korte keten PHA‟s gesproken, bestaat de monomeer uit 6 tot 16 C-atomen is het een medium keten PHA. In Figuur 4 zijn drie veel bestudeerde PHA‟s weergegeven: Polyhydroxybutyraat (PHB), Polyhydroxyvaleraat (PHV) en Polyhydroxybutyraatvaleraat (PHBV).
9
Figuur 4: Chemische structuur van 3 veel bestudeerde PHA's: Polyhydroxybutyraat (PHB); Polyhydroxyvaleraat (PHV); Polyhydroxybutyraatvaleraat (PHBV). I.4.2.1. Toepassingen In Tabel 1 worden bedrijven weergegeven die PHA‟s produceren of er onderzoek naar doen. Hieruit blijkt dat de meeste toepassingen zich situeren in de verpakkingsindustrie als bioplastics, in de medische sector en als grondstof voor andere chemische processen. Verder worden vier grote groepen van toepassingen besproken: toepassingen als biopolymeren, - als energiebron, als prebiotica en toepassingen in de medische industrie. Tabel 1: Bedrijven die PHA produceren of er onderzoek naar doen (Chen, 2009) Bedrijf
Type PHA
Productieschaal(t/j)
Periode
toepassing
ICI, Verenigd Koninkrijk Chemie Linz, Oostenrijk btF, Oostenrijk Biomers, Duitsland BASF, Duitsland Metabolix, VS Tepha, VS ADM, VS (met Metabolix) P&G, VS Monsanto, VS Meredian, VS Kaneka, Japan (met P&G) Mitsubishi, Japan Biocycles, Brazilië Bio-On, Italië Zhejiang Tian An, China Jiangmen Biotech Ctr, China Yikeman, Shandong, China Tianjin Northern Food, China Shantotu Lianyi Biotech, China Jiang Su Nan Tian, China Shenzhen O‟Bioer, China Tianjin Green Bio-Science (+DSM) Shandong Lukang, China
PHBV PHB PHB PHB PHB, PHBV Verschillende PHA Verschillende PHA Verschillende PHA Verschillende PHA PHB, PHBV Verschillende PHA Verschillende PHA PHB PHB Onduidelijk PHBV PHBHHx Onduidelijk PHB Verschillende PHA PHB Verschillende PHA P3HB4HB Verschillende PHA
300 20–100 20–100 Onbekend Piloot opstelling Onbekend Onbekend 50000 Op bestelling Plant PHA productie 10000 Onbekend 10 100 10000 2000 Onbekend 3000 Piloot opstelling Piloot opstelling Piloot opstelling Onbekend 10000 Piloot opstelling
1980s tot 1990s 1980s 1990s 1990s tot nu 1980s tot 2005 1980s tot nu 1990s tot nu 2005 tot nu 1980s tot 2005 1990s 2007 tot nu 1990s tot nu 1990s 1990s tot nu 2008 tot nu 1990s tot nu 1990s 2008 tot nu 1990s 1990s tot 2005 1990s tot nu 2004 tot nu 2004 tot nu 2005 tot nu
Verpakkingsmateriaal Verpakkingsmateriaal & medisch Verpakkingsmateriaal & medisch Verpakkingsmateriaal & medisch Mengsel met Ecoflex Verpakkingsmateriaal Medische bio-implantaten Grondstotffen Verpakkingsmateriaal Grondstotffen Grondstotffen Verpakkingsmateriaal Verpakkingsmateriaal Grondstotffen Grondstotffen Grondstotffen Grondstotffen Grondstotffen Grondstotffen Verpakkingsmateriaal & medisch Grondstotffen Onbekend Grondstotffen & Verpakkingsmateriaal Grondstotffen & medisch
10
Biopolymeren en bioplastics PHA‟s kunnen gebruikt worden om biodegradeerbare, olie-onafhankelijke plastics te maken. Vanaf 1980 is men hiermee begonnen omdat men dacht dat de olieprijs sterk zou stijgen waardoor de PHA-plastics een economisch valabel alternatief zouden zijn (Philip et al., 2007). De olieprijs steeg echter pas sterk na 2000 (tot 140$ per barrel in 2008), tussen 1980 en 2000 bleven de investeringen dan ook beperkt of stopten, na 2000 was er een hernieuwde interesse in de productie van olie-onafhankelijke plastics. Dit is duidelijk zichtbaar in Tabel 1, de bedrijven die verpakkingsmateriaal maakten in de 1980s en 1990s hielden er bijna allemaal mee op voor 2000. Ondanks het feit dat de huidige olieprijs terug lager is dan in 2008 is er toch nog steeds een grote interesse in PHA‟s als grondstof voor bioplastics omdat ze milieuvriendelijker zijn dan klassieke plastics, en dankzij de veel verschillende beschikbare monomeren is de productie van plastics met uiteenlopende eigenschappen mogelijk. Een voorbeeld is BIOPOL®, dit is een copolymeer van PHB en PHV, in Figuur 4 staat BIOPOL® weergegeven als PHBV. Het is een thermoplastic met smeltpunt van 140-180°C. Hoe meer PHV er in het mengsel zit, hoe elastischer het polymeer (Philip et al., 2007). BIOPOL® wordt voor vele doeleinden gebruikt, onder andere als verpakkingsmateriaal of als deklaag op papier, karton of film. Het heeft antistatische eigenschappen waardoor het gebruikt kan worden voor de verpakking van elektrische en elektronische dingen. Het wordt ook gebruikt voor de productie van visnetten en touwen omwille van zijn sterkte en biodegradeerbaarheid en er worden shampoo- en motorolie-flessen mee gemaakt (Philip et al., 2007). Daarnaast wordt het gebruikt in de medische sector als inwendige hechtdraad omdat het niet toxisch is en omdat het lichaam het zelf kan afbreken zodat de draadjes niet verwijderd moeten worden (Chen, 2009). Energie Door middel van zure hydrolyse kunnen PHB en medium-keten PHA‟s omgezet worden in respectievelijk 3-hydroxybutyraat methyl ester (3HBME) en medium-keten hydroxyalkanoaat methyl esters (3HAME) (Zhang et al., 2009). Deze verbindingen hebben een verbrandingswarmte van respectievelijk 20 kJ per g en 30 kJ per g. De verbrandingswarmte van ethanol ter vergelijking bedraagt 27 kJ per g. Toevoeging van 10% 3HBME of 3HAME aan ethanol verhoogt de verbrandingswarmte naar 30 en 35 kJ per g. Toevoeging van 3HBME of 3HAME aan n-butanol of n-propanol zorgt voor een lichte daling van de verbrandingswarmte. Ook toevoeging aan diesel of benzine verlaagt de verbrandingswarmte een klein beetje, maar 3HBME-diesel of 3HBME-benzine en 3HAMEdiesel of 3HAME-benzine zijn nog redelijk bruikbaar als brandstof (Zhang et al., 2009). Volgens een schatting van Chen (2009) zou de productiekost van biobrandstoffen die afgeleid zijn van PHA‟s, en die geproduceerd worden uit afvalwaters en/of actief slib rond de 1200$ per ton liggen (Zhang et al., 2009). Hierbij komt nog dat PHA-afgeleide brandstoffen die geproduceerd worden uit afval geen controverse veroorzaken omtrent het gebruik van landbouwgebied en eetbare gewassen voor de productie van energie.
11
Prebiotica Het is geweten dat korte-keten vetzuren zoals acetaat, propionaat en butyraat positieve effecten hebben op de gezondheid in, en de gezondheid van, de dikke darm (Scheppach, 1994). Dit komt onder meer door hun antimicrobiële en antivirale eigenschappen (Bergeim, 1940). Uit dierproeven is gebleken dat acetaat onder andere voor een goede doorbloeding van de dikke darm zorgt, butyraat vormt de hoofdenergiebron van epitheelcellen van het colon en speelt een preventieve rol in colon-ontstekingen (Scheppach, 1994). Butyraat heeft ook anticarcinogene eigenschappen. Het zou de groei van kankercellen inhiberen via acetylatie van bepaalde histonen (Scheppach et al., 1995). PHB bevat butyraat, en uit onderzoek is gebleken dat PHB in het gastro-intestinaal stelsel van verschillende dieren kan worden afgebroken waardoor hier butyraat wordt vrijgesteld (Defoirdt et al., 2009). Op deze manier vormt PHB een prebioticum. Dit principe wordt al op toegepast in de aquacultuur waar PHB een alternatief kan vormen voor een aantal klassieke antibiotica (Defoirdt et al., 2009). Uit onderzoek blijkt ook dat het gebruik van PHB producerende bacteriën als probioticum hetzelfde effect kan hebben (Dang et al., 2009). Medisch Dankzij hun biocompatibiliteit en hun biodegradeerbaarheid worden PHA‟s ook gebruikt in de medische industrie, onder andere als materiaal voor hechtingen, pleisters, orthopedische pinnen, syntetische hartkleppen, weefselbegeleidende materialen, etc. (Chen et al., 2005). Ze worden ook gebruikt om capsules te maken voor medicijnen zodat deze op de juiste plaats en op het juiste tijstip vrijkomen in het lichaam (Koosha et al., 1989). I.4.2.2. Productie PHA‟s worden door veel bacteriën intracellulair geproduceerd als een reservestof (Anderson et al., 1990; Lee, 1996). Ze worden ook weer afgebroken en doen dienst als energiebron. Productieprocessen moeten dus zo ontworpen worden dat bacteriën opgekweekt worden in omstandigheden waarin er een optimale PHA-productie is, en ze moeten afgeoogst worden als het PHA-gehalte maximaal is. Dit gebeurde in eerste instantie doormiddel van batch-processen omdat deze goed te controleren zijn, later werden ook fed-batch, en continue processen ontwikkeld. In eerste instantie werd gebruik gemaakt van pure culturen en dure grondstoffen zoals glucose. Dit zorgde ervoor dat de productiekost zeer hoog was en PHA‟s niet konden concurreren met alternatieve producten. (ca. 9€ per kg voor PHA‟s en ca. 1€ per kg voor synthetische polymeren (Serafim et al., 2004)) Aangezien de kost voor de grondstoffen tot 30% van de totale productiekost kan zijn (Choi et al., 1997), kan het gebruik van secundaire- en hernieuwbare grondstoffen een sterke kostenverlaging met zich meebrengen. Een substraat met een hoog gehalte aan korte keten vetzuren zoals acetaat, propionaat en butyraat kan een hoge opbrengst leveren. Daarnaast kan er gebruik gemaakt worden van niet-steriele mengculturen in plaats van steriele zuivere culturen. Dit vergemakkelijkt ook het gebruik van complexe groeimedia omdat de microbiële populatie zich 12
constant kan aanpassen aan veranderingen in het medium (Serafim et al., 2004). Natuurlijke selectie in de mengcultuur gebeurt op basis van de PHA opslag-capaciteit, dus sterilisatie is niet meer nodig. Dit draagt allemaal bij tot een verlaagde productiekost. Het idee om PHA‟s te produceren met mengculturen kwam voort uit het besef dat PHB een rol speelde als metabolische intermediair tijdens microbiële processen die plaatsvinden in de waterzuivering, met name in de biologische fosfaatverwijdering (Rees et al., 1993; Rodgers et al., 2010). Dit proces bestaat uit twee fases, eerst een anaerobe fase waarin de aanwezige organische C-verbindingen omgezet worden in PHB, deze stap gaat gepaard met extra excretie van fosfaat. Tijdens de tweede, aerobe, fase wordt het opgeslagen PHB opnieuw verbruikt als energiebron. Tijdens dit proces wordt fosfaat uit de oplossing opgenomen in de cel, en opgeslagen als poly-P molecules, ook een reservestof (Mino et al., 1998). De bacteriën die tijdens dit proces aangerijkt worden noemt men fosfaat accumulerende organismen (PAO‟s) of poly-P bacteriën (Serafim et al., 2008). Er bestaan ook glycogeen accumulerende bacteriën (GAO‟s), deze maken tijdens de aerobe fase glycogeen aan in plaats van poly-P. Hier wordt geen fosfaat uit het water verwijderd dus deze bacteriën spelen geen rol in de biologische fosfaatverwijdering, maar kunnen wel PHB produceren tijdens een feast-famine proces (Serafim et al., 2008). Feast-famine Het feast-famine proces is een veelbelovende productiemethode voor PHA‟s, en ze kan toegepast worden op mengculturen (Reis et al., 2003). Actief slib wordt achtereenvolgens onderworpen een fase waarin er veel C-substraat beschikbaar is (feast) en waarin er geen C-substraat beschikbaar is (famine). Tijdens de feast-periode is er groei en zullen bepaalde bacteriën koolstof opslaan onder de vorm van PHA‟s. Tijdens de famine-periode kunnen deze PHA‟s dan gebruikt worden als energiebron. De micro-organismen die PHA‟s kunnen opslaan hebben een competitief voordeel ten opzichte van de micro-organismen die dit niet kunnen aangezien ze de famine-periode beter kunnen overleven. Zij zullen dominant worden (Serafim et al., 2004). De PHA-opbrengst die met deze methode gehaald kan worden ligt op 62% van de droge stof (Satoh et al., 1998). Dit is nog laag in vergelijking met de productie door zuivere culturen, en met dure, zuivere grondstoffen waar 80% gehaald wordt, maar optimalisatie van het proces is nog in volle gang, er kan nog vooruitgang geboekt worden (Serafim et al., 2004).
I.5. Doel van dit eindwerk In het kader van dit eindwerk werd onderzocht of het duurzame energie probleem en het afvalprobleem met elkaar verbonden kunnen worden om tot een win-win oplossing te komen. Er werd gekeken of mogelijk is om hoogwaardige microbiële lipiden rechtstreeks uit ruw afvalwater te winnen door gebruik te maken van actief slib systemen die al gebruikt worden in de waterzuivering. Er werd specifiek gekeken naar mycolinezuren, polyhydroxyalkanoaten en
13
verschillende toepassingen hiervan, onder andere als energiebron of als grondstof voor andere industrieën. Voor de productie van mycolinezuren werd geprobeerd om een actief slib aan te rijken aan Mycolata zoals Gordonia amarae. Er werd getracht schuimvorming of drijvend slib te creëren. Dit slib of deze schuim zou afgeoogst kunnen worden en er zouden mycolinezuren uit gewonnen kunnen worden. Door het schuim als een product te behandelen wordt zo tegelijkertijd een mogelijke oplossing voor het schuimvormingsprobleem geboden. Voor de productie van PHA‟s werd nagegaan of het (economisch) mogelijk en relevant is het feast-famine proces in de praktijk toe te passen op echt industrieel afvalwater. Ook hier werd gewerkt met reeds aanwezige bacteriën door te starten met een actief slib afkomstig uit een waterzuiveringsinstallatie die biologische fosfaatverwijdering toepast.
14
II. Materiaal en Methoden Tijdens deze masterproef werden veel verschillende analysetechnieken gebruikt. In deel 1 van dit hoofdstuk wordt hiervan een overzicht gegeven. Voor de uitgevoerde experimenten was telkens actief slib en afvalwater nodig, in deel 2 van dit hoofdstuk wordt besproken waar dit slib en dit afvalwater vandaan kwamen en hoe ze geanalyseerd werden. De uitgevoerde experimenten in verband met de productie van hoogwaardige microbiële lipiden worden beschreven in deel 3 (mycolinezuren) en deel 4 (PHA‟s) van dit hoofdstuk.
II.1.
Analysemethoden
II.1.1. Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik (CZV) Voor de bepaling van de totale CZV van een staal werd gebruik gemaakt van de kaliumdichromaatmethode (Greenberg et al., 1992). De CZV die aanwezig is in een staal reageert met een gekende hoeveelheid kaliumdichromaat, de overschot van dit kaliumdichromaat wordt dan getitreerd met een ijzerammoniumsulfaatoplossing. De CZV van het staal moet tussen 100- en 700 mg O2 per liter liggen, indien het hoger is moet het staal verdund worden. In een glazen destructiebuis met geslepen nek werd aan 20 mL staal, 10 mL 0.25Nkaliumdichromaat-oplossing toegevoegd. Daarna werd er 0.4 g kwiksulfaat bijgedaan om de vrije chloride te complexeren. Hierbij werd voorzichtig nog 30 mL zilversulfaat oplossing gevoegd. Dan werd een glazen koelbuis op de destructiebuis geplaatst en werd de oplossing geschud zodat de water- en de zuurlaag goed gemengd werden. Vervolgens gingen de stalen exact 2u in een verwarmingsblok bij 150°C. Daarna werden ze terug afgekoeld tot op kamertemperatuur, de koelbuizen werden met gedeïoniseerd water gespoeld terwijl ze nog op de buizen stonden om staal dat hierin gecondenseerd was terug in de destructiebuis te krijgen. Dan werd 0.5 mL ferroïne indicator toegevoegd. De overschot kaliumdichromaat werd vervorlgens getitreerd door middel van een ijzerammoniumsulfaat-oplossing tot de indicator van blauw-groen in rood-bruin verandert. Er werd ook telkens een blanco ( 20mL gedeïoniseerd water) meegenomen, en de titer van de kaliumdichromaat oplossing werd elke keer opnieuw bepaald. De bepaling van de titer gebeurde als volgt: 10 mL kaliumdichromaat werd tot 100 mL aangelengd met gedeïoniseerd water, hieraan werd 20 mL geconcentreerd zwavelzuur toegevoegd. Nadat deze oplossing afgekoeld was werd ze op dezelfde manier als de stalen getitreerd. Berekeningen: 10 x 0.25 n n = getitreerd volume ijzerammoniumsulfaat (mL)
Titer: t ( N )
15
CZV: CZV (mgO2 / L) A B t Vs
( A B) x t x 8 x 1000 VS
= Getitreerd volume ijzerammoniumsulfaat voor de blanco (mL) = Getitreerd volume ijzerammoniumsulfaat voor het staal (mL) = Titer = Volume van het staal (mL) (indien een verdunning gebruikt werd moet hier het volume van het staal genomen worden dat initieel gebruikt werd om de verdunning te maken)
II.1.2. Bepaling van het biologisch zuurstofverbruik (BZV) Voor de bepaling van de BZV van een staal werd gebruik gemaakt van de OXITOP-methode (Kuokkanen et al., 2004). Een welbepaald volume staal werd in een bruine fles gebracht, hierbij werd een kleine hoeveelheid microbieel inoculum gedaan, bijvoorbeeld een schepje bodem. Deze fles werd afgesloten met een elektronische stop die drukverschillen kan meten en weergeven. De fles werd gedurende 5 dagen geïncubeerd bij 20°C. In deze periode verbruikten de bacteriën uit het inoculum de zuurstof die aanwezig was in de fles. Hierdoor daalde de druk in de fles want het geproduceerde CO2 werd opgevangen door natriumhydroxide korrels die zich onder de stop bevonden. De stop mat het drukverschil en gaf de hoeveelheid O2 weer die verbruikt werd in mg per L. II.1.3. Bepaling van de totale ammonium-stikstof (TAN) Voor de bepaling van de TAN werd gebruik gemaakt van de distillatiemethode (Greenberg et al., 1992). 20 mL staal (of 20 mL van een verdunning) werd door toevoeging van 0.4 g magnesiumoxide (MgO) zwak alkalisch gemaakt en gedistilleerd. Het ammoniak dat hieruit komt werd opgevangen in een 10 mL boorzuur-indicator oplossing en werd gebonden als een ammoniumboraat complex ((NH4)3BO3). Deze oplossing werd getitreerd met HCl tot een pH van 5.3. Berekeningen: NH4-N: A B t Vs
NH 4
N (mg / L)
(A
B) x t x 14 x 1000 VS
= Getitreerd volume HCl voor het staal (mL) = Getitreerd volume HCl voor de blanco (mL) = Titer van de HCl-oplossing = Volume van het staal (mL) (indien een verdunning gebruikt werd moet hier het volume van het staal genomen worden dat initieel gebruikt werd om de verdunning te maken)
16
II.1.4. Bepaling van het zwevende stof gehalte en de vluchtige fractie hiervan (Total suspended solids (TSS) en Volatile suspended solids (VSS)) Voor de bepaling van de TSS werd de centrifugaalmethode gebruikt zoals beschreven in NBN 366.01 (1956). De VSS werd bepaald na verassing bij 600°C. Een goed gehomogeniseerd staal werd gedurende 10 minuten gencentrifugeerd bij 10000 g. De pellet werd overgebracht in een porseleinen kroesje waarvan het tarra-gewicht gekend was. De pellet werd overnacht gedroogd bij 105°C, zodat al het water eruit verdampte. De volgende dag, nadat het kroesje in een desiccator afgekoeld was tot kamertemperatuur werd het opnieuw gewogen. Daarna werd het kroesje met de droogrest gedurende 2u bij 600°C verast in een moffeloven, hierbij verdween al het organisch materiaal uit het staal, datgene dat achterbleef werd de asrest genoemd. Na opnieuw afkoelen tot kamertemperatuur in een desiccator werd nogmaals het gewicht bepaald. Berekeningen: TSS:
Total Suspended Solids (g/L) = X1 X2 VS
VSS:
( X 2 X 1) x 1000 VS
= Tarragewicht van het kroesje (g) = Gewicht van het kroesje en de pellet na overnacht drogen bij 105°C (g) = Volume van het staal in (mL)
Volatile Suspended Solids (g/L) = X2 X3 VS
( X 2 X 3) x 1000 VS
= Gewicht van het kroesje en de pellet na overnacht drogen bij 105°C (g) = Gewicht van het kroesje en de pellet na 2u drogen bij 600°C (g) = Volume van het staal in (mL)
II.1.5. Ionenchromatografie De bepaling van het sulfaat-, fosfaat-, chloride-, nitraat-, en nitrietgehalte gebeurde door middel van een Dionex ionenchromatograaf (IC 761 Compact, Metrohm) met een AS9HC kolom en een Metrosep A 4/5 guardkolom. Het eluent bestond uit 3,2 mM Na2CO3 en 1,0 mM NaHCO3 bij een debiet van 0,7 mL min per minuut. Er werden stalen van 10 mL gebruikt na filtratie door een 0,45 μm filter (Millex). De detector werkt aan de hand van elektrochemische conductiviteit. II.1.6. Analyse van de vluchtige vetzuren Voor de bepaling van vluchtige vetzuren werd gebruik gemaakt van capillaire gaschromatografie (Instruction manual GC 8000 Top series - CE Instruments). Bij 2 mL staal werd in een centrifugeerbuisje 0.5 mL zwavelzuur (1/1) gevoegd, hierbij kwam 0.4 g NaCl, 0.4 mL interne standaardoplossing en 2 mL diethyl-ether De interne standaardoplossing bestond uit 1500 µL 2-methylhexaanzuur in 200 mL gedeïoniseerd water. Dit mengsel werd gedurende 2 minuten langzaam geschud. Dan werd het gedurende 3 minuten 17
gecentrifugeerd bij 3000 g. Vervolgens werd de etherlaag overgebracht in een vitatron tube die afgesloten werd met een dop met een blauw-wit septum. Daarna volgde de gas-chromatografie. Er werd gebruik gemaakt van een GC-2014 (Shimadzu) met een FID detector en split injector. Het injectie-volume was 1 µL en het temperatuurprofiel werd ingesteld van 110°C tot 160°C, met een stijging van 6°C per minuut. Er werd gebruik gemaakt van een capillaire vetzuurvrije kolom (EC-1000 Econo-Cap kolom (Alltech, Laarne, Belgium), 25 m × 0.53 mm; film dikte 1.2 µm). Het draaggas was stikstof (20 mL per minuut) en de temperatuur van de injector en de detector bedroegen respectievelijk 200°C en 220°C. II.1.7. Bepaling van het fosfaat-gehalte Voor de bepaling van het fosfaatgehalte in een staal werd gebruik gemaakt van de scheelmethode, een spectrofotometrische methode (Gabriels et al., 1985; Greenberg, 2005). In een zure omgeving geven orthofosfaat- (=oplosbaar fosfaat) en molybdaat-ionen aanleiding tot de vorming van oplosbare fosfomolybdaten. Deze worden omgezet in molybdeenblauw door selectieve reductie met methol (=mono-methyl-p-aminofenolsulfaat). Molybdeen blauw kan spectrofotometrisch gemeten worden bij een golflengte van 700nm. Voor een exacte beschrijving verwijs ik naar de gegeven referenties. II.1.8. Denaturating gradient gelelektroforese (DGGE) DGGE werd gebruikt voor de microbiële analyse van startmateriaal. Deze techniek werd specifiek toegepast om na te gaan of er Actinomyceten aanwezig waren in het materiaal waarin geprobeerd werd Mycolata aan te rijken. DNA extractie werd uitgevoerd volgens een aangepast protocol gebaseerd op (ElFantroussi et al., 1997) en (El Fantroussi et al., 1999). Voor het exacte protocol wordt naar Bijlage 1: DNA extraction from sludge and soil verwezen. Voor de amplificatie van het DNA werd gebruik gemaakt van een nested-PCR. De eerste PCR werd uitgevoerd met primers F 243 en R 1378, specifiek voor Actinomyceten. Het gebruikte programma bestond uit 35 cycli van 1 minuut denaturatie bij 95°C, 1 minuut vasthechting van de primers bij 63°C en 2 minuten elongatie bij 72°C. De tweede PCR bestond uit 30 cycli van hetzelfde programma als hierboven beschreven en gebeurde met de algemene primers F GC338 en R 518 (Boon et al., 2002). „GC‟ in F GC338 wil zeggen dat aan deze primer een GC-klem toegevoegd is. Dit zorgt ervoor dat de twee DNA strengen tijdens de DGGE-analyse niet van elkaar loskomen. De amplificatieproducten werden na elke PCR ter controle geanalyseerd door elektroforese op een 1% agarose gel in TAE 1X buffer met ethidiumbromide kleuring. De DGGE werd gedurende 16u bij 60°C en 120V gelopen in TAE 1X buffer op een 6% (w/v) polyacrylamidegel met een 40-60% denaturatie gradiënt van ureum en formamide. Er werd gebruik gemaakt van het INGENYphorU systeem. Kleuring van de gel gebeurde met SYBR Green I. De analyse gebeurde met Bionumerics software version 5.1 (Applied Maths, Sint18
Martens-Latem, België). Het gebruikte protocol is bijgevoegd in Bijlage 2: DGGE Ingeny protocol II.1.9. Bepaling van het PHB-gehalte PHB werd zowel op een kwalitatieve- als een kwantitatieve manier bepaald. Kwalitatieve meting van PHB gebeurde microscopisch door middel van een kleuring met de fluorescente kleurstof „Nile Blue A‟ (Ostle et al., 1982). Verwerking van de beelden werd gedaan met ImageJ. Voor de kwantitatieve bepaling werd een spectrofotometrische methode gebruikt die gebaseerd is op de methode beschreven in (Kaynar et al., 2009). Omdat er heel wat tijd gekropen is in het op punt stellen van deze methodes is een gedetailleerde beschrijving ervan terug te vinden in het hoofdstuk „Resultaten‟.
II.2.
Startmaterialen voor de experimenten
II.2.1. Oorsprong Voor de uitgevoerde experimenten was telkens actief slib en afvalwater nodig, in dit deel wordt besproken waar dit slib en dit afvalwater vandaan kwamen en hoe ze geanalyseerd werden. Er werden water- en slibstalen genomen uit waterzuiveringsinstallaties op vier locaties: Agristo, een aardappelverwerkend bedrijf in Harelbeke; Imperial Meat Products (IMP), een vleesverwerkend bedrijf in Gent; Rioolwaterzuiveringsinstallatie Ossemeersen (Aquafin) in Gent; en Cofely Services, een waterzuiveringsinstallatie die water zuivert van Genencor ,een enzymproducerend bedrijf uit Brugge. Uit de installaties van Agristo en Imperial Meat products werden meerdere stalen genomen uit verschillende delen van de waterzuiveringsinstallatie. Uit de installaties van Ossemeersen en Cofely Services werd enkel actief slib gehaald. Agristo bezit een waterzuiveringscomplex waarbij het proceswater mechanisch wordt voorgezuiverd, daarna volgen een anaerobe en aerobe biologische zuivering en voor de laatste zuivering gebruikt men een biologische membraanfilter. De anaerobe biologische zuivering gebeurt door middel van een „upward-flow anaerobic sludge blanket‟. De aerobe biologische zuivering is de klassieke nitrificatie, gevolgde door de (anaerobe) denitrificatie. Slib wordt behandeld in een fermentor met CH4-winning. Bij IMP wordt het proceswater ook eerst mechanisch gefilterd, daarna gaat het door een vetflotatietank, gevolgd door een aerobe tank met intervalbeluchting (biologische zuivering) en tenslotte een slibflotatietank. Een deel van het slib uit de slibflotatietank wordt met het waterige effluent van de vetflotatietank gemengd vooraleer het naar de aerobe tank gepompt wordt, dit wordt gedaan om de nodige micro-organismen voor de biologische zuivering te recupereren. Overmaat slib wordt gedumpt op een stortplaats.
19
De plaatsten in de zuiveringsinstallaties waar de verschillende water- en slibstalen werden genomen, zijn weergegeven in Tabel 2.
Tabel 2: De plaatsen in de zuiveringsinstallaties waar de verschillende water- en slibstalen werden genomen, en de afkortingen die ervoor gebruikt worden in Hoofdstuk III.
Agristo
Imperial Meat Products
IA
Influent Agristo
Na de mechanische filter
DA
Denitrificatie Agristo
Uit de denitrificatietank
NA
Nitrificatie Agristo
Uit de nitrificatietank
EA
Effluent Agristo
Effluent net voor lozing
IM
Influent Meat
Voor de mechanische filter
EVM
Effluent vetflotatie Meat
Waterige fractie na de vetflotatietank
BM
Biologische zuivering Meat
Beluchtingsbekken (in open lucht)
SM
Slib uit slibflotatietank Meat Slibfractie uit de slibflotatietank
EM
Effluent Meat
Effluent net voor lozing
De rioolwaterzuiveringsinstallatie van Ossemeersen in Gent is een klassieke installatie met een mechanische voorzuivering en een biologische zuivering met actief slib. De slibstalen werden uit het beluchtingsbekken genomen. De waterzuiveringsinstallatie van Cofely Services is een phoredox 5-staps systeem., een systeem dat biologische fosfaatverwijdering toepast, dit zorgt voor een verhoogde aanwezigheid van PHA-producerende bacteriën in het actief slib. De slibstalen werden genomen van het slib dat naar de eerste anaerobe reactor gerecirculeerd werd. II.2.2. Analyses Van verschillende stalen van Agristo en IMP werden de CZV, BZV, NH4-N, TSS, VSS, het gehalte aan verschillende ionen (Chloride, Nitriet, Nitraat, Fosfaat, Sulfaat) en het gehalte aan vluchtige vetzuren bepaald. Door middel van een DGGE werd getest voor de aanwezigheid van Actinomyceten in actief slib en influent water. Op het actief slib uit de installaties van Ossemeersen en Cofely Services werden geen specifieke analyses uitgevoerd. Het diende enkel als startmateriaal in verschillende experimenten. 20
II.3. Experimenten betreffende de productie van hoogwaardige microbiële lipiden door selectie op slibflotatie en schuimvorming Er werden verschillende experimenten uitgevoerd om floterend slib en/of schuimvorming te induceren. Voor deze experimenten werd gebruik gemaakt van „sequencing batch reactors‟ (SBR‟s) met voeding aan het begin van elke cyclus, en microbiële mengculturen die reeds aanwezig zijn in de huidige waterzuiveringsinstallaties. II.3.1. Experiment 1: Niet-geholpen flotatie II.3.1.1. Cyclus van 48u Met dit experiment werd geprobeerd actief slib aan te rijken aan bacteriën die flotatie en/of schuimvorming veroorzaken of bevorderen. Hiervoor werd telkens de bovenste fractie, na 15 minuten sedimentatie, uit een SBR als ent voor een nieuwe SBR gebruikt. Om te starten werd 0.2 L slib samen met 1 L voeding in een plastieken Erlenmeyer van 2 L op een schudtoestel geplaatst bij 28°C, er werd continu actief belucht. Na 48u werd de oplossing in een Imhoff-kegel gebracht om te bezinken. Na 15 minuten bezinken werd de bovenste 200mL afgenomen en opnieuw geïncubeerd met 1L verse voeding, dit was het startpunt (t0) van het experiment. In Figuur 5 is een schematische voorstelling weergegeven.
Figuur 5: Schematische weergave van de opzet en het doel van experiment 1: niet-geholpen flotatie
21
Als startmateriaal werd gebruik gemaakt van aeroob actief slib van Agristo, IMP en Ossemeersen. Het slib van Agristo kwam uit de nitrificatietank, het slib van IMP uit de slibflotatietank en het slib van Ossemeersen uit de beluchtingstank. Als voeding werd gebruik gemaakt van influent water van de verschillende zuiveringsinstallaties. Agristo en IMP werden gekozen omdat hun afvalwater rijk is aan hoogenergetische, en „vette‟ verbindingen. De combinaties waarin het slib en de verschillende influenten gecombineerd werden zijn weergegeven in Tabel 3. In SBR 1 en 2 werden slib en influenten van dezelfde zuiveringsinstallaties gecombineerd, in SBR 3 werd influent van IMP gecombineerd met slib uit de installatie van Ossemeersen om na te gaan als een „normaal‟ slib, enkel onder invloed van de influentsamenstelling, in een „vet‟ floterend slib kan veranderen.
Tabel 3: De slib en voeding combinaties in de verschillende sequencing batch reactoren (SBR's) die gebruikt werden tijdens Experiment 1. SBR 1
Influent van Agristo + Aeroob actief slib van Agristo
SBR 2
Influent van IMP + Aeroob actief slib van IMP
SBR 3
Influent van IMP + Aeroob actief slib van Ossemeersen
Gedurende 4 cycli (8 dagen) werden de CZV en de VSS in de totale oplossing en in de bovenste fractie opgevolgd. Gram CZV per gram VSS werd als maat voor het vetgehalte van het slib genomen. Daarna werd het experiment nog 4 cycli verder uitgevoerd, maar de CZV/VSS werd niet meer bepaald, er werd enkel visueel nagegaan als er schuimvorming optrad, of als er een aanrijking was aan floterend slib. II.3.1.2. Cyclus van 24 uur Dit experiment was exact hetzelfde als het experiment beschreven in 3.1.1, enkel de cycluslengte werd van 48u naar 24u teruggebracht. CZV en VSS werden niet bepaald, er werd enkel visueel gekeken of er flotatie of schuimvorming optrad. Het experiment werd 10 cycli (10 dagen) gelopen. II.3.2. Experiment 2: Geholpen flotatie Experiment 2 had dezelfde basisopstelling als experiment 1 met de additie dat er een aantal manieren getest werden om de selectie van de bacteriën die flotatie en schuimvorming veroorzaken te bevorderen. In Tabel 4 is een overzicht van de verschillende testen weergegeven. Er werden in totaal 9 SBR‟s opgestart, per combinatie van influent en slib die ook gebruikt werden in Experiment 1 werden drie methodes toegepast die hieronder beschreven worden.
22
Tabel 4: De verschillende testen die werden uitgevoerd bij elke sequencing batch reactor (SBR) tijdens experiment 2. SBR 1a + Poly-elektrolyt SBR 1b + Lucht Influent van Agristo + Aeroob actief slib van Agristo SBR 1c + Olie SBR 2a + Poly-elektrolyt SBR 2b + Lucht Influent van IMP + Aeroob actief slib van IMP SBR 2c + Olie SBR 3a + Poly-elektrolyt SBR 3b + Lucht Influent van IMP + Aeroob actief slib van Ossemeersen SBR 3c + Olie
II.3.2.1. Poly-elektrolyten Poly-elektrolyten zijn geladen macromoleculen. Ze kunnen de ladingen die in het actief slib aanwezig zijn neutraliseren en op die manier coagulatie ervan induceren. Dit kan zowel sedimentatie als flotatie bevorderen, afhankelijk van de hydrofobiciteit van het slib (hoe meer hydrofoob, hoe meer flotatie). Het doel hier was door toevoeging van poly-elektrolyt net voor de sedimentatie het slib te laten coaguleren en zo flotatie te stimuleren. Eerst werd door kleine testjes in falcon buisjes nagegaan hoeveel poly-elektrolyt toegevoegd moest worden aan de oplossing om voldoende coagulatie te krijgen. Nadat dit geweten was werden de batchexperimenten opgestart. Na elke cyclus, net voor de sedimentatiestap werd 100 µL poly-elektrolyt (Kemira Optifloc) toegevoegd aan de 1.2L uit de SBR. De rest van de cyclus verliep zoals beschreven voor experiment 1.
II.3.2.2. Gas Door fijne gasbelletjes in water te brengen kan flotatie gestimuleerd worden, de belletjes raken vastgehecht aan slibdeeltjes waardoor deze makkelijker beginnen drijven (Zlokarnik, 1998). Het doel was hier om, door net voor de sedimentatiestap fijne belletjes in de SBR-oplossing te brengen, flotatie te stimuleren. Net voor de sedimentatiestap, terwijl de oplossing al in de Imhoff-kegel zat, werd 100 mL Spabruis toegediend aan de 1.2 L. Dan werd de kegel afgedekt en goed geschud. Vervolgens werd de druk langzaam afgelaten door een kleine opening te maken in het deksel waardoor kleine belletjes ontstonden.
23
II.3.2.3. Olie In de plaats van gasbelletjes kan ook gebruik gemaakt worden van oliedruppeltjes. Als een paar druppels olie goed in de oplossing in de SBR gemengd worden net voor de sedimentatie kunnen bacteriën met een hydrofoob oppervlak hiermee in contact komen en eraan blijven plakken. Tijdens de sedimentatie zouden deze bacteriën dan mee naar het oppervlak moeten drijven (persoonlijke communicatie met Prof. Verstraete). In het experiment werd gebruik gemaakt van zuivere dieselolie. De hoeveelheid olie die toegevoegd werd aan de 1.2 L werd via volgende berekening bepaald: Het influent van Agristo bevat ongeveer 4 g CZV / L, dat van IMP ongeveer 2. Voor volgende berekening werd 2 g CZV / L gebruikt.
2 g CZV / L ca. 2g slib droge stof / L 1000 L ca. 1 kg slib DS De verwerking van 1 kg slib DS ca. 0.6 € Dieselolie ca. 1.27 € / L Maximum ca. 0.5 mL dieselolie / L influent gebruiken
10 minuten voor het einde van de cyclus werd 0.5 mL dieselolie aan de 1.2 L oplossing toegevoegd zodat dit nog goed gemengd kon worden. Na de sedimentatie werd gewoon zoals voorheen de bovenste 200 mL gebruikt als ent voor de volgende batch. II.3.3. Experiment 3: Laag opgelost zuurstof gehalte Experimenten 1 en 2 werden telkens uitgevoerd met actieve beluchting. door Zhao werd echter gevonden dat een laag opgelost zuurstof gehalte soms schuimvorming bevordert (Zhao et al., 2010). Om hier rekening mee te houden werden experimenten 1 en 2 herhaald maar dan zonder beluchting.
II.4.
Experimenten betreffende de productie van PHA’s
Voor deze experimenten werd gebruik gemaakt van SBR‟s van 1.5 L. Aangezien het de bedoeling was PHA te produceren door gebruik te maken van bestaande zuiveringsinstallaties en reeds aanwezige bacteriën, werd gekozen voor een feast-famine cyclus van 6 uur verdeeld in een anaeroob en aeroob deel gebaseerd op het biologisch fosfaatverwijderingsproces (Rodgers et al., 2010), zie ook „I.4.2.2‟. Als startmateriaal werd actief slib gebruikt uit de waterzuiveringsinstallatie van Cofely Services, een installatie die een biologisch fosfaatverwijderingsproces gebruikt. De cyclus van 6 uur ging als volgt: 10 minuten toevoeging van in totaal 1 L influent gevolgd door een anaerobe fase van 2 uur waarin niet belucht en niet gemixt werd. Hierna volgde een aerobe fase van 3 uur waarin het 24
mengsel ook gemixt werd aan 300 t/min. Daarna werden de beluchting en mixing opnieuw uitgeschakeld en volgden 15 minuten sedimentatie. Vervolgens werd in 30 minuten tijd 1 L effluent weggepompt. Daarna volgden nog 5 minuten rust vooraleer de cyclus opnieuw begon. Eenmaal per dag werd 100 mL van het mengsel weggepompt tijdens de aerobe fase, waarin de „mixed liquor‟ goed gemengd was. Zo werd een slibverblijftijd van ongeveer 15 dagen gehandhaafd. Er werd telkens gewerkt met 1 reactor, analyses in drievoud waren daardoor niet mogelijk. Wel werden de analyses elke keer uitgevoerd op 3 stalen die tegelijkertijd uit de reactor genomen werden zodat er toch foutenmarges berekend konden worden op de metingen zelf. Een foto van de opstelling is bijgevoegd in Bijlage 3: Foto van de opstelling van de reactor voor de productie van PHB.. II.4.1. Experiment 1: Synthetische voeding In experiment 1 werd een reactor opgestart zoals hierboven beschreven. Er werd gebruik gemaakt van een synthetisch influent met volgende samenstelling:
0.5 g NaAc-CZV / L, toegevoegd als 0.64 g NaAc / L 0.5 g Zetmeel-CVZ / L, toegevoegd als 0.5 g zetmeel 100 mg NH4-N / L, toegevoegd als 0.38 g NH4Cl 60 mg PO4-P / L, toegevoegd als 0.26 g KH2PO4 Kraantjes water
In deze reactor werd gedurende 1 maand de PHB-productie opgevolgd. Er werd ook gekeken naar de veranderingen in de gehaltes acetaat en fosfaat tijdens de anaerobe fase. II.4.2. Experiment 2: Voeding met effectief afvalwater Experiment 2 werd aansluitend op experiment 1 uitgevoerd. Er werd gebruik gemaakt van dezelfde reactor als in experiment 1, met het actief slib dat hierin reeds aanwezig was. Het enige verschil was dat er gebruik werd gemaakt van influent van Agristo dat verdund werd zodat een CZV-belasting van 2 g CZV per liter per cyclus werd toegediend. Dit kwam overeen met 8 g CZV per liter per dag. In deze reactor werd opnieuw gedurende 1 maand de PHB-productie opgevolgd. Er werd ook opnieuw gekeken naar de veranderingen in de gehaltes aan vluchtige vetzuren en fosfaat tijdens de anaerobe fase.
25
III.
Resultaten
Eerst worden de analyses van de startmaterialen getoond. Vervolgens worden de resultaten van de experimenten betreffende de stimulatie van de productie van hoogwaardige microbiële lipiden door selectie op slibflotatie en schuimvorming weergegeven. Dan worden de methodes voor de bepaling van het PHB-gehalte uitgelegd. Deze staan niet in „hoofdstuk II – Materiaal en Methoden‟, omdat de gebruikte protocols voor een deel zelf werden opgesteld en uitgewerkt. Als laatste worden de resultaten van de experimenten betreffende de productie van PHA‟s weergegeven.
III.1.
Analyse van de startmaterialen
III.1.1. Chemische analyses In Tabel 3 worden het CZV-, N-, P-, acetaat-, propionaat-, butyraat- en valeraatgehalte van de gebruikte influentwaters weergegeven (Influent van Agristo (IA); Influent van „imperial Meat pruducts‟ (IM)). De C/N- en C/P verhoudingen worden ook getoond. Het influent van Agristo bevatte met ca. 4 g/L de hoogste CZV; het influent van IMP bevatte ca. 2 g/L. In het influent van Agristo werden ook hoge concentraties vetzuren waargenomen van ca. 1 g/L acetaat en ca 0.5 en 0.6 g/L propionaat en butyraat. In het influent van IMP waren deze concentraties lager. In beide influenten werden relatief hoge fosfaat concentraties gevonden.
Tabel 5: Een aantal belangrijke eigenschappen (COD-, N-, P-, Acetaat-, Propionaat-, Butyraat- en Valeraatgehalte) van de gebruikte influentwaters. IM staat voor Influent van ‘imperial Meat products’; IA svoor Influent van Agristo. C/N en C/P zijn de respectievelijke verhoudigen van CZV/N en CZV/P. Alle waarden zijn het gemiddelde van 3 onafhankelijke metingen, en werden afgerond op 10 mg.
IM IA
CZV (mg/L) 1800 4100
N (mg/L) 20 130
P (mg/L) 70 360
C/N
C/P
90 32
26 11
Acetaat (mg/L) 120 1050
Propionaat (mg/L) 40 470
Butyraat (mg/L) 20 640
Valeraat (mg/L) / 280
III.1.2. Moleculaire analyses Er werd via moleculaire technieken nagegaan of er Actinomyceten, die bekend staan als 1 van de oorzaken van schuimvorming in waterzuiveringsinstallaties, aanwezig zijn in het influent en het actief slib van installaties van IMP en Agristo. In Figuur 6 worden de resultaten getoond van een DGGE-analyse van deze stalen met primers specifiek voor Actinomyceten. Het is duidelijk zichtbaar dat er „smiling‟ is opgetreden maar er kon toch nog bruikbare informatie uitgehaald worden. Elk bandje stelt een andere Actinomyceet voor, dus zowel in de influenten als in het actief slib werden verschillende Actinomyceten 26
aangetroffen. Aangezien Mycolata de meest voorkomende Actinomyceten in slib zijn kan hieruit afgeleid worden dat er wel degelijk Mycolata aanwezig zijn in de startmaterialen. Deze kunnen aldus aan de basis liggen van floterend slib. IMPERIAL MEAT PRODUCTS Influent Actief slib AGRISTO Influent Actief slib Figuur 6: Resultaten van een DGGE- analyse van de influenten en het actief slib van Imperial Meat Products en Agristo met primers specifiek voor Actinomyceten.
III.2. Experimenten betreffende de productie van hoogwaardige microbiële lipiden door selectie op slibflotatie en schuimvorming III.2.1. Experiment 1: Niet-geholpen flotatie III.2.1.1. Cyclus van 48 uur In Figuur 7 is voor vier opeenvolgende cycli de verhouding CZV/VSS uit de bovenste 200 mL van de Imhoff-kegel, na 15 minuten bezinken, weergegeven als een maat voor de „vetheid‟ van de bacteriën in deze bovenste 200 mL (de rode rechthoek in het kleine figuurtje rechtsboven in Figuur 7 toont de betreffende 200 mL). De hypothese achter dit experiment was dat na 15 minuten sedimentatie de „meest floterende en -schuimvormende bacteriën in deze bovenste 200 mL zouden zitten. Door deze selectief over de brengen in de volgende SBR werd gedacht dat na een aantal cycli een kritische concentratie bereikt zou worden waardoor schuimvorming zou optreden. De hoeveelheid floterend slib zou ook toenemen (Zie Figuur 5 voor een schematische voorstelling). Er werd gebruik gemaakt van actief slib en influenten van verschillende industriële waterzuiveringstations (Agristo en IMP) waar „vet‟ water, rijk aan hydrofobe-verbindingen, gezuiverd wordt. Er werd ook slib uit een huishoudelijk afvalwaterzuiveringsstation gebruikt om na te gaan of enkel door de influentsamenstelling flotatie of schuimvorming gestimuleerd kan worden. Er werden waarden gevonden tussen 2 en 4.5 gCZV/gVSS. Er werd geen stijging waargenomen na verschillende cycli; in de SBR‟s met slib van OSS + IMP en Agristo werd zelfs een daling waargenomen van respectievelijk ca 4.5 en 3.3 gCZV/gVSS naar ca 2.1 gCZV/gVSS. Het experiment werd nog gedurende 4 extra cycli opgevolgd maar zonder CZV/VSS te berekenen. Er 27
werd enkel visueel gekeken als er schuimvorming optrad of als er een aanrijking was aan floterend slib. Er werd echter noch schuimvorming, noch een verhoogde hoeveelheid floterend slib waargenomen. Figuur 8 geeft de VSS weer in de bovenste 200 mL na 15 minuten sedimentatie. Gedurende de 4 cycli blijft de VSS quasi stabiel, er is geen merkbare stijging van microbiële massa in de bovenste laag. Voor de SBR met Agristo slib en -influent schommelt de waarde rond 1.8 gram per liter. Zowel de SBR met slib en influent van IMP, als de SBR met slib van Ossemeersen en influent van IMP schommelen rond 0.5 gram per liter. In Figuur 9 is de CZV in de hele SBR weergegeven voor zowel het start- als het eindpunt van alle cycli. Op die manier is duidelijk zichtbaar dat er CZV verbruikt wordt tijdens elke cyclus. Er was dus wel degelijk activiteit in de SBR‟s, ze resulteerde echter niet in een aanrijking van floterende bacteriën in het actief slib. Het is ook goed zichtbaar dat de cycli van slib van IMP en OSS + IMP, die hetzelfde influent kregen, al samenvallen na 1 cyclus.
Figuur 7: Verhouding CZV/VSS uit de bovenste 200 mL van de Imhoff-kegel na 15 minuten bezinken aan het einde van elke cyclus. Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde Imhoff-kegel, de foutenbalken geven de standaardfout op het gemiddeld weer. De rode rechthoek in het figuurtje rechtsboven toont schematisch de 200 mL waarop de analyse uitgevoerd werd. OSS = Ossemeersen; IMP = Imperial Meat Products.
28
Figuur 8: De VSS in de bovenste 200 mL van de Imhoff-kegel na 15 minuten bezinken aan het einde van elke cyclus gedurende 4 cycli. Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde Imhoff-kegel, de foutenbalken geven de standaardfout op het gemiddelde weer. De rode rechthoek in het figuurtje rechtsboven toont schematisch de 200 mL waarop de analyse uitgevoerd werd. OSS = Ossemeersen; IMP = Imperial Meat Products.
Figuur 9: De CZV van het hele mengsel aan het begin en einde van elke cyclus (Start 1 = begin van cyclus 1; Eind 2 = Eind van cyclus 2). Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit hetzelfde mengsel, de foutenbalken geven de standaardfout op het gemiddelde weer. De rode rechthoek in het figuurtje rechtsboven toont schematisch het deel van het mengsel waarop de analyse uitgevoerd werd. OSS = Ossemeersen; IMP = Imperial Meat Products. 29
III.2.1.2. Cyclus van 24 uur Dit experiment had exact dezelfde opstelling als het vorige experiment, enkel de cycluslengte werd van 48u naar 24u teruggebracht om het effect hiervan na te gaan. CZV en VSS werden niet bepaald, er werd enkel visueel gekeken of er flotatie of schuimvorming optrad. Het experiment werd 10 cycli (10 dagen) gelopen. Er werd echter in geen van de 3 SBR‟s schuimvorming of verhoogde flotatie waargenomen. III.2.2. Experiment 2: Geholpen flotatie III.2.2.1. Poly-elektrolyt, gas en olie Poly-elektrolyt, gas en olie werden getest als hulpmiddel bij het induceren van flotatie. Polyelektrolyt omwille van zijn capaciteit om slibdeeltjes te laten coaguleren. Gasbelletjes omdat deze tussen of aan slibdeeltjes vast kunnen raken waardoor deze deeltjes beginnen drijven. Olie omdat kleine oliedruppeltjes zich kunnen vasthechten aan bacteriën met een hydrofoob uiterlijk waardoor deze bacteriën mee naar boven drijven. Tijdens deze experimenten werd enkel visueel gekeken naar schuimvorming of verhoogde flotatie van het actief slib. CZV/VSS werd niet berekend. Geen enkele van de voorgestelde behandelingen had een stimulerend effect op schuimvorming of flotatie. Enkel bij een toepassing van meer dan 100 mL dieselolie per liter „mixed liquor‟ werd een verhoogde flotatie van het actief slib waargenomen. Dit wordt getoond in Figuur 10.
Figuur 10: Flotatie van actief slib na toepassing van 100 mL dieselolie tijdens de laatste 10 minuten van de cyclus voor de sedimentatie.
30
III.2.3. Experiment 3: Laag opgelost zuurstof gehalte Om na te gaan of het zuurstofgehalte een effect had schuimvorming werden alle reeds beschreven experimenten ook uitgevoerd met een lage concentratie aan opgeloste zuurstof. Opnieuw werd enkel visueel gekeken naar schuimvorming of verhoogde flotatie van het actief slib. Ook tijdens deze experimenten werd geen schuimvorming of verhoogde flotatie waargenomen.
III.3.
Bepaling van het PHB-gehalte
Deze methodes werden hier weergegeven omdat ze voor een deel zelf uitgewerkt zijn. Hier worden de methodes weergegeven zoals ze uiteindelijk gebruikt werden. In IV.2 worden ze verder besproken. Kwalitatieve bepaling door middel van een kleuring met de fluorescente kleurstof ‘Nile Blue A’. Een druppel uit een goed gehomogeniseerd slibstaal werd door middel van een plastieken spatel in een van de welletjes op een 10-well draagglaasje uitgesmeerd (door gebruik te maken van deze draagglaasjes kunnen gemakkelijk meerdere stalen op 1 draagglaasje gefixeerd worden). Het draagglaasje werd in een oven bij 50°C gebracht tot de druppel volledig opgedroogd was (ca 15 minuten). Na het drogen werd het uitstrijkje gefixeerd boven een vlam (warmte fixatie). Vervolgens werd een dikke druppel 1% Nile Blue A oplossing in water (50°C) in het welletje met het staal gebracht. Na 10 minuten incuberen in de oven bij 50°C, (het is belangrijk dat de druppel niet volledig opdroogt), werd het draagglaasje gedurende 1 seconde gespoeld met kraantjeswater en 1 minuut met 8% Azijnzuur oplossing om de overmaat kleurstof weg te wassen. Het draagglaasje werd voorzichtig drooggedept met een stukje absorberend papier, en opnieuw lichtjes bevochtigd met kraantjeswater alvorens er een dekglaasje over te plaatsen. Het dekglaasje is nodig omdat anders standaard immersie-olie een deel van de fluorescente kleurstof uit het preparaat zal extraheren waardoor een gele waas over het beeld zal ontstaan. De microscopische analyse gebeurde met licht met een golflengte van 550 nm. Kwantitatieve bepaling door middel van een spectrofotometrische methode. Het PHB-gehalte werd bepaald door zure hydrolyse van het slibstaal waardoor PHB omgezet werd in crotonzuur. Dit werd spectrofotometrisch gemeten bij een golflengte van 235 nm. Omdat het PHB intracellulaire granules vormt, waren eerst een aantal stappen nodig om de cellen af te scheiden en open te breken. Methode: Er werden slibstalen van 20 mL genomen. Deze werden goed gehomogeniseerd en hieruit werd tweemaal 9 mL in een centrifugeerbuis van 10 mL gepipetteerd. Van het eerste staal werd het 31
PHB-gehalte gemeten, van het tweede staal de VSS (dit om gPHB / gVSS te kunnen berekenen). Het PHB staal werd gedurende 20 minuten gecentrifugeerd bij 10000 g (bij 6000 g of 8000 g werd er geen stevige pellet gevormd en kwamen er nog stukken los bij het afgieten van het supernatans). Het supernatans werd afgegoten en er werd 2mL gedeïoniseerd water, en 2 mL HCL 2M bij het pellet gedaan (de methode waarop deze gebaseerd is doet hier een extra verdunning, maar de standaardfout op het gemiddelde van 3 herhalingen was significant kleiner als dit niet gedaan werd (p-waarde = 0.002), zoals weergegeven in Figuur 11) Vervolgens werd goed gevortexd. Het staal werd dan gedurende 2u in een waterbad van 100°C geplaatst voor een goede hydrolyse (in deze stap wordt het PHB nog niet omgezet in croton zuur, hier wordt er enkel voor gezorgd dat de cellen openbreken zodat de PHB granules vrijkomen). Daarna werd gedurende 20 minuten gecentrifugeerd bij 6000 g (hier werd wel een stevig pellet bekomen bij 6000 g). Het supernatans werd weer weggegoten en het pellet werd geresuspendeerd in 5 mL geconcentreerde chloroform (de PHB granules migreren in deze chloroformfase). Het staal werd dan overnacht op een schudtoestel gezet bij 28°C. De volgende dag werd opnieuw gedurende 20 minuten gecentrifugeerd bij 6000 g. Dit zorgt ervoor dat de oplossing verdeeld is in een onderste chloroformfase en kleine bovenste waterfase met hierin zo goed als al het materiaal van de pellet. Uit de chloroformfase werd 0.1 mL opgezogen met een spuit met een metalen naald (een metalen naald om gemakkelijk doorheen de bovenste waterfase te geraken zonder hier een deeltje van mee te nemen). Deze 0.1 mL werd in een nieuwe glazen proefbuis gebracht en in een waterbad van 50°C gezet onder de trekkast tot het volledig uitgedampt was. Eenmaal droog werd er 5 mL geconcentreerd H2SO4 toegevoegd en werd het staal 20 minuten in een waterbad gezet bij 100°C. (Tijdens deze hydrolyse stap wordt het PHB omgezet in crotonzuur). Vervolgens werd gewacht tot de stalen afgekoeld waren tot kamertemperatuur en werd het PHB-gehalte spectrofotometrisch bepaald bij een golflengte van 235 nm.
standaardfout in gPHB/gVSS
0,0012 0,001 0,0008 0,0006 0,0004 0,0002 0 Zonder extra verdunning
Met extra verdunning
Figuur 11: De gemiddelde standaardfout op 6 PHB/VSS-metingen met elk 3 herhalingen. De foutenbalken stellen de standaardfout op deze gemiddelde standaardfout voor. De standaardfout op de meting zonder extra verdunning is significant lager dan deze met de extra verdunning met een p-waarde van 0.002 32
Voor de berekening van het PHB gehalte werd gebruik gemaakt van een standaardcurve. Voor de opstelling hiervan werden oplossingen met 1-, 2-, 5- en 10 mg PHB per liter gebruikt. Deze werden bereid uit een stockoplossing van 500 mg PHB per L die aangemaakt werd door 500 mg PHB poeder op te lossen in 1 liter geconcentreerd H2SO4. Deze stockoplossing werd lichtjes verwarmd om al het PHB te laten oplossen. Er werden 3 afzonderlijke stockoplossingen van 500 mg PHB per liter gemaakt waaruit driemaal onafhankelijk van elkaar de verschillende oplossingen aangemaakt werden zodat drie statistisch onafhankelijke metingen konden gedaan worden voor de opstelling van de standaardcurve. De oplossingen van 1-, 2-, 5- en 10 mg PHB per liter werden net als de stalen 20 minuten gekookt in geconcentreerd H2SO4 om het PHB om te zetten in crotonzuur. Na afkoeling tot kamertemperatuur werd de absorptie bij 235 nm bepaald. De gebruikte standaardcurve is weergegeven in Figuur 12.
2,5 y = 0,1906x R² = 0,9937
Absorptie (od)
2
1,5
1
0,5
0 0
2
4
6
8
10
12
PHB (mg/L)
Figuur 12: Opgestelde standaardcurve voor de spectrofotometrische bepaling van het PHB-gehalte in slibstalen. De gemeten punten zijn aangeduid met een ruitje, de weergegeven lijn is de standaardcurve. De punten zijn het gemiddelde van drie onafhankelijke metingen.
33
III.4.
Experimenten betreffende de productie van PHA’s
III.4.1. Experiment 1: Synthetische voeding In Figuur 13 zijn het acetaat- en fosfaatgehalte in de waterfase tijdens één anaerobe cyclus van de SBR weergegeven, tijdens de eerste week dat deze actief was; de eenheid is gram per liter. Het acetaatgehalte daalde tijdens de 2u durende anaerobe fase van ca 0.450 g/L tot 0.220 g/L. Het fosfaatgehalte steeg van ca. 0.050 g/L naar ca. 0.060 g/L. Ook het PHB gehalte uitgedrukt in gram PHB per gram droge stof is weergegeven en steeg van 0.017 naar 0.026. De weergegeven cyclus is dezelfde als die in Figuur 14 bij „Week 1‟ (In Figuur 14 wordt enkel het PHB gehalte weergegeven).
PHB/VSS (g/g) en fosfaat (g/L)
0,070
PO4
0,060
0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0
-
0,050 0,040
Acetaat
0,030 0,020
PHB
0,010 0,000 0
20
40
60
80
100
120
Acetaat (g/L)
In Figuur 14 worden verschillende grafieken getoond die de PHB productie per gram droge stof weergeven gedurende de anaerobe fase van de cyclus. Tussen de verschillende grafieken zit telkens 1 week zodat de evolutie van de PHB-productie in de SBR kan nagegaan worden. In vergelijking met de meting in week 1 werd in week 2, -3 en -4 ca. 0.8% meer PHB geproduceerd per gram droge stof (0.032 en 0.034 ten opzichte van 0.026 gPHB/gVSS). Tussen week 2, -3 en 4 werden geen grote veranderingen waargenomen. De productie na vier weken bedroeg 32 mg PHB per gram droge stof of 3.2% PHB per gram droge stof. De productiesnelheid in week 4 bedroeg 9.5 mg PHB per gram droge stof per uur.
140
Tijd (minuten)
Figuur 13: Het acetaat- en fosfaatgehalte in de waterfase tijdens één anaerobe cyclus tijdens de eerste week dat de SBR actief was. Het acetaatgehalte moet afgelezen worden van de rechter as, het fosfaatgehalte van de linker as. De hoeveelheid PHB in de cellen wordt weergegeven als PHB/VSS (g/g) en moet afgelezen worden van de linker as. Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde SBR. Er zijn geen foutenbalken zichtbaar omdat deze te smal waren om weergegeven te worden.
34
Figuur 14: Het PHB-gehalte per gram droge stof in functie van de tijd. De verschillende grafieken stellen elk één anaerobe cyclus voor met telkens een week ertussen. Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde SBR. De foutenbalken stellen de standaardfout voor. III.4.2. Experiment 2: Voeding met effectief afvalwater
35
In Figuur 15 is de PHB productie per gram droge stof tijdens de anaerobe fase van de cyclus weergeven, de verschillende lijnen stellen verschillende metingen voor met telkens ca. een week ertussen. Dag „0‟ komt overeen met de meting van „Week 4‟ uit Figuur 14. Deze meting gebeurde net voor de verandering van de voeding (zie „Materiaal en Methoden–4.2). Er werd een significante stijging van de PHB productie waargenomen over de 22 dagen waarin de SBR actief was met verdund influent van Agristo. Het maximale PHB gehalte aan het einde van de anaerobe cyclus steeg van 0.032 gPHB/gVSS naar 0.082 gPHB/gVSS, of van 3.2% naar 8.2% van de droge stof. De PHB productiesnelheid bedroeg op dag 22: 35 gram PHB per gram VSS per uur. 0,090
0,080
0,082
0,070
0,062
PHB/VSS (g/g)
0,060
0,050 0,044
Dag 22 Dag 15
0,040 0,039
0,034
Dag 8 Dag 0
0,032
0,030 0,025 0,020
0,021
0,010
0,000 0
20
40
60
80
100
120
Tijd (minuten)
Figuur 15: Het PHB gehalte per gram droge stof tijdens de anaerobe fase van de cyclus in functie van de tijd. Elke lijn stelt één anaerobe fase voor. Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde SBR. De foutenbalken stellen de standaardfout voor.
36
PHB/VSS (g/g)
Aan het einde van de anaerobe fase bereikt het PHB gehalte zijn maximum. In Figuur 16 werden de maxima van de cycli, die ook in Figuur 15 werden weergegeven, uitgezet in functie van de tijd. Elke waarde stelt het PHB-gehalte voor na 2u anaerobe cyclus, de x-as geeft de tijd (dagen) weer dat de SBR liep met verdund influent van Agristo. Hieruit blijkt duidelijk dat de PHBproductie steeg naarmate de SBR langer actief was. Tussen dag 0 en dag 22 steeg het maximale gemeten PHB gehalte van 0.032 naar 0.082 gram PHB per gram droge stof. Er heeft dus wel degelijk een aanrijking aan PHB-producerende bacteriën plaatsgevonden in het actief slib zoals de bedoeling was bij de opzet van het experiment.
0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0
0,082 0,062 0,039 0,032
0
5
10
15
20
25
Tijd (dagen)
Figuur 16: Maximale gPHB/gVSS tijdens een cyclus in functie van de looptijd van de SBR. Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde SBR. De foutenbalken stellen de standaardfout voor.
Ter vergelijking met Figuur 13 wordt in Figuur 17 de verandering van de PHB- en fosfaat gehaltes tijdens een anaerobe cyclus op dag 15 na de verandering van het influent weergegeven. De cyclus die weergegeven werd in Figuur 13 was van tijdens de eerste week dat de SBR actief was met het synthetisch influent. Van zowel het PHB- als het fosfaat gehalte werd een sterkere stijging waargenomen. Na 22 dagen werd tijdens een anaerobe cyclus meer PHB geproduceerd dan bij de start van het experiment op dag 0.
37
PHB/VSS (g/g) en fosfaat (g/L)
0,07
PHB
0,06 0,05
PO4-
0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 0
20
40
60
80
100
120
140
Tijd (minuten)
Figuur 17: Het fosfaatgehalte in de waterfase tijdens een anaerobe fase van een cyclus op dag 15 na de verandering van het influent. De hoeveelheid PHB/VSS (g/g). Elke waarde is het gemiddelde van 3 metingen uit dezelfde SBR. De foutenbalken geven de standaardfout weer.
III.4.3. Kwalitatieve bepaling van PHB PHB werd ook kwalitatief bepaald door middel van een kleuring met de fluorescente kleurstof Nile Blue A. In Figuur 18 is een beeld van actief slib na 2u anaerobe fase weergegeven. Er is een filamenteuze bacterie te zien waarin duidelijk individuele partikels PHB te onderscheiden zijn. Het beeld bestaat uit twee foto‟s. Een eerste met zichtbaar licht, hierin is het filament te zien. Een tweede in het fluorescent spectrum, hierin zijn de PHB partikels zichtbaar. Door de twee beelden te combineren werd onderstaand resultaat bekomen. Er zijn verschillende filamenteuze bacteriën gekend die intracellulair PHB kunnen aanmaken. Onder andere, maar zeker niet alleen, Sphaerotilus natans (Takeda et al., 1995), Nocardia amarae (Blackall et al., 1991) en Microthrix parvicella (Majone et al., 2007). Uit de foto kan echter niet afgeleid worden welk filament het is.
38
Figuur 18: Filamenteuze bacterie uit het actief slib na 2u anaerobe fase van de cyclus. a = een foto in zichtbaar licht waarin het filament zichtbaar is. b = een foto in het fluorescente spectrum bij 550 nm waarin de PHB-partikels zichtbaar zijn. c = Het samengestelde beeld van a en b.
39
IV.
Bespreking
In volume uitgedrukt vormt spuislib het grootste nevenproduct dat in de waterzuiveringsindustrie gevormd wordt en de verwerking ervan brengt hoge kosten met zich mee. In deze masterproef echter werd onderzocht of het mogelijk is om in de plaats van „afvalslib‟, een slib te produceren dat waarde heeft en vermarkt kan worden. Er werd geprobeerd om de energie en de nutriënten die aanwezig zijn in afvalwater te recycleren in een bruikbare vorm met behulp van bacteriën die reeds in waterzuiveringsinstallaties aanwezig zijn. Er werd voornamelijk gekeken naar de productie van hoogwaardige microbiële lipiden zoals mycolinezuren en PHA‟s. In dit hoofdstuk zullen eerst apart de resultaten van de verschillende delen besproken worden, daarna volgt een meer algemene bespreking.
IV.1. Experimenten betreffende de productie van hoogwaardige microbiële lipiden door selectie op slibflotatie en schuimvorming Ondanks het feit dat er wel degelijk Mycolata in de startmaterialen aanwezig waren (Figuur 6), en dat de gebruikte influenten qua samenstelling gelijkaardig waren aan influenten waarmee in de praktijk soms last is van schuimvorming (rijk aan hydrofobe-, vette verbindingen), werd er geen schuimvorming of drijvend slib geoberveerd tijdens de SBR-experimenten. Uit Figuur 7 blijkt wel dat de bovenste laag in de SBR na 15 minuten sedimentatie behoorlijk „vet‟ was maar er werd geen stijging waargenomen na een aantal cycli, er werd zelfs een daling geobserveerd. Dit was het tegenovergestelde dan wat verwacht was. Voor de combinaties van Agristo-slib met Agristo-influent en IMP-slib met IMP-influent werd verwacht dat er vrij snel schuimvorming of flotatie zou optreden omdat dit slib al gewend was aan zijn respectievelijke „vette‟ influent. Voor de combinatie tussen Ossemeersen-slib en IMP-influent werd verwacht dat er meer tijd zou nodig zijn omdat het actief slib zich zou moeten aanpassen en veranderen van een „normaal‟ slib in een „vet‟ slib. Ook de methodes die gebruikt werden om flotatie te stimuleren (poly-elektrolyt, gas of olie toevoegen) hadden geen resultaat, enkel vanaf een toevoeging van 100 mL dieselolie aan het mengsel werd flotatie geobserveerd, maar deze hoeveelheden zijn economisch niet interessant. Hieruit kan besloten worden dat er geen eenzijdig verband is tussen schuimvorming/flotatie enerzijds en het soort influent dat aanwezig is anderzijds, maar dat ook andere factoren die minder gemakkelijk in kleine sequencing batch reactoren gesimuleerd kunnen worden een rol spelen. Bijvoorbeeld pH- of temperatuursveranderingen of een verandering in de samenstelling van het influent water. Uit persoonlijke communicatie met bedrijven werd duidelijk dat schuimvorming een probleem was tijdens de winter. Daarom zou het interessant zijn een aantal van de gedane testen te herhalen bij een lagere temperatuur dan de 28°C waarbij de experimenten nu werden uitgevoerd, of bij een cyclisch temperatuurverloop, of om stalen voor de startmaterialen te nemen in de winter of wanneer zich effectief schuimvorming voordoet.
40
Een mogelijk alternatief voor de gebruikte SBR‟s is een continu systeem met een beluchtingsbekken, een sedimentatiebekken en een slibverblijftijd van minstens 10 dagen. De recirculatie van slib moet dan aan de bovenkant van het sedimentatiebekken gebeuren in plaats van aan de onderkant zodat de floterende bacteriën in het systeem gehouden worden. Op de bodem van het sedimentatiebekken kunnen eventueel fijne luchtbelletjes in het water gepompt worden zodat deze kunnen helpen bij de flotatie. Het voordeel van zo een systeem ten opzichte van een SBR is dat het meer de realiteit benadert, en dat er meer controle is op de omgeving. Dankzij de slibverblijftijd van 10 dagen heeft het slib ook meer tijd om zich aan te passen. Een tweede stelling die, afgaande op de resultaten, gemaakt kan worden is dat “een hydrofoob uiterlijk hebben”, een nadeel moet zijn voor bacteriën. Zelfs in omstandigheden waarin ze selectief bevoordeeld werden was er geen aanrijking. Dit kan te maken hebben met het feit dat ze hun voeding uit een waterige omgeving moeten halen. Met een hydrofoob uiterlijk kunnen ze hier minder goed bij. Uit de bekomen resultaten kunnen vooralsnog geen conclusies getrokken worden omtrent de productie van mycolinezuren door middel van actief slib systemen. Dit betekent echter niet dat hier geen toekomst in zit aangezien er voldoende toepassingen voor handen zijn, zoals onder andere in de detergentsector (Lee et al., 2005) of in de milieu-industrie in de bioremediatie (Lee et al., 2006). De hypothese omtrent de toepassing als energiebron blijft ook zeker aannemelijk aangezien het zeer gereduceerde moleculen betreft die lijken op moleculen zoals plantaardige vetten die reeds toegepast worden in deze sector (Figuur 3, b en d). Mede hierdoor, en door het feit dat schuimvorming van actief slib zo frequent voorkomt en wereldwijd voor problemen zorgt, blijft het interessant om te proberen dit proces op een gereguleerde manier te kunnen veroorzaken en het schuim als een product te behandelen in plaats van als een probleem of afvalstroom. IV.1.1. Economisch potentieel Uit de experimenten konden geen opbrengstcijfers afgeleid worden aangezien er geen stijging van de VSS/CZV en dus geen vervetting van het slib werd bekomen. Uit de literatuur blijkt echter dat Gordonia amarae uit 1 kg olijfolie als koolstofsubstraat ca. 0.1 kg mycolinezuurbiosurfactantia kan produceren (Moussa et al., 2010). Dit is een rendement van 10%. Volgens (Makkar et al., 2011) kan de huidige marktprijs voor biosurfactantia oplopen tot meer dan 100€ voor 10 mg zuiver product en meer dan 30€ voor 1 kg slurry zonder downstream processing. Als met deze 30€ verder wordt gerekend kan per kg behandeld organisch afval 3€ verdiend worden. Vermoedelijk zal in de praktijk met organisch afval als koolstofbron en actief slib nooit een even hoog rendement gehaald worden als met een hoogwaardige koolstofbron zoals zuivere olijfolie, en zuivere microbiële culturen. Makkar stelt ook dat er gestreefd wordt naar een marktprijs van 3-5€ per kg biosurfactant (Makkar et al., 2011). Met deze 3€ zou de opbrengst dan 0.30€ per kg behandeld organisch afval bedragen. Dit toont nogmaals aan dat slibomzetting van organisch afvalwater in mycolinezuren onbestudeerd potentieel inhoudt. 41
IV.2.
Bepaling van het PHB gehalte
De bestaande methode voor de bepaling van het PHB gehalte was niet zo zeer ontoereikend maar was wel zeer omslachtig en niet geoptimaliseerd voor gebruik op de actief slib stalen die geanalyseerd werden in dit eindwerk. Daarom werden er op verschillende stappen (onder andere de centrifugatiesnelheden en –tijden; de hoeveelheid startmateriaal, de uitgevoerde verdunningen en het gebruikte materiaal voor de verschillende stappen uit te voeren) variaties uitgeprobeerd om zo tot een protocol te komen dat optimaal werkte in dit eindwerk en onder de gegeven omstandigheden. Er werd uiteindelijk een protocol bekomen waarbij de stalen van in het begin van het protocol tot net voor de extractie van 0.1 mL uit de chloroformfase in de voorlaatste stap in hetzelfde buisje bleven. Op die manier gaat er zo weinig mogelijk staal verloren en wordt de variatie tussen verschillende metingen beperkt. Dit in vergelijking met het eerdere protocol waar nog een extra verdunningsstap gebruikt werd en waar de variatie tussen verschillende herhalingen groter bleek. (Figuur 11). Daarnaast werd ook vastgesteld dat extractie van 0.1 mL uit de chloroformlaag het best ging met een metalen naald in plaats van plastieken pipettips omdat hiermee de minste contaminatie optrad van slibresten uit de bovenliggende waterlaag. De hoeveelheid startmateriaal bleek geen echte invloed te hebben op de kwaliteit van de meting, maar omwille van praktische redenen werd 9 mL gekozen. Dan kon gebruik gemaakt worden van centrifugeerbuisjes van 10 mL, en was er tijdens de hydrolyse in kokend zuur nog een beetje marge om overkoken te voorkomen. Minder als 9 mL werd niet overwogen omdat er toch een zekere hoeveelheid PHB aanwezig moet zijn in de stalen om representatieve analyses te kunnen doen. De in dit eindwerk geoptimaliseerde methode leverde goede, reproduceerbare resultaten, zoals gebleken is uit Figuur 14 en Figuur 15. De foutenbalken geven hier de standaardfout weer tussen metingen van drie stalen die op hetzelfde moment uit dezelfde reactor genomen zijn. De variatie tussen deze verschillende metingen was gemiddeld 0.00053 gPHB/gVSS (Figuur 11). De methode was wel nog steeds tijdsintensief aangezien de analyse van 1 staal 2 dagen in beslag nam. Een ander nadeel was ook dat ze gebaseerd was op een spectrofotometrische analyse die over het algemeen minder nauwkeurige resultaten dan bijvoorbeeld gas- en vloeistofchromatografische methoden oplevert. Bij de kleuring van slibstalen met Nile Blue A bleek dat het van cruciaal belang is dat de druppel kleurstof die op het staal gebracht wordt niet volledig opdroogt gedurende de 10 minuten in de oven. Dit is vereist om te voorkomen dat er zich fluorescente kristallen vormen. Deze bemoeilijken de verdere beeldanalyse. Het protocol dat origineel voor deze kleuring gevonden werd dateerde al vanuit 1982 en werd up to date gebracht. Volgens de oude methode zou veel te veel kleurstof nodig zijn voor het maken van 1 preparaat.
42
IV.3.
Experimenten betreffende de productie van PHA’s
Gedurende de looptijd van de SBR met het synthetisch influent werd er, op het kleine verschil tussen week 1 en week 2 na, geen stijging waargenomen van de PHB-productie. De vier metingen die in vier opeenvolgende weken uitgevoerd werden en die weergegeven zijn in Figuur 14 tonen allemaal ongeveer dezelfde productie hoeveelheden en snelheid. Na de verandering van synthetisch influent naar echt industrieel afvalwater van Agristo (verdund zodat een belasting van 8 g CZV per liter per dag bekomen werd) werd wel een stijging van de PHB-productie waargenomen. Over het verloop van 22 dagen trad er meer dan een verdubbeling op van de maximale hoeveelheid PHB die per cyclus geproduceerd werd. Van 3.2 gram PHB per gram droge stof naar 8.2 gram PHB per gram droge stof. Waarom deze stijging niet geobserveerd werd tijdens de fase met het synthetisch influent is niet geheel duidelijk. Het is mogelijk dat hierin een of meerdere essentiële nutriënten ontbraken. Een reden hiervoor kan het gebruik van kraantjeswater in plaats van een sporen-elementen oplossing zijn, ervan uitgaande dat hier alle essentiële nutriënten zouden inzitten. De productiehoeveelheid die bereikt werd na 22 dagen ligt lager dan de hoeveelheden die in de literatuur worden teruggevonden in systemen die gebruik maken van zuivere bacteriële culturen of hoogwaardige voeding. Met deze systemen worden extreem hoge PHB concentraties tot 88% van de droge stof bereikt (Lee et al., 1998; Lee et al., 1999). Het grote verschil met deze systemen is natuurlijk dat in de huidige studie gebruik gemaakt werd van actief slib en industrieel afvalwater in plaats van zuivere culturen en hoogwaardige voedingsbronnen. Met systemen die vergelijkbaar zijn met het systeem dat hier gebruikt werd, worden echter ook hogere opbrengsten gerapporteerd: Takabatake en Dias rapporteren opbrengsten van 20% tot 50% van de droge stof (Takabatake et al., 2000; Dias et al., 2006). Dit is nog een stuk hoger dan de 8.2% die gehaald werd tijdens deze studie, maar het is zeer waarschijnlijk dat de PHBproductie capaciteit van het actief slib nog verder zou gestegen zijn als de SBR langer dan 22 dagen opgevolgd werd. Door tijdsgebrek is dit niet gebeurd, maar verwacht wordt dat een vergelijkbare opbrengst van 20 á 30% haalbaar moet zijn. Er kan dus voorzichtig positief gereageerd worden op deze bevindingen aangezien het vooropgestelde doel om hoogwaardige microbiële lipiden (in dit geval PHB) te produceren door gebruik te maken van bestaande systemen en reeds aanwezige bacteriën haalbaar lijkt. Dit is ook meteen het grote voordeel van deze methode in vergelijking met andere methoden die wel een hogere opbrengst halen maar moeilijker te implementeren zijn in bestaande waterzuiveringsinstallaties. Daarbij komt nog dat de PHB-producerende bacteriën die in het actief slib werden aangetroffen hoofdzakelijk filamenteuze bacteriën waren. Een foto hiervan is weergegeven in Figuur 18. In praktisch opzicht maakt dit de afoogsting een stuk makkelijker. Dit kan bijvoorbeeld gebeuren door een grove filter waar „gewone‟ bacteriën gemakkelijk doorheen kunnen maar deze filamenteuze bacteriën niet. Het kan ook door geïnduceerde flotatie met behulp van fijne luchtbelletjes. Hiervoor kan eventueel gebruik gemaakt worden van „Induced Air Flotation‟ (IAF) of een afgeleide techniek. (Zlokarnik, 1998). Deze afoogsting moet zo geregeld worden 43
dat het afgeoogste slib een deel van het spuislib, of het volledige spuislib bedraagt. Op die manier is dit ook een slibbehandelingsmethode en vermindert de hoeveelheid slib die effectief gestort of verbrand moet worden.. Dat hoofdzakelijk filamenteuze bacteriën PHB produceerden was wel verrassend want er werd verwacht dat er een aanrijking was gebeurd aan „Phosphate Accumulating Organisms‟ of PAO‟s, vlokvormende bacteriën die aan de basis liggen van het biologisch fosfaatverwijderingsproces (Serafim et al., 2008; Rodgers et al., 2010). Het is wel geweten dat sommige filamenteuze bacteriën in staat zijn intracellulaire PHB-granules aan te maken (Blackall et al., 1991; Takeda et al., 1995; Majone et al., 2007). En er zijn aanwijzingen dat een hoge CZV-concentratie PHB-productie door filamenteuze bacteriën kan stimuleren (Pandolfi et al., 2007). Maar dit is toch een belangrijke vaststelling uit dit eindwerk die zeker verder zal onderzocht worden. IV.3.1. Economisch potentieel Een conventionele waterzuiveringsinstallatie produceert per kg behandeld organisch afval ca 0.4 kg slib droge stof. De kost voor de verwerking hiervan bedraagt ca. 0.6€/kg slib droge stof. Dit zorgt voor een kost van ca. 0.24€ per kg behandeld organisch afval. (Persoonlijke communicatie met Prof. Verstraete) Met het voorgestelde systeem werd ongeveer bekomen dat 10% van de slib droge stof uit PHB bestond. 10% van 0.4 kg is 0.04 kg PHB per kg behandeld organisch afval. De industriële marktprijs van PHB ligt volgens Choi, Lee en Listewnik tussen de 3€-15€ per kg, afhankelijk van de gewenste zuiverheidsgraad (Choi et al., 1997; Lee et al., 1998; Choi et al., 1999; Listewnik et al., 2007). (Ter vergelijking, de prijs voor volledig zuiver PHB bij SigmaAldrich bedroeg op 05/06/2011: 79.20€ voor 10 gram!) Aangezien het product in deze studie quasi ongezuiverd is (volledige cellen met PHB granules nog intracellulair) wordt met de ondergrens van 3€ per kg verder gerekend. 0.04 kg PHB brengt dan 0.12€ op. Of anders gezegd, er is nu een opbrengst van 0.12€ per kg behandeld organisch afval! (Een PHB opbrengst van 20% levert al 0.24€ per kg behandeld organisch materiaal, en 50% levert 0.60€ per kg behandeld organisch materiaal) Andere argumenten waaruit kan afgeleid worden dat dit systeem en deze technologie potentieel hebben zijn een aantal recent verschenen artikels (uit 2011) (Cai et al., 2011; Dobroth et al., 2011; Liu et al., 2011), die eveneens over de productie van PHA‟s uit afvalstromen door middel van actief slib systemen handelen, en het feit dat de waterzuiveringsinstallatie van Brussel-Noord plannen heeft om op grote schaal PHA‟s te gaan produceren uit afvalwater. Het gaat hier dan wel voornamelijk om PHA‟s als grondstof voor de productie van bioplastics. Mits een aantal vereenvoudigingen en veronderstellingen kan bovenstaande berekening toegepast worden op de RWZI van Brussel-Noord:
44
Brussel-Noord maakt gebruik van een biologische zuiveringsstap met een anaerobe en een aerobe fase. Dit is geschikt voor de aanrijking van PHB-producerende bacteriën, zoals aangetoond in dit eindwerk. Als verondersteld wordt dat al het spuislib afgeoogst wordt in de anaerobe fase kan volgende berekening uitgevoerd worden. RWZI Brussel-Noord behandelt jaarlijks ca. 100 000 000 m3 afvalwater waaruit ca. 22 000 ton slib droge stof komt (Aquiris, 2011). Met een opbrengst van 10% PHB/droge stof zou dit betekenen dat er op jaarbasis 2 200 ton PHB geproduceerd kan worden. Als het PHB-bevattend slib als ruw ongezuiverd product wordt verkocht, zonder verdere downstream processing, en er wordt hiervoor de ondergrens prijs van 3€ per kg PHB gerekend, kan dit 6 600 000€ per jaar opbrengen. In de praktijk zal echter nooit ál het spuislib in de anaerobe fase kunnen geoogst worden. Daarnaast zal er ook enige vorm van downstream processing nodig zijn om het volume van het PHB-bevattend slib naar omlaag te krijgen. Anders zouden de transportkosten te hoog oplopen. Dat het PHB intracellulair zit kan hier een voordeel zijn, door het slib te ontwateren kan al een opconcentratie gebeuren. Anderzijds is het ook mogelijk dat het rendement tot boven de 10% wordt gebracht waardoor de opbrengst automatisch ook stijgt. Naast het gebruik als grondstof voor de productie van bioplastics kunnen PHA‟s ook een belangrijke rol spelen als prebioticum of als alternatieve energiebron. Uit korte keten PHA‟s kunnen in het gastro-intestinaal stelsel korte keten vetzuren gemaakt worden zoals azijnzuur en boterzuur, waarvan geweten is dat ze gezondheidsbevorderende eigenschappen hebben (Scheppach, 1994; Scheppach et al., 1995; Dang et al., 2009; Defoirdt et al., 2009; De Schryver et al., 2010). De productie van prebiotica (een voedinsmiddel), uit afvalwater zal wel enkel kunnen met sterk gereguleerde en gedefinieerde industriële afvalwaters aangezien huishoudelijke afvalwaters teveel stoffen bevatten die absoluut niet in voeding mogen belanden. Een toepassing als alternatieve energiebron is een zeer interessante piste en is zeker verder onderzoek waard (zie I.4.2.1). Volgens een schatting van Chen is de productie van biobrandstoffen die afgeleid zijn van PHA‟s, en die geproduceerd worden uit afvalwaters en/of actief slib mogelijk tegen een prijs rond de 1200$ per ton (Zhang et al., 2009). Ter vergelijking, de prijs voor ruwe olie bedroeg op 05/06/2011 ongeveer 632€ per ton.
IV.4.
Conclusie
In de introductie werden twee problemen geschetst (zie I.1). De nood aan het duurzaam omgaan met uitputtelijke grondstoffen, en de stijgende afvalproductie. Er werd gesteld dat door deze twee problemen te koppelen er een win-win situatie gecreëerd kon worden. In dit eindwerk werd geprobeerd om door gebruik te maken van bestaande waterzuiveringsprocessen en –systemen hoogwaardige verbindingen uit afvalwater te recycleren. Hierdoor ontstaat een hernieuwbare grondstofbron, en vermindert tegelijkertijd de hoeveelheid geproduceerd spuislib. 45
Uit experimenten bleek dat het niet mogelijk was om slib afkomstig uit een huishoudelijke afvalwaterzuiveringsstaion in SBR‟s aan te rijken aan mycolinezuren door enkel het influent te sturen. Ondanks deze waarnemingen mag deze onderzoekslijn echter zeker niet worden stopgezet want uit de gemaakte theoretische berekeningen is gebleken dat hier toch veel potentieel in zit. De sterk gereduceerde mycolinezuren kunnen als grondstof dienen in de energiesector. Een groot pluspunt is ook dat ze geen competitie veroorzaken tussen voedsel- en energieproductie. In het geval van de PHA-productie werd aangetoond dat de productie van PHA‟s uit industrieel afvalwater met behulp van reeds aanwezig actief slib mogelijk en economisch relevant is. De productie moet wel nog geoptimaliseerd worden maar dit eindwerk toonde in elk geval het potentieel hiervan aan.
46
Referentielijst Alshamaony, L., M. Goodfellow and D. E. Minnikin (1976a). Free mycolic acids as criteria in classification of nocardia and rhodochrous complex. Journal of General Microbiology 92(JAN): 188-199. Alshamaony, L., M. Goodfellow, D. E. Minnikin and H. Mordarska (1976b). Free mycolic acids as criteria in classification of gordona and rhodochrous complex. Journal of General Microbiology 92(JAN): 183-187. Anderson, A. J. and E. A. Dawes (1990). Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiology and Molecular Biology Reviews 54(4): 450-472. Aquiris. (2011). transparency through water technology - français. 08/06/2011, http://www.aquiris.be/nl/telechargement/Aquiris_brochure_240810_light.pdf. Arenskotter, M., D. Broker and A. Steinbuchel (2004). Biology of the metabolically diverse genus Gordonia. Applied and environmental microbiology 70(6): 3195-3204. Asselineau, J. and E. Lederer (1950). Structure of the Mycolic Acids of Mycobacteria. Nature 166(4227): 782-783. Barry Iii, C. E., R. E. Lee, K. Mdluli, A. E. Sampson, B. G. Schroeder, R. A. Slayden and Y. Yuan (1998). Mycolic acids: structure, biosynthesis and physiological functions. Progress in Lipid Research 37(2-3): 143-179. Bergeim, O. (1940). Toxicity of Intestinal Volatile Fatty Acids for Yeast and Esch. coli. The Journal of Infectious Diseases 66(3): 222-234. Blackall, L. L., V. Tandoi and D. Jenkins (1991). Continuous culture studies with nocardiaamarae from activated-sludge and their implications for nocardia foaming control. Research Journal of the Water Pollution Control Federation 63(1): 44-49. Boon, N., W. De Windt, W. Verstraete and E. M. Top (2002). Evaluation of nested PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) with group-specific 16S rRNA primers for the analysis of bacterial communities from different wastewater treatment plants. Fems Microbiology Ecology 39(2): 101-112. Cai, M. M., F. Y. Cui, Q. L. Zhao and H. Chua (2011). Polyhydroxyalkanoates (PHA) production by mixed cultures fed by excess sludge fermentation liquid. Advances in Biomedical Engineering: 295-298. Cameotra, S. S. and R. S. Makkar (1998). Synthesis of biosurfactants in extreme conditions. Applied Microbiology and Biotechnology 50(5): 520-529. Chen, G. Q. (2009). A microbial polyhydroxyalkanoates (PHA) based bio- and materials industry. Chemical Society Reviews 38(8): 2434-2446. Chen, G. Q. and Q. Wu (2005). The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials. Biomaterials 26(33): 6565-6578. Choi, J. and S. Y. Lee (1999). Factors affecting the economics of polyhydroxyalkanoate production by bacterial fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology 51(1): 13-21. Choi, J. I. and S. Y. Lee (1997). Process analysis and economic evaluation for poly(3hydroxybutyrate) production by fermentation. Bioprocess Engineering 17(6): 335-342. Chua, A. S. M., H. Takabatake, H. Satoh and T. Mino (2003). Production of polyhydroxyalkanoates (PHA) by activated sludge treating municipal wastewater: effect of pH, sludge retention time (SRT), and acetate concentration in influent. Water research 37(15): 3602-3611. 47
Chun, J., S. O. Kang, Y. C. Hah and M. Goodfellow (1996). Phylogeny of mycolic acidcontaining actinomycetes. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 17(3): 205-213. Dang, T. V. C., V. H. Nguyen, K. Dierckens, T. Defoirdt, N. Boon, P. Sorgeloos and P. Bossier (2009). Novel approach of using homoserine lactone-degrading and poly-betahydroxybutyrate-accumulating bacteria to protect Artemia from the pathogenic effects of Vibrio harveyi. Aquaculture 291(1-2): 23-30. Davenport, R. J. and T. P. Curtis (2002). Are filamentous mycolata important in foaming? Water Science and Technology 46(1-2): 529-533. Davis, D. A., H. C. Lynch and J. Varley (2001). The application of foaming for the recovery of Surfactin from B-subtilis ATCC 21332 cultures. Enzyme and Microbial Technology 28(4-5): 346-354. Dawes, E. A. and P. J. Senior (1973). The Role and Regulation of Energy Reserve Polymers in Micro-organisms. Advances in Microbial Physiology. A. H. Rose and D. W. Tempest, Academic Press. Volume 10: 135-266. de los Reyes, F. L. and L. Raskin (2002). Role of filamentous microorganisms in activated sludge foaming: relationship of mycolata levels to foaming initiation and stability. Water research 36(2): 445-459. De Schryver, P., A. K. Sinha, P. S. Kunwar, K. Baruah, W. Verstraete, N. Boon, G. De Boeck and P. Bossier (2010). Poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) increases growth performance and intestinal bacterial range-weighted richness in juvenile European sea bass, Dicentrarchus labrax. Applied Microbiology and Biotechnology 86(5): 1535-1541. De Standaard Online. (2011). Elk jaar wordt meer dan miljard ton voedsel verspild 11/05/2011, http://www.standaard.be/artikel/detail.aspx?artikelid=DMF20110511_133. Defoirdt, T., N. Boon, P. Sorgeloos, W. Verstraete and P. Bossier (2009). Short-chain fatty acids and poly-beta-hydroxyalkanoates: (New) Biocontrol agents for a sustainable animal production. Biotechnology Advances 27(6): 680-685. Desai, J. D. and I. M. Banat (1997). Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews 61(1): 47-&. Dias, J. M. L., P. C. Lemos, L. S. Serafim, C. Oliveira, M. Eiroa, M. G. E. Albuquerque, A. M. Ramos, R. Oliveira and M. A. M. Reis (2006). Recent advances in polyhydroxyalkanoate production by mixed aerobic cultures: From the substrate to the final product. Macromolecular Bioscience 6(11): 885-906. Dinh, T. N., M. Wille, P. De Schryver, T. Defoirdt, P. Bossier and P. Sorgeloos (2010). The effect of poly beta-hydroxybutyrate on larviculture of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Aquaculture 302(1-2): 76-81. Dobroth, Z. T., S. J. Hu, E. R. Coats and A. G. McDonald (2011). Polyhydroxybutyrate synthesis on biodiesel wastewater using mixed microbial consortia. Bioresource technology 102(3): 3352-3359. Dubey, K. V., A. A. Juwarkar and S. K. Singh (2005). Adsorption-desorption process using wood-based activated carbon for recovery of biosurfactant from fermented distillery wastewater. Biotechnology Progress 21(3): 860-867. Eide, A. (2008). The Right to Food and the Impact of Liquid Biofuels (Agrofuels), FAO.
48
El Fantroussi, S., L. Verschuere, W. Verstraete and E. M. Top (1999). Effect of phenylurea herbicides on soil microbial communities estimated by analysis of 16S rRNA gene fingerprints and community-level physiological profiles. Applied and environmental microbiology 65(3): 982-988. ElFantroussi, S., J. Mahillon, H. Naveau and S. N. Agathos (1997). Introduction and PCR detection of Desulfomonile tiedjei in soil slurry microcosms. Biodegradation 8(2): 125133. European Commission (2001). Disposal and recycling routes for sewage sludge, Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities. European Commission (2002). Implementation of Council Directive 91/271/EEC of 21 May 1991 concerning urban waste water treatment, as amended by Commission Directive 98/15/EC of 27 February 1998 Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities. Fytili, D. and A. Zabaniotou (2008). Utilization of sewage sludge in EU application of old and new methods--A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 12(1): 116-140. Gabriels, R., H. Engels and W. V. Keirsbilck (1985). Analyse van water, grond en planten laboratoriumhandboek, Ministerie van Landbouw, Bestuur voor Landbouwkundig Onderzoek, Rijkscentrum voor Landbouwkundig Onderzoek Gent. Gerardi, M. H. (2002). Nitrification and Denitrification in the Activated Sludge Process, Wiley. Greenberg, A. (2005). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, Water Environment Federation. Greenberg, A. E., L. S. Clesceri and A. D. Eaton (1992). Standard Methods for the examination of water and wastewater. Kadouri, D., E. Jurkevitch, Y. Okon and S. Castro-Sowinski (2005). Ecological and agricultural significance of bacterial polyhydroxyalkanoates. Critical Reviews in Microbiology 31(2): 55-67. Kaynar, P. and Y. Beyatli (2009). Determination of poly-beta-hydroxybutyrate production by Bacillus spp. isolated from the intestines of various fishes. Fisheries Science 75(2): 439443. Koosha, F., R. H. Muller and S. S. Davis (1989). Polyhydroxybutyrate as a drug carrier. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6(2): 117-130. Krhutkova, O., I. Ruzickova and J. Wanner (2002). Microbial evaluation of activated sludge and filamentous population at eight Czech nutrient removal activated sludge plants during year 2000. Water Science and Technology 46(1-2): 471-478. Kuokkanen, T., P. Vahaoja, I. Valimaki and R. Lauhanen (2004). Suitability of the respirometric BOD Oxitop method for determining the biodegradability of oils in ground water using forestry hydraulic oils as model compounds. International Journal of Environmental Analytical Chemistry 84(9): 677-689. Le Corre, K. S., E. Valsami-Jones, P. Hobbs and S. A. Parsons (2009). Phosphorus Recovery from Wastewater by Struvite Crystallization: A Review. Critical Reviews in Environmental Science and Technology 39(6): 433-477. Lee, M., M. K. Kim, I. Singleton, M. Goodfellow and S. T. Lee (2006). Enhanced biodegradation of diesel oil by a newly identified Rhodococcus baikonurensis EN3 in the presence of mycolic acid. Journal of applied microbiology 100(2): 325-333.
49
Lee, M. J., H. S. Gwak, B. D. Park and S. T. Lee (2005). Synthesis of mycolic acid biosurfactants and their physical and surface-active properties. Journal of the American Oil Chemists Society 82(3): 181-188. Lee, S. Y. (1996). Bacterial polyhydroxyalkanoates. Biotechnology and Bioengineering 49(1): 114. Lee, S. Y. and J.-i. Choi (1998). Effect of fermentation performance on the economics of poly(3hydroxybutyrate) production byAlcaligenes latus. Polymer Degradation and Stability 59(1-3): 387-393. Lee, S. Y., J. I. Choi and H. H. Wong (1999). Recent advances in polyhydroxyalkanoate production by bacterial fermentation: mini-review. International Journal of Biological Macromolecules 25(1-3): 31-36. Liberti, L., M. Notarnicola and A. Lopez (2000). Advanced Treatment For Municipal Wastewater Reuse In Agriculture. III - Ozone Disinfection. Ozone: Science & Engineering: The Journal of the International Ozone Association 22(2): 151 - 166. Liberti, L., M. Notarnicola and D. Petruzzelli (2003). Advanced treatment for municipal wastewater reuse in agriculture. UV disinfection: parasite removal and by-product formation. Desalination 152(1-3): 315-324. Listewnik, H. F., K. D. Wendlandt, M. Jechorek and G. Mirschel (2007). Process Design for the Microbial Synthesis of Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) from Natural Gas. Engineering in Life Sciences 7(3): 278-282. Liu, Z. G., Y. P. Wang, N. He, J. L. Huang, K. Zhu, W. Y. Shao, H. T. Wang, W. L. Yuan and Q. B. Li (2011). Optimization of polyhydroxybutyrate (PHB) production by excess activated sludge and microbial community analysis. Journal of Hazardous Materials 185(1): 8-16. Majone, M., M. Beccari, D. Dionisi, C. Levantesi, R. Ramadori and V. Tandoi (2007). Effect of periodic feeding on substrate uptake and storage rates by a pure culture of Thiothrix (CT3 strain). Water research 41(1): 177-187. Makkar, R., S. Cameotra and I. Banat (2011). Advances in utilization of renewable substrates for biosurfactant production. AMB Express 1(1): 5. Martin, J., T. Henrichs, A. Pirc-Velkavrh, A. Volkery, D. Jarosinska, P. Csagoly and Y. Hoogeveen (2010). The european environment state and outlook 2010, European Environment Agency. Martins, A. M., K. Pagilla, J. J. Heijnen and M. C. van Loosdrecht (2004). Filamentous bulking sludge--a critical review. Water research 38(4): 793-817. Martins, A. M. P., J. J. Heijnen and M. C. M. van Loosdrecht (2003). Effect of feeding pattern and storage on the sludge settleability under aerobic conditions. Water research 37(11): 2555-2570. Mino, T., M. C. M. van Loosdrecht and J. J. Heijnen (1998). Microbiology and biochemistry of the enhanced biological phosphate removal process. Water research 32(11): 3193-3207. Moussa, T. A. A., G. M. Ahmed and S. M. S. Abdel-Hamid (2010). Mathematical model for biomass yield and biosurfactant production by Nocardia amarae. New Aspects of Fluid Mechanics, Heat Transfer & Environment. 8th IASME-WSEAS International Conference on Fluid Mechanics & Aerodynamics (FMA '10) and 8th IASME-WSEAS International Conference on Heat Transfer, Thermal Engineering and Environment (HTE '10), Taipei, Taiwan, WSEAS Press.
50
Muthusamy, K., S. Gopalakrishnan, T. K. Ravi and P. Sivachidambaram (2008). Biosurfactants: Properties, commercial production and application. Current Science 94(6): 736-747. Oehmen, A., P. C. Lemos, G. Carvalho, Z. G. Yuan, J. Keller, L. L. Blackall and M. A. M. Reis (2007). Advances in enhanced biological phosphorus removal: From micro to macro scale. Water research 41(11): 2271-2300. Oerther, D. B., F. L. De los Reyes, M. F. De los Reyes and L. Raskin (2001). Quantifying filamentous microorganisms in activated sludge before, during, and after an incident of foaming by oligonucleotide probe hybridizations and antibody staining. Water research 35(14): 3325-3336. Organic Waste Systems. (2008). SORDISEP Technology. 25/04/2011, http://www.ows.be/pages/index.php?menu=85&submenu=121&choose_lang=EN. Ostle, A. G. and J. G. Holt (1982). Nile blue-a as a fluorescent stain for poly-betahydroxybutyrate. Applied and environmental microbiology 44(1): 238-241. Pagilla, K. R., A. Sood and H. Kim (2002). Gordonia (nocardia) amarae foaming due to biosurfactant production. Water Science and Technology 46(1-2): 519-524. Pandolfi, D., M. N. Pons and M. da Motta (2007). Characterization of PHB storage in activated sludge extended filamentous bacteria by automated colour image analysis. Biotechnology Letters 29(8): 1263-1269. Pekin, G., F. Vardar-Sukan and N. Kosaric (2005). Production of sophorolipids from Candida bombicola ATCC 22214 using Turkish corn oil and honey. Engineering in Life Sciences 5(4): 357-362. Philip, S., T. Keshavarz and I. Roy (2007). Polyhydroxyalkanoates: biodegradable polymers with a range of applications. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 82(3): 233247. Pynaert, K., B. F. Smets, D. Beheydt and W. Verstraete (2004). Start-up of Autotrophic Nitrogen Removal Reactors via Sequential Biocatalyst Addition. Environmental Science & Technology 38(4): 1228-1235. Rees, G. N., G. Vasiliadis, J. W. May and R. C. Bayly (1993). Production of poly-betahydroxybutyrate in acinetobacter spp isolated from activated-sludge. Applied Microbiology and Biotechnology 38(6): 734-737. Reis, M. A. M., L. S. Serafim, P. C. Lemos, A. M. Ramos, F. R. Aguiar and M. C. M. Van Loosdrecht (2003). Production of polyhydroxyalkanoates by mixed microbial cultures. Bioprocess and Biosystems Engineering 25(6): 377-385. Renewable Fuels Association (2011). 2011 RFA Ethanol Industry Outlook, Renewable Fuels Association. Rodgers, M. and G. X. Wu (2010). Production of polyhydroxybutyrate by activated sludge performing enhanced biological phosphorus removal. Bioresource technology 101(3): 1049-1053. Satoh, H., Y. Iwamoto, T. Mino and T. Matsuo (1998). Activated sludge as a possible source of biodegradable plastic. Water Science and Technology 38(2): 103-109. Scheppach, W. (1994). Effects of short chain fatty acids on gut morphology and function. Gut 35(1 Suppl): S35-S38. Scheppach, W., H. P. Bartram and F. Richter (1995). Role of short-chain fatty acids in the prevention of colorectal cancer. European Journal of Cancer 31(7-8): 1077-1080. Schultz, T. E. (2005). Biological wastewater treatment. Chemical Engineering magazine 112: 4449. 51
Serafim, L. S., P. C. Lemos, M. G. E. Albuquerque and M. A. M. Reis (2008). Strategies for PHA production by mixed cultures and renewable waste materials. Applied Microbiology and Biotechnology 81(4): 615-628. Serafim, L. S., P. C. Lemos, R. Oliveira and M. A. M. Reis (2004). Optimization of polyhydroxybutyrate production by mixed cultures submitted to aerobic dynamic feeding conditions. Biotechnology and Bioengineering 87(2): 145-160. Seviour, R. J., J. A. Soddell, E. M. Seviour, J. R. Liu, C. A. McKenzie and C. P. Saint (2000). The filamentous bacteria causing bulking and foaming in activated sludge plants. Australasian Biotechnology 10(3): 24-29. Singh, A., J. D. Van Hamme and O. P. Ward (2006). Surfactants in microbiology and biotechnology: Part 2. Application aspects. Biotechnology Advances 25(1): 99-121. Six, W. and L. Debaere (1992). Dry anaerobic conversion of municipal solid-waste by means of the dranco process. Water Science and Technology 25(7): 295-300. Steinbuchel, A. and H. E. Valentin (1995). Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids. Fems Microbiology Letters 128(3): 219-228. Steinbusch, K. J. J. (2010). Liquid biofuel production from volatile fatty acids. Wageningen University. PhD Stodola, F. H., A. Lesuk and R. J. Anderson (1938). The chemistry of the lipids of tubercle bacilli. liv. the isolation and properties of mycolic acid. Journal of Biological Chemistry 126: 505-513. Takabatake, H., H. Satoh, T. Mino and T. Matsuo (2000). Recovery of biodegradable plastics from activated sludge process. Water Science and Technology 42(3-4): 351-356. Takeda, M., H. Matsuoka, H. Hamana and M. Hikuma (1995). Biosynthesis of poly-3hydroxybutyrate by Sphaerotilus natans. Applied Microbiology and Biotechnology 43(1): 31-34. Tchobanoglous, G. (1991). Wastewater engineering, treatment, disposal and reuse, McGraw-Hill Companies. Trummler, K., F. Effenberger and C. Syldatk (2003). An integrated microbial/enzymatic process for production of rhamnolipids and L-(+)-rhamnose from rapeseed oil with Pseudomonas sp DSM 2874. European Journal of Lipid Science and Technology 105(10): 563-571. Werther, J. and T. Ogada (1999). Sewage sludge combustion. Progress in Energy and Combustion Science 25(1): 55-116. Xu, Y., R. H. Wang, A. A. Koutinas and C. Webb (2010). Microbial biodegradable plastic production from a wheat-based biorefining strategy. Process Biochemistry 45(2): 153163. Zhang, X., R. Luo, Z. Wang, Y. Deng and G.-Q. Chen (2009). Application of (R)-3Hydroxyalkanoate Methyl Esters Derived from Microbial Polyhydroxyalkanoates as Novel Biofuels. Biomacromolecules 10(4): 707-711. Zhao, Y., L. Zhou and L. Li (2010). Impact of DO Concentration on Filamentous Sludge Bulking in Treatment of Brewery Wastewater by SBR Process. China Environmental Protection Industry 24(9). Zlokarnik, M. (1998). Separation of activated sludge from purified waste water by Induced Air Flotation (IAF). Water research 32(4): 1095-1102.
52
BIJLAGEN
53
Bijlage 1: DNA extraction from sludge and soil Reagents Tris-HCl 10 mM (pH 9) dissolve tris in MQ, adjust pH and autoclave, store in cold room lysozyme (50 mg/ml stock) dissolve in tris-HCl SDS (20%) store in 37°C incubator CHCl3-IAA: chloroform – isoamylalcohol- 24:1 (v/v) store in yellow cabinet mol lab CH3COO.NH4 (8M) prepare, autoclave and store in cold room 100 % isopropanol or 100 % ethanol use isopropanol, prepare when needed Molecular water
Operating procedures Bead beating 2 g soil or 2 ml culture + 4 ml Tris-HCl 10 mM (pH 9) mix well manually add 3 g beads bead beating (90 seconds) and wait 10 seconds; repeat 3 times Extraction add 160 μl lysozyme (50 mg/ml stock) mix gently 15 min. on shaker (37°c) add 300 μl SDS (20%) and mix 5 min. slowly manually add 1 ml CH3COO.NH4 (8M) Centrifuge, 4°C, 7000 rpm, 15 min. Recover supernatant and add 4 ml CHCl3-IAA (24:1) and mix manually until homogenous (milk-like) Centrifuge, 4°C, 7000 rpm, 15 min. Recover water phase Add 0.8 volumes 100 % isopropanol and precipitate for at least 1 hour at –20°C or add 2.5 volumes of 100 % ethanol and precipitate overnight at –20°C Centrifuge, 4°C, 7000 rpm, 25 min. Dry the pellet at room temperature (at least 15 min.) Add sterile distilled water (+/- 250 μl, depending of the pellet size) Put 5 μl of the solution on agarose gel Freeze the remaining solution at –20 °C
54
DNA clean-up Depending of the quality of DNA, an additional cleaning is necessary: Add 1 ml “resin” to 100 μl sample (or more, depending of the amount of DNA) Vortex for a short time Syringe on filter-column Filter the samples Add 2ml 80% isopropanol Centrifuge 30 seconds (tube and filter) Dry 5 min. Take a new tube Add 50 μl sterile distilled water at 68°C (from heat block) on filter Incubate 2 min. at room temperature Centrifuge 30 sec.
References Boon, N., J. Goris, P. De Vos, W. Verstraete and E.M. Top. 2000. Bioaugmentation of activated sludge by an indigenous 3-chloroaniline-degrading Comamonas testosteroni strain, I2gfp. Appl. Environ. Microbiol. 66:2906-2913. El Fantroussi, S., Mahillon, J., Navaeu, H., and Agathos, S.N. (1997) Introduction and PCR detection of Desulfomonile tiedjei in soil slurry microcosms. Biodegradation 8: 125-133. El Fantroussi, S., Verschuere, L., Verstraete, W., and Top, E.M. (1999) Effect of phenylurea herbicides on soil microbial communities estimated by analysis of 16S rRNA gene fingerprints and community-level physiological profiles. Appl. Environ. Microbiol. 65: 982-988.
55
Bijlage 2: DGGE Ingeny protocol Acrylamide concentration As you can see in the protocol below, different acrylamide concentrations are described. How to determine the optimal acrylamide concentration: Check the length of your PCR fragment in literature, or by comparing it with a marker on an agarose gel. For short bp-fragments (180-200 bp), use 8% acrylamide, intermediate fragments (350 bp), use 7% acrylamide, long fragments (400-500bp), use 6% acrylamide.
Media Composition Composition of the 60% denaturation buffer The volumes in the tables are for 50 ml solution (Falcon tube). Add the proper volumes, and fill further up to 50 ml with milli-Q water. Make sufficient buffer. Store in the cold room (can be done for longer time). Product Acrylamide (40% stock) BisAA (2% stock) Urea Formamide TAE (50X stock)
3,5 % Acrylamide 4,4 ml 2,5 ml 12,5 g 12 ml 1 ml
6% Acrylamide 7,5 ml 2,5 ml 12,5 g 12 ml 1 ml
8% Acrylamide 10 ml 2,5 ml 12,5 g 12 ml 1 ml
6% Acrylamide 7,5 ml 2,5 ml 1 ml
8% Acrylamide 10 ml 2,5 ml 1 ml
Composition of the 0% denaturation buffer Product Acrylamide (40% stock) BisAA (2% stock) TAE (50x stock)
3,5% Acrylamide 4,4 ml 2,5 ml 1 ml
Composition of the gradient solution % denaturation 60% 55% 45% 40%
60 % denaturation 10 ml 9,16 ml 7,5 ml 6,66 ml
0% denaturation 0 ml 0,84 ml 2,5 ml 3,4 ml
56
Ammonium persulfate (APS) Add 0.1 g in 1 ml milli-Q (10% APS, closet under DGGE) (small error on it is ok) This is a catalysator, which makes your gel solidify faster. You find this product in closet with DGGE-plates. Store in cold room in an ep, you need it for your bottom gel, gel and stacking gel.
Protocol Preparing the gel Clean the glass plates and the spacers thoroughly o Cif under warm water tap (scrub enough) and then pure EtOH (70% or 100%) o For every cleaning step that will follow: use dust-free tissues (or you will see dust on the gel) o pure EtOH for already cleaned plates is sufficient Check if the holder is free of gel of former gels (on top and on the bottom) Put the spacer between the plates and place all together in the holder o The larger plate with the 'horns' up in the back and the smaller one with the 'horn' downwards in the front o If you only have one gel, then put it in the front holder, and the dummy on the other side o (front/back, black connection on your left hand side = front is towards you) o Use the screws to make sure the plate can go in and out Pull up the spacer just until the back plate would go up. Check if plates are horizontal Screw now screws in while dividing the pressure. Do not overscrew them. From the moment it is fixed, stop turning Clean a comb with EtOH (pure, 70%) and dry paper and put the gel comb on the right hand side of the plates o Screw the upper screws a bit open so the comb fits in and then screw on again o Make sure you can still see the back-plate through the comb, so there is some air in the slides Making of the bottom gel This must be done fast. Make sure you use cold products For every gel, you add 1 ml of your highest gradient buffer in an ep. For every ml, you add 20 µl APS and 1 µl TEMED quickly and shake shortly Use a syringe (3 ml) with green needle, put next to spacer and add the ml to each gel. Swirl holder a bit, so the whole bottom is covered Let the gel stand for at least 15'
57
Making of the gel This must be done very fast! Take freshly made gradient solutions of your highest and lowest % denaturation buffer (24 ml each in a falcon tube) Connect the tubing (tape it so it is quite high) with green needle just next to the spacer (avoid touching the system during the gel making). Get the white rod out of the middle piece between the two compartments of the mixing system and check that the hole is free o If not, clean the rod Add for the solutions with highest % denaturation buffer: 100 µl APS and 5 µl TEMED quickly in and shake shortly. o In winter time, you could use 130 µl APS and 8 µl TEMED Mix and fill the appropriate compartment (high denaturation gradient most close too you), remove the air bubble between the compartments (open and close the tap very quickly). Then bring the little volume that moved to the lowest gradient vessel back to the highest volume vessel (blue tip of 1 ml). Put on the magnetic stirrer (around 5) Do the same now for the lowest % denaturation buffer Open the tap and switch on the pump (pump speed 30) at the same time o Check if pump keeps on pumping When the tube is almost empty, add MQ to the small vessels (and rinse the sides while doing) When all gel is out of the tube, let the washing water go into a separate container (speed 99). Switch off the pump when the tube is empty Add 1 to 2 ml of MQ water on top of the gel with a syringe and green needle slowly o try to avoid that the comb does not make contact with the water layer Wait min. 2 hours and cover the gel (or wait even longer) o Fill the DGGE apparatus with TAE 1X until the line (2X) and preheat for at least 1 hour at 60 °C o TAE buffer comes in 50X, so 1 bottle of 100 ml in the vessel of 5 L Making the stacking gel turn the plates on their sides to get the extra water off (use some dust-free tissue) Now make the stacking gel (per gel): o 10 ml 0 % denaturation solution o 10 µl TEMED o 200 µl APS (10 %) Use a syringe with green needle to get stacking gel in quickly (about 6 ml) until the rim o You did a good job if there are some small air bubbles in the top of the lanes 58
o Make sure all holes are filled up to the top with stacking gel Cover the gel with aluminum foil and leave for 15 minutes Screw open all the lower screws completely (later on, the buffer has to pass there) Screw open the other screws a bit Push the spacer in so it goes down gently put with enough power Loading and running the gel Get your comb out slowly by pulling the top a bit back Bend the comb a bit to the back, so air comes in easier o If combs come out hard, make sure your lanes are free and straight with a needle Screw the screws on the side until plate is fixed (not to hard), the ones of the bottom should stay open Put the holder in the tank and slowly and with a 30° angle o Normally the tank should be at low voltage at that moment Now make sure the gel is under the 1X TAE buffer (add or use tubing) o Make sure the air bubbles are out of the lanes Load the gel with the PCR-samples (9 µl) with your hand behind the spacer o The back lane you should load like looking in a mirror o Samples should contain loading dye (about 1 µl for 4 µl sample) which you can find in the side of the ATP-fridge o First dip your tip in the buffer and then load o Put at the complete right and left lane (or 2) the rainbow stuff that you can find on the DGGE bench to prevent smiling. connect the red and black wires to the holder connections Close the tank and press the HV button Turn the upper button on the right hand side of the tank from the 3 o'clock position to the 12 o'clock position Put powerpack on and put at higher voltage (normally 120 V) and press the runner symbol Run 16 hours at 120 V (Primers 338-518) and check after a while if there is no error Development of the gel Put the power off the INGENY, and the power pack Get the buffer out of the gel-holder and into the INGENY tank, screw open the screws Carefully remove the gel o Get the plates out of the holders and put in the DGGE trays (you can find in EtBrroom) on some aluminum foil in mol lab o Put the plates with the larger side up o Put the spacers a bit out from the side and push/pull the spacer and back plate, so the plates come loose 59
o If you loose stacking gel, no problem, even easier o Role up the upper side a bit o If the gel sticks to both plates, put plates in more horizontal position and manipulate a bit so the gel goes completely to the lower plate o use TAE 1X (300 ml) and poor it above the gel so it comes down into the tray Take the tray to the DGGE room Try to get the gel flat by manipulation of the tray. Add 16 µl SYBR Green I (freezer mol lab), not directly on your gel and stain the gel 20 min. Shake the tray after about 10 min. Cover the trays (lid or aluminum foil) and put lamp out if possible Taking pictures of the gel Open the program Carera on the desktop o Make sure the SYBR green filter is in at the right hand side of the apparatus, and check if it is clean Open the machine o Clean with dust-free paper and ethanol until it is clean and dry Put UV-illuminator on (right hand front side of the plate) and put it at 70% Spray some water on the plate (A LITTLE BIT! Too much will drown the machine!) Take the tray with your gel and poor the water out into the special pot, while holding your hand under the tip of the tray (gel has to stay in without ruptures). Leave a little bit of buffer in and then, with a smooth move, put the gel on the plate (REMOVE as much buffer AS HUMANLY POSSIBLE) Manipulate the gel so it comes straight o The stacking gel at the top o If pieces fall of, get them away o Be careful with the gel, give no counter-power and use rather your whole hand than a finger o If it gets sticky, move it a bit and add some water on top (A LITTLE BIT!) o Try to get air bubbles out, and pieces away Close the machine Photograph the stained gel directly on a UV-transilluminator (make a digital picture too). o Put the UV bottom on (right hand corner) and select preview o Zoom in and center with positioning o Take enough pictures with different illumination times o Iris: standard 1,5 (the smaller, the sharper) and focus on 20 o Put illumination time at 8 to start, and take pictures for values from 4 to 10 Click preview and then STOP followed by ACQUIRE. Save as a tiff-file
60
Cleaning up Fold the gel and take it to the RMA-wast Use dust-free paper and clean up the buffer/water, afterwards clean with ethanol Be careful that no water comes on you and avoid to get it on the floor or clothes Leave computer on Remove the buffer from the special pot in the DGGE waste
61
Bijlage 3: Foto van de opstelling van de reactor voor de productie van PHB. Reactor (1.5L mixed liquor)
Influent
Mixing en beluchting
Effluent
62
