MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA CENTRUM PRO VÝZKUM TOXICKÝCH LÁTEK V PROSTŘEDÍ
HODNOCENÍ CHEMOPREVENTIVNÍCH ÚČINKŮ FYTOCHEMIKÁLIÍ POMOCÍ IN VITRO METOD
Zuzana Lenčešová Diplomová práce
Vedoucí: RNDr. Pavel Babica, Ph.D. Brno, Česká republika, rok 2014
Bibliografický záznam Autor:
Název práce:
Zuzana Lenčešová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Hodnocení chemopreventivních účinků fotochemikálií pomocí in vitro metod
Studijní program:
Experimentální biologie
Studijní obor:
Speciální biologie
Vedoucí práce:
RNDr. Pavel Babica, Ph.D.
Akademický rok:
2012/2014
Počet stran:
89 + 4
Klíčová slova:
chemoprevence; protirakovinné účinky; nádorová promoce; fytochemikálie; přírodní látky; mezibuněčná komunikace; mezerové spoje
Bibliographic Entry Author:
Title of Thesis:
Zuzana Lenčešová Faculty of Science, Masaryk University Research Centre for Toxic Compounds in the Environment Chemopreventive effects of phytochemicals – in vitro evaluation
Degree programme:
Experimental biology
Field of Study:
Special biology
Supervisor:
RNDr. Pavel Babica, Ph.D.
Academic Year:
2012/2014
Number of Pages:
89 + 4
Keywords:
chemoprevention; anticancer; tumor promotion; phytochemicals; natural compounds; gap junctional intercellular communication
Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá chemopreventivními a protinádorovými účinky fytochemikálií, které byly posuzovány in vitro metodami. Chemopreventivní vlastnosti byly hodnoceny dle účinků těchto látek na mezibuněčnou komunikaci zprostředkovanou mezerovými spoji (GJIC) potkaních jaterních buněk WB F344. Protinádorové účinky dvou vybraných fytochemikálií byly navíc posuzovány dle jejich vlivu na buněčnou proliferaci, indukci apoptózy a buněčný cyklus u WB F344 buněčné linie trasfekované H-ras onkogenem. Pro tyto účely bylo vybráno devět fytochemikálií nebo jim příbuzných látek: dialyl sulfid, kyselina skořicová, kurkumin, emodin, indol-3-karbinol, metformin, quercetin, silibinin a tymochinon. U těchto látek byl posuzován vliv na chemicky indukovanou inhibici mezibuněčné komunikace. Inhibice GJIC byla zajištěna pomocí šesti známých inhibitorů a nádorových promotorů: 1,1,1-trichlor-2,2-bis(4-chlorfenyl)ethanu (DDT), fluoranthenu, lindanu, pentachlorofenolu (PCP), kyseliny perfluorooktanové (PFOA) a 12-tetradekanoyl-13-forbolesteru (TPA). Testy ukázaly, že všechny z uvedených fytochemikálií jsou schopny preventivně působit proti inhibici alespoň jednoho inhibitoru. Tato skutečnost potvrzuje, že vybrané fytochemikálie mají potenciálně chemopreventivní účinky. Dále bylo prokázáno, že metformin a silibinin jsou schopny obnovit GJIC, indukovat apoptózu a ovlivňovat buněčný cyklus u tumorigenní linie WB F344-ras. Selektivní účinky metforminu a silibininu na proliferaci tumorigenních buněk nebyly prokázány. Všechny tyto efekty nasvědčují, že by se mohlo jednat o látky, které jsou schopny účinně působit na vývoj nádorových onemocnění.
Abstract This diploma thesis focused on chemopreventive and anticancer effects of phytochemicals and their analogues, which were evaluated using in vitro methods. Gap junctional intercellular communication (GJIC) in rat liver epithelial cell line WB-F344 and their neoplastically transformed derivatives was evaluated as the major biomarker of chemopreventive effects. Set of nine selected phytochemicals or their analogues (diallyl sulfide, cinnamic acid, curcumin, emodin, indole-3-carbinole, metformin, quercetine, silibinin and thymoquinone) were tested at noncytotoxic doses for their ability to prevent inhibition of GJIC induced by environmental toxicants or tumor promoters in nontransformed WB-F344 cells: 1,1,1-trichlor-2,2-bis(4-chlorfenyl)ethan (DDT), fluoranthene, lindane, pentachlorophenol (PCP), perfluorooctanoic acid (PFOA) and
12 tetradecanoyl-13-forbolester (TPA). It was demonstrated that all these
phytochemicals were able to prevent at least one of these chemicals from GJIC inhibition. The most pronounced effects were observed with quercetin and silibinin. Experiments with two selected chemicals, silibinin and metformin, showed, that these chemicals were able to increase GJIC in WB cells transformed with H-ras oncogene (WB-ras). Moreover, exposure to both metformin and silibinin induced apoptosis in WB-ras cell line, and metformin also increased the relative number of cells in the G2/M phase of cell cycle. These results provide novel information on chemopreventive and anticancer effects of studied phytochemicals and also indicate that in vitro evaluation of GJIC in WB cell lines represents a valuable tool for identification and characterization of chemopreventive and anticancer effects of chemicals.
Poděkování Touto cestou bych chtěla poděkovat především svému vedoucímu diplomové práce RNDr. Pavlovi Babicovi, PhD. za výborné odborné vedení, velkou trpělivost a přátelský přístup. Další poděkování patří MVDr. Přemyslu Mikulovi, PhD. za odbornou pomoc s průtokovou cytometrií, a také celému kolektivu buněčné laboratoře centra RECETOX.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci na téma Hodnocení chemopreventivních účinků fytochemikálií pomocí in vitro metod vypracovala samostatně pod vedením vedoucího diplomové práce a s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány a uvedeny v seznamu použité literatury.
Brno 16. května 2014
……………………………… Zuzana Lenčešová
Obsah Seznam použitých zkratek ..………………………………………………………………………………………. 12
Teoretická část 1. Nádorová onemocnění …………………………………………………………………………………………. 15 1.1. Historie nádorového onemocnění ………………………….……………………………………… 15 1.2. Nádorová onemocnění v číslech …………………………………………….……………………… 15 1.3. Vznik nádorového onemocnění …………………………………….………………………………. 17 1.4. Vlastnosti nádorových buněk ………………………………………………………………………… 18 2. Mezibuněčná komunikace ……………………………………………………………………………………. 20 2.1. Struktura mezerových spojů …………………………………………………………………..……… 21 2.2. Regulace GJIC …………………………………………………………………..……………………………. 22 2.3. Inhibice GJIC ……………………………………………………………..…………………………………… 23 2.3.1. Inhibitory GJIC ……………………………………………………………………………………….. 24 2.4. Měření funkčnosti GJIC …………………………………………………………………………………. 25 2.5. GJIC vs nádorová onemocnění ………………………………………………………………………. 26 3. Chemoprevence ……………………………………………………………………………………………………. 27 4. Fytochemikálie ……………………………………………………………………………………………………… 28 4.1. Polyfenoly ……………………………………………………………………………………………………… 30 4.1.1. Kurkumin …………………………………………………………………………………………….. 30 4.1.2. Kyselina skořicová ……………………………………………………………………………….. 32 4.1.3. Quercetin …………………………………………………………………………………………….. 33 4.1.4. Silibinin ………………………………………………………………………………………………… 34 4.2. Organosirné sloučeniny …………………………………………………………………………………. 35 4.2.1. Dialyl sulfid ………………………………………………………………………………………….. 35 4.2.2. Indol-3-karbinol …………………………………………………………………………………… 36 4.3. Chinony …………………………………………………………………………………………………………. 38 4.3.1. Emodin ………………………………………………………………………………………………… 38 4.3.2. Tymochinon ………………………………………………………………………………………… 38
4.4. Biguanidy ………………………………………………………………………………………………………. 39 4.4.1. Metformin …………………………………………………………………………………………… 39
Praktická část Cíle praktické části ……………………………………………………………………………………………………. 43 5. Materiál a metody ………………………………………………………………………………………………… 45 5.1. Buněčné linie ………………………………………………………………………………………………… 45 5.1.1. WB-F344 ……………………………………………………………………………………………… 45 5.1.2. WB-ras ………………………………………………………………………………………………… 45 5.1.3. WB-neo ……………………………………………………………………………………………….. 46 5.2. Kultivace a pasážování buněčných linií ………………………………………………………….. 46 5.2.1. Materiál ………………………………………………………………………………………………. 46 5.2.2. Pracovní postup …………………………………………………………………………………… 47 5.3. Hodnocení přijmu neutrální červeně ……………………………………………………………… 48 5.3.1. Expozice buněčných kultur testovaných látkám …………………………………… 48 5.3.2. Materiál ………………………………………………………………………………………………. 50 5.3.3. Pracovní postup …………………………………………………………………………………… 50 5.3.4. Vyhodnocení výsledků …………………………………………………………………………. 51 5.4. Měření funkčnosti GJIC – SL/DT …………………………….………………………………………. 51 5.4.1. Expozice buněčné kultury ……………………………………………………………………. 51 5.4.2. Materiál ……………....……………………………………………………………………………… 54 5.4.3. Pracovní postup …………………………………………………………………………………… 54 5.4.4. Vyhodnocení výsledků …………………………………………………………………………. 55 5.5. Western blot …………………………………………………………………………………………………. 55 5.5.1. Materiál ………………………………………………………………………………………………. 56 5.5.2. Pracovní postup …………………………………………………………………………………… 57 5.6. Detekce indukce apoptózy fluorescenční mikroskopií ……………………………………. 60 5.6.1. Expozice ………………………………………………………………………………………………. 60 5.6.2. Materiál ………………………………………………………………………………………………. 60 5.6.3. Pracovní postup …………………………………………………………………………………… 61
10
5.7. Analýza buněčného cyklu ………………………………………………………………………………. 61 5.7.1. Expozice ……………………………….……………………………………………………………… 61 5.7.2. Materiály ………………………………………….…………………………………………………. 61 5.7.3. Pracovní postup …………………………………………………………………………………… 62 6. Výsledky a diskuze ………………………………………………………………………………………………… 63 6.1. Buněčná linie WB-F344 …………………………………………………………………………………. 63 6.1.1. Cytotoxické efekty fytochemikálií na buněčnou linii WB-F344 …………….. 63 6.1.2. Hodnocení koncentračně závislých účinků látek na GJIC v linii WB-F344 65 6.1.3. Vliv fytochemikálií na chemicky indukovanou inhibici GJIC ………………….. 69 6.2. Tumorigenní buněčná linie ……………………………………………………………………………. 70 6.2.1. Měření mezibuněčné komunikace ………………………………………………………. 70 6.2.2. Ověření exprese H-ras …………………………………………………………………………. 71 6.2.3. Účinky MET a SIL na proliferaci ……………………………………………………………. 72 6.2.4. Účinky MET a SIL na indukci apoptózy …………………………………………………. 73 6.2.5. Vliv MET a SIL na buněčný cyklus …………………………………………………………. 74 Závěr ………………………………………………………………………………………………………………………… 79 Seznam použité literatury …………………………………………………………………………………………. 80 Příloha ………………………………………………………………………………………………………………………. 90
11
Seznam použitých zkratek: APS
peroxodisíran amonný
CUR
kurkumin
CIA
kyselina skořicová
CK1
kaseinkináza 1
Cx
konexin
DAS
dialyl sulfid
DADs
dialyl disulfid
DATS
dialyl trisulfid
DDT
1,1,1-trichlor-2,2-bis(4-chlorfenyl)ethan
dH2O
destilovaná voda
DMSO
dimethylsulfoxid
DTT
dithiotreitol
EMO
emodin
EtOH
ethanol
FBS
fetal bovine serum
Fla
fluoranthen
FRAP
fluorescence redistribution after photobleaching
GJIC
gap junctional intercellular communication = mezibuněčná komunikace zprostředkovaná mezerovými spoji
Gly
glycin
I3C
indol-3-karbinol
LAMP
local activation of molecular fluorescent probe
Lin
lindan
MAPK
mitogenem aktivované proteinkinázy
MeCN
acetonitril
MeOH
methanol
MET
metformin
NK buňky
natural killer cells = buňky imunitního systému
NRU
neutral red uptake
OSCs
organosirné sloučeniny
12
PAK
proteinkináza A
PBS
pufrovaný fyziologický roztok
PCR
polymerase chain reaction = polymerásová řetězová reakce
PCP
pentachlorofenol
PFOA
perfluorooktanová kyselina
PI
propidium jodid
PKC
proteinkináza C
PP2
specifická fosfatáza
QUER
quercetin
SDS
dodecylsíran sodný
SIL
silibinin
SL/DT
scrape loading/dye transfer
TEMED
N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylenediamin
THY
tymochinon
TPA
12-O-tetradekanoylforbol-13-acetát
13
Teoretická část
14
1. Nádorová onemocnění 1.1. Historie nádorového onemocnění Nádorové onemocnění neboli rakovina provází lidstvo již řadu let. Rakovina byla poprvé popsána v antickém Řecku, známým lékařem Hippokratem, jako „karkinos“. O několik století později, bylo poprvé použito slovo neoplazie, které definoval starověký lékař Galén. V roce 1775 byl rozpoznán vztah mezi expozicí látkám vyskytujícím se v životním prostředí a neoplastickými změnami v organismu. Anglický chirurg Percivall Pott popsal častý výskyt rakoviny šourku u londýnských kominíků, jako důsledek opakované expozice sazím. Podobnou souvislost popsal v roce 1761 také John Hill a to u pacientů s rakovinou nosní sliznice, kteří dlouhodobě šňupali tabák. V roce 1890 byl napříč celou Evropou pozorován vysoký výskyt rakoviny močového měchýře u pracovníků v chemickém a gumárenském průmyslu. Koncem 19. století již tedy bylo zřejmé, že některé chemické látky mají rakovinotvorné účinky. To vedlo k mnohým výzkumům, které měly za úkol studovat karcinogenní účinky chemických látek, porozumět této nemoci a především najít způsoby jak bránit jejímu vzniku a jak ji léčit (Oliveira et al., 2007). 1.2. Nádorová onemocnění v číslech Rakovina se celosvětově řadí mezi hlavní příčiny smrti, jen v roce 2012 bylo zaznamenáno 8,2 milionů případů úmrtí v důsledku nádorového onemocnění (www.who.org, 30.4.2014). Česká republika není v tomto ohledu výjimkou a v počtu onkologicky nemocných zaujímá přední místa v Evropě. Každoročně onemocní v České republice více než 77 000 obyvatel, 27 000 pacientů tomuto zákeřnému onemocnění podlehne, přičemž incidence nádorových onemocnění vykazuje dlouhodobý vzestupný trend (Obr. č. 1). Mezi roky 1998 a 2008 narostl počet nově diagnostikovaných pacientů o 28%. Česká republika je již dlouhodobě na prvním místě v Evropě, v četnosti výskytu rakoviny tlustého střeva. Nejčastějšími typy nádorového onemocnění je však u mužů karcinom plic. Přibývá ale také karcinomů tlustého střeva, konečníku a prostaty. U žen je nejčastějším typem nádorového onemocnění karcinom prsu, ale zvyšuje se počet případů karcinomu plic. Naproti tomu bylo v posledních letech zaznamenáno snížení
15
výskytu karcinomu žaludku u mužů i žen a nebyl pozorován nárůst počtu pacientek s karcinomem děložního čípku (www.linkos.cz, 30.4.2014).
Obrázek č. 1: Vývoj incidence nádorových onemocnění u mužů a žen v období 1986–2010 (www.uzis.cz, 2010).
Na Obr. č. 2 je znázorněna věková struktura nově hlášených případů nádorového onemocnění v roce 2010. U mužů je nejrizikovější období mezi 60–74 lety, následují muži starší než 75 let a jako třetí jsou muži ve věku 45–59 let. U žen je toto pořadí stejné, nicméně nemocných žen ve věku 60–74 let je přibližně o 10% méně než mužů. Toto onemocnění se však projevilo více u mladších žen. Ačkoli jsou nádorová onemocnění zastoupena ve všech věkových skupinách, se zvyšujícím se věkem se výrazně zvyšuje i počet nemocných (www.uzis.cz, 2010).
Obrázek č. 2: Věková struktura nově hlášených pacientů s nádorovým onemocněním v roce 2010 (www.uzis.cz, 2010).
16
1.3. Vznik nádorového onemocnění Na vzniku nádorového onemocnění se může podílet množství faktorů. Tyto faktory se zpravidla dělí do dvou skupin, na exogenní a endogenní. První skupina zahrnuje nutriční návyky (příprava a konzervace potravin), socio-ekonomické postavení, životní styl (konzumace alkoholu, kouření cigaret), fyzikální působení (např. rentgenové či radioaktivní záření), chemické (působení mutagenů a karcinogenů) a biologické faktory (např. Helicobacter pylori, HPV – human papilloma virus, parazité, ale také působení růstových faktorů). Mezi endogenní faktory zahrnujeme poškození imunity, záněty s nejistou příčinnou vzniku (ulcerózní kolitida či pankreatitida), genetické predispozice, věk, endokrinní nerovnováha a psychický stav (Oliveira, et al., 2007). Rakovina je vícestupňový proces. U většiny nádorových onemocnění trvá mnoho let, než dojde k rozvoji nemoci a začnou se projevovat klinické příznaky (Breheny, et al. 2011). Karcinogenezi tradičně rozdělujeme na tři vývojové procesy: iniciaci, promoci a progresi (Obr. č. 3). V počátečním stádiu nádorového bujení, tzv. iniciaci, vzniká nevratné poškození buněčné DNA (např. působením karcinogenů), což vede k mutacím. V tomto stádiu nejsou tyto „iniciované“ buňky dostatečně aktivní, proto nejsou považovány za nádorové. V tento typ buněk se mění teprve až poté, co působení karcinogenních faktorů stále a pravidelně pokračuje a případně dochází k vytvoření nových mutací (Béliveau & Gingras, 2008). S výjimkou mechanismů reparace poškozené DNA nebo odstranění poškozených buněk (imunitní systém, apoptóza) jsou procesy probíhající ve fázi iniciace považovány za nevratné, ireverzibilní (Oliveira, et al., 2007). V druhém stadiu karcinogeneze, promoční fázi, dochází ve tkáních k narušení signálních a regulačních procesů kontrolujících buněčný růst, apoptózu a buněčnou diferenciaci a dochází k potlačení schopnosti udržovat homeostázu na tkáňové úrovni (Forejtnikova & Kubinova, 2003). To má za následek nárůst dělení „iniciovaných“ buněk, potlačení procesů indukujících jejich apoptózu a diferenciaci, což je provázeno také snížením mezibuněčné komunikace (Kapitola č. 2). Fáze nádorové promoce je složitý proces, pro který je charakteristické dlouhodobé ovlivnění zmíněných signálních a regulačních buněčných procesů epigenetickými (negenotoxickými) mechanismy. Stádium nádorové promoce proto může probíhat u lidí až několik let a má reverzibilní
17
charakter. To poskytuje velmi široký prostor pro zpomalení tohoto procesu či dokonce k zabránění vstupu do posledního stádia a vzniku rakoviny. V posledním stádiu karcinogeneze, tzv. progrese, již buňka získává zhoubný charakter, což vede k napadání tkáně, ve které se buňka nachází, ale je také schopna se rozšířit do dalších tkání těla ve formě metastáz. Všechny buňky, které dospějí do tohoto stádia, mají společné charakteristické vlastnosti, tzv. „hallmarks of cancer“ (Béliveau & Gingras, 2008; Hanahan & Weinberg, 2011).
Obrázek č. 3: Tři vývojové procesy karcinogeneze: iniciace, propagace a progrese (Béliveau & Gingras, 2008).
1.4. Vlastnosti nádorových buněk Vývoj rakoviny je tedy progresivní, několika stupňový proces, během kterého buňky získávají jedinečné vlastnosti, které jim umožňují vytvářet zhoubné nádory. Hanahan a Weinberg v roce 2000 definovali šest biologických funkcí, které buňka získá během karcinogeneze, tzv. charakteristické znaky nádorových buněk („hallmarks of cancer“). Tyto charakteristické znaky zahrnují 1) růst v nepřítomnosti prorůstových signálů (nepřetržité proliferativní signálování), 2) necitlivost k růstovým supresorům, 3) rezistence k apoptóze, 4) získání replikační nesmrtelnosti (neomezené dělení), 5) indukce angiogeneze a 6) schopnost invaze do okolních tkání a metastázování (Obr. č. 4) (Hanahan & Weinberg, 2011). Výzkumy posledních let ukazují, že důležitým faktorem pro vznik a rozvoj nádorových onemocnění jsou také genomová nestabilita a zánětlivé procesy. Genomová nestabilita, vytváří genetickou rozmanitost, což urychluje získávání charakteristických znaků, zánět zase zvýrazňuje jejich projevy v průběhu fáze nádorové promoce. Další
18
výzkumy naznačují, že pro patogenezi některých nebo snad i všech nádorových onemocněních jsou klíčové další dva znaky. Prvním je schopnost modifikovat či přeprogramovat buněčný energetický metabolismus, tak aby bylo nádorové bujení co nejúčinnější. Druhý umožňuje nádorovým buňkám vyhnout se imunologickému zničení, zejména T a B lymfocyty, makrofágy nebo NK buňkami. Proto byly tyto vlastnosti navrženy jako další charakteristické znaky nádorových buněk (Obr. č. 4) (Hanahan & Weinberg, 2011).
Obrázek č. 4: Obrázek zobrazuje deset základních charakteristických znaků nádorových buněk tzv. „hallmarks of cancer“ (Hanahan & Weinberg, 2011)
19
2. Mezibuněčná komunikace Za jeden z charakteristických znaků druhé fáze karcinogeneze, nádorové promoce, lze považovat také inhibici mezibuněčné komunikace zprostředkované mezerovými spoji (gap junctional intercellular communication – GJIC) (Forejtnikova & Kubinova, 2003). Již v roce 1966 Loewenstein a jeho kolegové navrhli, že mezerové spoje mohou hrát velkou roli v tumorigenezi (Loewenstein & Kanno, 1966). Tyto spoje hrají velice důležitou roli v udržování homeostázy v organismu a podílejí se na koordinovaném řízení růstu, vývoje a diferenciace buněk v různých tkáních (Forejtnikova & Kubinova, 2003). Proto dochází při jejich porušení k mnoha patologickým stavům, jako jsou např. nemoci kůže, hluchota, neuropatie, šedý zákal, kardiovaskulární onemocnění (Zoidl & Dermietzel, 2010; Pfenniger, et al., 2011) a k různým druhům nádorových onemocnění (Cronier, et al., 2009). Mezerové spoje se vyskytují u všech mnohobuněčných živočichů a jsou přítomny téměř ve všech tkáních, kromě buněk kosterních svalů a krevních elementů. Tyto spoje jsou definovány jako spoj dvou buněk, jejichž plazmatické membrány jsou odděleny mezerou o velikosti 2–3 nm. Proto zajišťují výměnu pouze iontů, nízkomolekulárních látek o molekulární hmotnosti do 2 kDa (Ca2+, cAMP, glutathion aj.) a jiných molekul do 1,5 nm (aminokyseliny, cukry, nukleotidy aj.) (Forejtnikova & Kubinova, 2003; Naus & Laird, 2010; Harris, 2007).
20
Homeostatická nerovnováha
Homeostatická rovnováha
Toxicita
Mezerový spoj
Nemoci
K+, Ca2+, cAMP, ATP
Karcinogeneze
Apoptóza Diferenciace Buněčný růst
Obrázek č. 5: Funkce mezerových spojů - Mezerové spoje zajišťují mezibuněčnou komunikací se sousedními buňkami (gap junctional intercellular communication – GJIC). Tyto spoje jsou schopny transportovat pouze ionty, nízkomolekulární látky nebo látky o velikosti maximálně 1,5 nm, jako např. Ca2+, K+, cAMP, ATP aj. Tyto látky jsou transportovány pasivní difuzí. GJIC je velice důležitá pro udržování homeostázy, což zahrnuje řízení buněčného růstu, diferenciaci buněk a apoptózu. Inhibice GJIC, tedy vede k narušení rovnováhy homeostázy, což zapříčiňuje vznik různých nemocí, toxicitu či karcinogenezi (Vinken et al., 2009) .
2.1. Struktura mezerových spojů Mezerové spoje jsou tvořeny dvěma kanálky tzv. konexony, které se navzájem přibližují na 2–3 nm a vytvářejí tak průchod pro transportované látky. Konexony se dále skládají z šesti proteinových podjednotek, nazývaných konexiny (Cx). Konexin čtyřikrát překlenuje plazmatickou membránu, kdy aminové a karboxylové konce směřují do cytoplasmy (Obr. č. 6). Cx se od sebe mohou lišit hned v několika směrech, uspořádáním aminokyselin či délkou karboxylového konce, ale nejdůležitějším znakem je jejich molekulová hmotnost. Ta se udává v kDa a konexiny jsou dle ní pojmenovány jako např. Cx32 nebo Cx43. Celkově je známo asi 15 typů konexinů o molekulové hmotnosti od 26 do 57 kDa. V různých tkáních se tvoří odlišné konexiny a ve většině tkání dochází k expresi více druhů konexinů. V hepatocytech se např. tvoří Cx26 a Cx 32, v kůži dokonce dochází k expresi pěti druhů konexinů (Forejtnikova & Kubinova, 2003).
21
Obrázek č. 6: Struktura mezerového spoje – Mezerové spoje jsou tvořeny dvěma kanálky tzv. konexony. Ty se skládají ze šesti proteinových podjednotek, nazývaných konexiny (Cx). Strukturu konexinů tvoří 4 transmembránové části (TM), 2 extracelulární kličky (EL), 1 cytoplazmatická klička (CL), 1 aminový konec proteinu (NT) a 1 karboxylový konec proteinu (CT) (Vinken, et al., 2009).
2.2. Regulace GJIC Důležitým aspektem je počet a velikost mezerových spojů, to je ovlivňováno buněčným cyklem, fyziologickým stavem organismu či tkáně a různými vlivy životního prostředí (Forejtnikova & Kubinova, 2003). Počet spojů je regulován transkripcí, translací, oligomerizací a degradací (Axelsen, et al., 2013). Velký vliv na regulaci mezibuněčné komunikace má také typ konexinu, na němž závisí selektivita a permeabilita mezerového kanálku (Forejtnikova & Kubinova, 2003). Funkce konexinů může být regulována několika posttraslačními modifikacemi. Nejvíce prostudovanou posttranslační modifikací je fosforylace, ta byla zaznamenána ve všech savčích konexinech (Axelsen, et al., 2013). Fosforylací konexinu dochází ke změně jejich terciální struktury, což má za důsledek otevření či naopak uzavření mezerového spoje. K fosforylaci dochází pomocí proteinkináz, jako jsou MAPK (= mitogenem aktivované proteinkinázy), PKC (= proteinkináza C), PKA (= proteinkináza A) či CK1 (= kaseinkináza 1) (Forejtnikova & Kubinova, 2003). V posledních letech bylo zjištěno, že důležitou roli v regulaci mezibuněčné komunikace hrají také jiné posttranslační modifikace jako ubikvitinace,
22
sumoylace, hydroxylace, nitrosylace, acetylace, methylace a ϒ-karboxyglutamace (Axelsen, et al., 2013). Regulace GJIC je ovšem zajišťována např. i genovou expresí konexinu. Genová transkripce je kontrolována epigenetickými mechanismy, jako jsou DNA methylace a posttranslační modifikace histonů (Vinken et al., 2006). 2.3. Inhibice GJIC Jak bylo zmíněno výše, inhibicí mezibuněčné komunikace dochází k narušení homeostázy a k deregulaci dalších procesů, které řídí růst, vývoj a diferenciaci buněk. Proto poté dochází k různým patologickým stavům, mezi něž patří i nádorová onemocnění (Forejtnikova & Kubinova, 2003). Mnoho in vitro i in vivo studií prokázalo, že inhibice mezibuněčné komunikace je předpokladem nekontrolovatelného dělení buněk, tedy rakovině (Trosko, 2005). U nádorových buněk je mezerových kanálku buďto méně, mají menší velikost nebo vůči normálním buňkám exprimují méně konexinů. U těchto buněk schopnost komunikovat přes mezerové spoje zcela vymizí (či se alespoň sníží viz Obr. č. 7), nebo mezerové spoje vytvoří, ale pouze s další nádorovou buňkou. Nejsou schopny vytvořit spoj s normálními nenádorovými buňkami, proto nemohou dostávat např. antiproliferativní či anti-apoptické signály (Forejtnikova & Kubinova, 2003).
Obrázek č. 7: Mezibuněčná komunikace u in vitro kultur normálních a tumorigenních buněčných linií. Porovnání GJIC u nenádorových buněk WB-F344 (vlevo) a WB-F344 buněk transfekovaných H-ras onkogenem (vpravo), které mají významně sníženou úroveň mezibuněčné komunikace.
23
2.3.1. Inhibitory GJIC Mnoho
chemických
a
biologických
toxických
látek
má
inhibiční
vliv
na mezibuněčnou komunikaci GJIC, který se může projevovat na různých úrovních a mechanismech regulace GJIC. Tyto látky mohou inhibovat transkripci konexinů, narušit transport konexin k membráně, jejich lokalizaci a vytvoření funkčního spojení mezi buňkami, či mohou ovlivnit posttranslační modifikace (např. fosforylaci) a další regulační procesy konexinů kontrolující propustnost mezerových spojů (King & Bertram, 2005), (Vinken, et al., 2009). Mezi tyto látky patří různé environmentální polutanty, biologické toxiny, organická rozpouštědla, pesticidy, farmaceutika, peroxidy, kovy a ftaláty (Vinken, et al., 2009). Organické sloučeniny, které vykazují silné inhibiční účinky na GJIC pozorované in vitro nebo in vivo, zahrnují také modelový promoter karcinogeneze 12-O-tetradekanoylforbol-13-acetát kontaminanty:
chlorované
(TPA),
pesticidy
dále
významné
environmentální
gamma-hexachlorocyklohexan
(lindan),
1,1,1-trichlor-2,2-bis(4-chlorfenyl)ethan (DDT), pentachlorofenol (PCP); polycyklický aromatický uhlovodík fluoranthen (Fla); a perfluorooktanovou kyselinu (PFOA). Podle výsledků studie realizované na řešitelském pracovišti jsou tyto látky schopné inhibovat GJIC in vitro rychlým mechanismem (během několika minut), přitom tyto jejich účinky jsou zprostředkovány zřejmě různým mechanismem (I. Sovadinova et al., submitted). Zatímco TPA a lindan inhibují GJIC v linii potkaních jaterních epiteliálních buněk mechanismem závislým na aktivaci MAPK-kinázy MEK1/2 a následné fosforylaci Cx43 MAP kinázou ERK1/2, účinky fluoranthenu a DDT jsou zprostředkovány aktivací fosfatidylcholin-specifické fosfolipázy C (PC-PLC) (I. Sovadinova, et al., submitted). Spoluúčast obou těchto signálních enzymů, MEK1/2 a PC-PLC, byla popsána v případě inhibice GJIC indukované PFOA (Upham et al., 2009), kdežto žádný z těchto enzymů se pravděpodobně nepodílí na inhibici GJIC vyvolané PCP, která je zřejmě indukovaná jinými signálními mechanismy (I. Sovadinova, et al., submitted). Těchto šest modelových inhibitorů GJIC bylo použito v experimentální části práce a jejich přehled je uveden v Tabulce č. I, podrobnější přehledné informace lze nalézt rovněž v bakalářské práci (Lenčešová, 2012).
24
Tabulka č. I.: Vybrané inhibitory GJIC, jejich výskyt v životním prostředí a mechanismus inhibice
Inhibitor
Použití/ Výskyt
Mechanismus účinku
Citace
1,1,1-trichlor-2,2bis(4-chlorfenyl)ethan (DDT)
Insekticid
Mechanismus závislý na PC-PLC
( Sovadinova et al., 2010)
Fluoranthen (Fla)
Motorová nafta, asfalt, černouhelný dehet, cigaretový kouř atd.
Mechanismus závislý na PC-PLC
(Stocker, et al., 1996; Sovadinova, et al., 2010)
Lindan (Lin)
Pesticid
Mechanismus závislý na MEK1/2
Pentachlorfenol (PCP)
Herbicid a insekticid
Perfluorooktoanová kyselina (PFOA)
Průmysl – např. výroba teflonu
12-Otetradekanoylforbol13-acetát (TPA)
Modelový nádorový promotor
Mechanismus není závislý na MEK1/2 ani na PC-PLC Mechanismus závislý na MEK1/2 i PC-PLC Mechanismus závislý na MEK1/2
(Engeler, 2009; Corcelle et al., 2006) (Sai et al., 1998; Sovadinova, et al., 2010) (Kudo N., 2003; Upham, et al., 2009) (Goel, et al., 2007); (Ruch et al., 2001)
2.4. Měření funkčnosti GJIC Funkčnost GJIC může být měřena několika in vitro metodami. Nejjednodušší z nich je sledování přenosu nízkomolekulárního barviva mezerovými spoji. Existuje více variant tohoto typu měření GJIC. Základním principem je sledování délky transportní dráhy barviva, ale liší se od sebe způsobem, jakým se barvivo do buňky dostává. Nejčastěji používaná je metoda SL/DT (scrape loading/ dye transfer), při které se barvivo dostane do buněk prostřednictvím řezu skalpelem. Dalšími možnostmi je vstříknutí barviva do buňky pomocí mikroinjekce či pomocí tzv. elektroporace (EL/DT, electroporation loading/dye transfer). Při elektroporaci dochází k elektrickému impulsu, který vyvolá otevření přechodných póru v plazmatické membráně, a to způsobí proniknutí barviva do buněk (Abbaci, et al., 2008). U metody gap-FRAP (gap-fluorescence redistribution after photobleaching) jsou všechny buňky v kultuře obarveny fluorescenční barvou. Následně se v buněčném kontinuu jednotlivé buňky odbarví pomocí laseru a poté se sleduje průnik barviva
25
mezerovými spoji do odbarvené buňky ze sousedních neodbarvených buněk (Forejtnikova & Kubinova, 2003). Další technikou je LAMP (local activation of molecular fluorescent probe), kdy je studovaná populace buněk označena fotoaktivovaným fluoroforem. Následně je pomocí laseru provedena lokální fotoaktivace tohoto fluoroforu ve vybrané buňce a provedeno hodnocení jeho migrace mezerovými spoji do okolních buněk (Abbaci, et al., 2008). Ke studiu GJIC je možné použít také hodnocení tzv. metabolické kooperace, která spočívá v předinkubování populace buněk s fluorescenčně nebo radioaktivně značeným metabolitem a vyhodnocování jeho transferu mezerovými spoji do populace neznačených buněk v kokultivačním experimentu. Dalí metodou je nepřímé stanovení hodnocení GJIC prostřednictvím fluorescenčních barviv citlivých na vysoké koncentrace vápenatých kationtů, kdy se po působení mechanického nebo chemického stimulu mikroskopicky sleduje mezibuněčné šíření vápníkové vlny (intercellular calcium wave) buněčným kontinuem. K hodnocení GJIC lze použít také stanovení elektrické vodivosti mezerových kanálků při měření elektrických proudů procházejících membránami sousedících buněk (technika „dual whole-cell patch clamp“) (Abbaci et al., 2007). Další metody při studiu mezerových spojů již nehodnotí funkčnost GJIC přímo, ale zaměřují se na detekci a kvantifikaci transkripce a genové exprese konexinů technikami PCR a Western blot, případně na hodnocení buněčné lokalizace konexinů a mezerových spojů pomocí imunofluorescenčního značení konexinů (Forejtnikova & Kubinova, 2003), (Trosko et al., 2000). 2.5. GJIC vs nádorová onemocnění Řada in vitro a in vivo studií, ukazuje, že narušením mezibuněčné komunikace GJIC dochází ke vzniku nádorových onemocnění. Např. bylo prokázáno že, exogenní a endogenní nádorové promotery reverzibilně inhibují GJIC, a také onkogeny jsou schopny inhibice mezibuněčné komunikace (Upham & Trosko, 2009). Nefunkční mezibuněčná komunikace patří mezi hlavní rysy nádorových buněk, které zpravidla neexprimují konexiny, nemají funkční mezerové spoje nebo je vytváří pouze mezi sebou, jak již bylo popsáno v Kapitole č. 2.3. Inhibice a ztráta GJIC jsou zřejmě jedním z hlavních procesů, které probíhají během karcinogeneze, převážně v její promoční fázi (Forejtnikova & Kubinova, 2003). Na druhou stranu některé studie potvrdily, 26
že působením protinádorových promoterů dochází ke zvýšení regulace GJIC. Další studie ukázala obnovu GJIC u tumorigenní buněčné linie po transfekci genu mezerového spoje z normálních komunikujících buněk (Upham & Trosko, 2009). Proto GJIC představuje významný biomarker, který je možno použít pro hodnocení, jak nádorově promočního, tak chemopreventivního potenciálu chemických látek (Lenčešová, 2012).
3. Chemoprevence Prevenci nádorových onemocnění rozdělujeme na tři kategorie: primární, sekundární a terciální. Primární prevence předchází vzniku nádorového onemocnění. Řadíme sem např. omezení kouření tabákových výrobků, střídmá konzumace alkoholu, pravidelný pohyb, zkrátka zdravý životní styl. Sekundární prevencí chápeme včasný záchyt onemocnění, ve stádium, které je ještě léčitelné. Základem tedy je, aktivně vyhledávat nádorové onemocnění formou pravidelných preventivních prohlídek jako např. pravidelné gynekologické prohlídky, samovyšetření prsu a mamografie či test na krev ve stolici. Posledním typem je terciální prevence, která zamezuje vzniku vedlejšího poškození v důsledku nemoci či chemoterapie (Žaloudík, 2008). Chemoprevence je definována jako používání přírodních, syntetických nebo biologických chemických látek na zvrácení, potlačení či k prevenci progresivní fáze karcinogeneze (Tsao, et al., 2004). Do terciální prevence můžeme naopak zařadit látky s chemoterapeutickými vlastnostmi, které ovlivňují přímo nádorové buňky a jejich charakteristické znaky. Či chemosensitizační látky, které sami o sobě nemají protirakovinné účinky, ale podporují tyto efekty u jiných látek. Používají se v případě vzniku rezistence na chemoterapii (Gupta, et al., 2011). Zde všude mohou nalézt uplatnění přírodní látky tzv. fytochemikálie nebo od nich odvozené produkty.
27
4. Fytochemikálie Fytochemikálie jsou zpravidla látky, kterými se rostliny brání proti infekcím a poškození způsobnému mikroorganismy, hmyzem či jinými škůdci. (Béliveau & Gingras, 2008). Nicméně fytochemikálie mohou mít i jinou funkci (fotosyntetické pigmenty, součást membrán, fytohormony). Fytochemikálie lze klasifikovat podle různých kritérií, například podle chemické struktury, botanického původu nebo biologických vlastností. (Gonzalez-Vallinas, et al., 2013). Podle chemické struktury je možné rozlišit tři hlavní skupiny fytochemikálií (Obr. č. 8): polyfenoly, terpeny a organosirné sloučeniny, v rámci těchto skupin pak několik dalších tříd a podtříd (Béliveau & Gingras, 2008).
Obrázek č. 8: Rozdělení fytochemikálií dle chemické struktury (Béliveau & Gingras, 2008).
Všechny rostliny obsahují několik fytochemikálií, v různých koncentracích. Právě tyto látky zodpovídají za jejich organoleptické vlastnosti (chuť, vůně, barva). Často jen podle barvy nebo vůně lze určit hlavní fytochemikálie vyskytující se v ovoci či zelenině. Například ovoce, které je velmi jasně zbarvené, je významným zdrojem polyfenolů. Bylo identifikováno více než čtyři tisíce polyfenolů, které jsou obsaženy v červeném víně, zeleném čaji, jablkách, bobulových plodech, cibuli, v různých druzích bylinek a koření, ale 28
také v zelenině a ořechách. Další skupina fytochemikálií, organosirné sloučeniny, se vyznačují svojí vůní, např. sirný zápach se objevuje po rozdrcení česneku či vařením kapusty. Naopak vůně citrusového ovoce souvisí s přítomností terpenů (Béliveau & Gingras, 2008). Ochranné účinky fytochemikálií ale nepůsobí pouze na zdraví rostlin, tyto látky mají vliv také na zdraví člověka (Béliveau & Gingras, 2008). Konzumace potravin obsahující fytochemikálie může snižovat riziko výskytu chronických onemocnění, jako jsou např. nádorové nebo také kardiovaskulární onemocnění (Forejtnikova & Kubinova, 2003; Lenčešová, 2012). Účinky fytochemikálií, ve vztahu k nádorovým onemocněním, se projevují na různých stupních karcinogeneze, od nádorové iniciace přes všechny charakteristické vlastnosti
nádorového
onemocnění
(viz
Kapitola
1.4.).
Studie
prokázaly,
že fytochemikálie mohou blokovat mutagenní aktivitu karcinogenů a takto působit chemopreventivně již během iniciační fáze karcinogeneze. Průběh fáze nádorové promoce, s ohledem na její dlouhodobý průběh a reverzibilní charakter, může být významně ovlivňován působením fytochemikálií přijímaných z potravy, které vykazují antioxidační či protizánětlivé účinky, inhibují buněčnou proliferaci, stimulují apoptózu nebo podporují buněčnou diferenciaci (Klener, 1999; Leone, et al., 2012). Mnoho epidemiologických studií prokázalo, že existuje vztah mezi bohatou konzumací ovoce a zeleniny a nižším rizikem vzniku mnoha onemocnění, včetně různých typů rakoviny (Forejtnikova & Kubinova, 2003). U řady fytochemikálií byla rovněž demonstrována jejich schopnost potlačovat další charakteristické vlastnosti nádorových buněk, jejichž rozvoj je spojen zejména s fází progrese karcinogeneze – angiogenezi, migraci buněk, jejich invazivitu a metastázování (Gonzalez-Vallinas, et al., 2013). Některé fytochemikálie případně jejich syntetické analogy vykazují natolik silné cytostatické účinky, že představují velmi významnou skupinu sloučenin využívaných nebo perspektivně využitelných přímo pro protinádorovou chemoterapii. Velmi známými a dobře probádanými
fytochemikáliemi
s
protikarcinogenními
vlastnostmi
jsou
např. kamptotecin (izolován z kůry a kmene Camptotheca acuminata), vikristin a vinblastin (izolovány z Catharanthus roseus) či paclitaxel (izolován z Taxus brevifolia). Řada fytochemikálií může rovněž zvyšovat účinky protinádorové chemoterapie nebo
29
radioterapie (chemosenzitizační působení), případně potlačovat nežádoucí vedlejší účinky protinádorové léčby (Gonzalez-Vallinas, et al., 2013). Vzhledem k tomu, že inhibice mezibuněčné komunikace GJIC představuje jeden z klíčových kroků ve fázi nádorové promoce, látky s chemopreventivními účinky by měly tento buněčný proces ovlivňovat. U fytochemikálií, které budou představeny v následující části práce (Obr. č. 10), již byly chemopreventivní či protinádorové účinky prokázány, avšak ve vztahu k mezibuněčné komunikaci o nich máme velmi málo či dokonce žádné informace.
Obrázek č. 9: Vzorce vybraných níže popsaných fytochemikálií.
4.1. Polyfenoly 4.1.1. Kurkumin (CUR) Tento ve vodě nerozpustný polyfenol o nízké molekulové hmotnosti (Obr. č. 9), je obsažen v rostlině Curcuma longa. Kurkumin je nejvíce aktivní látka této rostliny a tvoří 2 – 5% celkové hmotnosti. CUR je také důvodem klasického žlutého zabarvení kurkumy. Kurkuma je používána převážně jako koření nebo přírodní barvivo. V indické kultuře má toto koření dlouhou tradici, převážně v léčbě různých druhů nemocí, používá se např. při onemocnění žlučových cest, anorexii, kašli, cukrovce, jaterních onemocněních, 30
revma či při zánětu dutin (Aggarwal, et al., 2005). Míra vstřebatelnosti CUR je nízká, ale látky vyskytující se v černém pepři (piperin) či novém koření zvyšují jeho absorpci až tisíci násobně. Bylo zjištěno, že CUR má schopnost snižovat hladinu cholesterolu v krvi, dále má antitrombotické, antioxidační, protizánětlivé, silné chemopreventivní a potenciálně i chemoterapeutické vlastnosti. Studie ukazují, že CUR působí např. proti kardiovaskulárním onemocněním, cukrovce, Alzheimerově chorobě, HIV, rakovině (žaludku, tlustého střeva, kůže či jater a to jak v počátečních, tak v pokročilých stádiích) (Obr. č. 11). V laboratorních podmínkách CUR inhibuje růst různých druhů lidských nádorových buněk a to vyvoláním apoptózy jako například u leukemických buněk, buněk nádorů tlustého střeva, prsu a vaječníku. CUR také blokuje nádorovou iniciaci vyvolanou benzo[a]pyrenem a 7,12-dimethylbenz[a]antracenem. V in vivo studiích potlačuje karcinogenezi kůže, jícnu, prsu a jater u myši. V neposlední řadě zabraňuje tvorbě nových krevních cév v nádorech (Aggarwal, et al., 2005; Béliveau & Gingras, 2008). V oblasti mezibuněčné komunikace, je CUR schopen po 24 hodinové inkubaci zmírnit inhibici GJIC vyvolanou methyglyoxalem na lidských endoteliálních buňkách pupečníkové žíly (HUVECs). CUR byl testován v koncentracích od 0,25 do 2,5 µM a mezibuněčná komunikace stoupala se vzrůstajícími koncentracemi CUR (Hu, et al., 2013). Také u N2a buněk (myší buňky neuroblastomu) byla pozorována obnova GJIC (Vanisree & Ramanan, 2007). Taktéž byla provedena in vivo studie, při které bylo pozorováno, že u potkanů exponovaných po dobu jednoho týdne CUR (300 mg/kg/den) nedocházelo ke snížení exprese Cx43 v myokardu, které bylo u neexponovaných jedinců pozorováno v souvislosti indukovaným ischemicko-reprefúzním poškozením (Kim et al., 2012).
31
Obrázek č. 10: Souhrnné schéma účinků kurkuminu (Aggarwal, et al., 2005).
4.1.2. Kyselina skořicová (CIA) Kyselina skořicová (Obr. č. 9) je polyfenol (Tsai et al., 2013), který je obsažen ve skořicovníku čínském (Cinnamomum cassia) (Choi et al., 2009) či v potravinách jako jsou jablka, citrusové plody, káva, zeleninové oleje, propolis a víno. CIA se běžně používá pro svou chuť i vůni (de Oliveira Niero & Machado-Santell, 2013). Bylo prokázáno, že má antimikrobiální, antifungální (Ekmekcioglu, et al., 1998), antioxidační (Choi, et al., 2009), antidiabetické a antikarcinogenní vlastnosti (Tsai, et al., 2013). Skořicovník čínský se v lidové medicíně používá na léčbu nemocí způsobených nedostatečnou cirkulací krve. Na základě těchto informací byly provedeny rovněž in vitro i in vivo studie, které ukázaly, že CIA vyvolává angiogenezi, což způsobuje zlepšení krevní cirkulace (Choi, et al., 2009). In vitro studie prokázaly, že CIA způsobuje inhibici buněčného růstu (Liu, at el., 1995), vyvolává diferenciaci (de Oliveira Niero & Machado-Santelli, 2013) a potlačuje tumorigenní vlastnosti lidských nádorových buněk. Konkrétně byla pozorována inhibice buněčné proliferace buněk glioblastomu, melanomu či nádorových buněk prostaty a plic (Liu, et al., 1995). Ekmekcioglu et al. prokázali inhibiční účinky CIA na růst buněk karcinomu střev (Ekmekcioglu, et al., 1998). Vzhledem ke své nízké toxicitě a antikarcinogenním vlastnostem, je CIA ideální látkou pro prevenci rakoviny či k terapeutickým účelům. Žádné studie zabývající se účinky CIA na GJIC prozatím nebyly publikovány. 32
4.1.3. Quercetin (QUER) Quercetin (Obr. č. 9) je flavonoid, vyskytující se v různých druzích zeleniny, ovoci, semínkách, oříškách, čajích a v červeném víně. Biodostupnost této fytochemikálie závisí na metabolické formě vyskytující se v potravě (Gibellini et al., 2011). Rostliny obsahující QUER jsou hojně používány v čínské medicíně (přibližně 19 ze 112 používaných rostlin, obsahuje právě QUER). Ale i v běžném jídelníčku může dosahovat denní dávka QUER až k 16–25 mg/den. V Tabulce č. II. můžeme vidět koncentrace QUER v některých potravinách (Bhagwat, et al., 2011). Konzumace těchto potravin je velice prospěšná, protože dietární příjem QUER je spojován se sníženým rizikem výskytu různých onemocnění, jako je osteoporóza, plicní a kardiovaskulární onemocnění, trombóza, vysoký krevní tlak, ateroskleróza a arytmie. Jeho dalšími důležitými vlastnostmi jsou protizánětlivé,
silné
antioxidační,
neuroprotektivní,
antikarcinogenní
a chemopreventivní účinky, ale také např. zvýšení vytrvalosti, což může vést ke zpomalení stárnutí (Dajas, 2012; Boots, et al, 2008). Bylo provedeno mnoho studií, které zkoumaly protinádorové účinky QUER. Experimenty probíhaly na široké škále buněčných linií a taktéž na zvířecích modelech. QUER má vysoce cytotoxické účinky pro nádorové buněčné linie v dávkách, které neovlivňují normální, netransformované buňky. Tyto cytotoxické efekty jsou zapříčiněny schopností QUER vyvolávat apoptózu v nádorových buňkách a také schopností blokovat jejich růst v různých částech buněčného cyklu (Gibellini, et al., 2011). QUER rovněž zabraňuje inhibici GJIC vyvolanou peroxidem vodíku u WB-F344 buněk. Další studie potvrdila, že QUER zvyšuje hladinu Cx43 u buněk rakoviny prsu (MDAMB-231) (Leone, et al., 2012).
33
Tabulka č. II.: Koncentrace quercetinu obsaženy v některých potravinách (Bhagwat, et al., 2011).
Potraviny
QUER
Potraviny obsahující
QUER
obsahující QUER
(mg/100g)
QUER
(mg/100g)
Kapary (syrové)
Brusinka
234
(Capparis spinosa)
Libeček
Švestky
170
(Levisticum officinale)
Šťovík
Fazolky
86
Sladké brambory
70
Borůvky
53
(Coriandrum sativum)
Rakytník
48,8
Opuncie
32
Jablka
31,5
Brokolice
30
3
(Brassica oleracea)
Čaj
23
(Brassica oleracea)
Aronie
4
(Malum)
(Nasturtium officinale)
Kapusta
5
(Opuntia Mill.)
(Cichorium endivia)
Řeřicha
8
(Hippophae rhamnoides)
(Allium cepa)
Čekanka
8
(Vaccinium)
(Foeniculum vulgare)
Červená cibule
10
(Ipomoea batatas)
sativus)
Fenyklové listy
11
(Vigna unguiculata)
Ředkvičkové listy
Lístky koriandru
12
(Prunus nigra)
(Rumex acetosa)
(Raphanus sativus var.
15
(Vaccinium)
2
(Camellia sinensis)
19
(Aronia prunifolia)
4.1.4. Silibinin (SIL) SIL (Obr. č. 9) se řadí mezi flavolignany obsažené v ostropestřci mariánském (Silybum marianum). Semena této rostliny jsou již více než 2000 let používány k prevenci a léčbě jaterních onemocnění jako jsou hepatitida a cirhóza. Mimo to mohou být listy a květy ostropestřce konzumovány v rámci běžné stravy jako surovina do salátů (Cheung, et al., 2010). Extrakt z plodů a semen ostropestřce se nazývá silymarin. Ten obsahuje
34
přibližně 65 – 80% flavolignanů a 20 – 35% mastných kyselin a jiných polyfenolových látek. Hlavní a nejvíce aktivní složkou silymarinu je silibinin (50 – 60%), dalšími složkami jsou isosilibinin, silikristin, silydianin, taxifolin a quercetin (Abenavoli, et al., 2010). SIL je směsí dvou diastereoisomerů, silibininu A a B v koncentračním poměru 1:1. Toxicita této fytochemikálie je minimální, avšak komplikací pro využití SIL v praxi je jeho nízká biodostupnost (20 – 50%), podobně jako u ostatních flavonoidů (Loguercio & Festi, 2011). Nicméně bylo prokázáno, že použití SIL v kombinaci např. s lecitinem, dochází ke zvýšení jeho biodostupnosti a vstřebatelnosti až deseti násobně (Kidd & Head, 2005). Jak už bylo řečeno, nejvýznamnější vlastností SIL jsou jeho hepatoprotektivní vlastnosti, které byly prokázány v in vitro i in vivo studiích (Cheung, et al., 2010). Jeho využitím je tedy léčba důsledků otrav (např. cirhóza), které byly způsobeny hepatotoxickými jedy. Příkladem je chemicky pozměněný SIL, který byl testován při léčbě otrav muchomůrkou zelenou (Mitchell, 2009). Mezi další významné efekty patří antioxidační a protizánětlivé vlastnosti, schopnost zabránit hyperglykemii (Loguercio & Festi, 2011) a antikarcinogenní vlastnosti. Protirakovinné účinky byly prověřeny pomocí jak in vitro, tak in vivo studií u epiteliálních nádorů jako např. kůže, prostaty, prsu, plic, močového měchýře, ledvin a střev (Cheung, et al., 2010). Důvodem potlačení nádorového onemocnění jsou jeho schopnosti inhibovat proliferaci, vyvolávat apoptózu, potlačovat metastázy, zastavit buněčný cyklus či potlačovat angiogenezi u tumorů (Li, et al., 2010). Účinky SIL ve vztahu k mezibuněčné komunikaci nebyly zatím prozkoumány. 4.2. Organosirné sloučeniny 4.2.1. Dialyl sulfid (DAS) Jedná se o thioether (Obr. č. 9), který je zodpovědný za aroma a chuť česneku (Allium sativum) (Yang, et al., 2001). Protirakovinné účinky česneku jsou dokladovány řadou laboratorních, ale i epidemiologických studií (Bao & Fenwick, 2005). Tyto efekty jsou přisuzovány organosirným sloučeninám
(OSCs), které jsou uvolňovány
zpracováváním této rostliny. Skladováním česneku v chladném prostředí se ve stroužcích kumuluje alliin, jejich zpracováním (drcení, krájení nebo žvýkání) se uvolňují enzymy, které mění alliin na allicin. Allicin se dále rozkládá na v tucích rozpustné látky např. dialyl sulfid (DAS), dialyl disulfid (DADS) nebo dialyl trisulfid (DATS) (Obr. č. 12) (Herman-Antosiewicz & Singh, 2004). Tyto látky preventivně působí proti rakovině 35
vyvolané nitrosaminy, které se tvoří v trávicím traktu z dusitanů a potravinářských přísad obsažených v nakládaných potravinách či v uzeninách. Proto hrají významnou roli v prevenci rakoviny trávicího traktu, jícnu, žaludku či tlustého střeva. DAS je také schopen inhibovat vývoj rakoviny plic u potkanů, způsobenou taktéž nitrosoaminy, které vznikají při přeměně nikotinu v plicích. Taktéž blokuje enzymy, zodpovědné za aktivaci karcinogenů a podílí se na eliminaci těchto látek z organismu. V neposlední řadě je schopen přímo atakovat nádorové buňky a vyvolat u nich apoptózu (nádorové buňky izolované z tlustého střeva, prsu, plic, prostaty či leukemické buňky) (Béliveau & Gingras, 2008). Účinky DAS na GJIC však dosud nebyly popsány.
Obrázek č. 11: Schéma vzniku organosirných sloučenin v Allium sativum (Herman-Antosiewicz & Singh, 2004).
4.2.2. Indol-3-karbinol (I3C) I3C (Obr. č. 9) je látka s možnými antikarcinogenními vlastnostmi, která se do lidského organismu dostává konzumací košťálové zeleniny (rod Brassica, čeleď Brassicaceae), jako je např. brokolice, hlávkové zelí, květák či růžičková kapusta. V této zelenině ale není obsažen přímo I3C, jež vzniká z glukosinolátů, které při mechanickém rozrušení rostliny (žvýkání), hydrolyzují za vzniku isothiokyanátů a indolů v důsledku působení enzymu myrosinázy. Glukosinoláty jsou velmi dobře rozpustné ve vodě, proto
36
vařením košťálové zeleniny dochází ke snížení jejich koncentrace až na polovinu, a tím tedy i ke snížení koncentrace uvolněného I3C (Béliveau & Gingras, 2008). Množství vznikajícího I3C také závisí na mnoha jiných faktorech jako například na druhu rostlin, aktivitě myrosinázového enzymu, úhrnu srážek, vlastnostech půdy nebo na množství slunečního svitu (Bradlow, 2008). In vitro studie ukázaly, že I3C je schopen potlačit proliferaci u různých nádorových buněčných linií (prsu, prostaty, děložní sliznice, střev či leukemických buněk), zabránit benzopyrenem vyvolané proliferaci prsních epitelových buněk, zastavit buněčný cyklus ve fázích G1/S či indukovat apoptózu (Obr. č. 13). Bylo provedeno i několik in vivo studií, ve kterých tato potenciálně chemopreventivní látka, účinkovala proti nádorovým onemocněním prsu a děložního čípku. Přesněji u těchto typů tumorigenních onemocnění vyvolává apoptózu, inhibuje tvorbu aduktů DNA-karcinogen, potlačuje produkci volných radikálů, stimuluje 2-hydroxylaci estradiolu a inhibuje angiogenezy. Některé studie také ukázaly silnou hepatoprotektivní aktivitu proti různým karcinogenům. Podle výsledků klinických studií, je I3C je slibným kandidátem potlačujícím zmíněnou rakovinu prsu a děložního čípku (Aggarwal & Ichikawa, 2005). In vitro studie provedena Hwang et al., ukázala, že I3C zabraňuje inhibici GJIC u WB-F344 buněk, která byla způsobená peroxidem vodíku. Mechanismus tohoto působení souvisí s inhibicí fosforylace Akt a pravděpodobně i prevencí fosforylace Cx43 (Hwang, et al., 2008).
Obrázek č. 12: Souhrn účinků indol-3-karbinolu (Aggarwal & Ichikawa, 2005).
37
4.3. Chinony 4.3.1. Emodin (EMO) Emodin je přírodní derivát antrachinonu (Obr. č. 9) vyskytující se v kořenech a kůrách různých rostlin, plísní a lišejníků. V tradiční čínské medicíně je používáno několik z těchto rostlin na léčbu mnoha nemocí již po stovky let a to např. rebarbora (Rheum palmatum), rdesno mnohokvěté (Polygonum multiflorum) či krušina olšová (Fragnula alnus). Je prokázáno, že EMO má diuretické, vazorelaxační, antibakteriální, antivirové, antiulcerogenní, protizánětlivé a antikancerogenní účinky. Bylo provedeno mnoho in vitro a in vivo studií na potvrzení protizánětlivých účinků EMO na slinivku břišní, artritidu, astma, arterosklerózu a glomerulonefritidu. Dále se ukázalo, že EMO potlačuje růst různých nádorových buněčných linií jako např. hepatocelulárního karcinomu, slinivky břišní, prsu, kolorektálního karcinomu, leukemie a rakoviny plic. Proto má potenciálně terapeutickou roli v léčbě jak zánětlivých, tak i nádorových onemocnění. Terapeutické studie, týkající se EMO ukázaly, že v kombinaci s chemoterapií je dosaženo lepších výsledků než u samotné chemoterapie (Wei, et al., 2013; Shrimali et al., 2013). Účinky EMO na GJIC prozatím nebyly prokázány. 4.3.2. Tymochinon (THY) Tymochinon (Obr. č. 9) je hlavní aktivní složkou esenciálního oleje ze semen rostliny čerňuchy seté (Nigella sativa), lidově známé jako černý kmín, vyskytující se ve Středozemí, Pákistánu a Indii. Olej z těchto semen je využíván v lidové medicíně již mnoho let a to na zvýšení imunity či na léčbu artritidy, zánětlivých plicních onemocnění a vysokého cholesterolu. Mimo semen čerňuchy seté byl THY později izolován i z listů různých druhů oregana, oleje z různých druhů saturejky či z květů tymiánu obecného. THY je velice dobře dostupný a vstřebatelný z uvedených rostlinných zdrojů a jeho toxicita je velice nízká. Vědecké výzkumy prokázaly, že THY má antimikrobiální, protizánětlivé, antidiabetické, antioxidační a protinádorové účinky. Tyto účinky byly prověřeny na mnoha různých zánětlivých, autoimunitních onemocněních (diabetes, astma, artritida) a rakovině. Také se ukázalo, že THY má preventivní účinky ve vztahu k ateroskleróze, osteoporóze, vysokému krevnímu tlaku a epilepsii. Protinádorové účinky THY byly zkoumány, v řadě in vitro a in vivo studií, které ukázaly, že THY má potenciál
38
ovlivňovat téměř všechny již výše zmíněné (Kapitola č. 1.4.) charakteristické znaky nádorových buněk (Schneider-Stock, et al., 2014). Konkrétně má THY na nádorové buňky antiproliferační a proapoptické účinky, vyvolává zastavení buněčného cyklu, inhibuje angiogenezi a tvorbu metastází. Pouze ovlivnění schopnosti nádorových buněk vyhnout se imunitnímu systému nebylo u THY zatím prokázáno (Schneider-Stock, et al., 2014). Další velmi důležitou vlastností THY je, že chrání mnoho orgánů (např. ledviny, játra či srdce) před poškozením způsobeným chemoterapií (doxorubicin, cisplatin či ifosfamid) a také zvyšuje účinnost chemoterapeutik (cisplatin či ifosfamid) a to dokonce u rezistentních typů nádorových onemocnění (Gali-Muhtasib, et al., 2006). THY je tedy velmi perspektivní látkou z hlediska jeho chemopreventivních, protinádorových, chemosensitizačních a chemoprotektivních účinků. V uskutečněných klinických studiích, bylo zjištěno, že lidské tělo je schopno tolerovat dávku až 2600 mg/den, přestože antikarcinogenní vlastnosti THY se projevují již při koncentraci 5 – 20 mg/kg). Tato koncentrace (2600 mg/den) byla podávána pacientům, u kterých selhala klasická terapie. THY jim byl podáván v takto vysokých dávkách 1 – 20 týdnů, bez jakýchkoliv vedlejších účinků (Schneider-Stock, et al., 2014). Velkým úspěchem také bylo prokázání antiepileptických efektů THY u dětí (Schneider-Stock, et al., 2014; Woo, Kumar, et al., 2012). Studie zabývající se tématem působení tymochinonu na GJIC však nejsou známy. 4.4. Biguanidy 4.4.1. Metformin (MET) Metformin (1,1-dimethylbiguanid) (Obr. č. 9) je látka, která je v dnešní době nejvíce světově používaný lék na diabetes II. typu. Guanidiny strukturně příbuzné MET (galegin a jeho deriváty) byly původně nalezeny v jestřabině lékařské (Galega officinalis). Tato rostlina se používala v přírodní medicíně střední Evropy na léčbu polyurie (nadměrný výdej moči), dnes už velice dobře známého symptomu neléčeného diabetu. MET byl poprvé syntetizován v roce 1950 a od 70. let 20. století začal být postupně používán k léčbě diabetu (Quinn, et al., 2013). Kromě toho se MET v dnešní době používá také při léčbě syndromu polycystických ovarií (Pierotti et al., 2013). Retrospektivní populační studie u diabetiků však neočekávaně ukázaly, že léčba MET je spojena také se snížením rizika vzniku nádorových onemocnění. Užívání MET významně snižuje vznik rakoviny o 30 – 50%, nejvýznamnější pokles rizika je u slinivky břišní, hepatocelulárního 39
karcinomu a rakoviny střev (Quinn, et al., 2013) Nedávno tyto výsledky potvrdila i Americká diabetologická asociace a Americká asociace pro léčbu rakoviny. V dnešní době probíhá dokonce 118 klinických výzkumů, studujících účinky MET a 25 studií na pacientech s rakovinou (Pierotti, et al., 2013). Mimo klinické výzkumy proběhlo i mnoho in vivo a in vitro studií, zabývajících se efekty MET na různé nádorové modely, jako je rakovina děložní sliznice (Cantrell et al., 2010), vaječníků (Gotlieb et al., 2008), slinivky břišní (Kisfalvi, et al., 2009), plic (Memmott et al., 2010), prostaty, střev (Zakikhani, et al., 2008), prsu (Zakikhani, et al., 2006), akutní myeloidní leukemie (Green et al., 2010) a gliomu (Isakovic et al., 2007). Výzkum s nádorovými buňkami slinivky břišní ukázal, že MET by mohl být vhodným kandidátem na terapii pro tento typ nádorového onemocnění, na který momentálně není dostupná žádná léčba. Během další studie se zjistilo, že MET inhibuje angiogenezi a rozšíření metastáz u rakoviny vaječníku. Protinádorové účinky MET mohou být důsledkem přímého nebo nepřímého působení na nádorové buňky. Přímé efekty mají dopad přímo na nádorové buňky, patří sem např. inhibice proliferace, iniciace buněčné smrti, inhibice syntézy proteinů či zastavení buněčného cyklu v G1 fázi. Nepřímý efekt účinkuje na systémových hladinách inzulínu nebo glukosy (Pierotti, et al., 2013). Mechanismus přímého i nepřímého účinku je znázorněn na Obr č. 14. Existují také studie, které poukazují na možné chemopreventivní účinky MET, který v in vitro experimentech potlačoval proliferační účinky nádorových promotorů na buňky karcinomu prsu (Jung et al., 2011). Účinky MET na GJIC však nebyly dosud zřejmě charakterizovány.
40
Obrázek č. 13: Mechanismus účinku MET na nádorové buňky. Antikarcinogenní aktivita MET je spojována s přímými a nepřímými efekty tohoto léku. Přímý, na inzulínu nezávislý efekt, je zprostředkován aktivací AMPK a inhibicí mTOR signálování, které je zodpovědné za syntézu proteinů, růst a proliferaci nádorové buňky. Nádorové supresory LKB1 a TSC2 hrají důležitou roli v inhibici mTOR., nicméně MET může inhibovat mTOR i nezávisle na LKB1, AMPK a TSC2. Nepřímý, na inzulínu závislý efekt MET, je zprostředkován jeho schopností aktivovat AMPK a inhibovat glukoneogenezi v játrech. Výsledné snížení cirkulujícího inzulínu, snižuje aktivaci PI3K/AKT/mTOR signálování v nádorových buňkách. OCT1 je schopný MET transportovat skrz buněčnou membránu a proto je velice důležitý pro účinnost MET (Dowling, et al., 2012).
41
Praktická část
42
Cíle praktické části V teoretické části diplomové práce byl popsán proces karcinogeneze a faktory zapříčiňující nádorová onemocnění. Jak bylo uvedeno protinádorové a chemopreventivní účinky byly prokázány u mnoha sloučenin rostlinného původu, tzv. fytochemikálií, a tyto sloučeniny tak představují významnou skupinu látek potenciálně využitelnou v nádorové chemoprevenci a chemoterapii. Zejména chemoprevence působením dietárních látek je považována za důležitý faktor působící preventivně proti vzniku a rozvoji nádorových onemocnění. Ovlivnění mezibuněčné komunikace zprostředkované mezerovými spoji (GJIC) je považováno nejen za velmi důležitý biomarker nádorově promočních a karcinogenních účinků chemických látek, ale také za účinný marker možných chemopreventivních účinků. Vzhledem ke své relativní jednoduchosti a nenáročnosti představuje in vitro hodnocení
GJIC
zajímavý
nástroj
potenciálně
využitelný
pro
screening
chemopreventivních účinků přírodních extraktů a produktů, jejich identifikaci a další charakterizaci zodpovědných mechanismů. Cílem praktické části bylo: 1) Prostudovat vliv vybraných fytochemikálií na chemicky indukovanou inhibici GJIC, v linii potkaních jaterních epiteliálních buněk WB-F344 a získat nové informace o schopnosti těchto látek blokovat inhibici GJIC indukovanou environmentálními toxikanty a nádorovými promotery. Pro tyto účely bylo na základě literární rešerše vybráno devět komerčně a finančně snadno dostupných fytochemikálií a látek, u kterých se předpokládají chemopreventivní nebo protinádorové účinky, avšak o jejich schopnosti ovlivňovat GJIC existuje jen omezené množství informací: dialyl sulfid (DAS), kyselina skořicová (CIA), kurkumin (CUR), emodin (EMO), indol-3karbinol (I3C), metformin (MET), quercetin (QUER), silibinin (SIL) a tymochinon (THY). Dále bylo vybráno 6 chemických inhibitorů GJIC, které zahrnují modelový nádorový promoter (TPA) a pět environmentálních toxikantů (fluoranthen, lindan, pentachlorofenol, perflurooktanovou kyselinu, DDT). Tyto látky reprezentují alespoň čtyři různé mechanismy inhibice GJIC. Tento cíl práce byl řešen v následujících etapách:
43
a.
nalezení koncentrací fytochemikálií, které nejsou cytotoxické (metodou hodnocení příjmu neutrální červeně, NRU) a zároveň nezpůsobují inhibici GJIC (hodnoceno metodou scrape-loading/dye-transfer, SL/DT) v buněčné linii WB-F344,
b. nalezení koncentrací environmentálních toxikantů a nádorových promoterů, které po 15 min expozici způsobí téměř kompletní inhibici GJIC v kultuře buněk WB-F344 (hodnoceno metodou SL/DT) c.
prozkoumání, zda inkubace kultury WB-F344 se zvolenou koncentrací fytochemikálie (po dobu 30 minut nebo 24 hodin) bude snižovat inhibiční účinky environmentálních toxikantů a nádorových promoterů na GJIC (hodnoceno metodou SL/DT)
2) Prověření
chemopreventivních
fytochemikálií
na
linii
a
potkaních
protinádorových jaterních
účinků
epiteliálních
vybraných buněk
WB
transformovaných H-ras onkogenem. Pro tuto část práce byly vybrány dvě fytochemikálie, metformin (MET) a silibinin (SIL). V rámci této části práce: a.
byla ověřena exprese ras onkogenu v linii WB-ras (metodou Western blot) a potlačení GJIC způsobené expresí onkogenu (metodou SL/DT)
b. byl prostudován vliv MET a SIL na GJIC inhibovanou expresí ras onkogenu c.
byly zkoumány cytotoxické účinky MET a SIL na linii WB-ras ve srovnání s kontrolní linií WB-neo
d. byl zkoumán vliv MET a SIL na indukci apoptózy v linii WB-ras e.
byl sledován vliv MET a SIL na buněčný cyklus buněčné linie WB-ras
44
5. Materiál a metody 5.1.
Buněčné linie
V experimentální části byla použita adherentní buněčná linie potkaních jaterních epiteliálních buněk WB-F344, a dále dvě od ní odvozené transgenní linie, WB-neo a WB-ras. 5.1.1. WB-F344 WB-F344 je nenádorová buněčná linie, která byla izolována z jater dospělého potkaního samce Fisher 344 (Tsao, et al., 1984). Jedná se o epiteliální diploidní buňky, které se svými charakteristikami odpovídají jaterním progenitorovým buňkám, resp. tzv. oválným buňkám. WB-F344 buňky si zachovávají schopnost sebeobnovy a jsou schopny in vivo nebo in vitro diferenciace do hepatocytárních buněk (Fan et al., 2009), kardiomyocytů (Anderson et al., 2007) nebo buněk žlučových kanálků (Jia et al., 2011). Buňky WB-F344 mají polygonální morfologii, vyznačují se kontaktní inhibicí růstu, nízkou schopností tvorby kolonií na měkkém agaru, exprimují Cx43 a komunikují prostřednictvím mezibuněčné komunikace GJIC. WB-F344 buňky nejsou tumorigenní in vivo. 5.1.2. WB-ras Druhým typem používané buněčné linie byly WB-F344 buňky transformované metodou transdukce onkogenem v-Ha-ras (Harvey rat sarcoma viral oncogene) nesoucím mutace v kodonech 12 a 5 (De Feijter et al., 1990). Použitý retrovirální vektor SVX nesoucí ras onkogen obsahoval markerový gen kódující resistenci vůči působení antibiotika neomycinu a jeho analogům, k vyselektování úspěšně transdukovaných buněk bylo použito antibiotikum G418 (deFeijter et al., 1996). Ras je rodina (proto)onkogenů, které jsou velmi často aktivovány nebo abnormálně exprimovány u různých typů tumorů. Tato rodina zahrnuje tři funkční geny: H-ras, K-ras a N-ras kódujících GTPázy o molekulové hmotnosti 21 kDa, které jsou součástí důležitých vnitrobuněčných signálních drah kontrolujících buněčnou proliferaci a diferenciaci (Bos, 1989). WB-ras buňky se od normálních buněk WB-F344 liší svým vřetenovým tvarem, ztrátou kontaktní inhibice růstu, schopností růstu na měkkém agaru,
45
tumorigenicitou in vivo, abnormální fosforylací a lokalizací proteinu Cx43 a nakonec i sníženou intenzitou mezibuněčné komunikace (deFeijter, et al., 1996). 5.1.3. WB-neo Posledním typem používaných buněk byly buňky WB-neo (klon 1A1), které byly transdukovány stejným způsobem jako buňky WB-ras, nicméně s použitím prázdného vektoru neobsahujícím ras onkogen (deFeijter, et al., 1996). Tyto buňky byly použity jako kontrola pro vyloučení vlivu transdukce na sledované parametry. Všechny tři druhy používaných buněčných linií byly poskytnuty z MSU (Michigan State University) z laboratoře Dr. J. Trosko a Dr. B. Upham. 5.2.
Kultivace a pasážování buněčných linií
Buňky byly kultivovány ve sterilních kultivačních lahvích o ploše 25 či 75 cm2 (TPP). Buňky byly uchovávány v termostatu při 95% vlhkosti vzduchu, 5% CO2 a 37 °C. Třikrát do týdne bylo prováděno pasážování buněk ve sterilním biohazardním boxu s laminárním prouděním. Pasážováním rozumíme naředění konfluentních buněk na potřebnou koncentraci, tak aby se mohly dále dělit. 5.2.1. Materiál
Kultivační médium pro WB-F344: DMEM (Gibco, 11880-028; 1 g/l glukosy, pyruvát sodný, bez fenolové červeně, bez glutaminu) obohacené přídavkem 5% FBS (PAA) a 2 mM L-glutaminu (Sigma)
Kultivační médium pro WB-ras a WB-neo: médium interně označované jako "CCD médium" je modifikací Eagle’s MEM média obsahujícího 2x vyšší koncentrace neesenciálních
aminokyselin,
1,5x
vyšší
koncentrace
všech
esenciálních
aminokyselin a vitamínů, 2mM glutaminu, 7,635 g/l chloridu sodného, 1 g/l hydrogenuhličitan sodného, 1 g/l glukózy a 1 mM pyruvát sodný (Kao, et al., 1997). Médium bylo připraveno z Eagle’s MEM (Sigma, M3024-10X1L), roztoku neesenciálních aminokyselin (Gibco, 11140-035), roztoku vitamínů (Gibco, 11120037), roztoku esenciálních aminokyselin (Gibco, 11130-051), glutaminu (Gibco, 25030-024), pyruvátu sodného (Gibco, 11360-039) a NaCl, NaHCO3. Médium bylo obohaceno 7% FBS (PAA) a 100 µg/ml normocinu (Invivogen).
46
Sterilní pufrovaný fyziologický roztok PBS: 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 8 mM Na2HPO4; 1,5 mM KH2PO4; pH 7,2
0,25% trypsin-EDTA v PBS (PAA L11-004) Transformované buněčné linie WB-ras a WB-neo, byly po transportu z Michigan
State University 14 dní reselektovány pomocí 500 µg/ml antibiotika G418 (Sigma, A1720) 5.2.2. Pracovní postup (pro kultivační láhev o velikosti 75 cm2) Před každým pasážováním byly buňky zkontrolovány, zda jsou konfluentní a není přítomna žádná kontaminace. Před započetím práce byl biohazardní box sterilizován UV lampou a veškerá práce s buňkami byla prováděna asepticky. Všechny používané roztoky, byly vytemperované na 37 °C s výjimkou trypsinu (vytemperován na teplotu laboratoře). Nejprve bylo z kultivační nádoby odsáto médium a buňky byly opláchnuty 10 ml PBS, po oplachu byl přidán 1 ml trypsinu. Trypsinizace probíhala v inkubátoru po dobu 5 minut. Mezitím bylo do nové kultivační láhve napipetováno 15 ml příslušného média. Po uplynutí 5 minut bylo pod mikroskopem ověřeno, zda se buňky zcela oddělily od povrchu kultivační lahve. Následně bylo k buňkám přidáno 5 ml média s fetálním bovinním sérem, čímž došlo k inaktivaci trypsinu. Buněčná suspenze byla řádně promíchána opakovaným nasátím a vypuštěním z pipety. Z buněčné suspenze byl odebrán alikvot, ve kterém byla spočítána koncentrace buněk pomocí Cellometru Auto (Nexcelcom Bioscience). Nakonec bylo do připravené nové kultivační lahve přepipetováno příslušné množství buněčné suspenze o koncentraci 40 000 buněk/cm 2 (hustota pro dosažení konfluence po 48 h) či 20 000 b/cm2 (dosažení konfluence po 72 h kultivace). Zbylá buněčná suspenze byla použita pro přípravu kultur buněk pro experimenty: pro hodnocení GJIC metodou SL/DT, pro extrakci proteinů a pro hodnocení buněčného cyklu byly buňky pěstovány ve 2 ml média na sterilních plastových 40 mm Petriho miskách (TPP); pro hodnocení cytotoxicity metodou hodnocení příjmu neutrální červeně nebo pro hodnocení indukce apoptózy byly buňky kultivovány ve sterilních plastových 96 jamkových deskách (TPP) ve 100 µl média na jamku. V případě 96 jamkových desek byla buněčná suspenze napipetována pouze do vnitřních 60-ti jamek, do zbylých okrajových jamek bylo napipetováno sterilní PBS. 47
5.3.
Hodnocení příjmu neutrální červeně (Neutral red uptake assay, NRU)
Tento test poskytuje relativní zhodnocení počtu životaschopných buněk v kultuře použitím supravitálního barviva neutrální červeně (neutral red), která se hromadí v lyzozomech životaschopných buněk. Pokud dochází vlivem experimentálního zásahu k narušení buněčných membrán, lyzozomů nebo pH gradientů uvnitř buněk, případně ke snížení počtu buněk v kultuře, barvivo je buňkami méně vázáno ve srovnání s kontrolními variantami. Po ukončení inkubace buněk s neutrální červení je navázané barvivo, extrahováno z buněk lyzačním pufrem a nakonec je pomocí spektrofotometru změřena absorbance každého vzorku (Repetto, et al., 2008). 5.3.1. Expozice buněčných kultur testovaným látkám Hodnocení cytotoxicity fytochemikálií pro buněčnou linii WB-F344 V tomto experimentu bylo hodnoceno působení látek na konfluentní, a s ohledem na kontaktní inhibici růstu, již málo proliferující buňky WB-F344, tzn. za podobných podmínek jako v experimentech pro hodnocení vlivu na GJIC. Konfluentní buňky WB-F344 v 96 jamkových deskách (TPP) získané po 48 h (nasazeno 40 000 b/cm 2) nebo 72 h (nasazeno 20 000 b/cm2) růstu byly mikroskopicky zkontrolovány pro zhodnocení konfluence, normální morfologie a absence kontaminace. Ze zásobních roztoků testovaných látek (Tabulka č. III) byly ředěním kultivačním médiem do sterilních mikrozkumavek asepticky připraveny expoziční roztoky těchto látek v požadovaných koncentracích (Tabulka č. III). Kultivační médium bylo z mikrotitrační desky sterilně odsáto a nahrazeno příslušným roztokem expozičního média (100 µL/jamka). V každé sadě vzorků na mikrotitrační desce byla prováděna tzv. „naivní“, neošetřená kontrola (tzn. pouze čisté médium s buňkami) a zároveň kontrola rozpouštědla v příslušné koncentraci. Všechny experimentální varianty byly na desku pipetovány v triplikátech. Buňky byly exponovány v CO2 inkubátoru po dobu 1 h nebo 24 h, poté byl proveden test s příjmem neutrální červeně. Všechny experimenty byly nezávisle opakovány alespoň třikrát. Vliv MET a SIL na růst buněčných linií WB-F344, WB-ras a WB-neo V tomto experimentu byly sledovány účinky látek na nekonfluentní a aktivně proliferující kultury buněk tak, aby bylo možné postihnout nejen cytotoxické účinky 48
a poškození buněk, ale také inhibici růstu a buněčného dělení. Buňky byly nasazeny
na 96 jamkovou mikrotitrační desku (TPP) v hustotě 40 000 buněk/cm2 a inkubovány 24 h. Poté byla provedena mikroskopická kontrola, z jamek bylo asepticky odebráno kultivační médium a nahrazeno 100 µl čerstvého média (neošetřená kontrola) nebo expozičního média obsahujícího zvolené experimentální koncentrace MET, SIL nebo příslušné rozpouštědlo (Tabulka č. IV). Buňky byly exponovány 24 h v CO2 inkubátoru a poté byl experiment ukončen provedením testu s příjmem neutrální červeně. Všechny experimentální varianty byly otestovány vždy v triplikátech na jedné desce a stejný experiment byl zopakován nejméně třikrát na všech třech buněčných liniích. Tabulka č. III: Experimentální koncentrace fytochemikálií a chemopreventivních látek pro hodnocení cytotoxicity v linii WB-F344 metodou příjmu neutrální červeně. Koncentrace Látka
Zkratka
zásobního roztoku
Experimentální koncentrace
a rozpouštědlo Dialyl sulfid
0,013; 0,025; 0,05; 0,1;
DAS
1M (DMSO)
CIA
1M (DMSO)
Kurkumin
CUR
1 mM (DMSO)
1,3; 2,5; 5; 10 a 20 µM
Emodim
EMO
20 mM (DMSO)
13; 25; 50; 100 a 200 µM
I3C
20 mM (DMSO)
13; 25; 50; 100 a 200 µM
Metformin
MET
125 mM (DMEM)
Quercetin
QUER
10 mM (DMSO)
13; 25; 50; 100 a 200 µM
Silibinin
SIL
10 mM (DMSO)
13; 25; 50; 100 a 200 µM
Tymochinon
THY
20 mM (DMSO)
13; 25; 50; 100 a 200 µM
Kys. Skořicová
Indole-3karbinol
Expoziční čas
0,2;0,3; 0,6; 1,25; 2,5 a 5 mM 0,013; 0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 4 a 8 mM
49
0,013; 0,025; 0,05; 0,1; 0,2; 1; 5; 25 a 125 mM
1 a 24 hod
Tabulka č. IV: Experimentální koncentrace metforminu a silibininu, látek pro hodnocení cytotoxicity a inhibice růstu linií WB-F344, WB-ras a WB-neo metodou příjmu neutrální červeně Koncentrace Látka
Zkratka
zásobního
Experimentální
roztoku a
koncentrace
Expoziční čas
rozpouštědlo Metformin
MET
Silibinin
SIL
45 mM
0,6; 1,7; 5; 15 a 45 mM
(DMEM) 20 mM
0,012; 0,036; 0,111;
(DMSO)
0,333 a 1 mM
24 hod
5.3.2. Materiál
Neutrální červeň (zásobní roztok 15 mg/ml v dH2O, před použitím byla promíchána)
DMEM (Gibco, 11880-028; 1 g/l glukosy, pyruvát sodný, bez fenolové červeně, bez glutaminu)
PBS (složení viz Kapitola 5.2.1.)
Lyzační pufr (1% kyselina octová–50% ethanol) 5.3.3. Pracovní postup Hodinu až dvě před ukončením testu bylo připraveno potřebné množství 50 µg/ml
roztoku neutrální červeně v DMEM (bez FBS). Takto připravený roztok se inkuboval 1-2 hodiny při 37 °C v CO2 inkubátoru. Těsně před použitím byl roztok zfiltrován přes 0,22 µm PES stříkačkový filtr pro odstranění případných nerozpuštěných krystalků neutrální červeně. Před zahájením testu byly exponované buňky mikroskopicky zkontrolovány. Poté bylo odstraněno expoziční médium z jamek a buňky byly opláchnuty PBS (100 µl/jamku). Po odstranění PBS byla k buňkám a do třech prázdných okrajových jamek desky napipetována zfiltrovaná neutrální červeň (100 µl/jamku). Následně se deska s buňkami inkubovala hodinu při 37 °C v CO2 inkubátoru. Po uplynutí inkubační doby byly buňky opět pozorovány pod mikroskopem. Poté byl odsát roztok neutrální červeně a buňky byly dvakrát opláchnuty PBS (100 µl/jamku). Nakonec byl přidán lyzační pufr (100 µl/jamku) a deska byla umístěna na třepačku na dobu 15-ti minut. Po dokonalém rozpuštění
neutrální
červeně
v
lyzačním
pufru
byla
změřena
absorbance
na spektrofotometru při vlnové délce 540 nm a referenční vlnové délce 690 nm.
50
5.3.4. Vyhodnocování výsledků Nejprve byla od hodnoty naměřené při 540 nm odečtena referenční hodnota (u každé jamky). Poté byla od všech hodnot odečtena průměrná hodnota blanku z okrajových jamek bez buněk inkubovaných s neutrální červení. Hodnoty takto upravených absorbancí zprůměrované pro jednotlivé experimentální varianty byly přepočítány na procenta průměrné hodnoty absorbance v neošetřené („naive“) kontrole (=100%). Pro grafická znázornění a statistické zpracování dat byly použity hodnoty průměru a směrodatných odchylek získaných zprůměrováním výsledků nezávisle opakovaných
experimentů.
Statistická
významnost
byla
vypočítána
pomocí
One-Way ANOVA, pro zhodnocení významnosti případných rozdílů oproti kontrole rozpouštědla byl použit Dunnetův testu. V případě nenormalně rozložených dat nebo nehomogenního rozptylu byla provedena neparametrická Kruskal-Wallis ANOVA a následně Dunnův test. 5.4. Měření funkčnosti GJIC – SL/DT Metoda Scrape-loading/dye-transfer umožňuje kvantifikovat úroveň mezibuněčné komunikace GJIC u in vitro adherentních buněčných kultur. Metoda je založena na schopnosti nízkomolekulárního fluorescenčního barviva Luciferová žluť procházet mezerovými spoji, nikoli však plazmatickou membránou zdravých nepoškozených buněk. Luciferová žluť je do jednovrstvy adherentních buněk vnesena pomocí řezu skalpelem. V případě funkčních mezerových spojů dochází k během inkubační doby k šíření barviva buněčným kontinuem. Následně se vzorek zafixuje a pomocí fluorescenčního mikroskopu hodnotí vzdálenost, do které je barvivo schopno difundovat. Tato vzdálenost přímo úměrně odpovídá míře mezibuněčné komunikace (Trosko, et al., 2000). 5.4.1. Expozice buněčných kultur Vliv fytochemikálií a inhibitorů mezibuněčnou komunikaci u buněčné linie WB-F344 nalezení optimální koncentrace látek Nejprve byly provedeny experimenty pro zjištění nejvhodnějších koncentrací fytochemikálií a inhibitorů tzv. testy dávka-odpověď. Testované koncentrace použitých látek a jejich expoziční doba jsou uvedeny v Tabulce č. V. Buňky byly pěstovány na 40 mm Petriho miskách a po dosažení téměř úplné konfluence po 48 h nebo 72 h růstu byla 51
provedena jejich mikroskopická kontrola. Následně byl objem média v Petriho miskách zredukován na 1 ml (metoda reverzního pipetování) a ze zásobního roztoku přímo přidány testované látky. Po přidání testované látky bylo médium promícháno a buňky dále exponovány v CO2 inkubátoru. V každém experimentu byly prováděny kontroly pro působení rozpouštědla, neošetřená ("naivní") kontrola a pozitivní kontrola (70 µM fluoranthen). Po uplynutí expoziční doby byla provedena metoda SL/DT. U všech látek byl tento typ testu proveden minimálně dvakrát nezávisle. Vliv fytochemikálií na chemicky indukovanou GJIC u buněčné linie WB-F344 WB-F344 buňky byly s vybranými fytochemikáliemi inkubovány po dobu 30 min nebo 24 h v CO2 inkubátoru. V případě 30 min expozice byly exponovány konfluentní buňky podle postupu popsaného v předchozím odstavci. U 24 h expozice byly mírně subkonfluentní buňky exponovány po asepticky provedené výměně kultivačního média za expoziční médium obsahující zvolenou experimentální koncentraci příslušné látky. Po uplynutí inkubační doby byl do média přidán inhibitor mezibuněčné komunikace GJIC. Po 15 minutách inkubace byl test ukončen provedením metody SL/DT. V každém experimentu byly prováděny kontroly pro působení rozpouštědla, neošetřená ("naivní") kontrola a pozitivní kontrola (70 µM fluoranthen). Každá kombinace uvedených látek (9xfytochemikálie a 6xGJIC inhibitor) a zvolených expozičních časů (30 min a 24 h) byla testována minimálně třikrát nezávisle.
52
Tabulka č. V: Testované látky a jejich koncentrace pro testy dávka-odpověď (SL/DT) Koncentrace a Zkratka
rozpouštědlo
Koncentrace
zásobního
Expoziční čas
Inhibitory
Rozpouštědla
roztoku MeCN
-
Maximum 1%
15 min
EtOH
-
Maximum 1%
15 min
DMSO
-
Maximum 2%
1 hod
DDT
10 mM (MeCN)
5; 10; 15; 20; 25; 30; 35 a 40 µM
Fla
10 mM (MeCN)
20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90 a 100 µM
Lin
10 mM (MeCN)
20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90 a 100 µM
PCP
10 mM (MeCN)
20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90 a 100 µM
PFOA
10 mM (MeCN)
20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90 a 100 µM
TPA
5 µM (EtOH)
2,5; 5; 7,5; 15; 20; 25 a 50 nM
Fytochemikálie
DAS
20 a 500 mM (DMSO)
50; 100; 200 a 500 µM
CIA
20 mM (DMSO)
50; 100 a 200 µM
EMO
20 mM (DMSO)
50; 100 a 200 µM
I3C
20 mM (DMSO)
50; 100 a 200 µM
MET THY
20 a 1 mM (DMEM) 20 mM (DMSO)
15 min
1 hod
50; 100; 200 a 1000 µM 50; 100 a 200 µM
Hodnocení GJIC u buněčných linií WB-ras a WB-neo Účelem tohoto experimentu bylo ověření snížené mezibuněčné komunikace u buněčné linie WB-ras a naopak neporušené GJIC u WB-neo, v porovnání s normální buněčnou linií WB-F344. GJIC byla hodnocena metodou SL/DT v konfluentních kulturách buněk pěstovaných po dobu 48-72 h v příslušném médiu na 40 mm Petriho miskách. V rámci tohoto experimentu byla zdokumentována i morfologie všech tří buněčných linií.
53
Působení MET a SIL na buněčnou linii WB-ras Mírně subkonfluentní buňky získané po 48-72 h růstu na 40 mm Petriho miskách byly zkontrolovány pod mikroskopem. Následovala sterilní výměna kultivačního média za expoziční médium, obsahující požadované experimentální koncentrace MET a SIL. V každém experimentu byla provedena taktéž „naive“ kontrola a kontrola rozpouštědla. Po přidání expozičního média s fytochemikáliemi byly buňky inkubovány 24 h a poté proveden SL/DT test. Experiment byl zopakován třikrát nezávisle. 5.4.2. Materiál
Konfluentní (krátkodobé expozice)nebo mírně subkofluentní (24h expozice) buněčná kultura
Fluorescenční barvivo Luciferová žluť (0,05% roztok v CaMgPBS)
CaMgPBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 0,68 mM CaCl2 · 6 H2O, 0,49 mM MgCl2 · 6H2O)
4% roztok formaldehydu v PBS
Skalpel 5.4.3. Pracovní postup Po ukončení expozice bylo odsáto médium a buňky byly třikrát opláchnuty
CaMgPBS. Po oplachu se misky položily na papírovou utěrku dnem vzhůru pro odkapání zbytků oplachu. Poté byly buňky převrstveny roztokem Luciferové žluti a na každé misce bylo provedeno 5 řezů skalpelem dle Obrázku č. 14. Po 3 minutách inkubace byla Luciferová žluť odsáta. Následně byly buňky znovu třikrát opláchnuty CaMgPBS a ponechány několik desítek sekund dnem vzhůru na papírové utěrce. Po odkapání oplachu byly buňky zafixovány 4% roztokem formaldehydu v PBS. Takto připravené misky byly ihned mikroskopicky vyhodnocovány nebo byly skladovány v temnu při pokojové teplotě, uzavřené parafilmem, aby se zabránilo odpařování formaldehydu.
54
Obrázek č. 14: Znázornění řezu skalpelem při hodnocení GJIC metodou SL/DT.
5.4.4. Vyhodnocování výsledků Buňky byly pozorovány pomocí fluorescenčního mikroskopu Axio Observer.Z1 při zvětšení objektivem 10x. Z každé misky byly pomocí digitální kamery AxioCam HRc a softwaru Axio Vision pořízeny tři reperezentativní fotografie, každá z jiného řezu. Pro kontrolu buněčné morfologie a konfluence buněk byla navíc z každé misky pořízena i fotografie při procházejícím světle. Vyhodnocení pořízených fotografií bylo prováděno v softwaru ImageJ, kde byla změřena velikost plochy fluoreskujících buněk. V případech experimentů s WB-ras byly hodnoty plochy přímo vztaženy ke kontrole rozpouštědla (100%). Všechny plochy naměřené v experimentech s buňkami WB-F344 však byly nejprve normalizovány odečtením hodnoty plochy změřené v pozitivní kontrole, která odpovídá zcela zainhibovaná GJIC (0%). Všechny získané hodnoty byly vztaženy ke kontrole rozpouštědla (100%). Z hodnot %GJIC získaných z nezávisle opakovaných experimentů byly vypočteny průměry a směrodatné odchylky, které byly graficky znázorněny. Statická analýza byla provedena pomocí softwaru SigmaPlot. Statistická významnost rozdílů jednotlivých experimentálních variant v porovnání s kontrolou byla hodnocena neparametrickým Mann-Whitney Rank Sum testem. 5.5.
Western blot
Western blot je analytická metoda, která je používána k detekci specifických proteinů. Nejprve jsou proteiny separovány gelovou elektroforézou a po separaci jsou přeneseny na membránu (např. PVDF = polyvinylidene difluorid). Proteiny navázané na membráně jsou následně označeny značenou či neznačenou protilátku tzv. primární. Detekce vytvořeného komplexu protein-protilátka je provedena u značených protilátek 55
přímo. U druhého typu protilátek musí být přidána značená sekundární protilátka. Důvodem používání primárních neznačených a sekundárních značených protilátek je vznik silnějšího signálu (amplifikace). Protilátky jsou nejčastěji značeny enzymy např. křenovou peroxidázou. Detekce a kvantifikace specifického proteinu může být provedena např. chemiluminescenčním způsobem. V tomto případě vzniká činností enzymu (peroxidáza) při přeměně chemiluminiscenčního substrátu světlo, jehož množství je přímo úměrné množství enzymu tzn., že i množství označeného proteinu. Vyzařované světlo může být zachyceno světlocitlivým papírem (fotografický film) či CCD-kamerami (Káš, et al., 2005). 5.5.1. Materiál Proteinová extrakce:
Lyzační pufr: 20 mM Tris; 4% SDS; 1 mM DTT; pH 7,6; 1X PHOS-Stop (Roche) a 1X cOmplete MINI (Roche)-inhibitor proteáz)
PBS
Měření koncentrace proteinů v buněčném lyzátu
Buněčný lyzát
BCA Protein assay reagent kit (Pierce, 23225)
Elektroforéza
Separační gel 12,5%: 375 mM lower Tris; 12,5% akrylamid; 0,05% roztoku peroxodisíranu amonného-10% (APS); 0,05% TEMED
Koncentrační gel 4%: 125 mM upper Tris; 4% akrylamid; 0,05% roztok peroxodosíranu amonného-10% (APS); 0,1% TEMED
Elektrodový pufr (Running buffer): 25 mM Tris/192 mM Gly; 0,1% SDS
Nanášecí pufr (SDS-loading buffer): 187,5 mM Tris; 30% glycerol; 6% SDS; 0,03% bromfenolová modř; 125 mM DTT
Délkový standard (MW Marker Color+Prestained Ladder, New England Biolabs)
56
Přenos proteinu na membránu
Transferový pufr: 25 mM Tris/192 mM Gly; 0,02% SDS; 20% methanol
PVDF membrána (Immobilion-P; Millipore Co.)
Filtrační papír
Methanol
dH2O
Imunodetekce
TBS (Tris-buffered saline): 20 mM Tris-báze; 137 mM NaCl; pH 7,6
TBST-0,1%: TBS-0,1% Tween 20
Blokovací roztok: 5% odtučněné sušené mléko v TBST-0,1%
Primární protilátka: zdroj-myš, anti (H)-ras (Millipore; MAB 3291); ředění 1:2000 v blokovacím roztoku
Sekundární protilátka: zdroj-kůň, anti-myší protilátka konjugovaná s HRP (Cell signaling; 7076); ředění 1:3000 v blokovacím roztoku
Vyhodnocení
Luminata Classico (Millippore, WBLUC0100)
Vývojka a ustalovač (Kodak)
Film (Amersham Hyperfilm ECL; GE 28-9068-35) 5.5.2. Pracovní postup
Proteinová extrakce Extrakce proteinů byla provedena z konfluentní buněčné linie WB-ras a WB-F344, pěstovaných na 40 mm Petriho miskách. Nejprve bylo odstraněno kultivační médium a buňky byly opláchnuty 3x PBS. Poté se misky nechaly okapat na papírové utěrce a zbytky
PBS byly vysušeny po naklonění misky pomocí přiložením rohu utěrky na stěnu misky. Následně bylo do středu Petriho misky napipetováno 120 µl lyzačního pufru a buňky byly důkladně seškrábávány z povrchu Petriho misky pomocí gumové stěrky. Nakonec byl získaný lyzát želatinové konzistence převeden do mikrozkumavky. Od tohoto kroku byly vzorky udržovány na ledu. Po sesbírání veškerého buněčného lyzátu byly vzorky zhomogenizovány na ledu pomocí ultrazvukové sondy (Bandelin Sonopuls HD2070,
57
MS72, výkon 70%, 3x20 s v 0,5 s pulzech). Nerozpuštěný materiál byl po homogenizaci odstraněn centrifugací (15 000xG, 15 min při 4 °C). Měření koncentrace proteinu Koncentrace proteinů v lyzátu byla zjištěna pomocí BCA Protein assay kitu, tato procedura byla prováděna na 96 jamkové mikrodesce. Nejprve byla připravena koncentrační řada albuminového (BSA) standardu (25 – 2000 µg/ml, plus blank) a pracovní činidlo (working reagent WR), smícháním dodávaného roztoku "A" a roztoku "B" v poměru 50:1. Do jamky bylo napipetováno 25 µl vzorku (či albuminu) a 200 µl WR, poté byla deska ponechána 30 s na třepačce. Po promíchání se deska inkubovala 30 minut při 37 °C. Po uplynutí inkubační doby byla změřena absorbance při vlnové délce 562 nm. Porovnáním vzorku s koncentrační křivkou albuminu byla zjištěna celková koncentrace proteinů ve vzorku. Elektroforéza Koncentrace proteinů všech vzorků byly upraveny na stejnou hodnotu zředěním lyzačním pufrem. Po promíchání vzorků s nanášecím pufrem byly vzorky zahřáty na 60 °C po dobu 10 minut, následně byly vzorky zcentrifugovány (15 000xG, 15 min) pro odstranění nerozpuštěných materiálů. Když byly vzorky připraveny k použití, předem nachystané polyakrylamidové gely byly umístěny do aparatury na elektroforézu, čím se vytvořily dvě komory. Vnitřní komora byla naplněna elektrodovým pufrem, až po vrchní okraj gelu. Do každé jamky gelu bylo pipetováno 10 µl vzorku (15 µg proteinů) či blanku (nanášecí pufr) nebo délkového standardu. Poté byla naplněna i vnější komora elektrodovým pufrem. Aparatura byla uzavřena a elektroforéza spuštěna při nastavení konstantního napětí 200V po dobu 75 min. Přenos proteinů na membránu Po separaci proteinů byl odstraněn koncentrační gel a zbylý separační gel byl ponořen do vychlazeného transferového pufru na 20–30 minut. Mezitím byly PVDF membrána a filtrační papíry upraveny přesně dle velikosti gelu a pravý horní roh membrány byl označen tužkou, veškerá manipulace s membránou byla prováděna pomocí pinzety. Takto připravená membrána byla aktivována methanolem (20s), opláchnuta dH2O a poté ponořena do čisté dH2O na dobu 2 minut. Nakonec byla alespoň
58
5 minut ekvilibrována v transferovém pufru. Přenos proteinů na membránu byl proveden pomocí tzv. „semi-dry“ techniky. Nejprve byl sestaven blotovací „sendvič“, který byl položen na spodní stranu aparatury (anodu) v tomto pořadí: 3x silný filtrační papír (nasáknutý
transferovým
pufrem)-membrána-gel-3x
filtrační
papír
(nasáknutý
transferovým pufrem). Všechny části sendviče byly stejně velké a pečlivě zarovnané tak, aby byl přenos účinný. Po vytvoření „sendviče“ z něj byly vytlačeny bubliny a nakonec byl přiklopen víkem (katoda). Přenos probíhal 45 minut při konstantním proudu (150 mA). Po ukončení přenosu byla membrána opatrně vyjmuta ze „sendviče“ a po 1 minutě oplachu v d H2O na třepačce byla připravena na imunodetekci. Imunodetekce Nejprve byla membrána ponořena 1,5 hodiny v blokovacím roztoku, při laboratorní teplotě a za stálého třepání. Po blokaci byla přesunuta do roztoku s primární protilátkou, ve které se přes noc inkubovala při 4 °C (na třepačce). Po 22 hodinách inkubace byla membrána 3x opláchnutá velkým množstvím destilované vody, a poté opláchnuta 3x10 min TBST0,1%. Následně byla membrána přesunuta do roztoku sekundární protilátky, se kterou se inkubovala 1 hodinu. Po uplynulé době byla membrána znova oplachována, a to stejným způsobem jako po inkubaci v primární protilátce. Nakonec bylo TBST0,1% nahrazeno TBS a membrána byla připravena pro finální vyhodnocení. Vyhodnocení Detekce zájmových proteinů byla provedeno pomocí chemiluminiscenčního zobrazení. Membrána byla vyjmuta z TBS, rohem papírové utěrky byl odstraněn TBS ulpívající na membráně. Po vysušení se membrána převrstvila detekčním činidlem Luminata classico a byla vložena do transparentní složky umístěné ve vyvolávací kazetě. Další pracovní postup již byl vykonáván v temné komoře. Po 1 minutě působení Luminaty, byl na membránu umístěnou ve vyvolávací kazetě položen film a kazeta byla uzavřena. Expozice byla ukončena po 5 s, film byl vyjmut z kazety a ponořen do vývojky. Po 1 minutě následoval oplach filmu v dH2O a inkubace v ustalovači po dobu 1 minuty. Výstupem této procedury je vyvolaný film, na kterém jsou zobrazeny proužky tzv. bandy, které představují přítomnost hledaného proteinu, a jejich intenzita je úměrná jejich koncentraci.
59
5.6.
Detekce indukce apoptózy fluorescenční mikroskopií
Apoptóza se řadí mezi hlavní typy programované buněčné smrti, jde o aktivní proces sebedestrukce buňky, který vyžaduje čas a dodání energie ve formě ATP. Během tohoto procesu dochází k charakteristickým změnám buněčné morfologie, jako např. ke zmenšení velikosti buňky, kondenzaci chromatinu a specifickou fragmentaci DNA. Dále dochází ke změně tvaru cytoplazmatické membrány (tzv. blebbing) a rozpadu buněk na apoptická tělíska. Taktéž dochází k translokaci fosfatidylserinu na vnější stranu cytoplazmatické membrány (tzv. eat me signal), tam slouží jako signál pro odstranění makrofágy (Ren & Savill, 1998). Na detekci takto translokovaného fosfatidylserinu se využívá fluorescenčně značený protein Annexin V, jenž se na fosfatidylserin váže (Vermes, et al., 1995). 5.6.1. Expozice Detekce apoptózy byla provedena na buněčné linii WB-ras exponované metforminem (MET) nebo silibininem (SIL). Do jamek 96 jamkové mikrotitrační desky bylo nasazeno 10 000 buněk/cm2 tak, aby po 72 h růstu ještě zcela nedosahovaly konfluence. Z jamek obsahujících takto připravené mírně subkonfluentní buňky bylo odebráno kultivační médium a nahrazeno expozičním médiem obsahujícím MET (12,5; 25; 50 a 100 mM), SIL (62,5; 125; 250 a 500 µM), příslušné rozpouštědlo (rozpouštědlová kontrola), čisté médium (neošetřená kontrola) a nocodazol (500 ng/ml, pozitivní kontrola). 5.6.2. Materiál
Annexin-V-FLUOS Staining kit (Roche)
DAPI (vodný roztok 250 µg/ml)
PBS
4% roztok formaldehydu v PBS
60
5.6.3. Pracovní postup Nejprve byl smíchán Annexin-V-Fluorescein s inkubačním pufrem v poměru 1:50. Po uplynutí expoziční doby bylo odstraněno expoziční médium a buňky byly opláchnuty 200 µl PBS. K opláchnutým buňkám bylo přidáno 50 µl/jamku připraveného reakčního roztoku Annexin-V-Fluorescein a inkubováno 15 min. Po uplynutí inkubační doby byl přidán 4% formaldehyd (50 µl/jamku). Nakonec byly buňky obarveny pomocí DAPI, ve finální koncentraci 2,5 µg/ml. Fotografie buněk byly pořízeny pomocí zobrazovacího systému Tissue FAXS, a ty byly následně upraveny v programu ImageJ. 5.7.
Analýza buněčného cyklu
K analýze distribuce buněk v jednotlivých fázích buněčného cyklu se nejčastěji používá metoda průtoková cytometrie. Fáze, ve které se buňka vyskytuje, se určuje na základě množství DNA obsaženého v buňce. Obsah DNA v buňce se stanovuje pomocí fluorescenčního barviva propidium jodidu (PI), intenzita fluorescence PI odpovídá množství DNA v dané buňce (Crissman & Hirons, 1994). 5.7.1. Expozice Buňky byly nasazeny v hustotě 40 000 buněk/cm2 na 40 mm Petriho misky. Druhý den po přisednutí buněk, bylo vyměněno médium za expoziční médium obsahující MET, SIL či příslušné rozpouštědlo. Expozice látkám trvala 24 h. Součástí experimentu byla i „naive“ a rozpouštědlová kontrola. 5.7.2. Materiály
0,25% trypsin-EDTA v PBS (PAA L11-004)
PBS
10% FBS v PBS
70% ethanol (studený)
Barvící pufr (10 mM Tris-báze; 10 mM NaCl; 0,1% Triton X-100; pH 7,6
RNAáza (roztok o koncentraci 10 mg/ml)
Propidium jodid (roztok o koncentraci 1 mg/ml)
61
5.7.3. Pracovní postup Po skončení expozice bylo z buněk odstraněno médium a buňky byly 2x opláchnuty 1 ml PBS. Odsáté médium i PBS byly přeneseny do sterilní centrifugační zkumavky. Buňky byly převrstveny 300 µl trypsinu a inkubovány po dobu 10 minut při teplotě 37 ˚C. Kontrola efektivity trypsinizace a uvolnění buněk do roztoku byla provedena pomocí světelné mikroskopie. Poté bylo misky opláchnuty dvakrát po 1 ml 10% FBS a buněčná suspenze byla převedena do centrifugační zkumavky a zkombinována s odsátým médiem a PBS. Buněčná suspenze byla zcentrifugována (200xG, 5 min), supernatant odstraněn a usazené buňky poté opláchnuty PBS (tento cyklus byl proveden 2x). K usazeným buňkám byly za stálého míchání na vortexu přidány celkem 3 ml vychlazeného 70% ethanolu. Buňky byly fixovány přes noc (při teplotě 4 °C). Druhý den byly fixované buňky opět promyty PBS (2 cykly centrifugace 200xG, 5min). Po posledním promytí byl buněčný pelet resuspendován v 960 µl barvícího pufru. Následně bylo přidáno 20 µl zásobního roztoku RNAázy (finální koncentrace 500 µg/ml) a 20 µl zásobního roztoku PI (finální koncentrace 50 µg/ml) Poté byl obsah zkumavky inkubován po dobu 30 minut při teplotě 37 ˚C. Analýza buněčného cyklu byla provedena na průtokovém cytometru CyFlow ML (Partec, Muenster, SRN) vybaveném modrým laserem jako zdrojem excitačního světla (λ = 488 nm) a 4-mi optickými parametry (FSC – forward scatter, SSC – side scatter a 2 fluorescenční parametry). Buňky byly odlišovány od pozadí na dvojparametrických dot-plotech (cytogramech) FSC vs. SSC. Intenzita (červené) fluorescence buněk obarvených PI byla sledována pomocí optického filtru 630LP. Analýza buněčného cyklu probíhala při nízkých rychlostech měření.
62
6. Výsledky a diskuze 6.1.
Buněčná linie WB-F344
6.1.1. Cytotoxické efekty fytochemikálií na buněčnou linii WB-F344 Cílem tohoto experimentu bylo nalezení necytotoxických koncentrací vybraných fytochemikálií, které by mohly být následně použity v experimentu zabývajícím se působením fytochemikálií na mezibuněčnou komunikaci GJIC. Experiment prověřil cytotoxický efekt těchto přírodních látek, jak u krátkodobé (1 h) tak i u dlouhodobé (24 h) expozice. Výsledky ukázaly, že mezi toxicitou studovaných látek byly výrazné rozdíly. U některých sloučenin, jako např. EMO, byly toxické účinky pozorovány již při koncentraci 50 µM, zatímco jiné látky, např. MET, nebyly cytotoxické ani v koncentracích 5 mM. Výsledné grafy jsou zobrazeny na Obr. č. 15. A)
B)
Obrázek č. 15
63
C)
D)
E)
F)
G)
H)
I)
Obrázek č. 15
64
Obrázek č. 15: Cytotoxické účinky studovaných fytochemikálií a chemopreventivních látek na konfluentní kulturu buněčné linie WB-F344 po 1 h a 24 h expozici hodnocené metodou příjmu neutrální červeně (NRU). Hodnoty statisticky významně odlišné od rozpouštědlové kontroly byly označeny jednou až třemi hvězdičkami dle velikosti hodnoty P. P ≤0,001 = ***; P ≤ 0,01 = **; p ≤ 0,05 = * (One-Way ANOVA následovaná Dunnetovým testem, případně Kruskal-Wallis ANOVA následovaná Dunnovým testem). A) dialyl sulfid (DAS), B) kys. skořicová (CIA), C) kurkumin (CUR), D) emodin (EMO), E) indol-3-karbinol (I3C), F) quercetin (QUER), G) metformin (MET), H) silibinin (SIL), I) tymochinon (THY)
6.1.2. Hodnocení koncentračně závislých účinků látek na GJIC v linii WB-F344 Hodnocení koncentračně závislých účinků látek na inhibici GJIC byly provedeny jak s vybranými fytochemikáliemi a chemopreventivními látkami, tak s environmentálními toxikanty a modelovými nádorovými promotery. Na základě výsledků byly zvoleny experimentální koncentrace pro pokusy zabývající se preventivním působením fytochemikálií proti chemicky indukované inhibici GJIC. Fytochemikálie Kromě možných cytotoxických účinků testovaných fytochemikálií bylo rovněž cílem ověřit, zda vybrané látky nebudou negativně ovlivňovat GJIC. Tyto experimenty byly provedeny pouze u látek DAS, CIA, EMO, I3C, MET a THY. Informace o účincích zbylých tří fytochemikálií CUR, QUER a SIL na GJIC byly již publikovány. V případě QUER a SIL byly použity 100 µM koncentrace, které neměly na GJIC žádné inhibiční účinky. V případě CUR byla použita 1 µM koncentrace, protože v koncentracích >2,5 µM docházelo k inhibici mezibuněčné komunikace (Lenčešová, 2012).
V použitých dávkách testovaných
fytochemikálií byla pozorována inhibice GJIC u dvou látek, THY a EMO (Obr. č. 17). U fytochemikálií EMO, I3C a THY byl pozorován v menší či větší míře jev, kdy byla Luciferová žluť detekovaná i v buňkách nacházejících se mimo řez skalpelem, což nasvědčuje o možném poškození membrán působením testovaných látek a následném průniku Luciferové žluti do buněk (Obr. č. 16). Proto byly provedeny dodatečné testy samotných fytochemikálií, ale i kombinace fytochemikálie s lindanem 70 µM. Tyto testy ukázaly, že nejvhodnější koncentrací pro fytochemikálie EMO, I3C a THY je koncentrace 10 µM pro všechny tři tyto fytochemikálie.
65
Obrázek č. 16: Ilustrační fotografie jevu pozorovaného u buněk WB-F344 vystavených působení EMO, I3C a THY (1 h) a následně použitých pro hodnocení mezibuněčné komunikace GJIC metodou SL/DT. Obrázek znázorňuje buňky vzdálené od řezu skalpelem, které jsou přesto obarveny Luciferovou žlutí, která do buněk pronikla nejspíše následkem poškození buněčných membrán působením zkoumaných látek.
Kombinací
výsledků
z
hodnocení
cytotoxicity
vybraných
fytochemikálií
a z hodnocení jejich účinků na GJIC byly vybrány jejich koncentrace pro další experimenty zaměřené na studium vlivu těchto látek na chemicky indukovanou inhibici GJIC. Zvoleny byly necytotoxické koncentrace fytochemikálií, které zároveň neinhibovaly GJIC. V případě CIA, DAS, EMO, I3C, MET a THY byla navíc v předběžných experimentech ověřována jejich schopnost v různých koncentracích bránit inhibici GJIC indukovanou lindanem, kdy koncentrace uvedené v Tabulce VI. poskytovaly nejlepší výsledky. Tabulka č. VI: Finální koncentrace fytochemikálií, pro použití v dalším experimentu
Fytochemikálie
Koncentrace
Fytochemikálie
Koncentrace
DAS
0,5 mM
MET
1 mM
CIA
100 µM
QUER
100 µM (1h); 25µM (24h)
CUR
1 µM
SIL
100 µM (1h); 50 µM (24h)
EMO
10 µM
I3C
10 µM
THY
10 µM
66
A)
B)
C)
D)
E)
F)
Obrázek č. 17: Účinky vybraných fytochemikálií na mezibuněčnou komunikace GJIC v linii WB-F344 po 1 h expozici. A) dialyl sulfid, B) kys. skořicová, C) emodin, D) indol-3-karbinol, E) metformin, F) tymochinon
Inhibitory GJIC Hodnocení závislosti inhibice GJIC na koncentraci bylo provedeno také s vybranými inhibitory buněčné komunikace. DDT, Fla, Lin, PCP, PFOA a TPA byly testovány v široké škále koncentrací po 15 min expozici (Tabulka č. V). Souhrnné výsledky jsou uvedeny na Obr. č. 18, na jejichž základě byly pro další experimenty vybrány takové koncentrace
67
inhibitorů GJIC, které způsobovaly snížení GJIC v průměru pod 20%. Zvolené koncentrace jsou sumarizovány v Tabulce č. VII. A)
B)
C)
D)
E)
F)
Obrázek č. 18: Působení vybraných inhibitorů na GJIC v linii WB-F344 po 15 min expozici. A) DDT, B) fluoranthen, C) lindan, D) pentachlorofenol, E) kys. perfluorooktanová, F) TPA
68
Tabulka č. VII. Finální koncentrace vybraných inhibitorů GJIC Inhibitor
Koncentrace
DDT
25 µM
Fla
50 µM
Lin
70 µM
PCP
70 µM
PFOA
100 µM
TPA
7,5 nM
6.1.3. Vliv fytochemikálií na chemicky indukovanou inhibici GJIC Jedním z hlavních cílů praktické části bylo ověření hypotézy, zda jsou vybrané fytochemikálie schopny preventivně působit proti inhibici GJIC. Tento experiment byl proveden ve dvou časových expozicích, krátkodobé (30 min) a dlouhodobé (24 h). Předchozími experimenty byly vybrány příslušné koncentrace fytochemikálií a taktéž inhibitorů buněčné komunikace (Tabulka č. VI a VII). Výsledky ukázaly, že některé fytochemikálie jsou skutečně schopny zabránit inhibici GJIC, což dále významně podporuje existující informace o jejich chemopreventivních účincích (Obr. č. 19). Účinky jednotlivých fytochemikálií se však liší nejen navzájem, ale také u různých typu inhibitorů GJIC (Obr. č. 26, 27), což indikuje možnou rozmanitost mechanismů chemopreventivních účinků různých fytochemikálií stejně jako různé mechanismy inhibice GJIC environmentálními toxikanty. Silnější preventivní účinky fytochemikálií byly pozorovány zpravidla již po krátkodobém, 30 min působení fytochemikálie. To může souviset s možnou metabolizací či rozkladem těchto látek v průběhu dlouhodobější expozice (24 h). Nejslibnějšími fytochemikáliemi se dle z hlediska jejich preventivních účinků vůči chemickým inhibitorům GJIC jeví QUER a SIL. QUER působil významně preventivně na všechny použité inhibitory ať už během krátkodobé či dlouhodobé expozice. SIL byl zase fytochemikálií, která vyvolala největší účinek, a to v kombinaci s 70 µM lindanem, kdy u buněk exponovaných SIL lindan způsobil pouze 13% pokles komunikace, zatímco u buněk nevystavených působeních SIL byl pozorován pokles GJIC o více než 80%. Nicméně naměřené hodnoty v některých případech vykazovaly poměrně vysoké směrodatné odchylky, což může souviset se semikvantitativním charakterem metody
69
SL/DT, která je ovlivňována mnoha vlivy jako je např. momentální kondice buněk, nestálost některých používaných látek.
a) kontrola
b) Lin 70 µM
c) QUER 25 µM + Lin 70 µM
Obrázek č. 19: Příklad preventivního působení fytochemikálií. a) Buňky WB-F344 kontrola, buňky komunikují. b) Inhibice GJIC nastala po 15 minutách působení 70 µM lindanu. c) V případě, že buňky byly nejprve exponovány fytochemikálii (25 µM QUER, po dobu 24 hodin), k inhibici nedošlo.
6.2.
Tumorigenní buněčná linie 6.2.1. Měření mezibuněčné komunikace GJIC Nejprve bylo prověřeno, zda se opravdu jedná o požadovanou buněčnou linii
WB-ras. Na Obr. č. 20 jsou zobrazeny všechny tři buněčné linie po provedení testu SL/DT. Bylo zjištěno, že u linie WB-ras opravdu dochází k inhibici buněčné komunikace. GJIC je u nich snížena přibližně na hodnotu 20%, v porovnání s netumorigenní buněčnou linií. Také byla potvrzena rozdílná morfologie WB-ras buněk. Bylo zdokumentováno, že WB-ras buňky mají podlouhlý tvar a jak je z obrázku zřejmé, dochází u nich ke ztrátě kontaktní inhibice tzn. že po zaplnění celého prostoru kultivační lahve rostou jedna přes druhou. Naopak u buněk WB-F344 a WB-neo je kontaktní inhibice zachována a ve stejné situace se buňky přestávají dělit.
70
A)
B)
C)
Obrázek č. 20: Porovnání buněčných linií A) WB F344 „wild type“, B) WB F344-ras a C) WB F344-neo1A1 z hlediska úrovně mezibuněčné komunikace GJIC, morfologie a schopnosti kontaktní inhibice.
6.2.2. Ověření exprese H-ras Ověření, zda linie WB-ras opravdu exprimuje protein H-ras bylo provedeno pomocí metody Western blot. Tento experiment nám potvrdil, že WB-ras linie opravdu exprimuje H-ras, a v porovnání s buněčnou linií WB-F344 je rozdíl opravdu znatelný (Obr. č. 21). H-ras se zobrazil na filmu ve formě dvou bandů. Spodní, rychleji
71
se pohybující, band znázorňuje H-ras vyskytující se na membráně, u kterého dochází k farnesylaci, což vede k onkogenní transformaci buněk. Druhým, pomaleji migrujícím bandem je nemodifikovaná forma H-ras, vyskytující se v cytosolu (Matesic et al., 2006).
Obrázek č. 21: Film vyvolaný pomocí ECL detekce, zobrazující dva vzorky, WB-ras (ras) a WB-F344 (wt). Výsledky potvrdily, že tumorigenní buněčná linie exprimuje protein H-ras. Naopak u WB-F344 buněk to nebylo prokázáno. Na filmu jsou zobrazeny dva bandy: spodní band znázorňuje H-ras vyskytující se na membráně a vrchní band znázorňuje H-ras vyskytující se v cytosolu.
6.2.3. Účinky MET a SIL na proliferaci Ke sledováním účinků fytochemikálií byly vybrány pouze dvě látky, a to MET a SIL. Byly sledovány jejich účinky na proliferaci tumorigenních buněk WB-ras. Výsledky ukázaly se, že MET ani SIL, se nevyznačují selektivními účinky na proliferaci pouze u tumorigenních WB-ras buněk (Obr. č. 22).
72
A)
B)
Obrázek č. 22: Závislost vlivu fytochemikálií na buněčnou proliferaci, u tří druhů buněčných linií WB-F344, WB-ras a WB-neo. A)SIL, B) MET
Obrázek č. 23: Účinky MET a SIL na mezibuněčnou komunikaci GJIC buněčné linie WB-ras po 24 hod expozici.
6.2.4. Účinky MET a SIL na indukci apoptózy Dalším znakem látek s protinádorovými účinky může být indukce apoptózy. Proto byly zkoumány účinky MET a SIL na tumorigenní buněčnou linii. Ukázalo se, že z testovaných koncentrací MET vyvolává apoptózu již ta nejnižší 12,5 mM. Se vzrůstající koncentrací se účinek zvyšoval, ale u nejvyšší použité koncentrace 100 mM MET se apoptické buňky téměř nevyskytovaly. Z toho vyplývá, že po expozici 100 mM 73
MET nejspíše nedocházelo k apoptóze, ale k jinému typu buněčné smrti např. nekróze (Obr. č. 24). Nejúčinnější koncentrací SIL je 125 µM, ale již u 62,5 µM SIL se objevovaly apoptické buňky.
Naopak koncentrace 500 µM SIL byla pro buňky příliš toxická,
a po oplachu PBS jich zůstalo v jamce velice málo. Více fotografií je umístěno v příloze.
A)
B)
C)
Obrázek č. 24: Apoptické účinky MET na tumorigenní nádorovou linii WB-ras po 24 hod expozici. Zeleně zbarvené buňky jsou barveny Anexinnem V a jsou ve fázi časné apopózy. Modře zbarvené jsou jádra buněk obarvené fluorescenčním barvivem DAPI. A) kontrola, B) MET 12,5 mM, C) MET 100 mM
6.2.5. Vliv MET a SIL na buněčný cyklus Posledním zkoumaným endpointem protinádorových účinků MET a SIL, je jejich vliv na buněčný cyklus. Byla provedena 24 hodinová expozice WB-ras buněk těmto látkám a výsledky ukázaly, že MET a SIL jsou schopny ovlivnit buněčný cyklus. Po expozici buněk těmto fytochemikáliím se vyskytuje větší procento buněk v G2/M fázi buněčného cyklu. Z toho vyplývá, že tyto látky jsou schopny blokovat další dělení nádorových buněk. Nejlepšího účinku bylo dosaženo pomocí 25 mM MET, který byl schopen zvýšit procento
74
buněk v G2/M fázi o přibližně 13%. U SIL nebylo dosaženo tak pozitivních výsledků, nicméně po expozici 100 µM SIL došlo ke zvýšenému počtu buněk v G2/M fázi o 1%. Výsledný graf je zobrazen na Obr. č. 25.
Obrázek č. 25: Účinky fytochemikálií MET a SIL na buněčný cyklus WB-ras buněk po 24 hod expozici.
75
Bylo pozorováno, že mnoho přírodních látek tzv. fytochemikálií nebo látek jimi inspirovanými, účinkuje proti různým druhům onemocnění, včetně nádorového. Tyto látky jsou schopny ovlivňovat mnoho biochemických procesů, čímž může docházet ke zpomalení či zamezení rozvoje nádorového onemocnění. Cílem této práce bylo využití tkáňových kultur pro hodnocení specifických biomarkerů, které by sloužili k identifikaci různých rostlinných látek s chemopreventivními či protinádorovými účinky. První část této práce je zaměřena na chemopreventivní účinky fytochemikálií, které jsou experimentálně studovány prostřednictvím jejich účinků na mezibuněčnou komunikaci GJIC, která má v procesu karcinogeneze velmi významnou roli. Za tímto účelem bylo vybráno devět fytochemikálií (dialyl sulfid, kyselina skořicová, kurkumin, emodin, indol3-karbinol, metformin, quercetin, silibinin a tymochinon) u kterých byly účinky na GJIC popsány velmi málo nebo dokonce vůbec. Tyto chemopreventivní účinky byly zkoumány sledováním vlivu vybraných fytochemikálií na chemicky indukovanou inhibici GJIC na jaterní potkaní buněčné linii WB F344, v krátkodobé a dlouhodobé expozici. Pro tento účel bylo vybráno šest inhibitoru GJIC, s různými mechanismy účinku, u kterých byla tato jejich vlastnost dobře prozkoumána (DDT, fluoranthen, lindan, pentachlorofenol, PFOA a TPA). V druhé části této práce byly vybrány dvě z těchto fytochemikálií metformin a silibinin, u kterých byly studovány jejich protinádorové účinky na buněčnou linii WB F344, transfekovanou ras onkogenem. Tyto látky byly vybrány na základě předchozích studiích, které ukázaly, že MET snižuje vznik hepatocelulárního karcinomu, navíc se nedávno ukázalo, že má selektivní účinky na endometriální buňky nesoucí mutovaný K-ras onkogen (Iglesias et al., 2013). U druhé vybrané fytochemikálie SIL bylo in vitro i in vivo studiích zjištěno, že se projevuje hepatoprotektivními vlastnostmi. V rámci tohoto experimentu byly zkoumány tyto účinky MET a SIL: vliv na buněčnou proliferaci, buněčnou komunikaci, indukci apoptózy a buněčný cyklus. Nejprve bylo ověřeno, že se opravdu jedná o linii exprimující ras onkogen, také byly ověřeny charakteristické vlastnosti této buněčné linie. Byl provedena metoda SL/DT, která ukázala, že WB-F344 buňky transfekované H-ras onkogenem komunikují prostřednictvím mezerových spojů pouze omezeně, v porovnání s netumorigenní linií WB F344 „wild type“ byla hodnota procentuální komunikace přibližně 20. Také byly
76
pozorovány morfologické změny a ztráta kontaktní inhibice. Následně byla provedena metoda Western Blot, která potvrdila, že WB F344-ras buňky opravdu exprimují H-ras. Poté byly provedeny testy cytotoxicity vybraných fytochemikálií, v krátkodobé i dlouhodobé expozice, které nastínily jejich finální koncentrace použité v dalších experimentech. Dále byly provedeny experimenty typu dávka-odpověď vlivu fytochemikálií a inhibitorů mezibuněčné komunikace na GJIC, které doplnily cytotoxické testy a jejich kombinací byly vybrány finální koncentrace fytochemikálií a inhibitorů GJIC. Finální koncentrace fytochemikálií jsou DAS 0,5 mM, CIA 100 µM, CUR 1 µM, EMO 10 µM, I3C 10 µM, MET 1 mM, QUER 100 µM pro krátkodobou expozici a 25 µM pro dlouhodobou expozici, SIL 100 µM pro krátkodobou expozici a 50 µM pro dlouhodobou expozici, THY 10 µM. Koncentrace inhibitorů vybrány pro další testy jsou DDT 25 µM, Fla 50 µM, Lin 70 µM, PCP 70 µM, PFOA 100 µM a TPA 7,5 nM. U experimentu, který sledoval preventivní účinky fytochemikálií vůči inhibici mezibuněčné komunikace, která byla způsobena chemickými inhibitory, byly pozorovány pozitivní výsledky. U všech fytochemikálií byl pozorován blokující účinek vůči minimálně jednomu inhibitoru. Účinky fytochemikálií v různých expozičních časech se poměrně lišily. K celkově pozitivnějším výsledkům došlo při krátkodobé expozici, při které se projevily inhibici blokující účinky u více fytochemikálií. Dle výsledků můžeme konstatovat, že během krátkodobé expozice, jsou preventivní účinky fytochemikálií zprostředkovány jinými procesy, než u dlouhodobé. U krátkodobé expozice mohou být příčinou chemopreventivních účinků např. antioxidační vlastnosti, které se vyskytují u pěti z devíti použitých fytochemikálií, a to u CUR, CIA, QUER, SIL a THY. Nejvíce statisticky významných efektů, během krátkodobé expozice, se projevilo v kombinaci s Lin, u kterého došlo k zabránění inhibice všemi použitými fytochemikáliemi. Naopak žádný statisticky významný efekt během krátkodobé expozice nenastal v kombinaci s DDT. Jinak tomu bylo u dlouhodobé expozice, nejvíce statisticky významných efektů, během 24 hodin nastalo, právě v kombinaci s DDT a Fla, inhibice obou látek je zprostředkována aktivací fosfatidylcholin-specifické fosfolipázy C (PC-PLC). Na druhé straně v kombinaci s Lin, který inhibuje GJIC mechanismem závislým na aktivaci MAPK-kinázy MEK1/2 a následné fosforylaci Cx43 MAP kinázou ERK1/2, nedošlo při dlouhodobé expozici k tak významným výsledkům. Tento experiment potvrdil, že tato metoda je vhodná pro predikci chemopreventivních účinků chemických látek. Výhodou 77
je hlavně jednoduchost této metody a její finanční nenáročnost. Nevýhodou ale je variabilita výsledků, které může být způsobena aktuální kondicí buněk či nestálostí některých inhibitorů. Výsledky z druhé části této práce ukázaly, že MET ani SIL nevykazují žádné proliferační účinky selektivně pouze na tumorigenní linie. Bylo dosaženo významného cytotoxického účinku po 24 hodinovém působení SIL, ale efekt se stejnou měrou projevil i na ostatních buněčných liniích. Co se týče ostatních zkoumaných parametrů, bylo dosaženo statisticky významných efektů. Byl pozorován vliv MET a SIL na mezibuněčnou komunikaci GJIC u WB F344-ras buněk po 24 hodinách. Nejúčinnější a statisticky významné účinky se projevily při působení 25 µM SIL, 1 a 2,5 mM MET. Také byl pozorován účinek MET a SIL na indukci apoptózy. Po 24 hodinách expozice, došlo k výraznému apoptickému účinku působením již 12,5 mM MET. I ve vyšších koncentracích tzn, 25 a 50 mM, byl pozorován tento efekt. Nicméně v koncentraci 100 mM MET již tento efekt pozorován nebyl, a to z toho důvodu, že se jednalo o příliš toxickou koncentraci, která vyvolávala jiný typ buněčné smrti, jako je nekróza. Stejný výsledků bylo dosaženo i u SIL. Koncentrace 62,5 µM již vyvolávala apoptózu, ale nejúčinnější koncentrací se zdá být 125 µM. V Případě 500 µM SIL byl pozorován velký úbytek buněk, což značí, že je tato koncentrace příliš toxická. Posledním sledovaným endpointem byl vliv MET a SIL na buněčný cyklus. I zde byl pozorován pozitivní výsledek, a zvýšené procento buněk vyskytující se v G2/M fázi buněčného cyklu. Nejlepšího účinku bylo dosaženo použitím 25 mM MET, který zvyšoval procento buněk v G2/M fázi o 13%. Tento účinek se projevuje blokováním dalšího dělení tumorigenních buněk. Všechny tyto účinky na tumorigenní buněčnou linii, svědčí o tom, že MET a SIL jsou schopni ovlivňovat charakteristické rysy nádorových buněk jako inhibice mezibuněčné komunikace, antiapoptické vlastnosti a deregulace buněčného cyklu. Všechny tyto efekty nasvědčují, že by se mohlo jednat o látky, které jsou schopny účinně působit na vývoj nádorových onemocnění.
78
Závěr Hlavními cíli této práce bylo prověřit chemopreventivní účinky devíti vybraných fytochemikálií či jim blízkých látek na nenádorovou buněčnou linii WB-F344 a blíže se zaměřit na dvě z těchto fytochemikálií metformin a silibinin a jejich protirakovinné účinky na tumorigenní linii WB-ras. Oba cíle byly splněny a provedené experimenty přinesly nové poznatky a chemopreventivních účincích dialyl sulfidu, kyseliny skořicové, kurkuminu,
emodinu,
indol-3-karbinolu,
metforminu,
quercetinu,
silibininu
a tymochinonu. Dále byly prokázány některé protinádorové účinky metforminu a silibininu jako např. vliv na mezibuněčnou komunikaci, indukci apoptózy či buněčný cyklus u tumorigenní linie.
79
Seznam použité literatury Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., & Didelon, J. (2008). Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques, 45(1), 33-+. Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Stines, J. R., Blondel, W., Dumas, D., Guillemin, F., et al. (2007). Gap junctional intercellular communication capacity by gap-FRAP technique: a comparative study. Biotechnol J, 2(1), 50-61. Abenavoli, L., Capasso, R., Milic, N., & Capasso, F. (2010). Milk Thistle in Liver Diseases: Past, Present, Future. Phytotherapy Research, 24(10), 1423-1432. Aggarwal, B. B., & Ichikawa, H. (2005). Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle, 4(9), 1201-1215. Aggarwal, B. B., Kumar, A., Aggarwal, M. S., & Shishodia, S. (2005). Curcumin derived from turmeric (Curcuma longa): a spice for all seasons. Phytopharmaceuticals in Cancer Chemoprevention, 349-387. Anderson, P. A., Muller-Borer, B. J., Esch, G. L., Coleman, W. B., Grisham, J. W., & Malouf, N. N. (2007). Calcium signals induce liver stem cells to acquire a cardiac phenotype. Cell Cycle, 6(13), 1565-1569. Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., & Nielsen, M. S. (2013). Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol, 4, 130. Bao, Y., & Fenwick, R. (2005). Phytochemicals in Health and Disease. New York: Marcel Dekker. Bhagwat, S., Haytowitz, D. B., & Holden, J. M. (2011). USDA Database for the Flavonoid Content
of
Selected
Foods.
from
http://www.ars.usda.gov/SP2UserFiles/Place/12354500/Data/Flav/Flav_R03.pd f Boots, A. W., Haenen, G. R. M. M., & Bast, A. (2008). Health effects of quercetin: From antioxidant to nutraceutical. European Journal of Pharmacology, 585(2-3), 325337.
80
Bos, J. L. (1989). RAS ONCOGENES IN HUMAN CANCER - A REVIEW. Cancer Research, 49(17), 4682-4689. Bradlow, H. L. (2008). Indole-3-carbinol as a chemoprotective agent in breast and prostate cancer. In Vivo, 22(4), 441-445. Breheny, D., Oke, O., & Faux, S. P. (2011). The Use of In Vitro Systems to Assess Cancer Mechanisms and the Carcinogenic Potential of Chemicals. Atla-Alternatives to Laboratory Animals, 39(3), 233-255. Béliveau, R., & Gingras, D. (2008). Výživa ako zbraň proti rakovine:potraviny, které pomáhajú v prevencii a liečbe nádorov. Bratislava: BALNEOTHERMA. Cantrell, L. A., Zhou, C., Mendivil, A., Malloy, K. M., Gehrig, P. A., & Bae-Jump, V. L. (2010). Metformin is a potent inhibitor of endometrial cancer cell proliferationimplications for a novel treatment strategy. Gynecologic Oncology, 116(1), 92-98. Cheung, C. W. Y., Gibbons, N., Johnson, D. W., & Nicol, D. L. (2010). Silibinin - A Promising New Treatment for Cancer. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 10(3), 186-195. Choi, D.-Y., Baek, Y.-H., Huh, J.-E., Ko, J.-M., Woo, H., Lee, J.-D., et al. (2009). Stimulatory effect of Cinnamomum cassia and cinnamic acid on angiogenesis through upregulation
of
VEGF
and
Flk-1/KDR
expression.
International
Immunopharmacology, 9(7-8), 959-967. Corcelle, E., Nebout, M., Bekri, S., Gauthier, N., Hofman, P., Poujeol, P., et al. (2006). Disruption of autophagy at the maturation step by the carcinogen lindane is associated with the sustained mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase activity. Cancer Research, 66(13), 6861-6870. Crissman, H. A., & Hirons, G. T. (1994). STAINING OF DNA IN LIVE AND FIXED CELLS. Methods in Cell Biology, Vol 41, 41, 195-209. Cronier, L., Crespin, S., Strale, P.-O., Defamie, N., & Mesnil, M. (2009). Gap Junctions and Cancer: New Functions for an Old Story. Antioxidants & Redox Signaling, 11(2), 323-338. Dajas, F. (2012). Life or death: Neuroprotective and anticancer effects of quercetin. Journal of Ethnopharmacology, 143(2), 383-396. De Feijter, A. W., Ray, J. S., Weghorst, C. M., Klaunig, J. E., Goodman, J. I., Chang, C. C., et al. (1990). Infection of rat liver epithelial cells with v-Ha-ras: correlation 81
between
oncogene
expression,
gap
junctional
communication,
and
tumorigenicity. Mol Carcinog, 3(2), 54-67. de Oliveira Niero, E. L., & Machado-Santelli, G. M. (2013). Cinnamic acid induces apoptotic cell death and cytoskeleton disruption in human melanoma cells. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 32. deFeijter, A. W., Matesic, D. F., Ruch, R. J., Guan, X. J., Chang, C. C., & Trosko, J. E. (1996). Localization and function of the connexin 43 gap-junction protein in normal and various oncogene-expressing rat liver epithelial cells. Molecular Carcinogenesis, 16(4), 203-212. Dowling, R. J. O., Niraula, S., Stambolic, V., & Goodwin, P. J. (2012). Metformin in cancer: translational challenges. Journal of Molecular Endocrinology, 48(3), R31-R43. Ekmekcioglu, C., Feyertag, J., & Marktl, W. (1998). Cinnamic acid inhibits proliferation and modulates brush border membrane enzyme activities in Caco-2 cells. Cancer Letters, 128(2), 137-144. Engeler, E. (2009). Treaty expanded by 9 more dangerous chemicals. from http://phys.org/news161085102.html Fan, J., Shen, H., Dai, Q., Minuk, G. Y., Burzynski, F. J., & Gong, Y. (2009). Bone morphogenetic protein-4 induced rat hepatic progenitor cell (WB-F344 cell) differentiation toward hepatocyte lineage. J Cell Physiol, 220(1), 72-81. Forejtnikova, H., & Kubinova, R. (2003). Natural compounds as stimulators of gapjunctional intercellular communication. Chemicke Listy, 97(12), 1168-1175. Gali-Muhtasib, H., Roessner, A., & Schneider-Stock, R. (2006). Thymoquinone: A promising anti-cancer drug from natural sources. International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 38(8), 1249-1253. Gibellini, L., Pinti, M., Nasi, M., Montagna, J. P., De Biasi, S., Roat, E., et al. (2011). Quercetin and Cancer Chemoprevention. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 1-15. Goel, G., Makkar, H. P. S., Francis, G., & Becker, K. (2007). Phorbol esters: Structure, biological activity, and toxicity in animals. International Journal of Toxicology, 26(4), 279-288. Gonzalez-Vallinas, M., Gonzalez-Castejon, M., Rodriguez-Casado, A., & Ramirez de Molina, A. (2013). Dietary phytochemicals in cancer prevention and therapy: a 82
complementary approach with promising perspectives. Nutrition Reviews, 71(9), 585-599. Gotlieb, W. H., Saumet, J., Beauchamp, M.-C., Gu, J., Lau, S., Pollak, M. N., et al. (2008). In vitro metformin anti-neoplastic activity in epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology, 110(2), 246-250. Green, A. S., Chapuis, N., Maciel, T. T., Willems, L., Lambert, M., Arnoult, C., et al. (2010). The LKB1/AMPK signaling pathway has tumor suppressor activity in acute myeloid leukemia through the repression of mTOR-dependent oncogenic mRNA translation. Blood, 116(20), 4262-4273. Gupta, S. C., Kannappan, R., Reuter, S., Kim, J. H., & Aggarwal, B. B. (2011). Chemosensitization of tumors by resveratrol. Resveratrol and Health, 1215, 150160. Hanahan, D., & Weinberg, R. A. (2011). Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell, 144(5), 646-674. Harris, A. L. (2007). Connexin channel permeability to cytoplasmic molecules. Progress in Biophysics & Molecular Biology, 94(1-2), 120-143. Hayashi, T., Nomata, K., Chang, C. C., Ruch, R. J., & Trosko, J. E. (1998). Cooperative effects of v-myc and c-Ha-ras oncogenes on gap junctional intercellular communication and tumorigenicity in rat liver epithelial cells. Cancer Lett, 128(2), 145-154. Herman-Antosiewicz, A., & Singh, S. V. (2004). Signal transduction pathways leading to cell cycle arrest and apoptosis induction in cancer cells by Allium vegetablederived organosulfur compounds: a review. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 555(1-2), 121-131. Hu, T.-Y., Liu, C.-L., Chen, J.-Y., & Hu, M.-L. (2013). Curcumin ameliorates methylglyoxalinduced alterations of cellular morphology and hyperpermeability in human umbilical vein endothelial cells. Journal of Functional Foods, 5(2), 745-754. Hwang, J. W., Jung, J. W., Lee, Y. S., & Kang, K. S. (2008). Indole-3-Carbinol Prevents H2O2-Induced Inhibition of Gap Junctional Intercellular Communication by Inactivation of PKB/Akt. Journal of Veterinary Medical Science, 70(10), 10571063.
83
Iglesias, D. A., Yates, M. S., van der Hoeven, D., Rodkey, T. L., Zhang, Q., Ngai Na, C., et al. (2013). Another Surprise from Metformin: Novel Mechanism of Action via KRas Influences Endometrial Cancer Response to Therapy. Molecular Cancer Therapeutics, 12(12), 2847-2856. Isakovic, A., Harhaji, L., Stevanovic, D., Markovic, Z., Sumarac-Dumanovic, M., Starcevic, V., et al. (2007). Dual antiglioma action of metformin: cell cycle arrest and mitochondria-dependent apoptosis. Cellular and Molecular Life Sciences, 64(10), 1290-1302. Jia, Y., Yao, H., Zhou, J., Chen, L., Zeng, Q., Yuan, H., et al. (2011). Role of epimorphin in bile duct formation of rat liver epithelial stem-like cells: involvement of small G protein RhoA and C/EBPbeta. J Cell Physiol, 226(11), 2807-2816. Jung, J.-W., Park, S.-B., Lee, S.-J., Seo, M.-S., Trosko, J. E., & Kang, K.-S. (2011). Metformin Represses Self-Renewal of the Human Breast Carcinoma Stem Cells via Inhibition of Estrogen Receptor-Mediated OCT4 Expression. Plos One, 6(11). Kao, C. Y., Oakley, C. S., Welsch, C. W., & Chang, C. C. (1997). Growth requirements and neoplastic transformation of two types of normal human breast epithelial cells derived from reduction mammoplasty. In Vitro Cellular & Developmental BiologyAnimal, 33(4), 282-288. Kidd, P., & Head, K. (2005). A review of the bioavailability and clinical efficacy of milk thistle phytosome: A silybin-phosphatidylcholine complex (siliphos (R)). Alternative Medicine Review, 10(3), 193-203. Kim, Y. S., Kwon, J. S., Cho, Y. K., Jeong, M. H., Cho, J. G., Park, J. C., et al. (2012). Curcumin reduces the cardiac ischemia-reperfusion injury: involvement of the toll-like receptor 2 in cardiomyocytes. Journal of Nutritional Biochemistry, 23(11), 15141523. King, T. J., & Bertram, J. S. (2005). Connexins as targets for cancer chemoprevention and chemotherapy. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 1719(1-2), 146160. Kisfalvi, K., Eibl, G., Sinnett-Smith, J., & Rozengurt, E. (2009). Metformin Disrupts Crosstalk between G Protein-Coupled Receptor and Insulin Receptor Signaling Systems and Inhibits Pancreatic Cancer Growth. Cancer Research, 69(16), 65396545. 84
Klener,
P.
(1999).
Chemoprevence
nádorových
onemocnění.
from
http://www.linkos.cz/files/klinicka-onkologie/52/1115.pdf Kudo N., K. Y. (2003). Toxicity and toxicokinetics of perfluorooctanoic acid in humans and animals. J. Toxicol Sci(0388-1350 (Print)). Káš, J., Kodíček, M., & Valentová, O. (2005). Laboratorní techniky biochemie. Praha: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze. Lenčešová, Z. (2012). In vitro metody pro studium chemopreventivních účinků fytochemikálií. Masarykova univerzita. Leone, A., Longo, C., & Trosko, J. E. (2012). The chemopreventive role of dietary phytochemicals
through
gap
junctional
intercellular
communication.
Phytochemistry Reviews, 11(2-3), 285-307. Li, L., Zeng, J., Gao, Y., & He, D. (2010). Targeting silibinin in the antiproliferative pathway. Expert Opinion on Investigational Drugs, 19(2), 243-255. Liu, L., Hudgins, W. R., Shack, S., Yin, M. Q., & Samid, D. (1995). CINNAMIC ACID - A NATURAL PRODUCT WITH POTENTIAL USE IN CANCER INTERVENTION. [Article]. International Journal of Cancer, 62(3), 345-350. Loewenstein, W. R., & Kanno, Y. (1966). Intercellular communication and the control of tissue growth: lack of communication between cancer cells. Nature, 209(5029), 1248-1249. Loguercio, C., & Festi, D. (2011). Silybin and the liver: From basic research to clinical practice. World Journal of Gastroenterology, 17(18), 2288-2301. Matesic, D. F., Villio, K. N., Folse, S. L., Garcia, E. L., Cutler, S. J., & Cutler, H. G. (2006). Inhibition of cytokinesis and akt phosphorylation by chaetoglobosin K in rastransformed epithelial cells. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 57(6), 741-754. Memmott, R. M., Mercado, J. R., Maier, C. R., Kawabata, S., Fox, S. D., & Dennis, P. A. (2010). Metformin Prevents Tobacco Carcinogen-Induced Lung Tumorigenesis. Cancer Prevention Research, 3(9), 1066-1076. Mitchell, T. (2009). Intravenous Milk Thistle (Silibinin-Legalon) for Hepatic Failure Induced
by
Amatoxin/Amanita
Mushroom
http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00915681
85
Poisoning.
from
Naus, C. C., & Laird, D. W. (2010). Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nature Reviews Cancer, 10(6), 435-441. Oliveira, P. A., Colaco, A., Chaves, R., Guedes-Pinto, H., De-La-Cruz, L. F., & Lopes, C. (2007). Chemical carcinogenesis. Anais Da Academia Brasileira De Ciencias, 79(4), 593-616. Pfenniger, A., Wohlwend, A., & Kwak, B. R. (2011). Mutations in connexin genes and disease. European Journal of Clinical Investigation, 41(1), 103-116. Pierotti, M. A., Berrino, F., Gariboldi, M., Melani, C., Mogavero, A., Negri, T., et al. (2013). Targeting metabolism for cancer treatment and prevention: metformin, an old drug with multi-faceted effects. Oncogene, 32(12), 1475-1487. Quinn, B. J., Kitagawa, H., Memmott, R. M., Gills, J. J., & Dennis, P. A. (2013). Repositioning metformin for cancer prevention and treatment. Trends in Endocrinology and Metabolism, 24(9), 469-480. Ren, Y., & Savill, J. (1998). Apoptosis: The importance of being eaten. Cell Death and Differentiation, 5(7), 563-568. Repetto, G., del Peso, A., & Zurita, J. L. (2008). Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols, 3(7), 1125-1131. Ruch, R. J., Trosko, J. E., & Madhukar, B. V. (2001). Inhibition of connexin43 gap junctional intercellular communication by TPA requires ERK activation. Journal of Cellular Biochemistry, 83(1), 163-169. Sai, K., Upham, B. L., Kang, K. S., Hasegawa, R., Inoue, T., & Trosko, J. E. (1998). Inhibitory effect of pentachlorophenol on gap junctional intercellular communication in rat liver epithelial cells in vitro. Cancer Letters, 130(1-2), 9-17. Schneider-Stock, R., Fakhoury, I. H., Zaki, A. M., El-Baba, C. O., & Gali-Muhtasib, H. U. (2014). Thymoquinone: fifty years of success in the battle against cancer models. Drug Discovery Today, 19(1), 18-30. Shrimali, D., Shanmugam, M. K., Kumar, A. P., Zhang, J., Tan, B. K. H., Ahn, K. S., et al. (2013). Targeted abrogation of diverse signal transduction cascades by emodin for the treatment of inflammatory disorders and cancer. Cancer Letters, 341(2), 139-149. Sovadinova, I., Babica, P., Boke, H., Kumar, E. R., Wilke, A., Park, J. S., et al. (submitted). Phosphatidylcholine specific phospholipase C dysregulation of gap junctional 86
intercellular communication, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol. PLOS One. Sovadinova, I. B., Pavel, B., Hatice, K., Esha, W., Andrew, P., Joon-Suk, T., et al. (2010). Phosphatidylcholine-Specific Phospholipase C Dysregulation of Gap Junctional Intercellular Communication, A Robust Cellular Response to Environmental Toxicants, and Prevention by Resveratrol. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal, 46, S80-S80. Stocker, K. J., Howard, W. R., Statham, J., & Proudlock, R. J. (1996). Assessment of the potential in vivo genotoxicity of fluoranthene. Mutagenesis, 11(5), 493-496. Trosko, J. E. (2005). The role of stem cells and gap junctions as targets for cancer chemoprevention and chemotherapy. Biomedicine & Pharmacotherapy, 59, S326-S331. Trosko, J. E., Chang, C. C., Wilson, M. R., Upham, B., Hayashi, T., & Wade, M. (2000). Gap junctions and the regulation of cellular functions of stem cells during development and differentiation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology, 20(2), 245-264. Tsai, C.-M., Sun, F.-M., Chen, Y.-L., Hsu, C.-L., Yen, G.-C., & Weng, C.-J. (2013). Molecular mechanism depressing PMA-induced invasive behaviors in human lung adenocarcinoma cells by cis- and trans-cinnamic acid. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 48(3), 494-501. Tsao, A. S., Kim, E. S., & Hong, W. K. (2004). Chemoprevention of cancer. Ca-a Cancer Journal for Clinicians, 54(3), 150-180. Tsao, M. S., Smith, J. D., Nelson, K. G., & Grisham, J. W. (1984). A DIPLOID EPITHELIALCELL LINE FROM NORMAL ADULT-RAT LIVER WITH PHENOTYPIC PROPERTIES OF OVAL CELLS. Experimental Cell Research, 154(1), 38-52. Upham, B. L., Park, J. S., Babica, P., Sovadinova, I., Rummel, A. M., Trosko, J. E., et al. (2009). Structure-Activity-Dependent Regulation of Cell Communication by Perfluorinated Fatty Acids using in Vivo and in Vitro Model Systems. Environmental Health Perspectives, 117(4), 545-551. Upham, B. L., & Trosko, J. E. (2009). Oxidative-dependent integration of signal transduction with intercellular gap junctional communication in the control of gene expression. Antioxid Redox Signal, 11(2), 297-307. 87
Vanisree, A. J., & Ramanan, R. (2007). In vitro assessment of curcumin against murine neuroblastoma cells. Neuroendocrinology Letters, 28(2), 204-212. Vermes, I., Haanen, C., Steffensnakken, H., & Reutelingsperger, C. (1995). A NOVEL ASSAY
FOR
APOPTOSIS
-
FLOW
CYTOMETRIC
DETECTION
OF
PHOSPHATIDYLSERINE EXPRESSION ON EARLY APOPTOTIC CELLS USING FLUORESCEIN-LABELED ANNEXIN-V. Journal of Immunological Methods, 184(1), 39-51. Vinken, M., Doktorova, T., Decrock, E., Leybaert, L., Vanhaecke, T., & Rogiers, V. (2009). Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 44(4), 201-222. Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., & Rogiers, V. (2006). Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cellular Signalling, 18(5), 592-600. Wei, W.-T., Lin, S.-Z., Liu, D.-L., & Wang, Z.-H. (2013). The distinct mechanisms of the antitumor activity of emodin in different types of cancer. Oncology Reports, 30(6), 2555-2562. Woo, C. C., Kumar, A. P., Sethi, G., & Tan, K. H. B. (2012). Thymoquinone: Potential cure for inflammatory disorders and cancer. Biochemical Pharmacology, 83(4), 443451. www.linkos.cz.
(30.4.2014).
from
http://www.linkos.cz/co-musite-vedet/ceska-
republika-a-rakovina-v-cislech/ www.uzis.cz. (2010). Novotvary 2010 ČR. www.who.org. (30.4.2014). from http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/ Yang, C. S., Chhabra, S. K., Hong, J. Y., & Smith, T. J. (2001). Mechanisms of inhibition of chemical toxicity and carcinogenesis by dialyl sulfide (DAS) and related compounds from garlic. Journal of Nutrition, 131(3), 1041S-1045S. Zakikhani, M., Dowling, R., Fantus, I. G., Sonenberg, N., & Pollak, M. (2006). Metformin is an AMP kinase-dependent growth inhibitor for breast cancer cells. Cancer Research, 66(21), 10269-10273.
88
Zakikhani, M., Dowling, R. J. O., Sonenberg, N., & Pollak, M. N. (2008). The Effects of Adiponectin and Metformin on Prostate and Colon Neoplasia Involve Activation of AMP-Activated Protein Kinase. Cancer Prevention Research, 1(5), 369-375. Zoidl, G., & Dermietzel, R. (2010). Gap junctions in inherited human disease. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology, 460(2), 451-466. Žaloudík, J. (2008). Vyhněte se rakovině aneb prevence zhoubných nádorů pro každého. Praha: Grada.
89
Příloha Metformin:
Nocodazol 500 ng/ml
Kontrola
Metformin 12,5 mM
Metformin 50 mM
Metformin 100 mM Obrázek č. 26: Účinky metforminu (MET) na indukci apoptózy v buněčné linii WB-ras. Subkonfluentní kultura byla exponována 12,5; 25; 50 a 100 mM MET. Po 24 h byla provedena detekce indukce apoptózy. Zeleně zbarvené buňky jsou obarveny Annexinem-V a označují buňky vyskytující se ve fázi časné apoptózy. Modře zbarvené jsou jádra buněk, obarvené fluorescenčním barvivem DAPI.
Silibinin:
Rozpouštědlová kontrola
Nocodazol 500 ng/ml
Silibinin 62,5 µM
Silibinin 125 µM
Silibinin 250 µM Obrázek č. 26: Účinky silibininu (SIL) na indukci apoptózy v buněčné linii WB-ras. Subkonfluentní kultura byla exponována 62,5; 125; 250 a 500 mM MET. Po 24 h byla provedena detekce indukce apoptózy. Zeleně zbarvené buňky jsou obarveny Annexinem-V a označují buňky vyskytující se ve fázi časné apoptózy. Modře zbarvené jsou jádra buněk, obarvené fluorescenčním barvivem DAPI.
10
Obrázek č. 27: Vliv chemopreventivních účinků vybraných fytochemikálií na chemicky indukovanou inhibici mezibuněčné komunikace (GJIC). WB-F344 buňky byly 30 minut inkubovány s danou fytochemikálií, poté byl přidán na 15 minut inhibitor. Bylo vybráno devět fytochemikálií: diallyl sulfid (DAS), kys. skořicová (CIA), kurkumin (CUR), emodin (EMO), indol-3-karbinol (IC3), metformin (MET), quercetin (QUER), silibinin (SIL), tymochinon (THY), ty byly testovány v kombinaci s šesti inhibitory: DDT, fluoranthen (Fla), lindan (Lin), pentachlorofenol (PCP), kys. Perfluorooktanová (PFOA) a TPA.
Obrázek č. 28: Vliv chemopreventivních účinků vybraných fytochemikálií na chemicky indukovanou inhibici mezibuněčné komunikace (GJIC). WB-F344 buňky byly 24 hod inkubovány s danou fytochemikálií, poté byl přidán na 15 minut inhibitor. Bylo vybráno devět fytochemikálií: diallyl sulfid (DAS), kys. skořicová (CIA), kurkumin (CUR), emodin (EMO), indol-3-karbinol (IC3), metformin (MET), quercetin (QUER), silibinin (SIL), tymochinon (THY), ty byly testovány v kombinaci s šesti inhibitory: DDT, fluoranthen (Fla), lindan (Lin), pentachlorofenol (PCP), kys. Perfluorooktanová (PFOA) a TPA.
