ZöldGMO
HÍRLEVÉL I. évfolyam | 2. szám
A kiadvány a TÁMOP-4.2.3-08/1-2009-0009 projekt keretében, az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap és az Európai Regionális Fejlesztési Alap társfinanszírozásával valósult meg.
2009. NOVEMBER
1
ZöldGMO
HÍRLEVÉL
Kiadja: MTA Szegedi Biológiai Központ Felelős szerkesztő: Dudits Dénes
I. évfolyam | 2. szám
2009. NOVEMBER
Dudits Dénes A búzába történő génbeépítés módszerei és hazai Géntechnológiaeredmények a búza szárazságtűrésének javítására
Az ezredfordulón a búza funkcionális genomikai kutatás kulcsmódszerévé a genetikai transzformáció vált, ami izolált gének beépítését és így transzgenikus növények előállítását jelenti. Ez nem a véletlen műve csupán. Figyelembe véve, hogy a rizs után a búza a világ második legfontosabb gabonaféléje, hogy termesztési története egybefonódik az emberiséggel, stratégiai fontossága máris megmagyarázza, miért áll a kutatások homlokterében (JORDAN és mtsai 2002.). A magyarok számára, a búza az élet és a gazdálkodás szimbólumnövénye, amit termesztési hagyományaink, kedvező agroökológiai körülményeink, a múlt nemesítési eredményei (Baross-, Fleischmann-, Bekeféle búzák, és még folytathatnánk) teljeséggel alátámasztanak. A genetikai transzformáció kutatása és majdani körültekintő, gondos kutatási illetve gyakorlati alkalmazása szinte szükségszerű. A gének szerepéről végleges, megbízható információt nyerhetünk a gének megváltoztatott formáinak a genomba történő beépítésével és a megváltozott tulajdonságok jellemzésével. A genetikai transzformáció módszertanának rövid történeti áttekintése a búza példáján Ha rövid történeti áttekintést teszünk akkor látható, hogy az első búza (Triticum aestivum L.) transzformációs eredmények (KLÖTI és mtsai, 1993, ZHOU és mtsai, 1993) – amelyek a gének protoplasztokban történő sikeres tranziens expesszióját és transzformált kalluszok előállítását jelentették – az 1990-es évek elején meglehetős nehezen születtek meg. Akkor még úgy gondoltuk, az izolált protoplasztokba
(PAUK és mtsai, 1994) történő génbeépítés hozza majd meg a módszertani áttörést a búza genetikai transzformációjában. Mint azt ma már tudjuk, a búzatranszformáció kulcsa a génbelövésre alapozott módszer lett. A magyar transzformációs eredmények megalapozása viszont jóval korábban kezdődött. A hazai kutatók már a kezdeti transzformációs kísérletet megelőzően is meghatározó szerepet játszottak a búza sejt- és szövettenyésztési módszereinek kidolgozásában. Elegendő, ha DUDITS és mtsai (1975), HESZKY és MESCH (1976) alapvető munkáira utalunk. Ezek a szomatikus és haploid szövettenyésztési eredmények alapvetően hozzájárultak ahhoz, hogy ma – a világirodalmi adatokkal és eredményekkel együtt – differenciálatlan, szomatikus és haploid szövettenyészetekből fertilis növényeket tudunk előállítani. E nélkül a módszertani háttér nélkül nem lehetne napjainkban a búza genetikai transzformációjáról értekezni. A módszertani és újdonság jellegű publikációkat (1993–96) követően, hozzávetőlegesen 1996-tól jelentek meg azok a közlemények, amelyek a búza valamely fontos tulajdonságát módosítják transzgenikus módszerrel. Ettől az időszaktól egy új, nemesítési szempontból is fontos szakasz kezdődött el a búza genetikai transzformációjának történetében. Ezek az eredmények már molekuláris szinten adnak információt egy-egy beltartalmi sajátosságról vagy a biotikus és abiotikus körülményhez való jobb alkalmazkodást biztosító molekuláris nemesítési megoldáshoz. A búza genetikai transzformációja jelentős erőfeszítéseket kívánt a kutatóktól. A legegysze2
rűbb módszernek a pollentömlőbe történő DNSbevitel látszott (CHONG és mtsai, 1998), de ez az eljárás nem hozott maradandó eredményeket. Az első publikációk a közvetlen génbevitel kezdeti sikereiről szóltak (LÖRZ és mtsai, 1985). Idegen gének bejuttatására az egyszikűeknél hosszú ideig a protoplaszttechnika ígérkezett a leghatékonyabb eljárásnak. Az első búza transzformációs irodalmi adatok a polietilén-glikollal (PEG) közvetített génbevitelről számoltak be (VASIL és mtsai, 1991, MARSAN és mtsai, 1993). A közleményekből és saját tapasztalatainkból is kiderült, hogy a genetikai transzformációnak ez a módja rendkívül nehézkes és időigényes. A protoplasztok izolálásán és PEG-kezelésén túl az eljárást az is nehezíti, hogy a protoplaszt eredetű kalluszokból a fertilis növények felnevelhetősége csekély gyakoriságú, illetve genotípushoz kötött (PAUK és mtsai, 1994). Mindezek ellenére figyelmet érdemel, hogy MÓROCZ és mtsai (1990) kukoricával született eredménye bizonyította, hogy a genetikai transzformációnak a protoplaszttechnika is hatékony eszköze lehet (OMIRULLEH és mtsai, 1993; GOLOVKIN és mtsai, 1993). A közvetlen génbeviteli módszer protoplasztizolálást és polietilén-glikol- (PEG) kezelést igényelt. A PEG kitágította a búzaprotoplasztok pórusait, és a transzformáló oldatba adagolt DNS a sejthártya pórusain át bejutott a sejtekbe. A PEG kezelés megszüntetése után a mikropórusok bezáródtak, a sejtmembrán és a sejtfal is regenerálódott. A sejtekben maradt DNS az osztódások megfelelő szakaszában beépült a befogadó sejt genomjába. A módszer jelentős hátránya, hogy a növények regenerációjára alkalmas szuszpenzió kialakítását feltételezi. Sajnos a búzaszuszpenziók gyorsan elveszítik regenerálódási képességüket (DIMAIO és SHILLITO, 1989), vagy olyan jelentős genetikai változást szenvednek (KRAP, 1991), hogy gyakorlati célú felhasználhatóságuk jelentősen csökken. Szegedi csoportunk is csaknem tíz évet fordított a protoplaszt-növény rendszer kialakítására (PAUK és mtsai 1994). A növényregenerációra képes szuszpenzió kialakításával szerzett tapasztalatokat viszont később jól tudtuk használni a kiszélesztett szuszpenziós tenyészetek génbelövésére. Szövetek és sejtek elektroporációjával is jelentek meg biztató közlemények egyes gabonafajok felhasználásával (LAURSEN és mtsai, 1994; XU és LI, 1994), de búza esetében ez a módszer nem vált be. Sajnos ez az eljárás sem tudta a búzát a rutinmódszerrel transzformálható fajok szintjére emelni. Ismert egy olyan megoldás, ami a génbelövéshez hasonlóan hordozókkal (szilícium-karbid) juttatott be búzasejtekbe DNS-t (SERIK és mtsai, 1996; PETOLINO és mtsai, 2000), de kiterjedtebb alkalma-
zását az első pozitív eredmények óta nem találjuk. Az eddig említett módszerek elterjedését bizonyos mértékig akadályozta a génbelövéses módszer biztos elterjedése. Mint ismeretes, a közvetített génbevitel az egyszikű fajoknál hosszú évekig nem jöhetett számításba annak a feltételezésnek köszönhetően , hogy az Agrobacterium csak kétszikű növényeket képes fertőzni. HIEI és mtsai (1994) rizsben tett felfedezése óta azonban nagy változás állt be. Az első sikeres Agrobacterium-közvetített rizs transzformáns eredmények (HIEI és mtsai, 1994; TINGAY és mtsai, 1997) közlése óta búzával is egyre több sikeres publikáció jelent meg (CHENG és mtsai, 1997; KHANNA és DAGGARD, 2003). Mi is elkezdtük a módszer adaptálását és búzában az Agrobacterium-közvetített transzformáció nagyon hatékony eljárásnak látszik. Mindeddig azonban a SANFORD (1988) által szabadalmaztatott részecskebelövés elvén alapuló módszer bizonyult a leghatékonyabbnak búzában. A következőkben ismertetett eredmények túlnyomó többsége is ezzel a módszerrel született. A gének mesterséges bejuttatásában módszertani szempontból nagy jelentőségű volt a Cornell Egyetemen kifejlesztett részecskebelövő berendezés, népszerű nevén a génpuska. Ez a berendezés az emberiség több ezer éves „lövöldözési mániáját” egy genetikai lépés újszerű megoldására használta fel. Az első fertilisbúza-transzformációt ezzel a módszerrel hozták létre VASIL és mtsai (1992), valamint WEEKS és mtsai (1993). Két különböző eredetű (Streptomyces hygroscopicus – bar, Escherichia coli – uidA) mikrobiális gént jutattak be búzába, melyek jelenlétét és működését hitelesen bizonyították. Esetükben a tavaszi búza éretlen embrióinak génbelövésétől a transzgenikus növények virágzásáig mindössze 168 nap telt el, azaz kevesebb, mint fél év. A transzformációs eredményt NEHRA és mtsai (1994) és BECKER és mtsai (1994) is sikeresen megismételték, kisebb módszertani fejlesztéseket közölve. Valamennyi idézett eredményben közös vonás, hogy bar herbicidrezisztenciát kódoló gént jutatták be búzába. Ezt a gént – mint marker gént – növénytranszformációkban ma már széles körben használják különböző foszfinotricin (ppt) hatóanyagú szelekciós rendszerekben. Az 1. táblázatban öszszefoglaltuk a búzában eddig használt szelektálható markereket, a markerek funkcióját és a működtető promótereket. Több kutatócsoport is megerősítette a transzformációs eredmények alapján, hogy az agronómiai szempontból fontos herbicidrezisztenciabevitelnek nincs technikai akadálya búza esetében (VASIL és mtsai, 1992; NEHRA és mtsai, 1994; JORDAN és mtsai, 1995; ALTPETER és mtsai, 1996; QURESHI és mtsai, 1996; WITRZENS és mtsai, 1998). 3
Marker
Funkció
Promóter
Referencia
Bar
Bastarezisztencia
CaMV 35S
Vasil és mtsai
1992
Nehra és mtsai
1994
Becker és mtsai
1994
Weeks és mtsai
1993
Altpeter és mtsai
1996
Ubi 1
Witrzens és mtsai 1998
nptII
Geneticinrezisztencia
Pauk és mtsai
1998
Act 1
Qureshi és mtsai
1996
Act 1
Nehra és mtsai
1994
Witrzens és mtsai 1998 CP4
GOX
Glifozátrezisztencia
Glifozárezisztencia
Qureshi és mtsai
1995
Jordan és mtsai
1995
CaMV 35S
Zhou és mtsai
1995
Act 1
Qureshi és mtsai
1995
Act 1
hpt
Hygromycin rezisztencia
CaMV 35S
Hagio és mtsai
1995
pmi
Mannóz mint C-forrás
Ubi
Barcelo
1998
1. táblázat: A búzatranszformációban használt szelekciós markerek, funkciójuk, a működtető promóter és az irodalmi referenciák Saját búzatranszformációs kísérleteinkben elért eredményeinkről 1998-ban számoltunk be (PAUK és mtsai, 1998). Munkánk során bar gént jutattunk be búzába, és a hosszú szelekciós idő fontosságát bizonyítottuk. A gondos szelekció nagyobb rezisztenskallusz-hozamot eredményezett, és minden regenerált transzformáns növényben bizonyítottuk a foszfinotricin-acetil-transzferáz (PAT) enzim aktivitását. Az aldóz/aldehidreduktáz (ALR) detoxifikáló enzim génjének beépítése búzába a stressztűrés javítása végett 1. A reaktív aldehidek és glükotoxinok hatékony méregtelenítése A növénytermesztési technológiák fejlődése ellenére a termesztett növények szinte állandóan ki vannak téve különböző környezeti hatásoknak, streszszeknek, mint pl. szárazság, fagy, UV-B sugárzás stb., de a biotikus stresszek csoportját is említhetjük. Az ilyen kedvezőtlen hatások számos esetben a növények károsodásához és végeredményben a terméseredmények csökkenéséhez vezetnek, melyek
kivédésére különböző mechanizmusok alakultak ki a növényvilágban. Ezek tanulmányozása, a növénynemesítés segítségével lehetőséget nyújt olyan fajták létrehozására, melyek jobban ellenállnak a kedvezőtlen környezeti hatásoknak. A genomika és a molekuláris módszerek fejlődésével mód nyílt arra, hogy a stresszekkel szembeni toleranciában szerepet játszó gének hatását in vitro kísérletekben, majd üvegházban, kísérleti parcellákban megvizsgáljuk, a gének funkcióját tisztázzuk. Végső soron, pedig lehetőség nyílik arra, hogy az így megismert géneket konvencionális és modern módszerekkel a nemesítés szolgálatába állítsuk. Az utóbbi évtizedek kutatásai kimutatták, hogy a növényekben csaknem valamennyi stressz, legyen az biotikus (vírusos, baktériumos, gombás fertőzés), vagy abiotikus (szárazság, túl magas vagy túl alacsony hőmérséklet, só, UV-B-besugárzás) reaktív szabadgyökök keletkezéséhez vezet (PRICE és mtsai, 1989; MORAN és mtsai, 1994). A növényi védekezési folyamatok integráns része a szuperoxid-, hidroxi-, peroxid-, illetve hidroxilgyökök hatástalanítása. Azok az enzimek és anyagcsereutak, amelyek a sejtekben ártalmatlanítják a toxikus anyagcseretermékeket, alapot adhatnak az ellenállóság javítását célzó stratégiák kidolgo4
zásához. A stressz hatására képződő H2O2 hatástalanításában a kataláz és az aszkorbát-peroxidáz enzimeknek van kitüntetett szerepük. A reaktív szabadgyökök felhalmozódásának hatására bekövetkező makromolekuláris degradáció további káros anyagcseretermékek megjelenéséhez vezet. Ezek sejtkárosító hatása – hosszabb életidejüknek köszönhetően – sokszorosan meghaladhatják a szabadgyökök toxicitását. Detoxifikálásukban többek között az aldóz/aldehidreduktáz (ALR) enzimnek tulajdonítanak szerepet. Az aldózreduktáz és az aldehidreduktáz enzimek az aldo-keto-reduktáz szupercsalád tagjai. Az ebbe a csoportba tartozó enzimek monomer, NADPH-függő, széles szubsztrátspecifitású oxireduktázok (BOHREN és mtsai, 1989). Az állati sejtekben ezeknek a enzimeknek feltételezhetően ozmoregulátor funkciójuk isvan, mivel az ALR enzimek a poliol reakcióút első lépését katalizálják: a D-glükóznak szorbitollá való átalakulását. Ismert, hogy a szorbitol intracelluláris mennyiségének változása szerepet játszik a sejttérfogat és az ozmotikus egyensúly fenntartásában (MORIYAMA és mtsai, 1989; GARCIA-PEREZ és mtsai, 1989; FERRARIS, 1996). Bár még sok bizonytalanság tapasztalható az ALR enzimek fiziológiai funkciójával kapcsolatban, az újabb vizsgálatok az ozmoreguláció mellett kiemelik a fehérje detoxifikáló szerepét. Mivel a legtöbb szabadgyök rendkívül rövid élettartamú, károsító hatásukat keletkezésük helyén vagy annak közelében tudják kifejteni. A szabadgyökök membránlipidekkel való reakciója azonban lipid-hidroxiperoxidokat és lipid-peroxidokat eredményez, melyek degradációijasorán aldehidkomponensek képződhetnek. Ezek a lipidaldehidek képesek arra, hogy keletkezésük helyétől a sejt belsejében szétdiffundáljanak, így a szabadgyökök károsító hatását kiterjesszék. Az egyik leggyakrabban keletkező és legtoxikusabb lipid-aldehid a 4-hidroxinonenál (HNE). A HNE aldehidcsoportja képes fehérjék keresztkötésére, katalitikus, illetve strukturális sajátságaik megváltoztatására. Nanomoláris koncentrációban DNS-károsító, nagyobb (mikromoláris) koncentrációban pedig citotoxikus hatása van. Mivel a HNE aldehidcsoporttal rendelkezik, detoxifikálásának egy lehetséges útja az aldo-keto-reduktázok által katalizált redukciója. Ezt az utóbbi évek kisérleti eredményei is valószínűsítik (SPYCHER és mtsai, 1996). Az oxidatív stressz következményeként képződő reaktív aldehidek között a metilglioxál (MG) kiemelt jelentőségű, és a glioxaláz I. enzimet túltermelő dohánynövények fokozottan sótűrők (SINGLAPAREEK és mtsai, 2003). Tekintettel arra, hogy a lucerna aldóz/aldehidreduktáz, amelyet búzában
szándékozunk kifejeztetni, képes lebontani az MG-t, több kísérletben vizsgáltuk a különböző koncentrációban alkalmazott MG hatását búzanövényeken. Az egyik kezelési mód során kalászolás előtti állapotban MG-oldatot injektáltunk be a növények szárába. Tapasztalataink szerint a 27,5 mM-os MG-oldattal végzett ilyen kezelés után a növényeken nagymértékű szövetpusztulást lehetett megfigyelni, a szár elhalt, a kalász szára megdőlt, lehetetlenné vált a kalász további fejlődése (1. ábra). A 11 mM-os és az 5,5 mM-os oldat hatása még látható volt, a kisebb szövetelhalás azonban nem gátolta a növényt a fejlődésében. Az kisebb koncentrációjú hatóanyag rövid távon nem okozott látható elváltozást.
1. ábra: A bal oldali képen bemutatott növényen látszik, hogy a kalász alatti szárrész a kezelés hatására (27, 5 mM-os MG-oldatot juttatva a szárba) nagy felületen elhalt, a kalász szára eltörött. Jobb oldalon a kezeletlen kontrollnövény látható Másik megközelítésként a növényekre két héten keresztül, kétnaponta cseppentettük az MG oldatokat, majd a magfogás után értékeltük a kezelés következményeit. Szemmel is jól látható volt a metilglioxál kedvezőtlen hatása a kalászméretre. A 2a ábra egyértelműen bizonyítja, hogy a metiglioxál gátlóan hat a kezelt búzanövények mérhető, menynyiségi tulajdonságaira. Bár az átlagos szemtömegben nem találtunk eltérést (2b ábra), jelentős különbséget figyeltünk meg a kalászok össztömegében és a kalászonkénti szemszámban (2c és 2d. ábra). Az ábrák összehasonlítása alapján tehát megállapítható, hogy a metilglioxál hatása elsősorban a kalászonkénti szemszám csökkenésében nyilvánul meg és ezen keresztül csökkenti a kalász össztömegét.
5
2. ábra: Metilglioxál hatása CY-45 búzanövények kalászfejlődésére. Metilglioxál-koncentráció: 1-es: 0mM, 2-es : 5,5mM, 3-as : 11mM A növényi aldóz/aldehidreduktázoknak, a szupercsalád többi tagjához hasonlóan, rendkívül széles a szubsztrátspecifitásuk, így szerepük lehet a sejteket érő, különböző reaktív aldehidek és ketonok képződésével járó károsító hatások kivédésében és a sejtek ozmoregulációjában is. A növényi aldózreduktáz enzimek valódi fiziológiai szerepéről azonban meglehetősen keveset tudunk. Elsőként a rozsnok és az árpa aldózreduktáz enzimek vizsgálati eredményei váltak ismertté. A rozsnokgén esetében a gén kifejeződése és a sejtek fagytűrésének kialakulása között találtak kapcsolatot, az árpa aldózreduktáz homológ gén pedig szerepet játszhat az embrió kiszáradása során. Ezzel szemben a lucerna (Medicago sativa L.) aldózreduktáz fehérje (MsALR) a növény minden szövetében előfordul. Az MsALR gén terméke az egyszikűekben található aldehidreduktázoktól nem csak szövetspecifitásában, hanem szekvenciálisan és funkcionálisan is eltér. Ezt jelen munkánk előzményeként hazai kutatások is igazolták (OBERSCHALL és mtsai, 2000).
2. A molekuláris háttér és transzformáns növények felnevelése A lucernából izolált aldózreduktáz (MsALR) gént pAHC25 plazmidmolekulába építettük be a GUS gén helyére (MAI és ERTUGRUL munkája) az SzBK Növénybiológiai Intézetében. A konstrukcióban a szelekciót biztosító bar gént és a szárazságtűrés szempontjából fontos MsALR gént kukorica ubiquitin promóter működteti (3. ábra).
3. ábra: A pAHALR nevű plazmid, amelyben a célgént (MsALR) és a szelekciós markergént kukorica ubiqutin promóter működteti 6
A transzformációhoz szükséges búza donornövényeket (CY-45) üvegházban neveltük fel, és a kalászokat virágzás után 11–12 nappal gyűjtöttük be éretlen embriók izolálására. Az éretlen szemeket 2% Na-hipoklorit és 100 µl/l Tween csapvizes oldatával sterileztük rázógépen 20 percig, majd többszöri steril desztillált vizes öblítés következett. Az izolált éretlen embriókat D indukciós táptalajra 2 (PUNHAUSER és GYULAI, 1993) helyeztük. Az embriókból származó felszíni kallusztenyészetben nevelt fiatal szomatikus kalluszokat génbelövéssel transzformáltuk PAUK és mtsai (1998) módszere alapján. A vízben oldott plazmidmolekulákat aranyszemcsékre történt rögzítés után a 4. ábrán látható készülékkel a kalluszszövetekbe belőttük.
arra törekedtünk, hogy az ALR fehérjét kimutassuk kalluszainkban, és csak azokkal a transzformáns vonalakkal folytassuk kísérleteinket, melyek egyértelműen ALR+-nak bizonyultak. A 5. ábra bal oldalán látható CY-45 transzformálatlan kontrollmintával összehasonlítva, a 2–7. mintákban lényegesen több Medicago sativa eredetű ALR fehérjét detektálhattunk Western blot-módszerrel.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
5. ábra: Lucerna eredetű ALR fehérje búzakalluszszövetekben, amelyek foszfinotricinrezisztensek. 1. CY-45 kontrollminta, 2-7. ALR transzformáns jelölt minták
A kalluszokból és növényekből izolált fehérjeminták koncentrációit Bradford-reagenssel mértük, a fehérjemintákat (20 µg/minta) 10%-os denaturáló poliakrilamid gélen szétválasztottuk, transzferáltuk Immobilon-P PVDF membránra és az MsALR fehérjét tisztított poliklonális MsALR ellenanyaggal mutattuk ki, anti-nyúl-IgG másodlagos ellenanyagot használva. A néhány centiméter méretű regeneránsokat gyökereztetésre ½MS0 (MURASHIGE és SKOOG, 1962) hormonmentes táptalajra raktuk (4c ábra). A regenerálás során már nem alkalmaztunk szelekciót a táptalajban. A tenyésztőszobából a jól gyökeresedett növénykéket üvegházi (Hensler) növénynevelő kamrába ültettük ki, majd a regenerált növényeket akklimatizáltuk az új környezethez. A megfelelően bokrosodott és gyökeresedett növénykéket (4–5 hetes gyökereztetés után) 1:1 arányú tőzeg/homok közegbe ültettük ki. A következő két hétben a növénykéket egyenként PVC tasakkal takartuk és 80% relatív páratartalommal, alacsony hőmérsékleten (10–15 oC) akklimatizáltuk. Az évszaktól függően, 200 µmol m-2 s-1 fényintenzitású pótmeg4. ábra: A transzformáció eszköze és lépései: világítást alkalmaztunk, 16 óra fény és 8 óra sötét génbelövő berendezés (a), szelekció után túlfotoperiódussal mellett. A növényeket standard növő kalluszok (b), regeneráló kalluszok (c), üvegházi körülmények között neveltük fel. transzformáns növények üvegházi kiültetés előtt Munkánk első évében, az üvegházi kiültetés(d) és egy transzgenikus növény kalásza (e). kor a növénykék gyökeresedésével sok problémánk volt, így a gyökeresedési gondok miatt számos növényt elvesztettünk. A regeneráló és gyökereztető A transzformált tenyészeteket 20 mg/l PPT-t táptalajok módosításával elértük, hogy a növénykék tartalmazó D2 táptalajon szelektáltuk. A tenyésze- jelentős része meggyökerezett. A transzformáns és tek szelekcióját sötétben, 28 ºC-os bakteriológiai jelölt kalluszokból folyamatosan végeztük a regetermosztátban végeztük. A szelektív körülmények nerálást, majd a magfogást. között túlnövő kalluszokat (lásd 4b ábra) a tenyészIlyen transzformáns növényeket mutat a 6. tés 3–4. hetében friss táptalajra helyeztük, és ezt ábra, amelyekről sikerült magot fogni, és lehetővé négy-öt hetes ciklusokban megismételtük. Közben vált az utódok molekuláris és élettani jellemzése. 7
6. ábra: Transzgenikus búzanövények magfogás előtt az üvegházban 3. Az ALR búza transzformánsok metilglioxál(MG) toleranciája
8. ábra: A búza-csíranövények túlélési százaléka a 14 napos 5,5 mM MG-kezelést követően. A transzformáns (ALR) növénykék kisebb mértékben károsodtak a toxikus aldehidszármazék jelenlétében 4. Az ALR búza transzformánsok fotoszintetikus funkciója ozmotikus stressz során in vitro nevelt szövetekben
Az ALR gén egyik hatása az MG-ellenállóság fokozódása lehet, ezért csíráztatási teszteket végeztünk. Mint a 7. ábra mutatja, a transzgenikus búza szemei jobban csíráztak, mint az eredeti CY-45 genotípusé 5,5 mM MG jelenlétében. Hosszan tartó kezelés esetén a transzformált növények jobb túlélést mutattak (8. ábra).
A búza stressztoleranciájával kapcsolatos kutatások egyik távlati célja transzgenikus növények előállítása, ami technikailag összetett, sok lépésből álló feladat. Ennek során a kalluszokból steril táptalajon regenerált növénykék normál talajon üvegházi körülmények között történő felnevelése igen kis hatékonyságú és hosszadalmas folyamat. A transzformáció eredményessége a hagyományos eljárások alkalmazásával csak a növénynevelési folyamat legvégén ellenőrizhető, amikor már az üvegházban, illetve szabadföldön rendelkezésre álló növények szárazságtoleranciája tesztelhető. A transzformációval történő növénynemesítés műveleteinek jelentős lerövidítésére kidolgoztunk egy eljárást a Szegedi Biológiai Központ Növénybiológiai Intézet Molekuláris Stressz- és Fotobiológiai csoportja valamint a Szegedi Gabonatermesztési Kutató Kht. Búza Sejt- és Szövettenyésztési Labor részvételével, amelynek alkalmazásával a transzformánsok szárazságtoleranciája a folyamat korai fázisában tesztelhető. Ehhez a munkánk ko7. ábra: A 7. napon mért csírázási százalék rábbi szakaszában kidolgozott klorofill fluoreszaz 5,5 mM metilglioxálos kezelés esetén. A cencia képalkotási módszert használtuk fel. In transzgenikus (ALR) vonal kevésbé érzékeny az MG vitro nevelt, Petri-csészékben regenerációt mutató 5,5 mM gátlással szemben kalluszszövetekről fluoreszcencia-kamerával kétdimenziós változó klorofillfluoreszcencia-képeket Ezekből az előzetes adatokból arra lehet követ- készítettünk, amelyekből az Fv/Fm paraméter kikeztetni, hogy a lucerna aldóz/aldehidreduktáz enzi- számításával a fotoszintetikus hatékonyság megálmet szintetizáló búzanövények kevésbé érzékenyek lapítható. Az eljárás első lépéseként megmutattuk, a külsőleg alkalmazott MG-vel szemben. Így várható, hogy a vizsgált szövetek fotoszintetikusan aktívak, hogy ez a védettség érvényesül a stresszhatásokra in és az Fo, Fm, Fv/Fm fluoreszcenciaértékek jól detekvivo keletkező MG méregtelenítésével. tálhatók (9. ábra). A szárazságstressz modellezésé8
hez a táptalajra 2,5 ml 40% PEG-oldatot rétegeztünk steril fülke alatt, majd 4 napon keresztül követtük a fotoszintetikus aktivitás változását. Az Fv/Fm paraméter csökkenése jelzi a PEG által indukált ozmotikus stressz következtében bekövetkező fotoszintetikus aktivitás csökkenést (10. ábra). A módszer alkalmazásával lehetővé vált a PEG kezelés, azaz ozmotikus stressz által okozott különböző mértékű aktivitáscsökkenés mértékének kimutatása, ily módon pedig azon transzformások azonosítása, amelyeknek megnövekedett ozmotikusstressz-tűrésük van, ennek következtében a belőlük felnevelt növények üvegházi, illetve szabadföldi körülmények között szárazságstresszel szemben várhatóan ellenállóak (10. ábra). A módszer alkalmazásával 15 transzformánst teszteltünk, és azonosítottunk 3–4 fokozottan stressztoleráns vonalat.
10. ábra: Petri-csészében nevelt regenerációt mutató szövetek fotoszintetikus aktivitásának változása PEG-kezelés folyamán. A növénykék változó klorofillfluoreszcenciás képét a kezelés előtt, illetve a 2.5 ml 40% PEG-oldat adását követő 3., 5. és 7. napon mértük, és az Fv/Fm paramétert ábrázoltuk a kezelési idő függvényében. Az ábrán látható számok az egyes transzformáns tenyészetek azonosítói. A fluoreszcenciás kép az idősor utolsó napján készült. A fotoszintetikus aktivitás mértéke a kéktől a vörös szín felé növekszik.
9. ábra. Petri-csészében nevelt növényregenerációt mutató szövetek klorofill-fluoreszcencia leképezése. A három képen felülről lefelé az alap (Fo) a maximális (Fm) és változó (Fv/Fm) fluoreszcencia látható 5 regenerálódó kallusz esetén. A fotoszintetikus aktivitás mértéke a kéktől a vörös szín felé növekszik
A kidolgozott klorofill-fluoreszcencia módszer nagy kapacitású, így lehetővé teszi a nagyszámú transzformáns vonal egyedi jellemzését. A módszerrel jelenlegi manuális formájában napi 100–200 vonal tesztelhető, ami automatikus mintakezelés és képfeldolgozás esetén a napi 400–500 transzformáns vonal tesztelésére növelhető. A jövőbeni fejlesztés után, egy automatikus nagy teljesítményű stresszdiagnosztikai rendszer elemeként működhet.
9
5. Szárazság tűrés tesztelése az ALR transzformáns erősítik a dohány-transzformánsokkal kapott búzanövényeken korábbi megfigyeléseket (OBERSCHALL és mtsai, 2000), másrészt alapot nyújtanak azon törekvéseA regenerált transzformáns növényekről begyűjtött inkhez, hogy a klorofillfluoreszcencia-paraméterek szemek felhasználásával fölnevelt búzanövények képalkotással történő követésével nagyszámú nöszárazságtoleranciáját klorofill-fluoreszcenciás mé- vény jellemzésére alkalmas, új szelekciós rendszert réssel követtük, ami lehetővé tette a levelek foto- dolgozunk ki. szintetikus aktivitásának meghatározását a fényin- Szárazságstressz vizsgálata hőfényképezés tenzitás függvényében. A vízmegvonással előállított módszerével szárazságstressz megkezdése előtt a kontroll (nem traszformált) és transzformáns növények fotoszin- Egy komplex stresszdiagnosztikai rendszer kiépítétetikus aktivitása azonos volt (11. ábra). 15 napos sekor törekedni kell minél több fiziológiai paramévízmegvonás után a nem transzformált növények ter felvételezésére. Így a fotoszintézis jellemzői melmaximális aktivitása a kontrollérték kb. 20%-ára lett a levélhőmérsékleti adatok mérésére szintén csökkent. A vizsgált ALR transzformáns (4310b) ese- diagnosztizált képalkotást kívánunk felhasználni. A tén azonban az eredeti aktivás kb. 50%-a még a 15 növények stressztoleranciáját, különös tekintettel a napos vízmegvonás után is megmaradt (11. ábra). szárazságstresszre, nagymértékben meghatározza a légzőnyílásokon keresztül történő párologtatás hatékonysága. Mivel a párolgás hőelvonást eredményez, a levélhőmérséklet változásai érzékeny indikátorként használhatók a párolgás hatékonyságának meghatározására. A jelenség kvantitatív jellemzésére egy nagy érzékenységű termokamerát használtunk, ami képes a búzanövények felületi hőmérsékletének kétdimenziós leképezésére 0,03 °C pontossággal.
11. ábra: Vízmegvonás hatása a fotoszintetikus aktivitásra. A transzformálatlan (kontroll) és ALR transzformáns (4310-b) növények fotoszintetikus aktivitását klorofill-fluoreszcenciás módszerrel mértük optimális öntözés (A panel) és 15 napos vízmegvonás után (B panel). Mind a transzformálatlan, mind a transzformáns csoport 10–10 növényt tartalmazott, amelyeken a fotoszintetikus aktivitás mérése egy-egy levélen történt. Az ábrán látható értékek a 10-es növénycsoportokra kapott átlagokat (illetve a hozzájuk tartozó szórásokat) jelentik Az itt példaként bemutatott fotoszintetikus adatok mint előzetes eredmények meg-
12. ábra: Szárazságstressz hatása búzanövények hőmérsékletére. A hőfényképek 10–90%-os relatív víztartalmú perlit-homok talajhoz adaptált Öthalom növényeken készültek Infratec Varioscan 3021 ST H, 8–12 µm termokamera segítségével. A feltüntetett dT értékek mutatják a növények és környezetük között fennálló hőmérsékletkülönbséget 10
A kamera felvételeinek értékeléséhez kifejlesztettünk egy szoftvert, ami lehetővé teszi a növényhez tartozó képpontok elválasztását a háttértől. Továbbá, a növényfelület hőmérsékletének képpontonkénti meghatározását, illetve a növény átlagos hőmérsékletének, illetve ezen érték környezettől való eltérésének meghatározását. A módszer alkalmazásával vizsgáltuk a vízmegvonás hatását a búzanövények hőmérsékletére. A kísérlet során 10–90%-os relatív nedvességtartalmú talajhoz adaptált növényeken mértük az átlagos levélhőmérsékletnek a környezet hőmérsékletétől mért eltérését. Mint a 12. ábrán látható, a levélhőmérséklet minden esetben kisebb, mint a környezet hőmérséklete, ami a levélfelületen történő párolgás következménye. Ez az érték az optimálisan öntözött, 90%-os nedvességtartalmú talaj esetén kb. 1,8 °C volt. A talaj nedvességtartalmának csökkenésével azonban a levelek és a környezet hőmérsékletének különbsége egyre kisebbé válik, és 30%-os nedvességtartalom alatt már csak kb. 1 °C-os hőmérsékletkülönbség volt észlelhető, a sztómák fokozott záródását mutatja. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a termokamerával történő levélhőmérséklet-mérés érzékeny módszert ad a búzanövényeket érő szárazságstressz következményeinek kimutatására. A módszer alkalmazásával várhatóan lehetővé válik a különböző mértékben szárazságtoleráns búzafajták, illetve transzformáns vonalak sztómafunkciójának vizsgálatára. Felhasznált és ajánlott irodalom ALPETER, F., VASIL, V., SRIRASTAVA, V., STÖGER, E., VASIL, I. K. (1996): Accelerated production of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) plants. Plant Cell Rep., 16: 12–17. BARCELO, P., RASCO-GAUNT, S., SPARKS, C., CANNEL, M., SALGUEIRO, S., ROOKE, L., HE, G.Y., LAMACCHIA, C., DE LA VINA, G., SHEWRY, P.R., LAZZERI, P.A., (1998): Transformation of wheat. State of the technology and examples of application. In SLINKARD A. E. (ed.): Proceedings of the 9th International Wheat Genetics Symposium, Keyvote Addresses and Oral Presetations, University of Saskatchewan: University Extension Press 43–57. BECKER, D., BRETTSCHNEIDER, R., LÖRZ, H. (1994): Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scutellar tissue. The Plant Journal, 5: 299–307.
reductases. Site directed mutagenesis of a critical lynine J. Biol. Chem, 266: 24031–24037 CHENG, M., FRY, J. E., PANG, S., ZHOU, H., HIRONAKA, C. M., DUNCAN, D. R., CONNER, T. W., WAN, Y. (1997): Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Physiol., 115: 971–980. CHONG, K., BAO, S., XU, T., TAN, K., LIANG, T., ZENG, J., HUANG, H., XU, J., XU, Z. (1998): Functional analysis of the ver gene using antisense transgenic wheat. Physiol. Plantarum, 102: 87–92. DIMAIO, J. J., SHILLITO, R. D. (1989): Cryopreservation technology for plant cell cultures. Journal of Tissue Culture Methods, 12: 163–169. DUDITS, D., HESZKY, L. (2000): Növényi biotechnológia és géntechnológia. Agroinform Kiadó, Budapest, pp. 1-312. DUDITS, D., NÉMETH, G., HAJDU, Z. (1975): Study iof callus growth and organ formation in wheat (Triticum aestivum L.) tissue cultures. Can. J. Bot., 53: 957–963. FERRARIS, J.D.-WILLIAMS, C.K.-JUNG, K.Y.-BEDFORD, J.J. (1996):ORE, a eukaryotic minimal essential osmotic response element. The aldose reductase gene in hyperosmotic stress. Biol. Cheem. 271. 31.18318-18321. GARCIA-PEREZ, A., MARTIN, B., MURPHY, R., UCHIDA, S., MURER, H., COWLEY, B. D. JR., HADLER, J. S., BURG, M. B. (1989): Molecular cloning of cDNA coding for kidneyaldose reductase. Regulation of specific mRNA accumulation by NaCl-mediated osmotic stress. J.Biol.Chem., 264 (28): 16815–16821. GOLOVKIN, M. V., ÁBRAHÁM, M., MÓROCZ, S., BOTTKA, S., FEHÉR, A., DUDITS, D. (1993): Production of transgenic maize plants by direct DNA uptake into embryogenic protoplast. Plant Sci. Limerick, 90: 41–52. HAGIO, T., HIRABAYASHI, T., MACHII, H., TOMOTSUNE, H. (1995): Production of fertile transgenis barley (Hordeum vulgare L.) plant using hygromycin resistance marker. Plant Cell Rep., 14: 329–334. HESZKY, L., MESCH, J. (1976): Anther culture investigation in cereal gene bank collection. Z. Pflanzenzüchtung, 77: 187– 197. HIEI, Y., OHTA, S., KOMORI, T., KUMASHIRO, T. (1994): Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J., 6: 271–282.
BOHREN, K. M., BULLOCK, B., WERMUTH, B., GABBAY, K. M. (1989): The aldo-keto reductase superfamily. cDNAs and deduced amino acid sequences of human aldehyde and aldose reductase. J.Biol. Chem., 246: 9547–9551.
JORDAN, M. C., QURESHI, J. A., CHIBBAR, R. N., KARTHA, K. K., RODRIGUE, D., FROMM, M. E., (1995): Genetic engeneering of wheat for glyphosate tolerance. Abstracts Conference on ValueAdded Cereals Through Biotechnology, Plant Biotechnology Institute, National Research Council of Canada, Saskatoon, SK, Canada, pp.1–95.
BOHREN, K. M., PAGE, J. L., SHANKAR, R., HENRY, S. P., GABBAY K. H. (1991): Expression of human aldose and aldehyde
KHANNA, H. K., DAGGARD, G. E. (2003): Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of wheat using
11
a superbinary vector and a polyamine-supplemented regeneration medium. Plant Cell Rep., 21: 429–436. KLÖTI, A., IGLESIAS, V.A., WUNN, J., BURKHARDT, P. K., DATTA, S. K. POTRYKUS, I. (1993): Gene transfer by electroporation into intact scutellum cells of wheat embryos. Plant Cell Rep., 12. 671–675. KRAP, A. (1991): In: Oxford Surveys Plant Molecular and Cell Bilology. vol 7 Oxford University Press, Oxford, pp. 1–58. LAURSEN, C. N., KRZYZEK, R. A., FLICK, C. E., ANDERSON, P. C., SPENCER, T. M. (1994): Production of fertile transgenic maize by electroporation of suspension culture cells. Plant Mol. Biol., 24: 55–61. LÖRZ, H., BAKER, B., SCHELL, J. (1985): Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Genet., 199: 178–182. MARSAN, P. A., LUPOTTO, E., LOCATELLI, F., QIAO,Y. M., CATTANEO, M. (1993): Analysis of stable events of transformation in wheat via PEG-mediated DNA uptake into protoplasts. Plant Science, 93: 85–94. MORAN, J. F., BECANA, M., ITURBE-ORMAETXE, I., FRECHILLA, S., KLUCAS, R. V., APARICIO-TEJO, P. (1994): Drought induces oxidative stress in pea plants. Planta 194: 346–352. MORIYAMA, T., GARCIA PEREZ, A. M., BURG, M. B. (1989): Osmotic regulation of aldose reductase protein syntesis in renal medullary cells. J.Biol.Chem. 264 (28): 16810–16814. MÓROCZ, S., DONN, G., NÉMETH, J., DUDITS, D. (1990): An improved system to obtain fertile regenerants via maize protoplasts isolated from a highly embryogenic suspension culture. Theor. Appl. Genet., 80: 721–726. MURASHIGE, T., SKOOG, F. (1962): A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: 473–497. NEHRA, N. S., CHIBAR, R. N., LEUNG, N., CASWELL, K., MAILARD, L., STEINHAUSER, L., BAGA, M., KARTHA, K. K. (1994): Self-fertile transgenic wheat plants regenerated from isolated scutellar tissue following microprojectile bombardment with distinct gene constructs. Plant J., 5: 285–297. OBERSCHALL, A., DEÁK, M., TÖRÖK, K., SASS, L., VASS, I., KOVÁCS, I., FEHÉR, A., DUDITS, D., HORVÁTH, G. V. (2000): A novel aldose/aldehyde reductase protects transgenic plants agains lipid peroxidation under chemical and drought stresses The Plant Journal 24 (4): 437–446. OMIRULLEH, S., ÁBRAHÁM, M., GOLOVKIN, M., STEFANOV, I., KARABAEV, M. K., MUSTARDY, L., MÓROCZ, S., DUDITS, D. (1993): Activity of the chimeric promoter with the doubled CaMV35S enhancer element in protoplast-derived cells and transgenic plants in maize. Plant Mol. Biol., 21: 415–428. QURESHI, J. A., HUCL, P., KARTHA, K. K. (1992): Is somaclonal variation a reliable tool for spring wheat improvement?
Euphytica, 60: 221–228. QURESHI, J. A., BASRI, Z., BURTON, R. A., SINGH, R. R., KOLLMORGEN, J. E., FINCHER, G., (1996): Production of fertile transgenic wheat using two different gene expression vectors. Cereals ’96. North Melbourne, Australia: Royal Australian Chemical Instiute, 422–424. PAUK J., HÄNSCH R., SCHWARZ, G., NERLICH, A., MONOSTORI, T., MÉSZÁROS, A., JENES, B., KERTÉSZ, Z., MATUZ, J., SCHULZE, J., MENDEL, R. R. (1998): Transzgenikus búza (Triticum aestivum L.) előállítása Magyarországon. Növénytermelés, 47: 241–251. PAUK, J., KERTÉSZ, Z., JENES, B., PURNHAUSER, L., MANNINEN, O., PULLI, S., DUDITS, D. (1994): Fertile wheat (Triticum aestivum L.) regenerants from protoplasts of embryogenic suspension culture. Plant Cell Tissue & Organ Culture, 38: 1–10. PETOLINO, J. F., THOMPSON, S. A. (1987): Genetic analysis of anther culture response in maize. Theor. Appl. Genet., 74: 157– 159. PETOLINO, J .F., HOPKINS, N. L., KOSEGI, B. D., SKOKUT, M. (2000): Whiesker-mediated transformation of embryogenic callus of maize. Plant Cell Rep., 19: 781–786. PRICE, A. M., ATHERTON, N. M., HENDRY, G. A. (1989): Plants under drought-stress generate activated oxygen. Free Rad. Res. Commun., 8: 61–66. PURNHAUSER, L. GYULAI, G. (1993): Effect of copper on shoot and root regeneration in wheat, triticale, rape and tobacco tissue cultures. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 35: 131– 139. SANFORD, J. C. (1988): The biolistic process - a new concept in gene transfer and biological delivery. Trends Biotechnol., 6: 229–302. SEARS, R. G., DECKARD, L. E. (1982): Tissue culture variability in wheat: Callus induction and plant regeneration. Crop Sci., 22: 546–550. SERIK, O., AINUR, I., MURAT, K., TETSUO, M., MASAKI, I. (1996): Silicon carbide fiber-mediated DNA delivery into cells of wheat (Triticum aestivum L.) mature embryos. Plant Cell Rep., 16: 133–136. SPYCHER, S., TABATABA-VAKILI, S., O’DONNEL, V. B., PALOMBA, L., AZZI, A. (1996): 4-Hydroxy-2,3-trans-nonenal induces transcription and expression of aldose reductase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 226: 512–516. TINGAY, S., MCELROY, D., KALLA, R., FIEG, S., WANG, M., THORNTON, S., BRETTELL, R. (1997): Agrobacterium tumefaciens–mediated barley transformation. Plant J., 11: 1369–1376. VASIL V., BROWN S.M., RE D., FROMM M.E., VASIL I.K. (1991): Stabily transformed callus lines from microprojectile bombardment of cell suspension cultures of wheat. Bio/ Technology, 9: 743-747.
12
VASIL, V., CASTILLO, A., FROMM, M., VASIL, I. (1992): Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microproprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. Bio/Technology, 10: 667–674. WEEKS, J. T., ANDERSON, O. D., BLECHL, A. E. (1993): Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum). Plant Physiol., 102: 1077–1084. WITRZENS, B., BRETTEL, R. I .S., MURRAY, F. R., MCELROY, D., LI, Z., DENNIS, E.S., (1998): Comparison of three selectable marker genes for transformation of wheat by microprojectile bombardment. Aust J Plant Physiol., 25: 39–44.
XU, Y., LI, B. (1994): Fertile transgenic indica rice plants obtained by electroporation of seed embryo cells. Plant Cell Rep., 13: 237–242. ZHOU, H., ARROWSMITH, J. W., FROMM, M. E., HIRONAKA, C. M., TAYLOR, M. L., RODRIGUEZ, D., PAJEAU, M. E., BROWN, S. M., SANTINO, C.G., FRY, J.E. (1995): Glyphosate-tolerant CP4 and GOX genes as selectable marker in wheat transformation. Plant Cell Rep., 15: 159–163.
13
