Het opzetten en optimaliseren van western blot voor verschillende typen collageen

Het opzetten en optimaliseren van western blot voor verschillende typen collageen BMTE07.14 Afstudeerstage Rick van Wezel Juni 2007

Supervisor: Stagedocente: Opleiding: Differentiatie: Stagebedrijf: Faculteit: Afdeling: Periode: School:

Ing. W.L. van de Loo Dr. A. mol Mw. C.A.M Huijbregts ROC Eindhoven MLO Microbiologie niveau 4 TU/Eindhoven Biomedische technologie Soft tissue engineering Februari t/m Juni 2007 ROC Eindhoven LMP

Samenvatting In dit verslag zal worden besproken hoe het western blotten voor verschillende typen collageen is opgezet. Deze techniek is opgezet om het type collageen in getissueengineerde hartkleppen te kunnen bepalen. Het hart is één van de belangrijkste organen in het menselijk lichaam. Het bloed dat rondgepompt wordt door het hart mag maar één kant op stromen. Dit is de functie van de hartkleppen. Als een klep niet goed afsluit is deze te vervangen. Aan de Technische Universiteit Eindhoven is men bezig de mogelijkheden te onderzoeken van getissue-engineerde hartkleppen. Weefsels halen de flexibiliteit en kracht uit het eiwit collageen. Zo ook hartkleppen. Deze weefsels zijn constant in beweging en dienen dus erg flexibel te zijn. Het eiwit collageen is onderverdeeld in verschillende typen met elk een eigen functie en plaats in het lichaam. Het type collageen in de getissue-engineerde hartkleppen is niet eerder vastgesteld. Het is tot nu toe nog onduidelijk welk type in de hartkleppen gevormd wordt en of dit het juiste type is. Ook moet uiteindelijk de verhouding tussen de verschillende typen collageen bepaald worden. Men wil met een getissue-engineerde klep zo veel mogelijk gelijkenis bereiken met de natuurlijke kleppen. Natuurlijke hartkleppen bevatten voornamelijk collageen type I en III. Daarom is voor het opzetten van western blotten gekozen voor het gebruik van positieve controles in deze collageen typen. Het doel van het onderzoek is dan ook het opzetten van western blot voor verschillende typen collageen. De methode bestaat uit 2 delen, het runnen van eiwitten in een SDS-page gel, en het blotten en zichtbaar maken van de eiwit bandjes. Dit laatste gebeurt door middel van antilichamen en chemolumonicentie. Bij het optimaliseren van de methode is gekeken naar dingen als gel percentage, blot voltage, run voltage en eiwit concentratie. Tijdens het optimaliseren hebben erg veel problemen zich voorgedaan waaronder het blotten zelf, een slecht werkend antilichaam, problemen met het monster en met de apparatuur. Ook is het gel percentage aangepast. Voor het slecht werkend antilichaam is een vervanger gevonden en het blotten is geoptimaliseerd door de blotbuffer aan te passen.

Door deze problemen en tegenslagen is het onderzoek beperkt gebleven tot collageen type I. In dit verslag zal verder beschreven worden hoe voor deze problemen een oplossing is gezocht en in veel gevallen is gevonden. Verder zijn in dit verslag de werkwijzen en de tot zover geoptimaliseerde methode te vinden. Een aantal punten staan ter discussie. Dit is onder andere het gel percentage, wat moeilijk vast te stellen is. Ook de blot temperatuur, blotbuffer en de uitdoving van de chemoluminicentie zijn niet 100% te controleren. Uiteindelijk is het gelukt om collageen type I humaan zichtbaar te krijgen op een blot. Een begin van het protocol “western blot voor collageen type I humaan” is vastgesteld. De verdunningen van zowel de eiwitten als de antilichamen zijn nog niet bepaald. Verder is het apparaat waarmee de foto’s zijn gemaakt, Versa Doc (Bio-Rad), nog niet geoptimaliseerd.

Voorwoord Dit stageverslag is geschreven aan de hand van het stageonderzoek wat ik heb uitgevoerd aan de Technische Universiteit van Eindhoven. Het gaat hierbij om de laatste stageperiode in het vierde leerjaar van het ROC in Eindhoven. Bij deze stageperiode heb ik een stageopdracht mee gekregen en deze uitgevoerd in het cellab dat zich bevindt in gebouw “Whoog” op het terrein van de Technische Universiteit Eindhoven . Ik zou graag de volgende mensen willen bedanken voor de samenwerking, uitleg en ondersteuning: Ing. Anita van de Loo, die mij gedurende mijn stage periode intensief heeft begeleid. Dr. Anita Mol, voor de mogelijkheden die ik heb gekregen op het laboratorium van de TU Eindhoven. Ook wil ik Dr. Moniek de Liefde bedanken die telkens nieuwe ideeën bracht als het onderzoek vast dreigde te lopen. Verder wil ik iedereen bedanken waarmee ik heb samengewerkt.

Afkortingen α µl kD M ml mg

= alpha = microliter = kilo dalton = mol = milliliter = milligram

V = volt mA = milliampère RPM = rotations per minute SDS-page SDS = sodium dodecyl sulfate Page = poly acrylamide gel electroforese BCA HYP APS HRP PVDF ECM

= Bicinchoninic acid assay = Hydroxyproline = Ammonium persulfaat = Horse radish peroxidase = Polyvinylidene fluoride = Extracellulaire matrix

Inhoudsopgave 1. Inleiding........................................................................................................ 1 2. Achtergrond informatie ................................................................................ 2 • 2.1 Het menselijk hart ...................................................................... 2 • 2.2 Hartkleppen................................................................................ 3 • 2.3 Tissue engineering ..................................................................... 5 • 2.4 Collageen ................................................................................... 6 3. Onderzoek en methoden ............................................................................... 7 • 3.1 Onderzoek .................................................................................. 7 • 3.2 BCA assay.................................................................................. 7 • 3.3 Hydroxyproline assay (HYP-assay)........................................... 7 • 3.4 Gel elektroforese ........................................................................ 8 • 3.5 Western blotting......................................................................... 8 • 3.6 Kleurings methoden ................................................................. 11 4. Resultaten ................................................................................................... 12 • 4.1 Eiwit concentratie .................................................................... 12 • 4.2 Gel percentage ......................................................................... 12 • 4.3 Running.................................................................................... 12 • 4.4 Antilichamen en dot blot.......................................................... 12 • 4.5 Membraan en gel kleuring ....................................................... 13 • 4.5.1 Monster behandeling ..................................................... 13 • 4.5.2 Blotten............................................................................ 13 • 4.5.3 SDS / methanol toevoeging ........................................... 13 5. Discussie..................................................................................................... 14 6. Conclusie en aanbevelingen ....................................................................... 15 7. Literatuurlijst .............................................................................................. 16 8. Bijlagen....................................................................................................... 17 • I Gelelektroforese...................................................................... 17 • II Gel percentage schema ........................................................... 19 • III Western blot protocol ............................................................. 20 • IV BCA protocol.......................................................................... 23 • V HYP protocol .......................................................................... 24 • VI BCA resultaat.......................................................................... 27 • VII HYP resultaat.......................................................................... 28 • VIII Antilichamen, controles en markers ....................................... 29 • IX Ponceau kleuring .................................................................... 30 • X Zymo kleuring ........................................................................ 31 • XI Indeling collageen volgens Bornstein en Traub ..................... 32 • XII Dot blot ................................................................................... 33

1.

Inleiding

Bij de Technische Universiteit Eindhoven worden erg veel onderzoeken gedaan. In gebouw Whoog op de 4e verdieping, waar ik mijn stage heb gelopen, is men bezig met tissue engineering. Het maken van hartkleppen en bloedvaten, wat hier plaatsvindt, is een belangrijk onderzoek waar veel mensen zich mee bezig houden. De hartkleppen die momenteel gebruikt worden voor transplantatie zijn afkomstig van donoren of vervaardigd uit kunststof. Een probleem wat de kunststof hartkleppen met zich mee brengen is dat deze niet mee groeien. Bij baby’s en kinderen moeten deze vaak vervangen worden. Elke ingreep aan het hart kent grote risico’s en geeft een grote hoeveelheid littekenweefsel. Donoren zijn, zoals bij alle organen het geval is, heel erg schaars. Enkele jaren onderzoek naar hartkleppen en het maken ervan zitten er al op. De kleppen die men nu maakt komen al aardig in de buurt van natuurlijke kleppen. Het belangrijkste is dat ze sterk en duurzaam zijn. Een van de eiwitten die een hartklep in deze eigenschappen kan voorzien is collageen. Van collageen zijn verschillende typen bekend. Elk type met een andere eigenschap en plaats in het lichaam. Men heeft onderzocht dat in een hartklep en bloedvaten voornamelijk collageen type I en type III voor moet komen. De volgende stap is natuurlijk het bepalen welke typen collageen voorkomen in de getissue-engineerde hartkleppen. Ook is het van belang om te bepalen wat de verhouding is tussen de verschillende typen. Om dit onderzoek te kunnen uitvoeren zal gebruik gemaakt worden van western blotting. Deze techniek is nieuw in dit laboratorium en dient geoptimaliseerd te worden. Het uit te voeren onderzoek is dan ook: Het optimaliseren van western blotting voor collageen type I en III. Hiervoor zal in de verschillende parameters gevarieerd worden tot een optimum is bereikt. Wanneer het optimaliseren is afgerond kan het collageen in het weefsel bepaald worden.

1

2. Achtergrond informatie 2.1

Het menselijk hart

Het hart is één van de belangrijkste organen van het menselijk lichaam. In het lichaam bevindt het hart zich meer links dan rechts van het midden in de borstkas. Het hart zorgt van daaruit dat zuurstofarm bloed naar de longen gepompt wordt om het te voorzien van zuurstof en het zuurstof rijke bloed naar de cellen in het lichaam. Afbeelding 1 laat zien dat hoe het hart is opgebouwd en de stroomrichting van het bloed.

Afbeelding 1 1. rechter boezem, 2. linker boezem, 3. bovenste holle ader, 4. aorta, 5. longslagader, 6. longader, 7. mitralisklep, 8. aortaklep, 9. linker kamer, 10.rechter kamer, 11. onderste holle ader, 12. tricuspidaalklep, 13. pulmonalisklep[1]

Het hart bestaat een besturingsdeel (sinusknoop) en een pompdeel (hartspier). De hartwand is opgebouwd uit vier lagen het endocard, het myocard (de spierlaag van het hart), epicard en als buitenste laag het pericard (hartzakje). [1]

2

2.2

Hartkleppen

Om het bloed slechts in één richting te laten stromen zitten er in het hart speciale kleppen. De kleppen in het hart bestaan uit materiaal van het endocard. In het hart zijn 4 verschillende kleppen aanwezig. Deze zijn te verdelen in de inlatende kleppen en de uitlatende kleppen. Onder de inlatende kleppen behoren de tricuspidalisklep en de mitralisklep. De tricuspidalisklep bevindt zich tussen de rechterboezem en de rechter kamer. De mitralisklep bevindt zich tussen de linkerboezem en de linkerkamer. De uitlatende kleppen zijn de pulmonalisklep en de aortaklep. De pulmonalisklep bevindt zich tussen de rechterkamer en de longslagader. De aortaklep die tussen bevindt zich tussen de linker kamer en de aorta. Zonder deze kleppen zou het hart zijn pompfunctie verliezen. Daardoor is ook goed voor te stellen dat wanneer een of meerdere kleppen niet goed functioneert er hartfalen zal ontstaan. Aandoeningen aan hartkleppen zijn onder te verdelen in drie typen. Dit zijn: Hartinsufficiëntie, waarbij de kleppen lekken. Stenose, in dit geval zijn de hartkleppen vernauwd en gaan niet goed open. Atresie, de hartklep ontbreekt, dit is een aangeboren afwijking. Atresie wil in principe zeggen dat er een natuurlijke opening ontbreekt. [2] Tegen deze aandoeningen zijn een aantal opties mogelijk. Er kan bijvoorbeeld een donorklep of een kunst klep (afbeelding 2) worden geïmplanteerd. De belangrijkst knelpunten van deze oplossingen zijn dat er te weinig donoren beschikbaar zijn. Als wel een donor beschikbaar is kan deze beter benut worden door het hele hart te transplanteren. Het komt niet vaak voor dat alleen een klep als donor beschikbaar is. Kunstkleppen zijn een uitkomst omdat men dan niet met een tekort aan donoren te maken heeft. Een kunstklep gaat tevens een heel leven mee maar zal niet met het lichaam meegroeien. Bij oudere mensen is dat geen probleem maar bij jonge mensen (vooral kinderen en baby’s) levert dit problemen op. Een klep zal dan na enige tijd vervangen moeten worden door een grotere klep. Een ander nadeel wat kunstkleppen met zich meebrengen is dat ze geluid maken wat buiten het lichaam te horen is. Door dit constante geluid bij iedere hartslag kan de persoon in kwestie psychische problemen krijgen. Het derde probleem wat kunstkleppen met zich mee brengen is dat aan het kunststof oppervlak sneller ophopingen vormen. De patiënt zal na de ingreep zijn hele leven antistollingsmiddel moeten blijven slikken om trombose te voorkomen. Een andere mogelijkheid is het inbrengen van een dierlijke hartklep. Deze kleppen zullen ook lang blijven functioneren maar worden vaak niet door het lichaam geaccepteerd. Doordat er een immuunrespons optreedt, is een dierlijke klep niet zonder gevaar en zeker niet de beste oplossing. Gezien het inbrengen van een hartklep erg veel risico’s met zich mee brengt is dat erg gevaarlijk. Voor het inbrengen van een hartklep is een openhartoperatie nodig. [2] [6]

3

Op zichzelf is een soortgelijke ingreep al erg gevaarlijk en daar komt bij dat het pericard (de zak die om het hart heen zit) geopend moet worden en niet kan worden hersteld. Het hart ligt daardoor niet meer “los” in de borstkas maar kan vastgroeien aan het borstbeen. Een tweede operatie is daardoor veel moeilijker en nog risicovoller dan de eerste.

Afbeelding 2 kunstkleppen[10][11]

Om al deze knelpunten met hartkleppen te verhelpen zal een klep ontwikkeld moeten worden die een heel leven mee gaat, geen geluid maakt, door het lichaam wordt opgenomen en mee kan groeien. Hier is men onderzoek naar aan het doen aan de TU Eindhoven. Bij dit onderzoek komt erg veel kijken omdat cellen zich in vitro mogelijk anders zullen gedragen dan in vivo. Niet alle processen die hier invloed op hebben in het lichaam zijn bekend. Een van de voornaamste belangen is dat de kleppen sterk genoeg zijn. De cellen worden gestimuleerd in een bioreactor en gaan groeien. Hierdoor gaan de cellen zichzelf ook verder verstevigen door extracellulaire matrix (ECM) aan te maken. Deze ECM bevat onder andere collageen Dit hele proces heet tissue engineering. De kleppen zullen in de toekomst (waarschijnlijk) niet geïmplanteerd worden bij volwassenen. Deze kunnen leven met de kunststof kleppen, donorkleppen en dierlijke kleppen. Een klep die meegroeit en opgenomen wordt door het lichaam is vooral geschikt voor jonge kinderen en baby’s. [2] [6] [14]

4

2.3 Tissue Engineering Tissue Engineering of cel- en weefselkweek technologie is een doorbraak in de wetenschap die verschillende wetenschappen met elkaar in verbinding stelt. Dit zijn onder andere moleculaire biologie, chemie en medische technologie. Het doel van tissue engineering is uiteindelijk het verkrijgen van (bio)implantaten die uitgevallen, slecht werkende of beschadigde organen moeten gaan vervangen of ondersteunen. Daarnaast wordt het mogelijk weefsels te implanteren waarvan de cellen genetisch zodanig aangepast zijn dat ze kunnen dienen voor de geregelde afgifte van stoffen (bijvoorbeeld insuline) die het lichaam van een patiënt niet (meer) maakt, voor bijvoorbeeld diabetes. Bij de Technische Universiteit Eindhoven onderzoekt men de mogelijkheden met geheel getissue-engineerde hartkleppen. Onder: een afbeelding die het principe van tissue engineering van hartkleppen duidelijk maakt. Geschikte cellen uit het lichaam worden opgekweekt en opgebracht op scaffold waarop de cellen zich ontwikkelen tot een volwaardige hartklep.[3][14]

3

I solation of cells from blood vessel

2 1

Afbeelding 3: tissue engineering van een hartklep.[14]

5

2.4 Collageen Het lichaam van mens en dier haalt voornamelijk de stevigheid, bescherming en vormgeving van de organen uit het bindweefsel. De bindweefsels beschermen dus de organen, bloedvaten en de zenuwen. Ze bestaan zelf uit weinig cellen in verhouding met andere weefsels. Tussen deze cellen bevinden zich niet-levende draadachtige vezels die voornamelijk uit collageen bestaan. Het woord collageen komt van het Griekse woord κολλαω wat letterlijk “samenbinden” betekend. Dit maakt ook al wat bekend over de functie van het eiwit. Collageen kan verschillende functies hebben. Het kan bijvoorbeeld werken om weefsel elastisch, sterk of juist erg trekvast te maken. Welke eigenschap het collageen aan het weefsel toevoegt is sterk afhankelijk van de plaats in het lichaam. In bijvoorbeeld pezen komt een andere variant van collageen voor dan in huid. Daarom is collageen onderverdeeld in verschillende typen. Voor zo ver bekend zijn er 28 verschillende typen collageen. (De typen zijn bepaald door Bornstein en Traub). In het menselijk lichaam bevindt zich voornamelijk type I. Het belangrijkste voorkomen van de meest voorkomende typen in het menselijk lichaam is als volgt:[4] -

Collageen type I: Bot, pezen, ligamenten, huid en bloedvaten. Collageen type II: Kraakbeen en tussenwervelschijven. Collageen type III: Huid en bloedvaten. Collageen type IV: Basaal membraan

De typen collageen verschillen tevens in opbouw. Collageen is opgebouwd uit 3 in elkaar gedraaide eiwit helixen. Bij type I is dit 2x een α1 helix en 1x een α2 helix. Type III bestaat uit 3x een α 1 helix. Zo zijn er veel mogelijkheden en combinaties mogelijk waardoor ook verschillende typen bestaan.[4] In bijlage XI is meer te vinden over de indeling van collageen in verschillende typen.

6

3 3.1

Onderzoek en methoden Onderzoek

Het onderzoek dat gedurende laatste stageperiode uitgevoerd zal worden is voornamelijk gericht op het opzetten van western blotting voor verschillende typen collageen. Het uiteindelijke doel is het bepalen van de typen collageen in de ge-tissue engineerde weefsels en de verhouding waarin dit voorkomt. Western blotten heeft erg veel parameters die vastgesteld moeten worden zoals het percentage van de gel en de verdunningen van de nodige antilichamen. Door deze te gaan variëren zal uiteindelijk een optimaal resultaat geboekt moeten worden. Voor het optimaliseren van de methode worden positieve controle monsters gebruikt. Tijdens het onderzoek zal voornamelijk gelet worden op de resultaten die met collageen type I en III te verkrijgen zijn. Dit zijn namelijk ook de typen die volgens de theorie in hartkleppen voorkomen. Voor het opzetten van deze blotmethode worden positieve controles gebruikt van collageen type I en III. Als negatieve controle zal collageen I van een rat worden meegenomen. Verder werkt Collageen I Humaan als controle voor III en andersom. De gebruikte controles en antilichamen zijn terug te vinden in bijlage VIII. 3.2

BCA assay

Om een indicatie te krijgen omtrent de hoeveelheid eiwit in de monsters zet men een BCA assay in. De bicinchoninic acid assay of BCA assay is een bepaling voor het totaal eiwit gehalte in een oplossing. De concentratie kan worden bepaald door kleurverandering van de oplossing. Deze kleurt bij van groen naar paars in verhouding tot de eiwit concentratie. De kleur verandering is meetbaar bij 562 nm in de spectrofotometer. Aan de hand van de gemaakte ijklijn is de concentratie van de monsters te bepalen.[5] Bijlage IV geeft het protocol weer en in bijlage VI staan onderzoeksresultaten. 3.3

Hydroxyproline assay (HYP-assay)

De Hydroxyproline assay is, net als de BCA assay, een methode om eiwitten mee te bepalen. Nu bepalen we echter een specifiek eiwit in een monster. Daarom is deze methode veel specifieker dan een BCA assay. Collageen is naast elastine het enige eiwit wat hydroxyproline bevat. Door middel van een kleuring kan de concentratie fotometrisch bepaald worden van de hydroxyproline. Deze uitslag zal vermenigvuldigd worden met de factor van hoeveel hydroxyproline normaal in collageen zit.[9] Zie bijlage V voor het protocol en bijlage VII voor onderzoeksresultaten.

7

3.4

Gel elektroforese

Om eiwitten van elkaar te scheiden word gebruik gemaakt van gel elektroforese. Bij deze methode worden de eiwitten op grootte gescheiden in een gel onder invloed van elektrische spanning. Voor deze stap zijn een aantal voorbewerkingen nodig. Zonodig moet het monster verdund worden, ook moeten de eiwitten in de oplossing uitvouwen tot een lineaire structuur. Dit gebeurt onder invloed van SDS (sodium dodecyl sulfate) in Laemmli buffer en verhitting. Laemmli buffer is een buffer met SDS om de eiwitten uit te vouwen en BFB (broomfenolblauw) voor een kleuring. Deze kleuring loopt door de gel mee als een indicator die aangeeft hoe ver het elektroforese proces gevorderd is. De eiwitten, die opgebracht worden op de gel, worden onder invloed van elektriciteit door de gel getransporteerd. Doordat de eiwitoplossingen in een SDS oplossing zijn gebracht zijn de eiwitten hun oorspronkelijke structuur verloren. De eiwitten zijn nu dus allemaal gelijk van vorm en alleen het formaat bepaalt nog de verschillen in een gel. Grote eiwitten kunnen niet zo snel door de gel diffunderen dan kleine eiwitten. Door dit effect ontstaan bandjes die elk staan voor een bepaald eiwit met bepaalde molecuul grootte. Deze zijn echter nog wel onzichtbaar in de gel. Om af te leiden waar de bandjes met welk formaat zich op de gel bevinden worden markers mee genomen. Deze markers bestaan uit eiwitten met verschillende grote zodat deze ook verschillende bandjes geeft in de gel. Er kan gekozen worden voor een gekleurde of niet gekleurde marker. Deze markers zijn echter niet zichtbaar bij chemoluminicentie omdat de antilichamen hier niet aan zullen binden. Een marker waar de antilichamen wel aan binden is de magic marker. Aan het gelelektroforese proces zijn verschillende parameters verbonden. Deze kunnen alle gevarieerd worden. De parameters die zijn gevarieerd zijn het voltage waarbij het runnen plaats vind en het gelpercentage. [7] Zie voor het protocol en het schema met gel percentages bijlage I en II, voor een schema met de gebruikte markers en controles bijlage VIII. 3.5

Western Blotting

Een gel die is verkregen door middel van gel elektroforese kan niet worden bewaard en is moeilijk te bewerken. Dit komt vooral doordat een gel dik is (0,75mm) en de eiwitten in de gel zitten. Verder zijn de gels ook zeer kwetsbaar en mogen niet uitdrogen. Als men een gel bewaart voor langere tijd kunnen de eiwitten gaan diffunderen in de gel waardoor de bandjes waziger en minder intens worden na kleuring. Door de eiwitten over te zetten op een membraan ontstaan er veel meer mogelijkheden met betrekking tot de detectie van de eiwitten. Het overzetten van gel naar membraan heet blotten. Dit proces vindt plaats onder invloed van elektrische stroom in een bak met blotbuffer. het blot proces is afhankelijk van het voltage, de duur, de temperatuur (koeling) en de samenstelling van de blotbuffer. dit zijn daarom allemaal parameters die onderzocht zijn. Western blotting is een vorm van blotten waarbij onder invloed van elektriciteit eiwitten naar de positieve elektrode zullen verplaatsen. Andere vormen van blotten zijn Northern blotting voor RNA en Southern blotting voor DNA.

8

Een onderdeel van western blotten is het zichtbaar maken van de eiwitten. De eiwitten uit de gel, die op een membraan zijn geblot, worden immunologisch gekleurd. Omdat western blot met antilichamen werkt wordt het ook wel immuno blot genoemd. Het principe van een immuno blot is vergelijkbaar met dat van een Elisa. Door middel van gel elektroforese is een gel verkregen met eiwitten in op grote gescheiden. De eiwitten vormen mogelijk erg veel bandjes per laantje, dat is van de zuiverheid van het monster afhankelijk. De eiwitten worden overgebracht op een PVDF-membraan via western blot. Op dit membraan zitten nu dus dezelfde bandjes als op de gel en ze zijn nog niet zichtbaar. De mogelijkheden om het hele membraan te kleuren zijn er. Deze zijn ook zeer geschikt in veel situaties maar als slechts 1 eiwit bepaald dient te worden, zonder vooraf het monster helemaal op te zuiveren, is een immuno blot meer geschikt. Op het membraan zitten verschillende bandjes van eiwitten. De eerste stap is nu om alle vrije plaatsen op het membraan te blokkeren. Dit kan simpelweg door het membraan in een eiwitrijke oplossing als bijvoorbeeld melk te brengen. De tweede stap is het eerste antilichaam op te brengen. Dit is een antilichaam dat gericht is tegen het bepaalde eiwit waar naar gezocht word. Dit antilichaam is vaak opgekweekt in een muis maar kan van verschillende dieren afkomstig zijn. De stap die hierop volgt is het opbrengen van het tweede antilichaam. Tussendoor wordt wel het overgebleven niet gebonden eerste antilichaam weg gewassen. Het tweede antilichaam is in een ander dier (bijvoorbeeld een konijn) opgekweekt en is gericht tegen antilichamen van muizen (of het diersoort waarvan antilichaam één afkomstig is). Het tweede antilichaam is gelabeled met HRP (horse radish peroxidase). De HRP zal worden geactiveerd door luminol met waterstofperoxide waardoor een chemoluminicentie zal ontstaan. Alleen de bandjes met het gewenste eiwit zullen dus licht gaan uitstralen. Dit is waar te nemen in het donker. Hiervan kan een foto gemaakt worden. Om te weten te komen of het antilichaam werkt zonder een hele blot te hoeven maken is een dot blot mogelijk. Op deze manier is, voorafgaande aan het onderzoek, de werking van het antilichaam bepaald. Verdere parameters die van belang zijn bij het blotten zijn monsterbehandeling, blotduur, samenstelling van de blotbuffer en de koeling tijdens het proces. De monsters moeten voor het runnen verhit en behandeld worden met Leammli buffer. De samenstelling van de blotbuffer is aan te passen door de te variëren met de concentratie methanol en SDS. De koeling van deze blotbuffer gebeurd door middel van een ijsbak. Tijdens het proces zal deze smelten en daarom dient deze halverwege vervangen te worden. [7][12][15] Het western blot protocol is terug te vinden in bijlage III. De werkwijze en resultaten van de dot blot staan in bijlage XII. Afbeelding 4 op de volgende pagina laat duidelijk zien hoe dit principe in zijn werk gaat.

9

Afbeelding [4]: principe western blot en immuno-blot[6]

10

3.6

Kleurings methoden:

Zojuist is kennisgemaakt met één kleurings methode, wel de immuno blot. Er zijn erg veel methoden om een gel of membraan te kunnen kleuren en daarmee de eiwit bandjes zichtbaar te maken. De methode die gebruikt word kan dan niet western blot meer genoemd worden omdat slechts een deel van de hele procedure wordt gevolgt. Het is dus niet perse noodzakelijk de membranen te kleuren met antilichamen en chemoluminicentie maar er zijn nog tal van nadere kleurings methoden. Een aantal voorbeelde van kleurings methoden zijn: Coomassi staining: een blauwe kleuring waarbij alle eiwitten gekleurd worden, erg makkelijk uit te voeren en onomkeerbaar. Coomassi staining is een kleuring die alleen geschikt is om gels mee te kleuren Zymo staining: Eveneens een blauwe kleuring. Maar dan op basis van broomfenol blauw en niet op coomassi blue zo als bij de coomassi staining. Deze kleuringsmethode duurt wat langer dan de coomassi kleuring en hoeft zelden ontkleurd te worden. Deze methode is niet geschikt voor membraan kleuringen. De bijbehorende werkwijze staat beschreven in bijlage X Ponceau staining: een soortgelijke kleuring als Coomassi maar dan roze. Deze vorm van kleuring is wel weg te spoelen met water, maar ook minder gevoelig. Dit maakt de methode wel erg geschikt om te gebruiken als screening. Een ponceau kleuring is alleen te gebruiken voor het kleuren van membranen. (kijken of het eiwitten goed zijn overgebracht op het membraan). Voor de werkwijze zie bijlage IX Bovengenoemde kleuringen zijn slechts een greep uit een grote hoeveelheid kleurings mogelijkheden. Deze vormen zijn echter niet specifiek en kleuren dus ook alle eiwitten in het monster. Dit is niet slecht, maar in sommige gevallen maakt dit het onoverzichtelijk of onmogelijk om de resultaten af te lezen. Wanneer men bijvoorbeeld een monster heeft met erg veel verschillende eiwitten zal een smeer ontstaan in plaats van losse bandjes. Bij dit soort monsters is het verstandiger om een specifieke methode te kiezen zoals de immuno blot. De membranen zijn na blotten gekleurd in ponceau om de overdracht van de eiwitten op het membraan te kunnen zien. Om te kunnen zien of er eiwit achter is gebleven in de gel is deze in zymo staining gekleurd. Op deze manier kunnen verschillende parameters bekeken worden

11

4

Resultaten

4.1. Eiwitconcentratie Voor het onderzoek naar collageen moet om te beginnen bekend zijn hoe groot de concentratie eiwit per slotje ongeveer bedraagt. De hoeveelheid is bepaald met behulp een BCA assay. Omdat de BCA assay niet selectief is voor collageen maar het totaal eiwit bepaald, is hiermee de zuiverheid van de monsters onbekend gebleven. Om alleen het collageen in de gebruikte controles te bepalen is gekozen voor een HYP assay. Uit de verschillen tussen de BCA en HYP resultaten is gebleken dat collageen I humaan minder zuiver is dan collageen type I rat. Naar schatting is collageen I humaan circa 70% zuiver en collageen I rat bijna 100%. Deze uitspraken kunnen niet verder meegenomen worden omdat ze slechts op deze enkele resultaten berusten. De resultaten en werkwijze van beide bepalingen zijn tevens terug te lezen in de bijlagen. (bijlage VI voor BCA en VII voor HYP resultaten) 4.2. Gel percentage Omdat geen eerdere resultaten van collageen met western blotting bekend zijn, is gekozen om te starten met een ‘standaard’ (veelgebruikt) gel percentage van 12%. In de loop van het onderzoek bleek dit gel percentage te hoog. Om het eiwit centraler op de gel te kunnen krijgen en het blotten te verbeteren is gekozen voor een lager gel percentage. Er is gekozen voor het gebruik van een 8% gel. Deze is goed te hanteren en verbeterd het blotten. Het gebruik van een 6% gel is ook geprobeerd maar deze gel wat te zwak om verder goed te kunnen bewerken. 4.3. Running Het voltage waarop de run plaats vindt is bepalend voor hoe goed de eiwitten door de gel lopen. De eiwitten kunnen snel runnen bij een hoog voltage. Bij dit hoge voltage zal de samplebuffer snel beneden zijn maar zien de bandjes er erg slordig uit op de gel na kleuring. De bandjes worden waziger en minder vlak bij te snel runnen. Om de monsters mooi uit de slotjes te laten komen is hier een stacking gel aangebracht. Deze 5% stacking gel moet op een laag voltage worden gerund om de eiwitten een mooiere start te laten maken in de echte gel. Voor het runnen in de stacking gel, wat ongeveer 10 minuten kost, is 90 tot 110 volt een acceptabele runsnelheid. Voor de gel zelf is het beste 110 tot 150 volt te gebruiken. 4.4. Antilichamen en Dot blot Van de antilichamen die gebruikt zijn was de werking niet bepaald. Om de werking te bepalen (en de bijgeleverde informatie van de fabrikant te controleren) is een dot blot ingezet. Uit deze dot blot is gebleken dat de antilichamen tegen collageen type I niet werkzaam waren na verhitting van de monsters. Ook was het antilichaam niet specifiek tegen collageen type I maar reageerde ook op collageen type III. Dit alles was tegenstrijdig aan wat de fabrikant vermeld had. Daarom is gekozen voor een

12

ander antilichaam van een andere fabrikant. Met de nieuwe antilichamen is direct een dot blot ingezet en deze antilichamen bleken wel geschikt voor western blot. Zie voor de dot blot bijlage XII en voor de gebruikte antilichamen bijlage VIII. 4.5. Membraan en gel kleuring De eiwitten op de membranen kunnen nog niet met antilichamen aangetoond worden omdat de overdracht van de eiwitten uit de gel op het membraan nog niet optimaal zijn. Om een indicatie te krijgen van de hoeveelheid overgebracht eiwit, werden gels gekleurd in zymo staining en de membranen in ponceau. Dit leverde interessante beelden op. Er was duidelijk te zien dat erg veel eiwit niet uit de gel kwam. Steeds als een parameter aangepast was die betrekking had op het blotten werd dit herhaald om toevalligheden uit te sluiten. Zo is gekomen tot een optimale verhouding tussen eiwit wat in de gel blijft en eiwit wat op het membraan kwam. “100%” Eiwit overdracht werd ook behaald maar de intensiteit van de marker neemt af naarmate de intensiteit van de eiwitten toe neemt. 4.5.1. Monster behandeling De monsters worden in Milli Q verdund in de gewenste verdunning. De eventueel verdunde monsters worden vervolgens één op één verdund in Laemmli buffer. Deze buffer zorgt dat de eiwitten uitvouwen onder invloed van verhitting. De verhittings stap moet bij grotere eiwitten langer zijn dan bij kleine eiwitten. Proefondervindelijk is aangetoond dat collageen betere resultaten geeft na 10 minuten verhitten dan na de gebruikelijke 5 minuten. De verhit temperatuur is vastgesteld 96oC. 4.5.2. Blotten Het blotten, ofwel de eiwitten uit de gel overbrengen op het PVDF membraan gebeurt standaard in 2 uur bij 200 mA. Voor grotere eiwitten kan langer blotten betere resultaten opleveren. Kleine eiwitten zullen ook eerder geblot zijn. Voor collageen is de blot tijd van 2 uur voldoende. Blot tijden van 3 uur en 4 uur zijn ook getest maar leverden geen noemenswaardige verschillen op. De toevoegingen in de blotbuffer spelen echter een belangrijkere rol bij het blotten. 4.5.3. SDS / Methanol toevoeging Collageen heeft twee eigenschappen die het moeilijk maken om het eiwit goed te kunnen blotten. Dit zijn het formaat van het eiwit (130kD) en de eigenschap dat collageen erg hydrofoob is. De sterkte van deze laatste eigenschap drukt men uit in hydropathy index. Deze is voor de segmenten van collageen erg hoog wat betekend dat collageen erg hydrofoob is. Dit was al duidelijk bij het oplossen van de gevriesdroogde monsters. Om collageen toch beter te kunnen blotten zal methanol toegevoegd moeten worden aan de blotbuffer. Omdat collageen ook relatief groot is zal het beter uitkomen SDS toe te voegen aan de blotbuffer zodat het eiwit beter kan uitvouwen. De volgende stap in het onderzoek is dan ook het methanol percentage verhogen in de blotbuffer en 0,05% SDS toe voegen. Hoe groter de concentratie SDS in de buffer hoe slechter de overdracht van de marker maar hoe beter de overdracht van de eiwitten. Hier moest daarom gezocht worden naar een optimum. Vele combinaties zijn getest en de beste resultaten zijn verkregen met een blotbuffer waaraan 30% methanol en 0,02% SDS is toegevoegd.[6][8]

13

5

Discussie en aanbevelingen

Gedurende dit onderzoek is getracht de western blot methode voor collageen type I en III te optimaliseren. Bij dit onderzoek zijn veel voorgevallen problemen opgelost, een aantal punten zijn open blijven staan en een ander aantal staat nog ter discussie. Hierbij gaat het onder andere om het feit dat de dichtheid van de gels nooit 100% vast staat. Ongeacht hoe nauwkeurig gewerkt word bij het maken van een gel kan deze toch van slechtere kwaliteit zijn dan een eerder gemaakte gel. Ook zijn de parameters niet helemaal vast te stellen. Bij het instellen van een vast voltage, om een run uit te voeren kan het amperage fluctueren. Tevens is de weerstand van een monster sterk afhankelijk van de samenstelling van het monster. Door deze eigenschap kan een monster slechter lopen of een onduidelijk beeld geven. Vooral zouten en zuurtegraad spelen hierbij een grote rol. Wat hiermee vooral aangegeven kan worden is dat tijdens het runnen nooit alle parameters 100% vast kunnen staan. Door zo nauwkeurig mogelijk te werken bij het maken van de gel en andere oplossingen is dit probleem echter wel te minimaliseren. Bij het blotten zijn het onder andere dezelfde factoren die een belangrijke rol spelen. De nauwkeurigheid bij het maken van de blotbuffer is van groot belang. Tijdens deze stap zullen dan ook de grootste afwijkingen ontstaan door onzorgvuldigheden. De concentraties van de bestanddelen in een blotbuffer zijn namelijk zeer bepalend voor het blotresultaat. De bak waarin het blot proces plaatsvindt, is gekoeld door middel van een ijsbak en een roervlo er in. Deze ijsbak is op de helft van het blot proces ver gesmolten en dient vervangen te worden om de koeling zo constant mogelijk te houden. De invloed van temperatuur op het blotten is niet onderzocht maar mocht dit problemen opleveren zou het gehele proces in een gekoelde omgeving moeten gebeuren. Waarvan de invloed niet bekend is, is het feit dat de netspanning, waarop de powersuply is aangesloten, nooit volledig constant is. Mogelijk spelen spanningspieken en dalen een rol bij het blotten dan wel bij het runnen. Of deze fluctuatie in spanning van belang is voor betere resultaten is zoals gezegd onbekend. Een oplossing hiervoor is moeilijk te verwezenlijken. Denk bijvoorbeeld aan constante spanningsbronnen als een accu. Het blokken van de membranen gebeurde met een oplossing van 3,5% melkpoeder. Of de concentratie van de blok oplossing van invloed is geweest op de resultaten is onduidelijk. Dit zou later onderzocht kunnen worden door hogere en/of lagere percentages te gebruiken. Tijdens het maken van een foto met de Versa Doc (Bio-Rad) kan niet meegenomen worden hoe snel de chemoluminicentie uitdooft. Hierdoor kan een bandje wat heel zwak oplicht, niet worden meegenomen op de foto door te lang wachten. Het is onbekend hoe veel procent uit de gel overgebracht kan worden op het membraan. Het is dus ook onbekend hoe veel eiwit werkelijk aangedaan word door de antilichamen. De enige mogelijke oplossing hiervoor is snel werken na toevoeging van de ECL oplossing.

14

Voor het optimaliseren is gebruik gemaakt van collageen standaarden. Bij een totaal eiwit bepaling met behulp van een BCA assay is dus ook het overgrote deel van dat totaal eiwit collageen. In weefsels zal dit anders zijn en er moet dus rekening mee worden gehouden bij het opbrengen van het eiwit. Collageen type III humaan is niet meer onderzocht door dat verschillende problemen zich voordeden bij het optimaliseren van collageen type I. Daarom zal hetzelfde proces zich moeten herhalen voor het optimaliseren van een blot methode voor collageen type III. Hierbij moet gelet worden op het feit dat de 2 methoden met elkaar gecombineerd kunnen worden. Uiteindelijk zal collageen type I en collageen type III op hetzelfde membraan moeten komen. Voor de immuno kleuring is gebruik gemaakt van een overmaat van beide antilichamen. Om het verbruik van de antilichamen te reduceren zal nog onderzocht moeten worden welke lagere concentraties ook goede resultaten geven.

15

6

Conclusie

Door het variëren van verschillende parameters is er een protocol opgezet voor western blot voor humaan collageen type I. Het onderzoek heeft zich beperkt tot het opzetten van een methode voor collageen type I, wegens tijdsgebrek is collageen type III niet uitgewerkt. Het opzetten van de western blot methode is voltooid maar het optimaliseren van de antilichaam verdunningen en visualisatie staat nog open.

16

7

Literatuur

[1]

http://nl.wikipedia.org/wiki/Hart

[2]

http://nl.wikipedia.org/wiki/Hartklep

[3]

http://www.stw.nl/Programmas/Tissue/

[4]

http://en.wikipedia.org/wiki/Collagen

[5]

http://en.wikipedia.org/wiki/Bicinchoninic_acid_assay

[6]

http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2B.asp

[7]

Braam, W.G.M.; Electroforese; EPN te Houten; 2000, 4edruk.

[8]

Fraser RD er al; Molecular mobility in the gap regions of type I collagen fibrils. Bioscience reports1986 Feb;6(2):221-6

[9]

http://en.wikipedia.org/wiki/Hydroxyproline

[10]

http://texasheart.org/Education/THIJournal/images/Starr8_1.jpg

[11]

www.lumc.nl/.../operaties/replacement.html

[12]

http://en.wikipedia.org/wiki/Western_Blot

[13]

Sambrook & Russel; Molecular cloning and laboratory manual; 2001, 3e editie

[14]

Uitleg, informatie formulieren, presentaties, afbeeldingen van Anita Mol TU/Eindhoven

[15]

W.L. van de Loo; Fontys stageverslag; augustus 2004

17

Bijlage I Gel elektroforese (SDS-Page) Materialen: Glasplaat met opstaande randjes (0,75mm) Afdek glas Mal Kam Houder Bak Power supply Runningbuffer Separating Gel Stacking gel Pipetten 1000 µl / 100 µl / 10 µl Bijbehorende puntjes Leammli buffer Marker Gels: Bijvoorbeeld 8% gel (andere percentages en stacking gels zijn terug te vinden in bijlage II) (onderstaande waarden zijn gebaseerd op 1 gel) Water: Bisacrylamide: Tris buffer: APS (ammonium per sulfaat): SDS: TEMED:

2,3 ml 1,3 ml Let op: Kankerverwekkend!! R45 1,3 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,003 ml

Let op: Na toevoegen van TEMED zal de gel polymeriseren. Dus direct verwerken! Gebruik bij het maken van een polyacrylamide gel altijd blauwe handschoenen! Leammli buffer: 2x Laemmli Buffer omdat deze met het monster verdund zal worden bij verwerking 125 mM Tris-HCl pH 6,8 20 % (v/v) Glycerol 5% SDS 0.02% Broom phenol Blue 10% 2-mercaptoethanol De Leammli buffer kan bij -20oC lang bewaard blijven.

18

Bijlage I Procedure: -

-

-

-

-

Neem de 2 glasplaatjes en plaats ze in de mal. Haal deze over de labtafel om zeker te zijn dat beide onderzeiden gelijk staan. Plaats de mal in de houder op het rubber sponsje om lekken te voorkomen. Maak zowel de stacking gel als de separating gel (Voeg pas TEMED toe bij gebruik). Pipeteer de separating gel tussen de twee glasplaatjes en laat ongeveer 1,5 cm vrij. Vul deze ruimte af met ethanol. Binnen 30 minuten is de gel gepolymeriseerd en kan de ethanol er afgegoten worden. Pipeteer nu de stacking gel hier boven op en plaats de kam in de gel. Laat deze gel ook polymeriseren. In de tijden dat de gels moeten polymeriseren moeten de samples verdund en verwerkt worden. De verdunde samples worden 1:1 vermengd met Leammli buffer en 10 minuten verhit bij 96oC. Haal de gel die tussen de glasplaatjes zit uit de mal en plaats deze in de houder. Zet de houder in de bak en vul de bak met running buffer. (Indien 1 gel runt, moet de tegenoverliggende houder afgedekt worden met de plastic plaat die hiervoor bestemd is). Was de slotjes uit door de buffer in en uit het slotje te pipeteren. Voeg 5µl van de gewenste marker toe aan het eerste en laatste slotje in de rij. Pipeteer van de verhitte samples 15µl in elk slotje. Sluit de bak af met de hiervoor bestemde deksel en sluit deze aan op de power supply. (Let hierbij op dat zwart staat voor – en rood voor +) Stel in op 90 Volt en start running. Na ongeveer 10 minuten het voltage verhogen naar 120 Volt. Als de blauwe kleur van de Leammli buffer de onderkant van de gel bereikt heeft is het runnen voltooid.

-

Neem glasplaatjes met de gel uit de houder en haal voorzichtig de glasplaatjes van elkaar. Steek de stacking gel weg en steek een klein hoekje af van het begin zodat je weet waar het eerste en laatste eiwit in gepipetteerd is.

-

De gel kan gekleurd worden in bijvoorbeeld zymo staining of coomassi staining. Indien nodig kan de gel gebruikt worden voor western blot. Let op: Een gel is niet houdbaar! [15]

19

Bijlage II Tabel 1:

Schema Gel percentage

Stacking gels 6% gel H2O 30% acrylamide 1,5M Tris pH8,8 10% SDS 10% APS TEMED

5ml 2,6 1,0 1,3 0,05 0,05 0,004

10ml 5,3 2,0 2,5 0,1 0,1 0,008

15ml 7,9 3,0 3,8 0,15 0,15 0,012

20ml 10,6 4,0 5,0 0,2 0,2 0,016

25ml 13,2 5,0 6,3 0,25 0,25 0,02

30ml 15,9 6,0 7,5 0,3 0,3 0,024

40ml 21,2 8,0 10,0 0,4 0,4 0,032

50ml 26,5 10,0 12,5 0,5 0,5 0,04

8% gel H2O 30% acrylamide 1,5M Tris pH8,8 10% SDS 10% APS TEMED

5ml 2,3 1,3 1,3 0,05 0,05 0,003

10ml 4,6 2,7 2,5 0,1 0,1 0,006

15ml 6,9 4,0 3,8 0,15 0,15 0,009

20ml 9,3 5,3 5,0 0,2 0,2 0,012

25ml 11,5 6,7 6,3 0,25 0,25 0,015

30ml 13,9 8,0 7,5 0,3 0,3 0,018

40ml 18,5 10,7 10,0 0,4 0,4 0,024

50ml 23,2 13,3 12,5 0,5 0,5 0,03

10% gel H2O 30% acrylamide 1,5M Tris pH8,8 10% SDS 10% APS TEMED

5ml 1,9 1,7 1,3 0,05 0,05 0,002

10ml 4,0 3,3 2,5 0,1 0,1 0,004

15ml 5,9 5,0 3,8 0,15 0,15 0,006

20ml 7,9 6,7 5,0 0,2 0,2 0,008

25ml 9,9 8,3 6,3 0,25 0,25 0,01

30ml 11,9 10,0 7,5 0,3 0,3 0,012

40ml 15,9 13,3 10,0 0,4 0,4 0,016

50ml 19,8 16,7 12,5 0,5 0,5 0,02

12% gel H2O 30% acrylamide 1,5M Tris pH8,8 10% SDS 10% APS TEMED

5ml 1,6 2,0 1,3 0,05 0,05 0,002

10ml 3,3 4,0 2,5 0,1 0,1 0,004

15ml 4,9 6,0 3,8 0,15 0,15 0,006

20ml 6,6 8,0 5,0 0,2 0,2 0,008

25ml 8,2 10,0 6,3 0,25 0,25 0,01

30ml 9,9 12,0 7,5 0,3 0,3 0,012

40ml 13,2 16,0 10,0 0,4 0,4 0,016

50ml 16,5 20,0 12,5 0,5 0,5 0,02

15% gel H2O 30% acrylamide 1,5M Tris pH8,8 10% SDS 10% APS TEMED

5ml 1,1 2,5 1,3 0,05 0,05 0,002

10ml 2,3 5,0 2,5 0,1 0,1 0,004

15ml 3,4 7,5 3,8 0,15 0,15 0,006

20ml 4,6 10,0 5,0 0,2 0,2 0,008

25ml 5,7 12,5 6,3 0,25 0,25 0,01

30ml 6,9 15,0 7,5 0,3 0,3 0,012

40ml 9,2 20,0 10,0 0,4 0,4 0,016

50ml 11,5 25,0 12,5 0,5 0,5 0,02

Separating gels 5% stacking gel H2O 30% acrylamide 1,0M Tris pH6,8 10% SDS 10% APS TEMED

1ml 0,68 0,17 0,13 0,01 0,01 0,001

2ml 1,4 0,33 0,25 0,02 0,02 0,002

3ml 2,1 0,5 0,38 0,03 0,03 0,003

4ml 2,7 0,67 0,5 0,04 0,04 0,004

5ml 3,4 0,83 0,63 0,05 0,05 0,005

6ml 4,1 1,0 0,75 0,06 0,06 0,006

Bron: Sambrook & Russel; Molecular cloning and laboratory manual; 3e editie 2001 [13]

20

8ml 5,5 1,3 1,0 0,08 0,08 0,008

10ml 6,8 1,7 1,25 0,1 0,1 0,01

Bijlage III Western Blot Materialen: PVDF membraan Whatman papier Sponsjes Blotmal Schaaltje Blotbak Ijsbak Roervlo Roerder Blotbuffer (Bio-Rad) 100ml 10x blotbuffer 200ml MeOH 700ml MilliQ PBS-Tween 0,1% 5 tabletten PBS per Liter water 1000ml MilliQ 1 ml Tween Handschoenen 50ml buis Melkpoeder PBS-tween 0,1% Eerste antilichaam (USBiological, C7510-17K) Tweede antilichaam (pierce, 31402) PBS ECL oplossing (kit met luminol en waterstofperoxide)

Oplossingen: Runningbuffer: -

100 ml Running buffer 10x Bio-Rad 900 ml Milli Q water

Blotbuffer: 100 ml Blotbuffer 10x Bio-Rad 300 ml Methanol 598 ml Milli Q water 2 ml 10%SDS oplossing

21

Bijlage III Procedure: Knip de membranen op formaat van de gel (90 mm bij 60 mm), draag hierbij handschoenen om te voorkomen dat er eiwit van je handen op het membraan komt. Week het membraan ongeveer één min. in 100% methanol. Week het membraan daarna in de blotbuffer samen met de sponsjes en whatman papiertjes. Leg de blotmal in een schaaltje met blotbuffer en leg de materialen er in de volgende volgorde in: Zwarte kant van de blotmal (-) Sponsje Whatman papier (aantal is afhankelijk van de dikte van het papier) Gel (verkregen via gel elektroforese) PVDF membraan Whatman papier (aantal is afhankelijk van de dikte van het papier) Sponsje Transparante kant van de blotmal (+) Plaats de blotmal in de blotbak met de zwarte kant aan de zwarte zijde. Zet de ijsbak en een roervlo er in. Zet de roerder rustig aan en blot 2 uur bij 200 mA. Na 1 uur blotten op pauze drukken en de ijsbak vervangen voor een nieuwe. Vries de gesmolten ijsbak opnieuw in voor latere blots. Na 130 minuten blotten: Spoel het blot met PBS-Tween en bewaar het blot in PBS-Tween. Het membraan kan zo ongeveer één dag bewaard blijven bij 4oC en onbeperkt bij -20oC. Het verkregen membraan bevat nu de eiwitten die in de gel een bandje vormden. Om de eiwitten zichtbaar te maken is een immuno blot mogelijk maar ook bijvoorbeeld een ponceau kleuring. Immunoblot: Als onderdeel van western blot. Materialen: Melkpoeder PBS /PBS-tween (0,1%) Primair antilichaam Secundair antilichaam 50 ml buis Versa Doc (Bio-Rad) Geblot PVDF membraan Rollenbank (gekoeld)

22

Bijlage III Werkwijze: Leg het membraan wat is verkregen door blotten in een schaaltje en voeg hier 30 ml 3,5% melkpoeder aan toe. Het melkpoeder oplossen in PBSTween 0,1%. Laat het 1 uur incuberen bij kamertemperatuur. Stop vervolgens het membraan in een 50 ml buis met de bovenkant naar binnen. Maak de juiste verdunning van het eerste antilichaam in 3,5% melkpoeder met PBS-Tween. Leg de buis in de koelkast op de rollenbank, laat overnacht incuberen. Was de volgende dag het blot door het buisje leeg te gieten en 5 tot 10 ml PBS-Tween toe te voegen. Leg het buisje 5 minuten op de rollenbank (bij kamertemperatuur). Herhaal deze wasstap 3x en maak een verdunning van het 2e antilichaam in 3,5% melkpoeder met PBS-Tween. Leg de buis gedurende 1 uur op de rollenbank bij kamertemperatuur om het 2e antilichaam te laten incuberen. Was daarna het blot weer 3 keer met PBS-Tween en één keer met PBS. Leg het membraan op een overhead sheet en maak de ECL oplossing klaar door 1:1 de 2 componenten (luminol en waterstofperoxide) bij elkaar te voegen. Druppel de substantie over het membraan en laat ongeveer 2 minuten incuberen. Laat het membraan uitdruppen en leg het op een nieuwe overhead sheet met een andere sheet er boven op zodat het membraan niet uit kan drogen. (Voorkom hierbij luchtbellen die er tussen kunnen komen). Maak nu een foto met het de Versa Doc (Bio-Rad) van Bio-Rad. Het uitgezonden licht is van de bandjes afkomstig en wordt zo zichtbaar gemaakt. [15]

Afbeelding: Voorbeeld van membraan gekleurd met behulp van immunoblot

Sluitertijd 60 sec. rechts en links magic mark™ midden collageen. Eerste 6 bandjes collageen type I humaan in verdunningen, 7e bandje collageen type I rat, lege plaats is collageen type III humaan. (Geen binding van 1e antilichaam aan type III)

23

Bijlage IV BCA assay Materialen: Bicinchoninic acid Koper (II) sulfaat BSA (1mg BSA opgelost in 1ml MilliQ) Eppendorf heated shaker Spectrofotometer op 562nm

Procedure: Maak de BCA oplossing door aan 50ml bicinchoninic acid, 1 ml koper(II) sulfaat toe te voegen. Maak dan de ijk lijn als volgt: -

0 µg/ml: 1 µg/ml: 3 µg/ml: 5 µg/ml: 10 µg/ml: 20 µg/ml: 30 µg/ml:

-

Maak de monsters als volgt klaar: 5µl monster + 995 µl BCA oplossing. Incubeer de monsters en standaarden 30 minuten bij 37oC in de eppendorf heated shaker op 300 toeren per minuut. Stel intussen de spectrofotometer in op 562nm. Na het incuberen 500µl in plastic disposible cuvetten pipeteren en meten. De resultaten van de standaarden vormen een ijklijn waarmee met de volgende berekening de concentratie van je echte sample’s kunt berekenen.

-

0 µl BSA (1mg/ml) + 1000 µl BCA oplossing 1 µl BSA (1mg/ml) + 999 µl BCA oplossing 3 µl BSA (1mg/ml) + 997 µl BCA oplossing 5 µl BSA (1mg/ml) + 995 µl BCA oplossing 10 µl BSA (1mg/ml) + 990 µl BCA oplossing 20 µl BSA (1mg/ml) + 980 µl BCA oplossing 30 µl BSA (1mg/ml) + 970 µl BCA oplossing

Conc. (µg/ml)= (waarde van de ijklijn) * 200 (* verdunnings factor)

24

Bijlage V Protocol Hyp assay Materialen en oplossingen Hydroxyproline standaard stock (10 mg/ml): 100 mg Hydroxyproline (Sigma H5534) in MQ tot een volume van 10 ml (bevries in aliquots op -20°C) NaOH-oplossing: 4 M oplossing (40 g/mol): 16 gram NaOH in 100 ml MQ Citric acid 1.4 M oplossing (192 g/mol): 29.4 gram Citric acid X H2O in 100 ml MQ Acetaat-citraat buffer (pH 6,5): Natrium Acetaat X 3 H2O (Sigma S7670) 60 gram Citric acid X H2O (Merck 1.00244.1000) 25 gram IJsazijn (Merck 1.00056.1000) 6 ml NaOH 17 gram Voeg MQ toe tot 500 ml and titrate pH at 6.0 met behulp van ijsazijn Chloramine-T oplossing: 1.41 gram Chloramin-T (Sigma C9887) 10 ml MQ 10 ml N-Propanol (1-propanol, Sigma P6334). Voeg 80 ml acetate-citrate buffer toe aan deze oplossing (total volume of 100 ml). Bij gebruik van Chloramin • 3 H2O, neem 1.74 gram i.p.v. 1.41 gram. Let op! Bewaar op 4°C tot maximaal 1 maand Gebruik de afzuigkap! Aldehyde/perchloric acid oplossing: 7.5 gram p-Dimethylaminobenzaldehyde (Sigma D8904) 31 ml N-Propanol. Voeg langzaam 11.2 ml 70% en 1.9 ml MQ perchloric acid toe; of 13 ml 60% perchloric acid

25

Bijlage V Procedure Zorg dat de volgende oplossingen aanwezig zijn: - hydroxyproline standaard oplossing - 4 M NaOH - 16 M NaOH - 1.4 M citric acid - Chloramin-T oplossing - Maak de standaarden voor de ijklijn in duplo: Oplossing A (40 µg/50 µl): 20 µl hydroxyproline stock (10 mg/ml) + 230 µl NaOH (4M) Standaard 1 (20 µg/50 µl): 50 µl oplossing A + 50 µl NaOH (4M) Standaard 2 (10 µg/50 µl): 50 µl of standaard 1 + 50 µl NaOH (4M) Standaard 3 (5 µg/50 µl): 50 µl of standaard 2 + 50 µl NaOH (4M) Standaard 4 (2.5 µg/50 µl): 50 µl of standaard 3 + 50 µl NaOH (4M) Standaard 5 (1.25 µg/50 µl): 50 µl of standaard 4 + 50 µl NaOH (4M) Standaard 6 (0.63 µg/50 µl): 50 µl of standaard 5 + 50 µl NaOH (4M)
Vortex en gooi 50 µl weg. Standaard 7 (blanco): 50 µl NaOH (4M) - Pipetteer 25 µl 16 M NaOH oplossing in een nieuw eppendorf cubje met schroefdop. - Voeg niets toe aan de standaarden. - Neem 75 µl van de samples en meng deze goed met 16 M NaOH. Het totaal volume (100 µl) is het [hydrolysatie volume]. - Vul een groot beker glas met papier en zet de ebjes rechtop in het tissue papier. - Autoclaaf dit 10 minuten op 120 °C. - Voeg 50 µl van 1.4 M citric acid toe aan de standaarden en 100 µl aan the gehydroliseerde samples en vortex. - Centrifugeer de samples op 12000 rpm gedurende 5 minuten. - Pipetteer 250 µl Chloramin-T oplossing in een nieuw eppendorf cubje. (gebruik een afzuigkap!) - Neem 25 µl van de samples en de standaarden (Bewaar deze gekoeld zodat de bepaling eventueel herhaald kan worden indien nodig). - Meng deze in de Chloramin-T oplossing. (Gebruik de afzuigkap!) - Incubeer 20 minutes op kamer temperatuur (Niet schudden!). - Maak aldehyde/perchloric acid oplossing.(in de zuurkast!) voeg 250 µl aldehyde/perchloric acid oplossing toe en vortex. (onder de afzuigkap!) - Incubeer 15 minuten op 65 °C (in de heated shaker). - Breng 400 µl van de inhoud van de buisjes in plastic wegwerp cuvetjes (Je kunt ook kiezen voor 100 µl in een 96 wells plaat ) - Meet de absorbtie op 550 nm in de spectrophotometer. (of in de plate reader als een 96-wells plaat is gebruikt)

26

Bijlage V Berekening: Maak de ijklijn, bereken de formule van de curve en de correlatie coefficient. Bepaal de concentratie hydroxyproline in de samples aan de hand van de ijklijn. 1) Bepaal de hoeveelheid hydroxyproline aan de hand van de ijklijn door de OD met de berekende “slope” te vermenigvuldigen en voeg later de intercept toe. (deze is negatief in de meeste gevallen). 2) Deel de berekende hoeveelheid hydroxyproline door 50 en vermenigvuldig dit met het hydrolysatie volume dat is gebruikt voor correctie van verschillen in hydrolysatie volumes van de monsters ten opzichten van de standaard. Als deze gelijk aan elkaar zijn hoeft dit natuurlijk niet. 3) Deel de berekende hoeveelheid hydroxyproline door het droog gewicht van de samples.

27

Bijlage VI Resultaten BCA assay Conc BSA

OD 562nm

OD 562nm

Average

(µg/ml)

1

2

OD

30

0,616

0,638

0,627

20

0,425

0,433

0,429

10

0,221

0,215

0,218

5

0,127

0,128

0,128

3

0,079

0,077

0,078

1

0,040

0,031

0,036

0

0,000

0,000

0,000

Conc.

Dilution

Slope

0,0206

Intercept

0,0135 OD 562 nm

Sample

Conc.

(µg/ml)

(µg/ml)

col I human

0,101

4,25

200

850,28

col I rat

0,077

3,09

200

617,18

standard line BCA assay 0,700

Average OD

0,600

y = 0,0206x + 0,0135

0,500

2

R = 0,9989

0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0

5

10

15

20

25

Concentration BSA (ug/ml)

28

30

35

Bijlage VII Resultaten HYP Assay OD 550nm

OD 550nm

Average

(µg/ml)

1

2

OD

20

0,962

0,944

0,953

10

0,474

0,431

0,453

5

0,277

0,267

0,272

2,5

0,155

0,156

0,156

1,25

0,105

0,102

0,104

0,625

0,082

0,078

0,080

0

0,049

0,051

0,050

standard line HYP assay 1,200 1,000 Average OD

Conc HYP std.

y = 0,0446x + 0,0446 R2 = 0,997

0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0

5

10

15

20

25

Concentration HYP (ug/ml)

Slope

0,0446

Intercept

0,0446 OD 550 nm

OD 550 nm

Conc

1

2

(µg/50µl)

col I human

0,183

0,179

col I rat

0,199

0,2

Sample

Hydrolyse

Conc

conc hyp

conc.

volume

µg

µg/ml

collageen

3,06

100

6,12

81,60

608,74

3,48

100

6,96

92,80

692,29

29

Bijlage VIII Tabel 2:

Gebruikte antilichamen, controles en markers

Controles

Verdunning

Fabrikant

Formaat (kD)

Prod. Nr.

Oorsprong

Collagen type I human Collagen type I rat Collagen type III human Primaire antilichamen Goat anti human immunopure col. Type I Anti Collagen type I Anti Collagen type III

------------------

Sigma

Ca. 130 kD

C7774

------------------

Sigma

Ca. 130 kD

C8897

Human placenta Rat tail

------------------

Sigma

Ca. 130 kD

C4407

Human placenta

------------------

1:100 – 1:500

USBiological

C7510-17K

Goat

Polyclonal

1:100 – 1:1000 1:100 – 1:1000

Santa Cruz

Sc-59773

Mouse

Monoclonal

Santa Cruz

Sc-59816

Mouse

Monoclonal

1:5000 – 1:100000

Pierce Biotechnology

31402

Rabbit

Monoclonal

1:5000 – 1:100000

Pierce Biotechnology

31457

Rabbit

Monoclonal

------------------

Bio-Rad

------------------

161-0373

------------------

Unstained marker

------------------

Bio-Rad

------------------

161-0363

Recombinante eiwitten Recombinante eiwitten

Magicmark xp

------------------

Invitrogen

------------------

LC 5602

Recombinante eiwitten

------------------

Secundaire antilichamen Rabbit anti goat immunopure IgG HRP labeled Rabbit anti mouse igG+IgM HRP labeled Controles All blue marker

30

Poly/monoclonal -----------------------------------

------------------

Bijlage IX Ponceau kleuring Materialen: Ponceau oplossing PVDF membraan (al wel geblot) Schaaltje Water Overhead sheet Pincet Tissues Procedure: Giet een bodem ponceau in het schaaltje. Neem het membraan voorzichtig met een schone pincet van het blotpapiertje af en leg deze in een schaaltje met ponceau oplossing. Zorg dat het membraan goed onder gedompeld is. Laat ongeveer 15 min staan. (evt op een schudplaat) Giet nu voorzichtig de ponceau oplossing terug in de fles en vul het schaaltje met water uit de kraan. Let op: niet rechtstreeks op het membraan laten spoelen! Spoel enkele seconden met het water en giet het water door de gootsteen. Vul het schaaltje opnieuw met een bodem water. (Weer niet direct op het membraan gieten) Haal het membraan uit het water en leg het op de overhead sheet. Dep het membraan droog met een tissue en laat het verder drogen. Een gedroogd membraan is onbeperkt te bewaren*. Een gedroogd membraan is echter niet meer te bewerken. Om het membraan te gebruiken voor immunoblot mag het zeker niet drogen. Afbeelding:

Voorbeeld membraan kleuring met ponceau kleuring

*mogelijk ontkleuren de membranen door blootstelling aan licht en lucht. Dit is nog niet bekend

31

Bijlage X Zymo kleuring Materialen: Zymo kleurings oplossing Gel (wel of niet geblot) Schaaltje Water Overhead sheet Pincet Procedure: Giet een bodem zymo kleuring in het schaaltje. Neem de gel voorzichtig met een schone pincet van het blotpapiertje af (indien geblot) of haal de gel uit de houder en glasplaatjes (indien niet geblot) en leg deze in een schaaltje met zymo oplossing. Zorg dat de gel goed onder gedompeld is. Laat ongeveer 45 min staan. (evt op een schudplaat) Giet nu voorzichtig de zymo oplossing in de fles met gebruikte zymo oplossing. Leg de gel op een overhead sheet en spoel deze voorzichtig af onder de kraan. Spoel enkele seconden met water. Nu kan de gel gefotografeerd worden let wel op dat de gel niet van de sheet af schuift. Laat de gel niet drogen. Een gel kan niet bewaard blijven. Afbeelding:

voorbeeld gel kleuring met zymo kleuring

32

Bijlage XI Tabel 3:

Indeling collageen volgens Bornstein en Traub

Type Notes

I

This is the most abundant collagen of the human body. It is present in scar tissue, the end product when tissue heals by repair. It is found in tendons, the endomysium of myofibrils and the organic part of bone.

II

Articular cartilage and Hyaline cartilage, makes up 50% of all cartilage protein

III

This is the collagen of granulation tissue, and is produced quickly by young fibroblasts before the tougher type I collagen is synthesized. Reticular fiber. Also found in artery walls, intestines and the uterus

IV

basal lamina; eye lens. Also serves as part of the filtration system in capillaries and the glomeruli of nephron in the kidney.

V

most interstitial tissue, assoc. with type I, associated with placenta

VI

most interstitial tissue, assoc. with type I

VII

forms anchoring fibrils in dermal epidermal junctions

VIII some endothelial cells

IX

FACIT collagen, cartilage, assoc. with type II and XI fibrils

X

hypertrophic and mineralizing cartilage

XI

cartilage

33

Bijlage XII Dot Blot. Materialen: PVDF membraan Monster 1e Antilichaam 2e Anitlichaam Melkpoeder PBS en PBS tween 0,1% 50 ml tube Versa Doc (Bio-Rad) ECL reagens Rollebank Procedure: Maak de juiste verdunning van de monsters in milli Q water. Activeer een PVDF membraan door 1 minuut in 100% methanol en 10 tot 15 minuten in blotbuffer te weken. Breng van elk monster een druppel op het membraan. Doe dit snel zodat het membraan niet uit kan drogen. Laat wel de druppels intrekken! Stop het membraan in een 50 ml tube en block met ca. 10 ml 3,5% melkpoeder. Doe dit gedurende ongeveer 60 minuten. Voeg het 1e antilichaam toe in de juiste verdunning (verdund in 3,5% melkpoeder) Was het blot 3x 5 min in PBS-tween voeg het 2e antilichaam toe in de juiste verdunning (verdund in 3,5% melkpoeder) Was het blot 2x 5 min in PBS-tween en 1x 5 min in PBS. Haal het membraan uit de buis en leg deze op een overhead sheet. Druppel ECL reagens over het membraan en laat 1 minuut inwerken. Neem een foto van het membraan met de Versa Doc (Bio-Rad). Doe dit ook snel want de chemoluminicentie dooft uit! Bij voorkeur de Versa Doc (BioRad) al voor deze stap instellen en scherpstellen op een controle kaart of iets anders wat fluoricerend is. Afbeelding:

Dot blot voorbeeld

34