HASIL Isolasi dan Identifikasi Cendawan Cendawan yang berhasil diisolasi dari larva A. aegypti instar III dan IV yang berasal dari lapangan berjumlah 9 isolat. Kesembilan isolat tersebut ialah Trichoderma sp., miselia sterilia, 3 isolat Mucor racemosus, Emericella nidulans, Aspergillus sp., Aspergillus niger, dan Penicillium sp. (Tabel 1). Tabel 1 Cendawan yang berhasil diisolasi dari larva A. aegypti pada instar III dan IV dari tiga lokasi di kota Bogor Kode Nomor isolat Cr/L3 Isolat 1 Cr/L3 Isolat 2 Isolat 3 Cr/L4 Bs/L3 Isolat 4 Bs/L4 Isolat 5 Isolat 6 Mt/L3 Mt/L4 Isolat 7 Mt/L4 Isolat 8 Mt/L4 Isolat 9 Keterangan: L3 = instar III L4 = instar IV
Isolat Trichoderma sp. Miselia sterilia Mucor racemosus Mucor racemosus Mucor racemosus Emericella nidulans Aspergillus sp. Aspergillus niger Penicillium sp. Cr = Curug Bs = Baranangsiang Mt = Menteng
Isolat 1 (Cr/L3) ialah Trichoderma sp. dengan ciri-ciri morfologi yang terbentuk pada media ADK sebagai berikut: warna koloni hijau, tekstur seperti bulu; konidia berwarna hijau tua, hialin; fialid tersusun berkelompok; konidiofor hialin, dan bercabang banyak (Gambar 2).
a
b c
10 um
Gambar 2 Struktur mikroskopis Trichoderma sp.: (a) konidia (b) fialid (c) konidiofor Perbesaran 400X.
a
Gambar 3 Struktur mikroskopis miselia sterilia: (a) hifa. Pebesaran 400X.
Tiga isolat yaitu isolat 3, 4 dan 5 ialah Mucor racemosus. Koloni ketiga isolat tersebut pada media ADK memiliki ciri-ciri: warna koloni putih, dan tekstur halus seperti kapas; hifa aseptat; kolumela terdapat di ujung hifa; dan sporangiospora berbentuk bulat (Gambar 4).
a b c 5 um
Gambar 4 Struktur mikroskopis Mucor racemosus: (a) spora (b) kolumela (c) sporangiofor. Perbesaran 400X.
Isolat 6 ialah Emericella nidulans dengan ciri-ciri morfologi yang terbentuk pada media ADK sebagai berikut: warna koloni hijau gelap dengan tekstur seperti beludru atau kapas; konidia hijau tersusun kolumner; biseriat, fialid memenuhi setengah permukaan vesikel; vesikel hemisfer; konidiofor halus, berlekuk-lekuk, dan berwarna coklat. Kleistotesium berwarna merah keunguan yang mempunyai askus berisi 4-8 askospora. Cendawan askomiset ini merupakan teleomorf dari Aspergillus nidulans (Gambar 5).
a Isolat 2 (CR-01) ialah miselia sterilia dengan ciri-ciri morfologi yang terbentuk pada media ADK sebagai berikut: warna koloni putih dengan tekstur halus seperti kapas; medium menjadi hitam pada bagian bawahnya apabila koloni sudah memenuhi seluruh permukaan agar yaitu 7 hari setelah inokulasi (Gambar 3).
b
e
c d
10 um
Gambar 5 Struktur mikroskopis A. nidulans (anamorf) : (a) konidia (b) fialid (c) vesikel (d) konidiofor (e) askus. Perbesaran 400X.
Isolat 7 ialah Aspergillus sp. Cendawan ini memiliki ciri-ciri morfologi yang terbentuk pada media ADK sebagai berikut: warna koloni hijau-kuning; tekstur seperti bulu; konidia hijau; susunan konidia radiat; uniseriat, fialid hampir memenuhi seluruh permukaan vesikel; vesikel bulat seperti bola; konidiofor kasar, berdinding tebal, dan berwarna hijau gelap (Gambar 6).
a
c
b
10 um
Gambar 6 Struktur mikroskopis Aspergillus sp.: (a) konidia (b) fialid (c) vesikel (d) konidiofor. Perbesaran 400X.
Isolat 8 ialah Aspergillus niger dengan ciri-ciri morfologi yang terbentuk pada media ADK sebagai berikut: warna koloni hitam; tekstur koloni seperti bulu; konidia hitam, susunan konidia radiat; biseriat, fialid memenuhi seluruh permukaan vesikel; vesikel bulat besar; konidiofor halus, berdinding tebal, berwarna coklat (Gambar 7).
c a b
Gambar
d 7
c d b
5 um
Gambar 8 Struktur mikroskopis Penicillium sp.: (a) konidia (b) fialid (c) percabangan (d) konidiofor. Perbesaran 400X.
d
10 um
a
Struktur mikroskopis A. niger: (a) konidia (b) fialid (c) vesikel (d) konidiofor. Perbesaran 100X.
Isolat 9 ialah Penicillium sp. Cendawan ini memiliki ciri-ciri morfologi yang terbentuk pada media ADK sebagai berikut: warna koloni hijau, teksturnya seperti bulu; konidia hijau, radiat; jarak antar fialid cukup rapat, berbentuk seperti botol dengan konidium di ujung-ujungnya; konidofor besekat (Gambar 8).
Pemeliharaan Nyamuk untuk Produksi Telur dan Uji Efikasi Pemelihaan nyamuk dilakukan mulai dari stadium telur, larva, pupa, hingga nyamuk dewasa. Jumlah telur yang diproduksi sebanyak ±4.000 butir. Telur-telur yang ditetaskan bersifat bebas dari infeksi patogen. Larva instar III dan IV yang terbentuk dari telur yang bebas patogen dipisah-pisahkan untuk uji efikasi isolat cendawan. Uji Efikasi 1 Skala laboratorium Dari uji efikasi pada skala laboratorium menunjukkan bahwa seluruh isolat cendawan yang berhasil diisolasi mempunyai kemampuan membunuh larva, baik larva instar III maupun larva instar IV dalam waktu 12 jam setelah inokulasi. Kematian larva berbanding lurus dengan konsentrasi cendawan. Patogenitas setiap isolat cendawan menunjukkan hasil yang berbeda nyata berdasarkan statistik pada taraf uji 5% (Tabel 2). Semakin tinggi konsentrasi cendawan yang diberikan maka akan semakin banyak pula larva yang mati (Tabel 2). Isolat cendawan yang digunakan untuk uji efikasi pada skala laboratorium membunuh larva instar III lebih banyak dibandingkan dengan larva instar IV. Dari sembilan isolat yang diuji, patogenitas cendawan dapat dikelompokkan kedalam tiga kelompok. Kelompok I yaitu A. niger, kelompok II yaitu Trichoderma sp., Emericella nidulans, Aspergillus sp., Penicillium sp., dan kelompok III yaitu 3 isolat Mucor racemosus, dan miselia sterilia.
Tabel 2 Persentase rata-rata kematian larva A. aegypti instar III dan IV akibat infeksi 9 isolat cendawan entomopatogen selama 12 jam setelah inokulasi Isolat Larva instar dan konsentrasi cendawan III IV 201.0 mm3 351.7 mm3 502.4 mm3 201.0 mm3 351.7 mm3 502.4 mm3 Trichoderma sp. 10.00cd 11.67de 16.67d 8.33c 10.00cd 13.33d Miselia sterilia
8.33d
10.00de
13.3de
6.67c
8.33de
10.00de
Mucor racemosus
6.67d
8.33def
11.67de
0.00d
6.67de
10.00de
Mucor racemosus
3.33d
3.33f
5.00e
0.00d
1.67e
3.33e
Mucor racemosus
5.00d
6.67ef
10.00de
0.00d
5.00de
8.33de
Emericella nidulans
11.67cd
13.33d
33.33c
8.33cd
11.67cd
28.33d
Aspergillus sp.
16.67bc
21.67c
28.33c
11.67c
16.67c
21.67c
Aspergillus niger
95.00a
100a
100a
88.33a
100a
Penicillium sp. 21.67b 45.00b 60.00b 16.67b 38.33b Keterangan : Angka-angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5%
Pada konsentrasi cendawan terendah yaitu 201.0 mm2 dengan waktu inkubasi 12 jam menunjukkan bahwa kelompok I yaitu A. niger mampu membunuh larva instar III dan IV paling tinggi dengan nilai masingmasing sebesar 95% dan 88.33%. Kelompok II yaitu Penicillium sp. memiliki daya bunuh relatif rendah terhadap larva instar III dan IV dengan nilai masing-masing sebesar 21.67% dan 16.67%. Isolat yang memiliki daya bunuh paling rendah pada kedua instar yang diuji yaitu, Mucor racemosus isolat 4 yang termasuk ke dalam kelompok III. Isolat tersebut hanya membunuh 3.33% larva instar III dan tidak mampu membunuh larva instar IV (0%) (Tabel 2). Pada konsentrasi cendawan 351.7 mm2 dengan waktu inkubasi 12 jam menunjukkan pola yang sama dengan konsentrasi 201.0 mm2. Kelompok I, A. niger mampu membunuh 100% larva instar III dan IV. Kelompok II, Penicillium sp. mampu membunuh 45% larva instar III dan 38.33% larva instar IV. Kelompok III, Mucor racemosus isolat 4 masing-masing mampu membunuh larva instar III dan IV yaitu sebesar 3.33% dan 1.67% (Tabel 2). Pada konsentrasi cendawan tertinggi yaitu 502.4 mm2 dengan waktu inkubasi 12 jam juga menunjukkan pola yang sama dengan perlakuan konsentrasi 201.0 mm2. Kelompok I, A. niger mampu membunuh 100% larva instar III dan IV. Kelompok II, Penicillium sp. mampu membunuh 60% larva instar III dan 55% larva instar IV. Kelompok III, Mucor racemosus isolat 4 masing-masing mampu membunuh larva instar III dan IV yaitu sebesar 5% dan 3.33% (Tabel 2).
100a 55.00b
2 Skala semi lapang 2a Perlakuan berbagai macam inokulum Dari pengamatan kematian larva yang dilakukan sampai 15 hari setelah inokulasi menunjukkan bahwa ketiga inokulum dari masing-masing isolat yaitu isolat yang diuji dan isolat pembanding menunjukkan hasil yang bervariasi. Semua perlakuan pada berbagai macam inokulum yaitu inokulum spora, miselia, dan campuran dapat membunuh larva. Inokulum campuran memiliki kemampuan membunuh larva instar III paling tinggi. Sedangkan inokulum spora mempunyai daya bunuh paling rendah pada kedua isolat yang diuji (Gambar 9 dan 10). Kemampuan membunuh setiap bentuk inokulum cendawan menunjukkan hasil yang berbeda nyata berdasarkan statistik pada taraf uji 5% (Gambar 9 dan 10). Pada inkubasi 24 jam setelah inokulasi, ketiga inokulum A. niger isolat 8 mampu membunuh larva instar III. Kematian larva yang tertinggi dan tercepat terjadi pada inokulum campuran. Pada inokulum campuran kematian larva terjadi sebanyak 95%. Inokulum miselia membunuh 64.67% sedangkan inokulum spora hanya membunuh 6% (Gambar 9). Hal yang sama juga terjadi pada isolat pembanding yaitu A. niger isolat 17. Inokulum campuran A. niger isolat 17 membunuh larva 81%. Inokulum miselia membunuh 10.7% sedangkan inokulum spora tidak mampu membunuh larva instar III (Gambar 10). Pada inkubasi lebih dari 24 jam setelah inokulasi, ketiga inokulum A. niger isolat 8 menunjukkan kematian larva instar III yang semakin meningkat hingga mencapai 77.33%100% pada hari ke-4 setelah inokulasi (Gambar 9). Hal yang sama juga terjadi pada A. niger isolat 17. Kematian larva instar III meningkat
yaitu sebesar 2.67%-100% pada hari ke-4 setelah inokulasi (Gambar 10). Pada perlakuan kontrol yang menggunakan media agar, tidak terjadi kematian larva sampai pada hari ke-5 setelah inokulasi. Pada perlakuan kontrol air tidak terjadi kematian larva sampai pada hari ke-3 setelah inokulasi. Namun pada hari ke-4 setelah inokulasi, pada kontrol air terdapat kematian sebesar 1.33% (Gambar 9 dan 10). Oleh karena itu data kematian pada perlakuan inokulum spora dan miselia pada gambar 9 dan 10 telah dikurangi dengan jumlah kematian larva pada kontrol.
P e r se n t a se k e m a t ia n ( % )
120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1
2
3
7 8 9 10 11 12 13 14 15 Waktu (hari ke-) Spora (108 spora/L) Miselium (47,5 gr) Campuran (508.68 cm3) Kontrol air Kontrol agar
Gambar 9
4
5
6
Persentase kematian larva A. aegypti instar III akibat infeksi A. niger isolat 8 pada 3 jenis inokulum berbeda.
P e r se n t a se k e m a t ia n ( % )
120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1
2
3
4
5
6
7 8 9 10 11 12 13 14 15 Waktu (hari ke-) Spora (108 spora/L) Miselium (47,5 gr) Campuran (508.68 cm3) Kontrol air Kontrol agar
Gambar 10 Persentase kematian larva A. aegypti instar III akibat infeksi A. niger isolat 17 pada 3 jenis inokulum berbeda.
2b Perlakuan berbagai macam konsentrasi dan media air Berdasarkan pengamatan kematian larva yang dilakukan sampai 15 hari setelah inokulasi menunjukkan bahwa kematian larva terjadi pada kedua media air yaitu media air kran steril maupun media air kran tidak steril yang digunakan dalam penelitian ini. Pada perlakuan berbagai konsentrasi yang digunakan menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi cendawan yang diberikan maka akan semakin tinggi pula larva yang mati (Gambar 11 dan 12). Kemampuan membunuh setiap bentuk inokulum cendawan pada berbagai macam konsentrasi menunjukkan hasil yang berbeda nyata berdasarkan statistik pada taraf uji 5% (Gambar 11 dan 12). Tabel 3 Persentase rata-rata kematian larva A. aegypti instar III pada konsentrasi dan media air yang berbeda akibat infeksi A. niger isolat 8 selama 24 jam setelah inokulasi Media air Inokulum steril nonsteril Spora (106 spora/L) 0.00d 0.00d Spora (108 spora/L) 6.67c 6.00c Spora (1010 spora/L) 72.00b 78.67b 85.33a 96.00a Spora (1012 spora/L) Campuran (127.17 cm3) 63.33c 75.33c 83.33b Campuran (254.34 cm3) 80.67b Campuran (381.51 cm3) 87.33ab 90.67ab 94.67a Campuran (508.68 cm3) 94.00a Kontrol 0.00d 0.00d Keterangan : Angka-angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5%
Data uji efikasi pada skala semi lapang pada inkubasi 24 jam setelah inokulasi menunjukkan bahwa kematian larva terendah yang terdapat pada media air kran steril dan tidak steril ialah masing-masing 63% dan 75%. Data tersebut diperoleh pada konsentrasi inokulum campuran terendah yaitu 127.17 cm3. Sedangkan kematian larva tertinggi dijumpai pada konsentrasi inokulum campuran tertinggi (508.68 cm3) baik pada media air kran steril maupun tidak steril yaitu sebesar 94%. Inokulum campuran dengan konsentrasi 254.34 cm3 mampu membunuh larva instar III lebih dari 80% baik dalam media air kran steril maupun tidak steril. Pada inokulum spora dengan konsentrasi terendah yaitu 106 spora/L baik pada media air kran steril maupun tidak steril ternyata tidak membunuh larva instar III. Sedangkan kematian larva tertinggi pada media air kran steril sebesar 85.33% dan pada media air kran tidak steril sebesar 96% pada konsentrasi inokulum spora tertinggi yaitu 1012 spora/L (Tabel 3).
P e r s e n t a s e k e m a t ia n ( % )
Setelah 24 jam inkubasi, pada media air kran steril kematian larva mencapai minimal 76% dan pada media air kran tidak steril mencapai 89.33% pada hari ke-5 setelah inokulasi. Kecuali pada perlakuan inokulum spora dengan konsentrasi 106 spora/L, yang hanya membunuh larva sebesar 1.33% pada media air kran steril maupun tidak steril. Pada konsentrasi 108 spora/L dan 1010 spora/L, kematian larva sebesar 76%-100% pada media air kran steril dan tidak steril pada hari ke-5 setelah inokulasi. Pada perlakuan kontrol air maupun kontrol agar, tidak terjadi kematian larva sampai pada hari ke-5 setelah inokulasi baik pada media air kran steril maupun tidak steril (Gambar 11 dan 12). 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1
2
3
4
5
6
7
8
Postulat Koch Cendawan yang tumbuh pada larva yang mati pada seluruh uji efikasi menunjukkan ciriciri yang sama dengan isolat yang sebelumnya diinokulasi ke dalam populasi larva. Hal ini menunjukkan bahwa kematian larva disebabkan oleh cendawan yang diinokulasikan ke dalam populasi larva. Kolonisasi Cendawan Entomopatogen pada Larva Nyamuk A. aegypti Cendawan entomopatogen yang digunakan untuk mempelajari proses kolonisasi pada larva A. aegypti instar III ialah A. niger isolat 8. Proses kolonisasi cendawan dimulai dari adanya kontak antara hifa atau konidia dengan larva melalui lubang spirakel/perispirakel pada kutikula (Gambar 13). Dari proses penempelan konidia, selanjutnya terbentuk hifa kecambah yang melakukan penetrasi pada kutikula larva dan membentuk apresorium di dalam tubuh larva A. aegypti. Selain itu, terdapat spora dalam jumlah cukup tinggi pada bagian dalam tubuh larva yang diduga berasal dari proses penelanan spora (Gambar 14).
9 10 11 12 13 14 15
a
Waktu (hari ke-) spora (106 spora/L) spora (1010 spora/L) Campuran (127.17 cm3) Campuran (381.51 cm3) Kontrol air
spora (108 spora/L) spora (1012 spora/L) Campuran (254.34 cm3) Campuran (508.68 cm3) Kontrol agar
tubuh larva
Gambar 11 Persentase kematian larva A. aegypti instar III akibat infeksi A. niger isolat 8 pada media air kran steril. tubuh larva
P e rs e n t a s e k e m a t ia n ( % )
120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
b
c
tubuh larva 1
2
3
4
5
6
7 8 9 10 11 12 13 14 15 Waktu (hari ke-)
spora (106 spora/L) spora (1010 spora/L) Campuran (127.17 cm3) Campuran (381.51 cm3) Kontrol air
d
spora (108 spora/L) spora (1012 spora/L) Campuran (254.34 cm3) Campuran (508.68 cm3) Kontrol agar
Gambar 12 Persentase kematian larva A. aegypti instar III akibat infeksi A. niger isolat 8 pada media air kran tidak steril.
Gambar 13 Kolonisasi A. niger ke dalam tubuh larva A. aegypti instar III pada pengamatan 1248 jam: (a) spora berkecambah (b) hifa eksternal (c) apresorium (d) hifa internal. Perbesaran 400x.
tubuh larva
k
Gambar 14 Konidia (k) A. niger yang terkumpul pada bagian saluran pencernaan larva A. aegypti instar III pada pengamatan 48 jam. Perbesaran 400x.
PEMBAHASAN Isolat cendawan yang diperoleh dari tiga lokasi di kota Bogor pada penelitian ini lebih sedikit bila dibandingkan dengan isolat yang berhasil diisolasi oleh Natalia (2000) dari lokasi yang sama. Natalia (2000) berhasil mengisolasi 24 isolat cendawan. Hal ini mungkin disebabkan karena sumber larva yang digunakan pada penelitian ini lebih sedikit yaitu hanya 2 macam instar (instar III dan IV) sedangkan Natalia (2000) mengisolasi cendawan entomopatogen dari 4 macam instar larva yaitu instar I, II, III, dan IV. Menurut Papp dan Darvas (2000) seluruh stadium dalam siklus hidup nyamuk dapat diserang oleh cendawan entomopatogen. Larva merupakan stadium yang paling rentan terinfeksi cendawan dibandingkan dengan stadium lainnya. Oleh sebab itu dalam penelitian ini digunakan nyamuk pada stadium larva. Kerentanan setiap jenis larva juga berbeda-beda. Larva instar II lebih rentan terhadap serangan cendawan entomopatogen dibandingkan dengan larva instar III dan IV (Natalia 2000). Hal ini diduga karena sistem kekebalan tubuh larva instar II belum sempurna dibandingkan dengan larva instar III dan IV. Larva instar I dan II tidak digunakan dalam penelitian ini karena ukurannya terlalu kecil sehingga menyulitkan dalam pengamatan. Menurut hasil analisis postulat Koch, larva yang mati pada uji efikasi baik pada skala laboratorium maupun semi lapang disebabkan oleh cendawan entomopatogen yang diinokulasikan. Hal ini ditunjukkan dengan ciri-ciri isolat yang berhasil diisolasi dari larva yang mati sama dengan ciri-ciri isolat yang diinokulasikan pada larva sehat.
Berdasarkan hasil uji efikasi yang dilakukan terhadap sembilan isolat cendawan entomopatogen yang berhasil diisolasi dalam penelitian ini menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi cendawan yang digunakan semakin tinggi pula tingkat kematian larva. Dari 9 isolat yang diperoleh, A. niger ialah isolat yang paling efektif membunuh larva pada semua tingkat konsentrasi yang digunakan pada instar III maupun IV. Hasil ini sesuai dengan yang dilaporkan Natalia (2000) bahwa A. niger merupakan isolat terbaik dari isolat yang berhasil diisolasi dengan kematian larva instar III dan IV sekitar 85% pada konsentrasi cendawan terendah yaitu 201.0 mm3 dalam waktu 12 jam setelah inokulasi. Kemampuan membunuh yang baik isolat A. niger kemungkinan besar karena isolat ini bukan merupakan kelompok dari cendawan oportunis yang hanya mampu membunuh larva ketika tubuh larva dalam keadaan lemah. Hasil dari pengujian efikasi pada skala semi lapang dengan perlakuan berbagai macam inokulum menggunakan dua isolat A. niger, menunjukkan hal yang sama dengan hasil uji skala laboratorium. Semakin tinggi konsentrasi inokulum cendawan dan semakin lama waktu inkubasi yang digunakan maka semakin tinggi pula kematian larva (Gambar 8 dan 9). Pengujian dengan menggunakan isolat A. niger (isolat 8 dari penelitian ini) dan A. niger (isolat 17, koleksi Bagian Mikologi) menunjukkan bahwa isolat 8 mempunyai daya bunuh yang lebih baik terhadap larva instar III pada semua jenis inokulum. Inokulum miselia tidak digunakan pada uji efikasi skala semi lapang dengan perlakuan berbagai macam konsentrasi dan media tumbuh larva karena beberapa hari setelah inokulasi, media tumbuh menjadi berbau busuk. Hal ini mungkin terjadi karena adanya proses fermentasi dari mikrob lain. Perlakuan dengan inokulum campuran, menunjukkan inokulum ini mampu membunuh populasi larva instar III diatas 80% dalam waktu 24 jam setelah inokulasi. Sedangkan efek pemberian inokulum spora baru dapat terlihat setelah 3-4 hari setelah inokulasi. Berdasarkan uji efikasi yang dilakukan pada skala semi lapang dengan perlakuan berbagai konsentrasi menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi cendawan dan semakin lama waktu inkubasi, tingkat kematian larva pada kedua macam media air kran steril maupun tidak steril semakin tinggi (Gambar 10 dan 11). Inokulum campuran memiliki daya bunuh yang lebih baik daripada inokulum spora. Hal ini mungkin disebabkan karena inokulum campuran mengandung lebih banyak jenis propagul yaitu
