HAPLOGROUP mtDNA MANUSIA ATAS DASAR RFLP DAN POSISI MUTASI URUTAN NUKLEOTIDA LENGKAP
TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung
Oleh Mastura NIM : 20504017 Program Studi Kimia
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2007
ABSTRAK HAPLOGROUP mtDNA MANUSIA ATAS DASAR RFLP DAN POSISI MUTASI URUTAN NUKLEOTIDA LENGKAP Oleh
Mastura NIM : 20504017 Mitokondria adalah organel sel eukariot yang berfungsi sebagai organ respirasi pembangkit energi dengan menghasilkan adenosine triphosphate (ATP). Urutan genom DNA mitokondria (mtDNA) manusia secara lengkap telah berhasil ditentukan yang dikenal dengan urutan nukleotida Cambridge Reference Sequence (CRS), dan menjadi rujukan standar dalam berbagai studi genetika molekul terutama yang berkaitan dengan polimorfisme mtDNA manusia. Peneliti-peneliti terdahulu telah menggunakan Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) sebagai salah satu metode untuk mengamati polimorfisme dalam studi antropologi molekul, dan metode tersebut sangat ampuh digunakan dalam menentukan elusidasi hubungan evolusi di antara kelompok etnis. Penelitian mengenai polimorfisme mtDNA manusia berdasarkan enzim restriksi di antaranya telah berhasil mengelompokkan populasi asli Amerika menjadi haplogroup A, B, C, dan D. Pada penelitian ini akan dilakukan penentuan haplogroup berdasarkan prinsip RFLP yang dilakukan atas dasar posisi mutasi dari urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia secara in silico. Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi penentuan jumlah, jenis dan posisi mutasi urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia menggunakan program Mito Mutation Analyzer (MMA), selanjutnya dilakukan penentuan haplogroup menggunakan empat belas enzim restriksi endonuklease. Enzim yang digunakan dalam penentuan haplogroup berdasarkan prinsip RFLP yaitu enzim HaeIII, AluI, HincII, HhaI, HaeII, HpaI, RsaI, MboI, AvaII, BamHI, NIaIII, HinfI, TaqI, dan AccI. Analisis 584 urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia dengan program Mito Mutation Analyzer (MMA) menghasilkan luaran berupa jenis, posisi dan jumlah mutasi, insersi serta delesi. Jumlah mutasi tertinggi sebanyak 129 titik, sedangkan jumlah terendah 12 titik. Penentuan haplogroup berdasarkan posisi mutasi dari urutan nukleotida lengkap menggunakan empat belas enzim restriksi memberikan hasil berupa haplogroup yang sangat bervariasi. Hasil penelitian menunjukan haplogroup terbanyak sampai yang terendah masing-masing secara berturut-turut terdapat pada individu yang memiliki satu haplogorup yaitu haplogroup H dan F, diikuti dengan individu yang memiliki dua haplogroup: EH, HL, HV, HI, HU, HX, FH, dan DE, selanjutnya individu yang termasuk ke tiga haplogroup: HJT, HIL, EHL, DEH, CEH, FHI, dan individu yang memiliki empat haplogroup: FHJT, HJLT, EHIL, EHJT, AEHL, FHIL. Terdapat sejumlah individu yang tidak termasuk ke haplogroup manapun, sedangkan sisanya individu yang belum di ketahui suku bangsanya.
Atas dasar enzim restriksi, setiap sampel ditentukan haplogroupnya. Haplogroup yang tingkat kesamaannya paling tinggi dengan haplogroup RFLP secara berturutturut masing-masing terdapat pada individu yang memiliki satu haplogroup, selanjutnya individu yang termasuk ke dalam dua haplogroup, tiga haplogroup dan individu yang memiliki empat haplogroup. Terdapat individu yang tidak termasuk ke haplogroup manapun. Di lihat dari segi jumlah dan tingkat kesamaannya, ternyata haplogroup RFLP hanya sesuai untuk individu yang memiliki satu haplogroup, sedangkan sisanya tidak mempunyai sesuatu yang spesifik untuk dapat digolongkan ke dalam group tertentu, karena sebagian besar individu memiliki lebih dari satu haplogroup sehingga individu tersebut dapat masuk ke haplogroup manapun. Atas dasar penelitian ini dapat ditarik kesimpulan bahwa sebagian haplogroup sesuai dengan haplagroup RFLP dan sisanya tidak sesuai dengan haplogroup RFLP. Untuk individu yang tidak termasuk ke haplogroup tertentu, kemungkinan dapat dibuat haplogroup baru berdasarkan posisi mutasi urutan nukleotida yang spesifik atau berdasarkan sisi pemotongan dari enzim restriksi yang terdapat pada urutan nukleotida mtDNA tersebut. Kata kunci : metode RFLP, haplogroup, urutan nukleotida lengkap, mtDNA manusia
ABTRACT HUMAN mtDNA HAPLOGROUP BASE ON RFLP AND NUCLEOTIDE SEQUENCE MUTATION
By Mastura NIM : 20504017 Mitochondria is an organelle of the eukaryote cell that functions as the energy generating system which produce adenosine triphosphate (ATP). The complete sequence of genome human DNA mitochondria (mtDNA) have been determined and recognized as the Cambridge Reference Sequence (CRS) nucleotide sequence, and become the standard reference in molecular genetics study especially related to human mtDNA polymorphism. Preview researchers used RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) as one of the methods to determine the evolution relationship among ethnical groups. Research concerning human mtDNA polymorphism base on restriction enzyme have succeededly grouped the original population of America into haplogroup A, B, C, and D. The research consist of several and takes, namely determination of amount, complete nucleotide sequence mutation position and type of human mtDNA using a mito mutation analyzer (MMA) programe, and determination of the haplogroup by using 14 endonuclease restriction enzymes. The enzymes used are HaeIII, AluI, HincII, HhaI, HaeII, HpaI, RsaI, MboI, AvaII, BamHI, NIaIII, HinfI, TaqI, and AccI The analysis of 584 the nucleotide sequence of human mtDNA using the above software revealed the amount and the position of mutation and also the insersion or deletion. The highest amount of the mutation is 129 position with the lower is 12 position. The determination of haplogroup base on the mutation position of the complete nucleotide sequence showed variative haplogroups. Based on this analysis almost all the samples could be associated into several haplogroups and some sample could be long to more than one haplogroups. Majority of samples belong to one haplogroups, namely H and F haplogroups, and the rest of sample belong to two, three, and four haplogroups respectively. The higst degree of similarity between haplogroup in this research and those which based on RFLP are shown in individuals owning one haplogroup. It could be concluded due to excistence of individual owning more than one haplogroup or individual withoud any haplogroup, a new haplogroup based on nucleotide mutation showed be created. Keyword : RFLP method, Haplogroups, complete sequence nucleotide, human mtDNA
HAPLOGROUP mtDNA MANUSIA ATAS DASAR RFLP DAN POSISI MUTASI URUTAN NUKLEOTIDA LENGKAP
Oleh
Mastura NIM : 20504017 Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung
Menyetujui Pembimbing
Tanggal…………………………
(Achmad Saifuddin Noer, Ph.D)
PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Tekonologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Direktur Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung
LEMBARAN DEDIKASI
”Bukankah Kami telah melapangkan untukmu dadamu, dan Kami telah menghilangkan darimu bebanmu, yang memberatkan punggungmu, dan Kami tinggikan bagimu sebutan namamu, karena sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan, sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan, maka apabila kamu telah selesai (dari suatu urusan), kerjakankah dengan sungguhsungguh (urusan) yang lain, dan hanya kepada Tuhanmulah hendaknya kamu berharap”.(Alam Nasyrah 1-8) Kupersembahkan kepada suami tercinta, yang telah mendampingiku dengan penuh cinta dan kasih sayang,.…, semua itu bagaikan mutiara yang menyinari hatiku serta anak-anakku tersayang Yusuf dan Syamil, kalian adalah permata di dalam hatiku......
UCAPAN TERIMA KASIH Segala puji bagi Allah SWT karena telah memberikan karunia dan rahmat-Nya yang tak terhingga kepada penulis. Rasa syukur yang sedalam-dalamnya, karena atas Karunia-Mu maka dapat kutuliskan kata-kata ini sampai menjelang akhir penantianku untuk menyelesaikan pendidikan S2 ini. Engkau menjadi penerang di saat hatiku mulai gelisah. Engkau menjadi kekuatannku disaat aku mulai lemah dan tidak berdaya, cahaya di dalam kegelapan, tempat bersandar di tengah kegalauan, tempat meminta disaat kesusahan, tempat mengadu dikala duka menyergap. Segala puji bagi Allah, hanya karena Rahmat-Mu aku dapat menjalani semua ini dengan hati yang penuh harapan dan impian akan masa depan yang lebih baik, untuk ku dan untuk orang-orang yang mencintai dan menyayangiku dengan sepenuh hati.
Rasa terimakasih yang tak terhingga penulis haturkan kepada Bapak Dr. Achmad Saifuddin Noer, yang telah membimbing penulis dalam menyelesaikan tesis ini dengan penuh kesabaran, pengertian dan kebijaksanaan, hanya Allah yang dapat membalas atas semua ilmu yang telah Bapak berikan kepada penulis, Bapak adalah ”Good Father for me”
Pada kesempatan ini penulis juga ingin menyampaikan rasa terimakasih kepada semua pihak yang telah ikut memotivasi, membantu dan memberikan wawasan ilmu untuk penulis khususnya kepada : 1. Direktur Program Pascasarjana ITB dan seluruh staf yang telah memberikan kesempatan untuk mengikuti Program Magister Kimia dan telah membantu kelancaran proses studi dan penelitian
2. Dirjen DIKTI Depdiknas dan Pimpinan Proyek BPPS atas bantuan beasiswa selama proses studi berlangsung 3. Ketua Departemen Kimia, Pengelola Program Magister Kimia, Ketua Bidang Biokimia, Kepala Laboratorium dan seluruh dosen berserta karyawan di Departemen Kimia,
atas segala bentuk pelayanan yang diberikan selama
pendidikan. 4. Staf dosen Biokimia-ITB, Bapak Dr. Akhmaloka, Ibu Dr. Dessy Natalia, Bapak Dr.Rukman Hertadi, Ibu Dr. Fida Madayanti, Bapak Dr. Zeily Nurachman, Bapak Dr. M. Abdulkadir M dan seluruh dosen kimia atas segala wawasan akademis yang sangat bermanfaat bagi penulis. 5. Bapak Drs.H.Jalaluddin Raden,MM, Kepala SMA Negeri 3 Langsa atas izin dan pengertiannya terhadap penulis 6. Ibu Dr. Yoni F Syukriani atas sampelnya juga motivasi, saran dan bantuan yang diberikan untuk penulis 7. Mba Vera, Pak Savante, Mba Hira dan Mba Prima, Pak Tanto atas segala bantuannya 8. Adik-adikku yang sangat baik hati: Faika, yang terbaik dan tak terlupakan, Ira dan Mery yang selalu membantu, hanya Allah yang dapat membalas semua kebaikan kalian 9. Rekan-rekan S2 2004, Pak Ari, Pak Rafi, Dini, Anne, Eka dan rekan S2 2005, Indira, Dwita, Ira, Puti dan Anton atas semua saran, bantuan serta diskusinya yang menyenangkan 10. Adikku Karima Yolita atas program “MMA”nya yang sangat membantu
11. Teristimewa kepada suami tercinta atas dukungan, pengorbanan, pengertian, kesetiaan dan doanya, serta permata hatiku Yusuf dan Syamil yang selalu menemaniku dengan penuh senyum dan tawa, kalian semua adalah penyemangatku.. 12. Seluruh keluargaku terutama Ibu, Ibu dan Bapak mertuaku atas doanya yang setiap saat untuk keberhasilanku. Kak ina, Bang Zakir, Bang Mahlil, atas bantuan moril, juga adikku Maskur dan Maulizar
Penulis tidak mampu membalas semua kebaikan ini, hanya Allah yang dapat membalasnya. Akhirnya penulis mengharapkan semoga penelitian ini dapat memberikan konstribusi berarti dalam khasanah ilmu pengetahuan khususnya dalam bidang Biologi molekul dan bioinformatik dewasa ini dan dimasa mendatang.
Bandung, September 2007
Penulis
DAFTAR ISI ABSTRAK .......................................................................................................................
ii
ABSTRACT.....................................................................................................................
iv
PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS .............................................................................
vi
UCAPAN TERIMAKASIH.............................................................................................
viii
DAFTAR ISI....................................................................................................................
x
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................................
xii
DAFTAR GAMBAR DAN ILUSTRASI ........................................................................
xiii
DAFTAR TABEL............................................................................................................
xiv
DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG ..................................................................
xv
BAB I
Pendahuluan.....................................................................................................
1
I. I
Latar Belakang.................................................................................................
1
I.2
Rumusan Masalah............................................................................................
2
I.3
Tujuan Penelitian.............................................................................................
2
I.4
Ruang Lingkup Penelitian ...............................................................................
3
I.5
Strategi Penelitian............................................................................................
3
I.6
Sistematika Tesis .............................................................................................
3
BAB II
Tinjauan Pustaka..............................................................................................
4
II.1
Mitokondria .....................................................................................................
4
II.2
Fungsi Mitokondria .........................................................................................
5
II.3
Genom Mitokondria ........................................................................................
6
II.4
Sifat Genetik Mitokondria ...............................................................................
8
II.5
Laju Mutasi mtDNA........................................................................................
9
II.6
Haplogroup mtDNA ........................................................................................
10
II.7
Analisis Variasi mtDNA dengan Metode RFLP .............................................
11
II.8
Program Mito Mutation Analyzer (MMA) ......................................................
12
II.9
Basis Data ........................................................................................................
13
BAB III Metodologi Penelitian......................................................................................
14
III.1 Analisis Urutan Keseluruhan mtDNA manusia Menggunakan Program MMA ...............................................................................................................
14
III.2 Penentuan Haplogroup mtDNA Manusia dengan Enzim Restriksi.................
14
BAB IV Hasil dan Pembahasan .....................................................................................
16
IV.1
Analisis Urutan Nukleotida Lengkap dengan Metode MMA .......................
16
IV.2 Penentuan Haplogroup dengan Enzim Restriksi Endonuklease......................
18
BAB V
Kesimpulan ......................................................................................................
31
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................................
32
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................................
35
DAFTAR LAMPIRAN LAMPIRAN A Haplogroup mtDNA Manusia yang Di analisis dengan Enzim Restriksi....................................................................................
36
LAMPIRAN B Individu yang Memiliki Satu Haplogroup...........................................
48
LAMPIRAN C Individu yang Memiliki Dua Haplogroup ...........................................
51
LAMPIRAN D Individu yang Memiliki Tiga Haplogroup...........................................
54
LAMPIRAN E
Individu yang Memiliki Empat Haplogroup .......................................
57
LAMPIRAN F
Urutan Nukleotida Lengkap mtDNA Manusia ...................................
58
LAMPIRAN G Suku Bangsa ........................................................................................
71
LAMPIRAN H File Sampel Urutan Nukleotida yang telah Selesai Diedit .................
84
LAMPIRAN I
File Sampel Urutan Nukleotida yang telah Dianalisis dengan Program MMA ....................................................................................
LAMPIRAN J
86
Hasil Analisis Urutan Nukleotida Lengkap dengan Empat Belas Enzim Restriksi....................................................................................
88
LAMPIRAN K Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Satu Haplogroup .................................................................. LAMPIRAN L
90
Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Dua Haplogroup ..................................................................
92
LAMPIRAN M Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Tiga Haplogroup..................................................................
94
LAMPIRAN N Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Empat Haplogroup...............................................................
96
LAMPIRAN O Individu yang Tidak Termasuk ke Haplogroup Manapun...................
98
DAFTAR GAMBAR DAN ILUSTRASI Gambar II. 1 Struktur dan Organisasi Fungsional mtDNA Manusia ........................... 7 Gambar IV.1 Urutan Nukleotida Lengkap yang belum diedit ...................................... 16 Gambar IV.2 Urutan Nukleotida Lengkap yang telah selesai diedit............................. 17 Gambar IV.3 Urutan Nukleotida Lengkap yang telah Dianalisis dengan Program MMA ........................................................................................ 18 Gambar IV.4 Hasil Analisis Urutan Nukleotida Lengkap dengan Enzim Restriksi ....................................................................................... 20 Gambar IV.5 Salah Satu Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Satu Haplogroup .............................................. 21 Gambar IV.6 Salah Satu Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Dua Haplogroup............................................... 23 Gambar IV.7 Salah Satu Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Tiga Haplogroup .............................................. 25 Gambar IV.8 Salah Satu Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Empat Haplogroup ........................................... 27
DAFTAR TABEL Tabel II. 1 Perbedaan kodon mtDNA manusia dengan kodon universal .......................9 Tabel II. 2 Perbedaan karakteristik DNA inti dan DNA mitokondria manusia .............10 Tabel IV.1 Haplogroup, enzim restriksi, sisi pemotongan, jenis dan posisi mutasi Urutan nukleotida .........................................................................................19 Tabel IV.2 Contoh beberapa Individu yang Memiliki Satu Haplogroup........................22 Tabel IV.3 Contoh beberapa Individu yang Memiliki Dua Haplogroup ........................24 Tabel IV.4 Contoh beberapa Individu yang Memiliki Tiga Haplogroup .......................26 Tabel IV.5 Contoh beberapa Individu yang Memiliki Empat Haplogroup ....................28 Tabel IV.6 Jumlah Haplogroup yang Sesuai dan Tidak Sesuai dengan Haplogroup RFLP.........................................................................................29
DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG SINGKATAN
NAMA
Pemakaian pertama kali pada halaman 1
ATP
Adenosine triphosphate
mtDNA
DNA mitokondria
1
DNA
Deoxyribonucleic acid
1
CRS
Cambridge reference sequence
1
RFLP
Restriction fragment length polymorphism
1
MMA
Mito mutation analyzer
3
kDa
Kilo Dalton
4
ADP
Adenosine diphosphate
5
NADH
Nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen
6
FADH2
Flavine adenine dinucleotide hydrogen
6
ND
NADH dehydrogenase
6
H
Heavy
6
L
Light
6
RNA
Ribonucleic acid
6
tRNA
Transfer RNA
6
rRNA
Ribosomal RNA
6
SNP
Single nucleotide polymorphism
10
HincII
Haemophilus influenza Rc
11
HpaI
Haemophilus parainfluenzae
11
Hinf I
Haemophilus influenzae Rf
11
BamHI
Bacillus amyloliquefaciens H
11
HhaI
Haemophilus haemolyticus
11
HaeII
Haemophilus aegypticus
11
MboI
Moraxella bovis
11
AluI
Arthrobacter luteus
11
HaeIII
Haemophilus aegypticus
11
AvaII
Anabaena variabilis
11
RsaI
Rhodopseudomonas sphaeroides
11
TaqI
Thermus aquaticus
11
