Hallás és szenzorineurális halláskárosodások – a gyógyszeres terápia lehetőségének kutatása
Zelles Tibor SE, Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézet 2017-4-19
A halláskárosodás jelentősége A leggyakoribb emberi szenzoros deficit
•
Az európai népesség >10 % érintett (>40 millió ember)
•
Befolyásolja a beszéd kialakulását, a kognitív fejlődést és a tanulást
•
Hátrányosan befolyásolja a mindennapi életet, gyakran vezet depresszióhoz idős korban
•
Becslések szerint a kezeletlen halláskárosodások évente több mint 90 milliárd € költségterhet jelentenek az EU-nak A vakság elszigetel a tárgyaktól. A süketség elszigetel az emberektől. (Imanuel Kant)
Halláskárosodások
• Vezetéses
• Szenzorineurális ▫ ▫ ▫ ▫
Zajkárosodás Presbycusis Ototoxicitás (pl. aminoglikozid, cisplatin) Egyéb (pl. genetikai okok, autoimmun, CMV)
Percepciós halláskárosodások (SNHL)
• Akut: • 5-20 / 100.000 (1977) • 160 / 100.000 (2009)
• 65 év feletti lakosság ~40%-t érinti * American Speech-Language-Hearing Association
Polony G., PhD védés, 2015
Növekvő társadalmi jelentőség „Hearing loss is projected to be among the top ten causes of burden of disease in high- and middle-income countries”
DALY (Disability-Adjusted Life Year) = years lived with disability + years of life lost Mathers & Loncar, PLOS Med, 2006
A szenzorineurális halláskárosodások aktuális terápiás lehetőségei* Megelőzésére és gyógyítására nincs hatékony gyógyszeres terápia. Akut esetben:
• Spontán javulás 32-65 %-ban (?)
• Kortikoszteroid kezelés
• Szisztémás: hatékonyság ???, ajánlható • Intratimpanális: > placebo
• Egyéb gyógyszeres lehetőségek • • • • •
Antivirális, Trombolitikus, Értágító, Vazoaktív anyagok és Antioxidánsok
alkalmazása nem javasolt (Stachler et al., 2012)
• Hiperbárikus O2 terápia: drága, hatékonyság??? – nem javasolt
Krónikus esetekre: nincs hatékony gyógyszeres kezelés. Egyetlen lehetőség: hallásjavító eszközök *American
Academy of Otolaryngology – Head and Neck Surgery Foundation érvényben lévő 2012-es szakmai irányelve alapján
Polony G., PhD védés, 2015
Békésy György - Georg von Békésy (Budapest, 1889.VI.3. - Honolulu, 1972.VI.13.)
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1961 "for his discoveries of the physical mechanism of stimulation within the cochlea"
Az egér alkalmas modell állat Ember
Egér (NMRI)
TheSciOfNature_61p506_1974_GünterEhret_AgedependentHearingLossInNormalHearingMice
Lateral olivocochleáris efferensek (LOC) Otoprotekció az IHC-SGC transzmisszió gátlásán keresztül
LOC terminálisok → CAP (zaj → Compound Action Potential )
DA receptor agonisták → hallóideg tüzelés
-
DA receptor agonisták → kóros struktúrális és funkcionális változások Lendvai et al., Neurochem Int, 2011 D’Aldin, EurArchOtorhinolaryngol, 1995; HearRes, 1995; Gil-Loyzaga, ActaOtolaryngol, 1995; Oestreicher, HearRes, 1997; Puel, HearRes, 1988; Pujol, ActaOtolaryngol, 1993
A LOC terminálisok DA felszabadításának első neurokémiai bizonyítéka, tengerimalac cochlea Vizi Szilveszter csoportja: Gáborján et al., Neuroscience, 1999
In vitro superfusion
[3H]DA release
Potenciális otoprotektív farmakoterápia emelni az endogén DA felszabadulást a LOC terminálisokból Isolated cochlea
1 mm
afferent terminal axon terminals Ribbon synapse
IHC
Halmos et al., Neuroscience, 2005 Doleviczényi et al., Neurosci Lett, 2005 Halmos et al., Neuroscience, 2008 Doleviczényi et al., Neurochem Res, 2008 Lendvai et al., Neurochem Int, 2011
A hallás objektív vizsgálata (objektív audiometria): auditoros agytörzsi kiváltott válasz (ABR) mérés altatott egéren
Hallásküszöb meghatározás
1 uV
1 uV 3 ms
3 ms
SNHL modellek: egy károsító tényezővel (pl. kanamycin, zaj, életkor előrehaladása) rontjuk a hallást Aminoglikozid példa: 2 hét kanamycin kezelés hallásküszöb eltolódást okoz
Kontroll
Kanamycin 800 mg/kg
1 uV
3 ms
Hallásküszöb eltolódás = küszöb kezelés után – küszöb kezelés előtt
In vivo SNHL modellek
1. Aminoglikozid (kanamycin) modell 2. Zaj okozta halláskárosodás (NIHL) modell 3. Időskori halláskárosodás (AHL) modell
1. A Rasagilin és egy másik kísérleti vegyület védő hatású az aminoglikozid okozta halláskárosodásban
Polony et al., Neuroscience, 2014
2. A zaj okozta halláskárosodás (NIHL) modell „Noise-box”: homogén zajtér, zajterhelés egyszerre akár 20 egérnek (fájdalomküszöb alatti zajterhelés – éber állatok) – Márki Ferenc, Firtha Gergely
állítható zajparaméterek (hangnyomás, frekvenciatartomány, zajterhelés ideje)
A zajszint és a spektrum folyamatos
ellenőrzése és regisztrálása zajszintmérővel Átmeneti (TTS) és permanens (PTS) hallásküszöb eltolódás mérése ABR módszerrel
Zajexpozíció Akut zajexpozíció
Krónikus zajexpozíció
Ismételt mérsékelt zajexpozíció
Egyszeri zajexpozíció okozta tartós halláskárosodás (PTS) modell
98 dB, 8-16 kHz, fehér zaj, 30 perc
Compound A védő hatása - egyszeri zajexpozíció
Hallásküszöb eltolódás (dB)
1. nap
30. nap (PTS)
1. nap
30. nap (PTS)
ANOVA és Bonferroni post hoc test
Zajszintmérés – akusztikus csoport 21 rendezvényen – 25 műszeres zajmérés
Gáborján Anita és mtsai (SE Fül-Orr-Gége Klinika)
Kategóriajel
A
dB*
A rendezés, részvétel feltételei
76 Gyermekek a rendezvényen korlátozás alatt nélkül részt vehetnek
76-85
gyermekek részvétele 2 óránál hosszabb műsor esetén nem ajánlott
C
86-93
18 év alattiak gyermekek részvétele 1 óránál részvétele esetén a hosszabb műsor esetén nem ajánlott. legnagyobb 1 óránál hosszabb tartózkodás esetén L nem lehet hallásvédő eszköz használata javasolt C,peak 125 dB-nél nagyobb
D
94-99
B
E
gyermekek részvétele nem ajánlott hallásvédő eszköz 99 gyermekek részvétele használata fölött nem ajánlott javasolt
Biztosítani kell, hogy a közönség ne tudja megközelíteni a hangsugárzókat 5 m-en belül
Biztosítani kell, hogy a közönség ne tudja megközelíteni a hangsugárzókat 15 m-en belül
Gáborján Anita és mtsai (SE Fül-Orr-Gége Klinika)
Ismételt, mérsékelt zajexpozíció modell
95 dB, 4-20 kHz, fehér zaj, 15 perc
Ismételt, mérsékelt zajexpozíció modell egyszeri zaj kiválasztása
n=3-6
Ismételt, mérsékelt zajexpozíció modell egyszeri zaj ismétlése
n=3-6
3. DBA/2J és BALB/c egerek az életkorral összefüggő halláskárosodást mutatnak (AHL); a DBA/2J progresszívebben
3. AHL elleni védő hatás tesztelése DBA/2J egerekben
3. AHL elleni védő hatás tesztelése BALB/c egerekben
Hallásküszöb eltolódás (dB)
*
*
* *
****
****
*** *
* *** *
*** *
****
****
Életkor (hetek)
**
****
* *
**** ****
****
Funkcionális imaging vizsgálatok halló egér hemicochlea preparátumon
Hemicochlea preparátum, Ca2+ indikátor töltés • •
Kifejlett hallású egerek (> P15)→ Érett Corti-szerv Megtartott anatómiai struktúra
•
Bulk loading
• •
Egysejt elektroporáció (Nevian & Helmchen 2007) Jóbb jel-zaj arány
4x-es objektív
300 μm 40x-es objektív
TM
OHCs
IHC IPC
DCs OPCs BM
30 μm
Az újszülött egerek süketek. A ~normál hallásuk P13-15 után kezdődik
• P8 – cochlea fő struktúrái kialakultak
Egér audiogrammok – korfüggés
• P9 - IHC elektromosan aktív • P9 – Nuel tér megnyílik
• P10 – BM & SG kialakult; külső hallójárat megnyílik • >P10 - AP-ok a n. VIII-ban • P14 – optimális érzékenység 15 kHz-nél megjelenik
P17-19
• P18 – utolsó mitózis a Cortiban
G Ehret, J Am Audiol Soc, 1976
Az ATP befolyásolja az endolympha K+ koncentrációját és az endocochleáris potenciált
Mammano, Physiology, 2007
Fiziológiás inger – ATP és a purinerg jelátviteli rendszer • Purinerg rendszer: ionotróp (P2X) és metabotróp (P2Y) receptorok → szerep a fejlődésben,
támasztósejtek közötti kommunikációban, zaj elleni védelemben • Intracelluláris Ca2+ szint növekedés, • belső raktárak ürítése
• sejtmembránon levő ioncsatornák
Hensen sejt
Deiters sejt
OGB-1
Fura2/K+
nyitása
Az ATP reverzibilis & ismételhető Ca2+ tranzienst vált ki a Corti szerv támasztósejtjeiben
Horváth et al., Neurochem Res, 2016
Az ATP kiváltotta Ca2+ tranziensek extracelluláris Ca2+ & intracelluláris Ca2+ raktár függők
Horváth et al., Neurochem Res, 2016
Elektroporációs Ca2+ indikátor töltés
Támasztó sejtek - Deiters sejt Kevésbé kutatott terület – szemben a szőrsejtekkel Aktív cochleáris mikromechanika
Passziv cochleáris mikromechanika
Tápanyag ellátás, metabolitok eltávolítása
Cochlea fejlődése
Endolympha K+ homeosztázis – hallás érzékenységének szabályozása – zaj elleni védelem Endolympha és perilympha ionösszetételének fenntartása Deiters sejt Ca2+ indikátorral töltve phalangeális nyúlvány
10 µm
DC nyúlvány és sejttest ATP válasz - Időeltolódás
0,2 ΔF/F0
Deiters’ sejt
0.6
20 s 0.4
0.2
0.0
2680
2700
2720
2740
2760
0.20 0.10 0.00
-0.10
5s
2710 2715 2720 2725 2730
(100 µM ATP, n=40, sejttest késésének átlaga = 5.28 s, S.E.M. = 0.7; p = 1.59*10-9)
2780
2800
A perfúzió iránya nem befolyásolja a késést
Megfordított áramlású kamrával: Ca2+ válasz késés
out
in
in
2s
out (40)
(11)
A két kísérleti felállásban a késés mértéke azonos (p=0,23)
A jelenség általánossága és koncentráció-függetlensége Beltenyésztett egértörzs → mutáció? Purinerg receptorok ATP koncentráció érzékenysége Ca2+ válasz késés
2s (6)
(24)
(40)
(3)
(5)
(6)
(8)
(18)
(7)
10
50
100
10
50
100
10
50
100
BALB/c (beltenyésztett)
C57Bl/6 (beltenyésztett)
ATP (µM)
CD1 (nem beltenyésztett)
Az adenozin receptorok aktivációja nem járul hozzá a Ca2+ válasz kialakításához
ATP
1 ATP
Adenosine
ATP
8-SPT
0,8
ATP
0.20 0.10 0.00
0,4
sec
ROI-background
0,6
10
-0.10 2710 2715 2720 2725 2730
8
0,2
∆F/F0
6 0 0,8 0,6
sec
4 2 0
0,4
Nincs válasz 11/12 kísérletben 100 s-on időablakon belül
0,2 0
8-SPT nem okoz jelentős változást sem az amplitúdó értékekben, sem a késés mértékében
Genetikailag módosított (KO) egerek – a hallás érintettségének vizsgálata
Pejvakin KO
A zajexpozícióval szembeni túlérzékenység oka a pejvakin függő peroxiszóma proliferáció károsodása & nem a mitokondrium károsodás okozta ROS túlprodukció
Delmaghani et al., Cell, 2015
m mérés (Rh123) a Corti szervben & a SG-ban emberi SNHL modelljében (pej -/-)
Delmaghani et al., Cell, 2015
Caskin KO
CASK • Ca2+/kalmodulin-dependens szerin protein kináz, adaptor protein • Nagy mennyiségben fordul elő az IR-ben • Megtalálható szomatodendritikusan, pre- ill. posztszinaptikusan
Funkciói: • • • •
Génátírás szabályozása Axonok kifejlődésének segítése Fehérje transzport Szinaptikus interakciókban való részvétel, szinapszis formálás
CASK gén deléciójaabnormális szinaptikus funkció, perinatális halál (egerekben)
CASK a fülben • Megtalálható a hallópálya szinapszisaiban • Külső és a belső szőrsejtek sztereocíliumaiban
• Kapcsolatba lép a whirlinnel, presztinnel, protein 4.1 N-el, melyek hibás működése halláskárosodással jár
Caskin •
Horgonyzófehérje, két izomer (Caskin 1,2)
•
Preszinaptikusan, posztszinaptikus denzitásban fordul elő
•
2 izoforma. Caskin 1: agyban, neuropilben, főleg szomatodendritikusan
•
A CASK Ca2+/kalmodulin doménjével kapcsolódik
– EphrinB1-R– Nck adaptor protein – Caskin 1 kapcsolat szerepe lehet a dendritek
citoszkeletális szerkezetének kialakításában – Retina ribbon szinapszisai (CASK és Caskin) Ribbon szinapszis a fülben
Caskin – WT vs KO
Caskin KO Click
100
11
** 5
60
2
Hallásküszöb (dB)
80
*** 7
40
0 0
7
6
**
12 16 13 4 9
5
60
40
40
20
20
0 10
15
20
***
0 0
5
10
32 kHz
100
**
***
80
** ***
*
15
20
0
80
***
60
40
40
40
20
20
20
0 10
15
20
10
15
20
**
***
15
20
***
60
0 5
5
65 kHz
100
*
60
0
***
7
*** 80
80
***
12
16 kHz
100
***
2
6 20
**
60
***
4
20
20
15
8 kHz
100
***
1
***
Caskin WT
4 kHz
100
80
Caskin HZ
0 0
5
10
15
20
Állatok életkora (hónapok)
0
5
10
Amplitúdó (nV)
Fiatal Caskin 1,2 KO és a heterozigóta (HZ) állatok amplitúdó értékei (30 dB; click stim)
Állatok életkora (hónapok)
Látencia (ms)
Fiatal Caskin 1,2 KO és a heterozigóta (HZ) állatok látencia értékei (30 dB; click stim)
Állatok életkora (hónapok)
PACAP KO
PACAP Kollaborációs partner eredményei (Dr. Reglődi Dóra csoport) • A glukagon/szekretin/VIP peptidcsalád tagja
• Legnagyobb
mennyiségben
az
idegrendszerben
endokrin mirigyekben • PAC1 és VPAC1, VPAC2 receptorok • Neurotrofikus, neuroprotektív, antiapoptotikus • Általános citoprotektív: cardiovaszkuláris, urogenitalis,
gastrointestinalis • Védő hatás az érzékszervekben
és
az
PACAP-ot expresszáló sejtek
PACAP – WT vs KO
Köszönetnyílvánítás
Márki Ferenc Firtha Gergely
Augusztinovicz Fülöp
Berekméri Eszter
Kollaborátorok:
Humli Viktória
Szepesy Judit -
Tamás László, Gáborján Anita, Polony Gábor, (SE, Fül-Orr-Gége Kl.)
Király Kornél Köles László
Vizi E. Szilveszter, Zsilla Gabriella (MTA KOKI)
Fülöp Balázs, Reglődi Dóra, Tamás Andrea (PTE) Buday László (MTA TTK)
Schlett Katalin (ELTE) Christine Petit (Inst. Pasteur) Horváth Tamás (Bajcsy-Zsilinszky Kh.)
TDK: Dienes Tamás, Juhász Balázs Deák Orsolya, Sapir Shawn
Halmos György (Univ. Groningen) Grimm András (SE)
