Tudományos Diákköri Dolgozat
SEBÁK FANNI
Gyors, multidimenzionális mérések adaptálása és tesztelése a p53 fehérje rendezetlen TAD régiójának esetében
Témavezető: Dr. Bodor Andrea Analitikai Kémiai Tanszék
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2015
Tartalomjegyzék 1. Rövidítésjegyzék.............................................................................................................3 2. Bevezetés.........................................................................................................................5 3. Irodalmi áttekintés ..........................................................................................................7 3.1 Gyors NMR technikák .............................................................................................7 3.2 A p53 biológiai szerepe............................................................................................8 3.3 Az eukarióta transzkripciós faktorok felépítése .....................................................9 3.4 A p53 szerkezete.......................................................................................................9 3.5 A rendezetlen fehérjék jellemzői ...........................................................................10 4. Célkitűzés ......................................................................................................................12 5. Módszer .........................................................................................................................14 6. Predikció .......................................................................................................................16 6.1 Rendezetlenség .......................................................................................................16 6.2 Eisenberg-féle hidrofobicitási index .....................................................................17 6.3 Accessible Surface Area ........................................................................................18 7. Mérés .............................................................................................................................20 8. Eredmények kiértékelése .............................................................................................22 8.1 Az asszignáció eredménye .....................................................................................22 8.2 A minor jelek ..........................................................................................................25 8.3 Másodlagos kémiai eltolódás.................................................................................27 8.4 Összevetés a predikcióval ......................................................................................29 8.5 Összevetés a hagyományos méréssel ....................................................................29 9. Összefoglalás ................................................................................................................32 10. Köszönetnyilvánítás .....................................................................................................33 11. Irodalomjegyzék ...........................................................................................................34
2
1. Rövidítésjegyzék Apaf-1
apoptotic protease activating factor-1
ASA
Accessible Surface Area
Bax
BCL2-Associated X Protein
Bcl-2
B-cell lymphoma 2
BEST
Band-Selective Excitation Short-Transient Experiments
BMRB
Biological Magnetic Resonance Data Bank
CARA
Computer Aided Resonance Assignment
CBP
CREB kötő fehérje
CD
cirkuláris dikroizmus
Cdk
ciklin dependens kináz
CREB
cAMP response element binding protein
CTF1
cardiotrophin 1
DSS
2,2-dimetil-2-szilapentán-5-szulfonsav
EPR
elektron paramágneses rezonancia
FTIR
Fourier transzformációs infravörös spektroszkópia
HSQC
Heteronuclear Single Quantum Coherence
IUP
intrinsically unstructered protein
MDM-2
mouse double minute protein 2
MES
2-(N-morfolino)-etánszulfonsav
NF-κB
nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B cells
NMR
mágneses megrezonancia
NOESY
nuclear Overhauser effect spectroscopy
NS
ismétlések száma
PDB
Protein Data Bank
PRD
prolinban gazdag régió (proline rich domain)
3
ppm
parts per million
RDC
reziduális dipoláris csatolás ( residual dipolar coupling)
SAXS
kisszögű röntgenszórás (Small-Angle X-ray Scattering)
SCS
másodlagos kémiai eltolódás (Secondary Chemical Shift)
SDS-PAGE
nátrium-dodecil-szulfát–gél-elektroforézis
SOFAST
Band-Selective Optimized-Flip-Angle Short-Transient
TAD
transzaktivációs domén (transactivation domain)
TCEP
trisz-(2-karboxietil)-foszfin-hidroklorid
TOCSY
Total Correlation Spectroscopy
4
2. Bevezetés Napjainkban világszerte súlyos problémát jelentenek a daganatos megbetegedések. A betegség prevalenciája 35 millió körüli, évente körülbelül 14 millió új esetet diagnosztizálnak. A halálozások száma is magas, évente körülbelül 8 millió ember hal meg daganatos betegségek következtében.1 A helyzet hasonlóan súlyos képet mutat hazánkban is. Magyarországon a kardiovaszkuláris megbetegedések után az onkológiai betegségek szerepelnek a második helyen a vezető halálokok között. 2011-ben 33274-en haltak meg daganatos betegségben, ami az összes halálozás 25,83%-a volt. A 65 év alatti népesség körében a daganatos halálozás az Európai Unió ugyanilyen halálozásához képest kétszeres volt (2000). Magyarországon a világon a harmadik legmagasabb, az európai régió országai között pedig a legmagasabb az életkorra standardizált daganatos halálozás (2002). Ezen kívül még megjegyzendő, hogy világelsők vagyunk a légcső, a hörgő és a tüdő rosszindulatú daganatai és a vastag- és végbéldaganatok okozta halálozás vonatkozásában, és fentieken kívül az ajak és szájüreg rosszindulatú daganatai okozta halálozás tekintve Európában szintén itt elsők vagyunk (2002).2,3 Az új esetek száma is rendkívül magas, évente közel 75000 is lehet. A Nemzeti Rákregiszter adatai alapján 2010-ben 67398 új rosszindulatú megbetegedést regisztráltak. A nemek között eltérések figyelhetők meg: míg a nőknél az emlő (6810), colorectális (4403), légzőrendszeri (3917), addig a férfiaknál a légzőrendszeri (6583), colorectális (5184) és prosztata (3658) daganatok voltak a leggyakoribb új megbetegedések. Nemcsak az új megbetegedések, hanem a különböző daganatok okozta halálozások is hasonló adatokat mutatnak. 2011-ben a Központi Statisztikai Hivatal szerint a férfiaknál a legtöbb daganat okozta halálozás a légcső-, hörgő- és tüdőtumorok (5558), vastag- és végbéltumorok (2835) és az ajak, a szájüreg és a garat daganatos megbetegedései (1213) miatt következett be. A nőknél szintén a légzőrendszeri (2975), a colorectális (2219) és az emlő (2138) daganatok vezetik a daganatos betegségek okozta halálozási statisztikát.4 A malignus tumorok kialakulásának egyik fő lépése a metasztázis. Az általam vizsgált fehérje, a p53 ebben a folyamatban fontos szereppel rendelkezik: tumorszupresszorként más fehérjékkel komplexet képezve apoptotikus folyamatok indulhatnak el a szervezetben. A p53 fehérjét kódoló, TP53 misszenz mutációja illetve a kiesett p53 jelátviteli út világszerte mintegy 27 millió daganatos megbetegedésben játszik szerepet,5 leggyakrabban emlő carcinomák, sarcomák, agydaganatok és mellékvesekéreg daganatos megbetegedéseiben (Li-
5
Fraumeni és Li-Fraumeni-like szindróma)6,7 ezért különösen fontos, hogy minél több információt nyerjünk a p53 működéséről és szerkezetéről. A fehérjék szerkezeti és oldatbeli mozgásainak feltérképezésében fontos szerepet játszik az NMR spektroszkópia. A makromolekulák, mint fehérjék, nukleinsavak és a komplexeik vizsgálatához nem alkalmasak az 1D spektrumok. Ennek oka elsősorban az NMR aktív magok keskeny frekvenciatartománya, amely jelátfedést okoz 1D spektrumokban, gyakorlatilag lehetetlenné teszi az atomi szintű információszerzést már relatíve kisméretű biopolimereknél is. Ez a probléma viszont többdimenziós spektrumok alkalmazásával kiküszöbölhető. A fehérje szerkezetének vizsgálatához jó felbontású spektrumok alkalmasak. A jó felbontás eléréséhez többdimenziós méréseknél nagyszámú ismétlésre van szükség, ami a mérési időt jelentősen megnöveli. A multidimenzionális spektrumok felvétele az alap pulzusszekvencia többszöri megismétlésével történik, az ismétlések között az egyensúly beállása hosszabb időt igényel. Ennek a technikának így a legnagyobb hátránya a hosszú mérési idő.8 A hosszú mérési idő lerövidítésére számos módszert dolgoztak ki. Ezek közül dolgozatomban a BEST típusú gyors mérési módszer alkalmazásával foglalkoztam, melyet a hagyományos mérésekkel hasonlítottam össze, a sejtbiológiailag kulcsfontosságú rendezetlen fehérje, a p53 szerkezetének vizsgálata esetében. A BEST (band-selective excitation short transient) mérés egy gyors NMR módszer, amelynek alapja, hogy csak szelektív besugárzást végzünk. Ezáltal rövidebb lesz az ismétlési idő és nő az érzékenység. 8,9 Így rövidebb idő alatt, kis koncentrációjú oldatban is helyes jelazonosítást tett lehetővé. Ezen felül még a hagyományos méréssel nem azonosítható minor szekvenciarészek is azonosíthatóvá váltak.
6
3. Irodalmi áttekintés 3.1
Gyors NMR technikák
Az NMR spektroszkópia egyedülálló módszer biológiai rendszerek, fehérjék szerkezeti és oldatbeli mozgásainak atomi szintű feltérképezésében. Mivel oldatfázisban is lehet alkalmazni, nem szükséges a mintát kristályosítani, ami jelentősen megkönnyíti a mintaelőkészítést a röntgendiffrakciós módszerhez képest. A megfelelő spektrumok előállításához azonban több feltételnek teljesülnie kell: a fehérjemintáknak izotópjelöltnek kell lenniük (15N-jelölt vagy emellett
13
C jelölt is), 0,5 - 1mM koncentrációban kell őket
előállítani. A hagyományos több dimenziós NMR módszereknél 1 scan nem eredményez megfelelő spektrumot. Az érzékenység növelhető spektrumakkumulációval, a jel/zaj arány az ismétlések számának négyzetgyökével lesz arányos. A nagyfelbontású spektrumhoz nagyszámú mérésre van szükség a jobb jel/ zaj arány eléréséhez megfelelő érzékenység mellett. Így a mérések akár napokig is tarthatnak. A hosszú mérési idő alatt a fehérjék nem stabilak, esetleg elbomolhatnak, illetve a koherenciatranszfer és a frekvenciaeditálási lépések következtében a mérés érzékenysége csökkenhet. Ezért fontos gyorsabb és nagyobb érzékenységű mérések alkalmazása. Adott töménységű mintánál jobb jel/zaj viszony elérése érdekében kisebb térfogatban (≈280µl), Shigemi-csőben is lehet mérni, ezen kívül a nagyobb mágneses tér alkalmazása, a hűtött mérőfej használata, a pulzusszekvenciák optimalizálása, az ismétlési idő csökkentése, SOFAST és BEST típusú pulzusszekvenciák használata vagy egyéb gyors módszerek alkalmazása lehet a megoldás. A mérési idő csökkentéséhez megjelentek különböző gyors mérési technikák. Ezek két különböző elv szerint működnek. Az első csoport közös tulajdonsága, hogy a hagyományos méréshez képest lecsökken a mintavételi pontok száma az indirekt dimenzióban. Természetesen ezen technikák többsége speciális adatfeldolgozó algoritmust igényel a spektrum adatainak kinyeréséhez. Ilyen technikák a nemegyenletes mintavételezés,10,11 a projekciós NMR,12,13,14 a Hadamard-féle,15,16 a térbeli frekvenciakódolás
17,18
és a kiterjesztett
spektrális aliasing.19 A másik csoportba tartozó technikák, mint például a SOFAST és a BEST, azon az elven működnek, hogy az egyes scanekhez szükséges időt lerövidítik, így csökken a spektrum felvételéhez szükséges időt. Ezt általában a két ismétlés közti, az egyensúly beállását szolgáló delay csökkentésével oldható meg. Az ilyen „fast-pulsing” NMR mérések érzékenysége
7
jelentősen növelhető a longitudinális relaxációt segítő technikákkal, úgynevezett Ernst-angle excitationnel és polarizáció átvitellel. A mérési idő csökkentése megvalósítható továbbá BEST (Band-Selective Excitation Short-Transient Experiments) típusú pulzusszekvenciákkal is. Ezek a szekvenciák lehetővé teszik rövid ismétlési idők (kb. 0,5 s) használatát, és optimalizálják a jelet annak ellenére, hogy csak szelektív besugárzást végzünk. A technika alapja, hogy csak az amid régió 1H jeleit gerjesztjük, ezáltal gyorsabb lesz a T 1 relaxáció. A proton mágnesezettség nagy része longitudinális marad a mérés során, és nem vesz részt a relaxációs folyamatban. Ez azt jelenti, hogy a spektrum további része deuteráltként viselkedik, lehetővé téve nagy felbontású triple resonance spektrumok felvételét.20 3.2
A p53 biológiai szerepe
A p53 jelentős feladattal rendelkezik mind a sejtciklus szabályozásában mind a sejt öregedésében, valamint a sejthalálban is. A sejtciklusban játszott szerepe szerint a p53 egy tumorszuppresszor fehérje, tehát gátolja a sejtciklust. A fehérjét a TP53 gén kódolja, amely a 17. humán kromoszóma rövid karján található.21 A génje recesszív hatású, mutáns variánsaik (funkció vesztett vagy elveszett) megtalálhatók tumorokban. A p53 szabályozása különböző fehérjékkel alkotott kötődéssel történik. Normál esetben inaktív formában van jelen a sejtekben, az MDM-2 onkogénhez kötve alacsony koncentrációban.
Aktiválódásakor
a
kötődés
megszűnik.22
A
p53-DNS
komplex
stabilizálásában és a transzkripcióban fontos szerepet játszanak még a CBP és p300 fehérjék.23 A p53 szabályozásában szerepet játszanak még az S100 fehérjecsalád tagjai. Ezen fehérjék közös tulajdonsága, hogy jól oldódnak telített ammónium-szulfát-oldatban. Ezen kívül Ca2+-ot kötő homodimerek, és alegységeik egy pszeudo-EF-hand és egy EF-hand motívumból állnak. A család egyik jelentős tagja, az S100A4 fehérje az áttétképződésben, a metasztázis kialakulásában játszik fontos szerepet.24 A p53 transzaktivációs doménjéhez illetve a C-terminális régiójához kapcsolódik. A p300 és az MDM2 fehérjével alkotott kötődést módosítja foszforiláció és acetiláció útján.25 Mivel a komplexképződés az apoptózist indukál, és a daganatokban csökken a p53 szint, ezáltal a védelmi funkciója csökken, tumoros sejtek tovább osztódhatnak.26 Külső környezeti hatásokra (például hypoxia nagymértékű sejtproliferáció esetén, vagy egyéb esetekben, mikor rossz a sejtek vérellátása) vagy a DNS sérülését okozó tényezők hatására aktiválódik a p53, illetve megnő a mennyisége a sejtben, és fokozza a p21 átírását, 8
mivel ennek promoteréhez kötődik. A p21 egy általános Cdk (ciklin dependens kináz) gátló fehérje, amely gátolja mindegyik G1 fázisban lévő Cdk komplex (Cdk46-D ciklin, Cdk2-E ciklin és Cdk2-A ciklin) aktivitását, nem engedi a sejtet S fázisba lépni. Ilyenkor, ha a DNS repair mechanizmusok a hibát ki tudják javítani, akkor a sejt továbbléphet az S fázisba. Ha a javítás nem sikerül, akkor a sejt apoptózissal elpusztul. A sejtcikluson kívül szerepet játszik az apoptózisban is a p53. Stresszhatásokra károsodhat a DNS. Ha a sérülést nem sikerül kijavítani, a p53 befolyásolja különböző, apoptózist szabályozó gének átírását, többek között csökkenti az antiapoptotikus Bcl-2 átírását, fokozza a proapoptotikus Apaf-1, Bax és Bid gének átírását, így serkenve az apoptózist.27 3.3
Az eukarióta transzkripciós faktorok felépítése
A p53 egy transzkripciós faktor, felépítése hasonló az egyéb eukarióta transzkripciós faktorokhoz. Általánosságban az eukarióta transzkripciós faktorok, melyek lehetnek aktivátorok vagy represszorok, moduláris felépítésűek. Részeik: DNS-kötő, ligandum-kötő és transzaktivációs-domén. A DNS-kötő domén legtöbbször homodimer, részleges palindrom szekvenciát ismer fel. A szabályozott gének számát illetve a szabályozás „finomhangolását” sokszor hetero- és homodimer formában tudják kombinatorikus módon növelni. Lehetnek hélix-kanyar-hélix, hélix-hurok-hélix, cinkujjas vagy leucin-záras felépítésűek. Az eukarióta transzkripciós faktorok transzaktivációs doménje igen változatos lehet. A csoportosításuk történhet a szekvencia legjellemzőbb aminosavai alapján csoportosítjuk őket. Például a GAL4 élesztő savas, a GCN4-ben hidrofób, az Sp1-ben Gln-gazdag, a CTF1-ben Pro-gazdag a transzaktivációs domén. Az NF-κB transzkripciós faktorban a legkisebb méretű transzaktivációért felelős motívumcsalád, mindössze 9 aminosavból áll.28 A feladata szerint a TAD vagy közvetlenül az RNS-polimeráz II enzimhez vagy a preiniciációs komplex valamelyik komponenséhez kötődik. Gyakran a TAD-on keresztül képes a transzkripciós faktor további szabályozó fehérjékkel kölcsönhatásba lépni. Ezen fehérjék nem közvetlen kötődnek a DNS-hez, transzkripciós kofaktorok, hidat képeznek az RNS polimeráz II és a transzkripciós faktor között.28 3.4
A p53 szerkezete
A p53 egy 43,7 kDa tömegű fehérje, amely nevét onnan kapta, hogy SDS-PAGE gélelektroforézist alkalmazva 53 kDa méretű fehérjeként viselkedik. Ennek oka, hogy poliprolin régióval rendelkezik, amely lassítja az elektroforézis során.29, 30 9
A p53 fehérje 393 aminosavból áll, szerkezetileg több alegységre osztható. Az Nterminális végén található a transzaktivációs domén, amit az 1-61. aminosav alkot. Ez felosztható még két régióra: AD1 és AD2. Az AD1-et az 1-42., az AD2-t 43-61. aminosav alkotja. Ezt követi a prolinban gazdag régió (PRD). További részei még a DNS kötő domén, a tetramerizációs domén és a C-terminális szabályozó domén.23 A C-terminális, szabályozó régió több részre osztható: flexibilis régió, tetramerizációs domén és bázisokban gazdag rész. A flexibilis régió szerepe a DNS összekötése a tetramerizációs doménnel. A bázisokban gazdag rész bonyolult másodlagos szerkezettel rendelkezik, β-redő-turn-α-hélix motívum figyelhető meg az NMR és röntgenkrisztallográfiás szerkezetvizsgálatokkal.22 A PRD régió szekvenciájában sok prolin található, melyek egy merev struktúrát vesznek fel, ezáltal gátolják a másodlagos szerkezeti elemek létrejöttét. E régiónak fontos szerepe van az N-terminális rész DNS-magkötő doméntől való megfelelő távolság kialakításában. Emellett a fehérje hidrofobicitását is befolyásolja.31 Az N-terminális rész a legfontosabb régió a komplexképzés szempontjából. A p53 szabályozásában jelentős szerepet játszó transzkripciós fehérjék kapcsolódnak ide. Ezek például az MDM-2, TFIID vagy a TBP, amelyek TATA kötő fehérjék.23 Korábbi NMR mérések azt mutatták, hogy a régió rendezetlen, fiziológiás körülmények között random coil szerű. Bizonyos szakaszok azonban tartalmaznak olyan szakaszokat, amelyek tranziens másodlagos szerkezettel rendelkeznek. Stabil másodlagos vagy harmadlagos szerkezetük nincs, ellenben gyenge helikális jelleget mutat némelyik régió. Ezek a 18. és 26. aminosav közötti rész, a 40-44. és a 48-53. aminosavak alkotta régiók is egyfajta gyenge másodlagos szerkezettel jellemezhető.32 RDC vizsgálattal a 21-25 aminosavak közti helikális jelleget is igazolták már.31 3.5
A rendezetlen fehérjék jellemzői
Az elmúlt évtizedben megfigyelték, hogy a rendezetlen fehérjék, más szóval IUP-k (intrinsically unstructured protein) meglehetősen gyakoriak a korábbi feltevésekkel ellentétben. Az új bioinformatikai kutatások szerint az eukarióta fehérjék 25-30%-a rendezetlen, továbbá hosszú rendezetlen régiókat tartalmaz több mint 50%-uk.33 A korábbi nézet szerint csak jól definiált szerkezettel rendelkező fehérjének van funkciója, mára azonban bebizonyosodott, hogy rendezetlen fehérjék vesznek részt kulcsfontosságú szabályozó folyamatokban, mint a differenciálódás, transzkripció, DNS kondenzáció vagy az apoptózis illetve egyéb jelátviteli folyamatokban. Szerepük van bizonyos neurodegeneratív 10
betegségek (például Alzheimer-kór, Huntington-kór, Parkinson-kór) illetve bizonyos ráktípusok kialakulásában is.34 A rendezetlen fehérjék legfőbb jellemzője, hogy nem rendelkeznek stabil másodlagos vagy harmadlagos szerkezettel, ezért rendkívül flexibilisek. Ennek eredményeként konformációs heterogenitás jellemzi őket. Ez azt jelenti, hogy fiziológiás körülmények között nagyszámú konformer van jelen. Ezen konformerek közül néhány random coil-szerű, némelyik pedig tranziens másodlagos szerkezettel rendelkezik.34,35,36 vagyis az IUP-k gyakran nem teljesen rendezetlenek, hanem előfordulnak bennük részlegesen rendezett régiók is. Az aminosavszekvencia alapján megjósolható rendezetlenségük. Az aminosavak lehetnek rendezetlenséget vagy rendezettséget erősítők. Az utóbbiak (aszparagin, cisztein, fenilalanin, izoleucin, leucin, tirozin, triptofán és a valin) az IUP-kben viszonylag ritkák, míg a rendezetlenséget erősítők (alanin, arginin, glicin, glutamin, glutamát, lizin, prolin és szerin) nagy mennyiségben fordulnak elő.36 Megfigyelhető a prolinok kiugró gyakorisága a PDB adatbázisban szereplő rendezett fehérjékhez képest. A prolinok merev struktúrát vesznek fel, ezzel gátolva a másodlagos szerkezeti elemek létrejöttét. A rendezetlenség mértékének becslésére jól alkalmazhatók a különböző szerkezetpredikciós módszerek, amelyek az aminosavszekvenciát felhasználó bioinformatikai algoritmusok (például az IUPred38,39, PONDR40 , DisEMBL 41, FoldIndex42 és DISOPRED243). Ezenkívül információt nyerhetünk szerkezetükről különböző spektroszkópiai módszerekkel, mint az NMR spektroszkópia, cirkuláris dikroizmus spektroszkópia (CD), Fourier transzformációs infravörös spektroszkópia (FTIR), Raman optikai aktivitás mérések, kisszögű röntgenszórás (SAXS) vagy az elektron paramágneses rezonancia (EPR) spektroszkópia.34
11
4. Célkitűzés A mérés során a p53 fehérje transzaktivációs doménjének vizsgálatát végeztük BEST típusú pulzusszekvencia felhasználásával. A vizsgált háromdimenziós spektrumok teljes asszignációjának elvégzése volt a feladatom. Az asszignációhoz a különböző atomok kémiai eltolódásának adatait a Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB) által közzétett statisztikai értékekek használtam fel.37 A szerkezet vizsgálatához a következő spektrumok BEST-változatát vettük fel: HN(CO)CA, HNCA, HNCACB, HN(CO)CACB, HNCO és HN(CA)CO. A mérési idő jelentősen lerövidült, egyes méréseknél órákkal csökkent a szükséges idő. Ezeket az információkat a 2. táblázat tartalmazza. A vizsgált spektrumokon a domén teljes asszignációját elvégeztük. Ezenkívül különböző predikciós módszerekkel is információkat kaptunk a szerkezetről. Előnyük, hogy csak az aminosav szekvenciát használják fel szerkezeti információszerzéshez.
Ezen
módszerek csak előzetes predikcióra szolgálnak, így pontos információt a szerkezetről csak méréssel kaphatunk. A predikcióra a következő módszereket használtuk fel: az IUPred,38,39 az Eisenberg-féle hidrofobicitás44 illetve a víz számára hozzáférhető felület nagysága (Accessible Surface Area, Relative Accessibility).45 Az IUPred analízissel az adott fehérje vagy fehérjeszakasz rendezetlenségére lehet következtetni. A másik két módszerrel a hidrofób régiók prediktálhatók. Az Eisenberg-féle hidrofobicitási index az adott aminosav hidrofilhidrofób jellegére utal. Az Accessible Surface Area a víz számára hozzáférhető felület, a Relative Accessibility (relatív hozzáférthetőség) ennek a felületnek a mérete a teljes szabad felület arányában egy adott aminosavra vonatkoztatva. Ezekből az adatokból is az adott aminosav hidrofil-hidrofób jellegére következtethetünk. A predikciók elvégzése után a teljes asszignációt készítettem el. Az asszignációt követően a mért eltolódásokból másodlagos kémiai eltolódást számoltam, amely alapján következtetni lehet a naszcens helikális szakaszok helyére. Az eltolódások alapján a szekvenciában található prolinok izomerizációs alakjára is lehet következtetni.
A kapott
eredményeket összevetettem a különböző predikciós eljárások eredményeivel. Ezenkívül összehasonlítottuk a BEST típusú méréseket a hagyományos módszerrel. Az utóbbi esetben az alábbi spektrumok álltak rendelkezésre: 1H-15N HSQC, HSQC-TOCSY, HSQC-NOESY (ez a három spektrum több hőmérsékleten felvéve: 283K, 288K, 293K, 298K és 303K)
HNCO, HNCACB, HNCA, HN(CO)CA, (H)CC(CO)NH. A két módszer
összehasonlítására csak a 1H-15N HSQC (303 kelvin hőmérsékleten), a HNCO, HNCACB, HNCA, HN(CO)CA és (H)CC(CO)NH spektrumokat használtuk fel. 46 12
A két módszer összehasonlításánál szembetűnő felvétel elkészüléséhez szükséges idő lerövidülése, illetve a minor jelek nagy száma a BEST módszernél, melyek nagy részét a rendelkezésre álló spektrumok alapján asszignálni is tudtam. A BEST minor jelei szomszédságában található prolinok térállása is megállapítható lett. Ezeket a hagyományos méréssel nem lehetett meghatározni.
13
5. Módszer A jelazonosítást a CARA (Computer Aided Resonance Assignment) nevű program segítségével végeztük, mellyel két- és háromdimenziós spektrumok is jól kezelhetők. A 2D spektrumok ábráinak elkészítéséhez a Sparky programot használtam.47,48 A méréseket BEST típusú pulzusszekvenciákkal végeztük. Az asszignációhoz az alábbi
spektrumokat vettük
fel:
1
H-15N
HSQC, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB,
HN(CO)CACB, HNCO, HN(CA)CO. Ha a fehérjénk nagy (akár 100 aminosav feletti), akkor szükséges a mintánknak 13
15
C jelöltnek lenni. A
N és
15
N és
13
C természetes gyakorisága kicsi (0,37% és 1,10%),49
giromágneses állandójuk is jelentősen kisebb a protonokénál. Ezért inverz NMR kísérleteket használunk, amely során a protonokról a mágnesezettség a heteroatomokra kerül. Ezek közül legfontosabb a HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence). A heteroatomtól függően lehet
1
H-13C HSQC, ahol a CH x csoport szénatomja korrelál a vele kötésben lévő
hidrogénekkel, illetve
1
H-15N HSQC, ahol az NH x csoport nitrogén atomja és a
hozzákapcsolódó hidrogének korrelációját mutatja. A 2D 1H-15N HSQC a 3D spektrumok H-N dimenziók menti vetülete, megmutatja az összetartozó H és N jeleket. Egy HSQC jel egy aminosavhoz rendelhető, a spektrum a fehérjegerinc amidprotonjainak jeleit tartalmazza. A spektrumban adnak jelet a N-H kötésttartalmazó oldalláncok is (arginin, aszparagin, glutamin, lizin, hisztidin és a triptofán), de ez a régió jól elkülöníthető a főlánc amid jeleitől, és jól látható, hogy az NH 2 -csoportban két H jel tartozik a nitrogénhez.
A prolin nem ad jelet HSQC spektrumban, mivel az amid
nitrogénjéhez nem kapcsolódik hidrogén. Jellegzetes eltolódásnál jelentkeznek a glicinek, a szerinek és treoninok jelei. A HNCA spektrum a harmadik dimenzióban az adott aminosavhoz (i) és az előtte lévő (i-1)-edikhez tartozó Cα jeleket mutatja. A mágnesezettség a 1H-től 15N-re, majd a 13Cα -ra NCα csatoláson keresztül, majd visszafordul
13
Cα-ról
15
N-re és 1H-re. Így lesz az adott
aminosavhoz (i) és az előtte lévő (i-1)-edikhez tartozó Cα detektálható. Könnyen azonosítható, hogy melyik jel tartozik (i) és az előtte lévő (i-1)-edik aminosavhoz, mivel az i-edikhez tartozó jel intenzívebb, illetve a HN(CO)CA spektrum alapján azonosítható lesz az (i-1)edikhez tartozó jel. A HN(CO)CA (i-1)-edik aminosav Cα jelét mutatja a harmadik dimenzióban, hozzárendelve a 1H és 13
α
15
N-hez. A mágnesezettség a 1H-től 15N-re, majd a 13
C -ra terjed, majd visszafordul C(O)-ról
15
1
N-re és H-re. 14
13
C(O)-ra, majd a
A HNCACB spektrum esetén az i-edik és az (i-1)-edik aminosav Cα és Cβ jeleit határozhatjuk meg. A mágnesezettség 1Hα -ról 13 Cα-ra, 1Hβ–ról 13Cβ-ra terjed, majd innen 15Nre, 1H-re. Könnyen azonosítható, hogy melyik jel tartozik (i) és az előtte lévő (i-1)-edik aminosavhoz, mivel az i-edikhez tartozó jel intenzívebb. A HN(CO)CACB spektrum alapján is meghatározható az i-edikhez tartozó Cα és Cβ. Ezenkívül a Cα és Cβ jeleit könnyű megkülönböztetni, mert ellentétes előjelűek. A HN(CO)CACB az (i-1)-edik aminosav Cα és Cβ jelét mutatja ellentétes előjellel. Az (i-1)-edik
Hα -ról az (i-1)-edik
1
Cα -ra, (i-1)-edik
13
Hβ–ról (i-1)-edik
1
13
Cβ-ra terjed a
mágnesezettség, majd innen (i-1)-edik C(O)-n keresztül 15N-re, 1 H-re. A HNCO az (i-1)-edik aminosav karbonil szén atomjához tartozó jelet mutatja. A mágnesezettség
1
H-ról a
15
N-re tevődik át, majd
15
N és
13
C(O) csatoláson keresztül
15
szelektíven a karbonil szénre kerül, majd innen áttevődik N-re és 1H-re. A HN(CA)CO spektrum esetén a mágnesezettség a 1H-től
15
N-re, majd a két Cα -n
keresztül az i-edik és az (i-1)-edik karbonil szénre kerül. A spektrum az i-edik és az (i-1)-edik aminosav karbonil szénjéhez tartozó jelet mutatja. Az (i-1)-edik aminosavhoz tartozó karbonil szenet a HNCO spektrum alapján azonosítottam.
15
6. Predikció Számos módszer alkalmazható a fehérjék szerkezeti tulajdonságainak felderítésére. Jelen esetben az IUPred, az Eisenberg-féle hidrofobicitási indexet illetve az Accessible Surface Area módszereket használtuk fel a szerkezet előrejelzéséhez. 6.1
Rendezetlenség
A rendezetlenség predikciójához az IUPred algoritmust használtuk.38,39 A módszer szerint a szekvenciális környezetben lévő aminosavak és egyéb, lehetséges kölcsönható partnerek is befolyásolják az aminosavak páronkénti kölcsönhatási energiáját. A rendezettséget ábrázolva az aminosav sorrend függvényében megállapíthatjuk, hogy fehérjénk mely szakaszai rendezetlenek. Az IUPred algoritmus szerint a 0 a teljes másodlagos szerkezettel rendelkező szakaszokhoz rendelhető érték, a szerkezettel egyáltalán nem rendelkezőké 1. A 0,5 feletti értékkel rendelkezők rendezetlennek tekinthetők. A 1. ábra alapján látható a p53 TAD doménjének IUPred analízise. Kijelenthetjük, hogy a vizsgált régió rendezetlen, de a S17-L37 szakasz a környezetéhez képest kisebbfajta rendezettséget mutat. Jól látható, hogy ebben a régióban a prolinok száma alacsony. A prolin a rendezetlenséget támogató aminosav, gátolja a másodlagos szerkezeti elemek létrejöttét azáltal, hogy merev szerkezettel rendelkezik. A régióban a rendezettséget támogató aminosavak száma magasabb, megfigyelhető a
leucinok
kiugró
gyakorisága
(6
darab),
de találhatók
ezen a
szekvenciaszakaszban aszparagin, valin, fenilalanin és triptofán is. Az adott régióban előforduló rendezetlenséget támogató aminosavak a prolin mellett a lizin, szerin és glutamin hatására az IUPred predikció szerint az adott szakasz még rendezetlennek tekintendő, habár a környezeténél rendezettebb.
16
1 0,9
Rendezetlenségi hajlam
0,8 0,7 0,6
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 G1 M3 E5 Q7 D9 S11 E13 P15 S17 E19 F21 D23 W25 L27 P29 N31 V33 S35 L37 S39 A41 D43 L45 L47 P49 D51 E53 W55 T57 D59 G61
0 aminosavak
1. ábra: A p53 TAD doménjének IUPred analízise. Az IUPred algoritmus által számolt rendezettség az aminosav szekvencia függvényében. A 0,5 feletti érték rendezetlenségre utal. 6.2
Eisenberg-féle hidrofobicitási index
Következtethetünk
a
másodlagos
szerkezet
jelenlétére
az
Eisenberg-féle
hidrofobicitási index alapján, mivel apoláris régiók nagyobb valószínűséggel rendezettek 44. E módszerrel a
hidrofil-hidrofób régiók
helyzetére következtethetünk. A szekvencia
függvényében ábrázolva a kapott értékeket, a negatív értékek a hidrofil, a pozitívak a hidrofób szakaszokat mutatják. A kapott eredményeket a 2. ábra mutatja. Ez alapján négy hidrofób régiót különböztethetünk meg: az E13-P15, S22-L27, L34-Q40 és D44-P49 szakaszok tekinthetők hidrofóbnak. Megfigyelhető, hogy az IUPred alapján „rendezettebb” régió (S17L37) valóban hidrofób jelleget mutat. Mind a négy régióra igaz, hogy kevesebb bennük illetve környezetükben a hidrofil aminosav, gyakoriak a leucinok, prolinok és metioninok, melyek hidrofób oldallánccal rendelkeznek. A metionin a hosszú oldalláncában kén atomot tartalmaz. A prolin gyűrűs aminosav, nem tartalmaz oldalláncában hidrofil, H-híd létrehozására alkalmas vagy bázikus vagy savas
csoportokat. A leucin hosszú apoláris oldallánccal
rendelkezik, amellyel van der Waals illetve hidrofób kölcsönhatások létrehozására képes.
17
0,5 0,4 0,3
0,1 0 -0,1
G1 M3 E5 Q7 D9 S11 E13 P15 S17 E19 F21 D23 W25 L27 P29 N31 V33 S35 L37 S39 A41 D43 L45 L47 P49 D51 E53 W55 T57 D59 G61
hidrofobicitás
0,2
-0,2 -0,3 -0,4
-0,5
aminosavak
2. ábra: Eisenberg-féle hidrofobicitás az aminosav szekvencia függvényében. A negatív értékek hidrofil, a pozitív értékek hidrofób jellegre utalnak. 6.3
Accessible Surface Area (víz számára hozzáférhető felület)
Az Accessibble Surface Area (ASA) a víz számára hozzáférhető felület. A meghatározásához a standard érték egy Gly-X-Gly tripeptid volt, ahol X egy adott aminosav, olyan konformációban, hogy Ψ=Φ=180°, ahol Ψ és Φ gerinckonformációt jellemző torziós szögek. A hozzáférhető felülethez meghatározták a partner atomok számát adott távolságon belül (4,5Å). Ábrázolták a partner atomok számának függvényében a hozzáférhtető felület nagyságát. A teljes felület meghatározásához extrapolálták a függvényt x=0-ra, ahol a környező atomok száma 0. Egy adott aminosavnál a víz számára a relatív hozzáférhető felületet az Eisenberg-féle hidrofobicitási indexhez hasonlóan számítottuk ki. A relatív hozzáférhetőség (Relative Accessibility) az ASA-t ábrázolja a teljes felület arányában egy adott aminosavra vonatkoztatva.45 A kapott adatokat a 3. ábra mutatja. A hidrofobicitással jól összevethető, mivel a hidrofób régiók relatív hozzáférhetősége kisebb, mint a környezetükben lévő hidrofil részeké. A hidrofil aminosavaknál ez az érték 0,3 körüli, hidrofóbaknál 0,2-0,25 körüli érték. Az 3.ábra alapján az E13-P15, Q18-E19, F21-L28, E30-L37, M42-P49 illetve a E53-W55 régiók víz általi hozzáférhetősége kisebb, ezek a részek hidrofób jellegűek. Az adott régió aminosavait megfigyelve látszik, hogy vagy hosszú apoláros vagy poláros töltés nélküli oldalláncokkal rendelkeznek. A nagyobb hozzáférhetőségű részeken a bázikus vagy savas oldalláncú aminosavak gyakorisága jelentősen nagyobb.
18
víz számára hozzáférhatő felület
0,325
0,3 0,275 0,25
0,225
G1 M3 E5 Q7 D9 S11 E13 P15 S17 E19 F21 D23 W25 L27 P29 N31 V33 S35 L37 S39 A41 D43 L45 L47 P49 D51 E53 W55 T57 D59 G61
0,2 aminosavak
3. ábra: A víz számára hozzáférhető felület az aminosavra vonatkoztatva. A hidrofób részeknél ez az érték 0,25 alatti.
19
7. Mérés Minden mérést BRUKER AVANCE-III 700 MHz-es NMR spektrométer segítségével végeztük. A p53 fehérje transzaktivációs doménjének vizsgálatát végeztük el, a vizsgált régió szekvenciája: GSMEE PQSDP SVEPP LSQET FSDLW KLLPE NNVLS PLPSQ AMDDL MLSPD DIEQW FTEDP GP. Az expresszió során egy glicin és egy szerin került a fragmens N-terminális végére. A mérési körülmények: 300 μl 0,7 mM
13
C,
15
N-jelölt p53-
fehérjefragmens, referencianyagként DSS-t alkalmazva, 20 mM MES és 2 mM TCEP pufferben, 10% D2O, 20 mM NaCl, 3 mM NaN3, pH = 5,8-as közegben, 303K hőmérsékleteken. A méréshez Shigemi-mérőcsövet alkalmaztunk. A 1. táblázat tartalmazza a mérések részleteit. A mérés típusa
F1
F2
F3
NS
BEST-3D HNCA
2048 (1H)
40 (15N)
128 (13C)
8
BEST-3D HN(CO)CA
2048 (1H)
40 (15N)
128 (13C)
8
BEST-3D HNCACB
2048 (1H)
40 (15N)
128 (13C)
16
HN(CO)CACB
2048 (1H)
40 (15N)
128 (13C)
8
BEST-3D HNCO
2048 (1H)
40 (15N)
128 (13C)
8
BEST-3D HN(CA)CO
2048 (1H)
40 (15N)
128 (13C)
8
BEST-3D
1. táblázat: Az NMR-mérések típusai és paraméterei. F1, F2, F3 a dimenziók méretét mutatja, NS az ismétlések száma A BEST típusú pulzusszekvenciákkal az alábbi spektrumokat vettük fel: 1H-15 N HSQC, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, HN(CO)CACB, HNCO, HN(CA)CO A klasszikus mérésekhez a következő spektrumok állnak rendelkezésre: HSQCTOCSY, HSQC-NOESY, HNCO, HNCACB, HNCA, HN(CO)CA, (H)CC(CO)NH.46 A 2. táblázatban a mérési időket foglaltuk össze. Jól látható, hogy a hagyományoshoz képest jelentősen megrövidültek a mérési idők. A HNCO spektrum felvételéhez szükséges idő 28,9%-ra csökkent a klasszikushoz képest, és a HNCACB felvétele is körülbelül 8 órával csökkent. A HNCA és HN(CO)CA felvételéhez szükséges idő is a hagyományos mérési idő kb. 40%-a lett.
20
klasszikus
BEST
NS
HNCO
8 h 46 min
2h 32 min
8
HNCA
16 h 45 min
7h 21 min
8
HN(CO)CA
16 h 58 min
6h 54 min
8
HNCACB
32 h
23h 56 min
16
2. táblázat: Az adott spektrumok felvételéhez szükséges idő a hagyományos és a BEST típusú mérés esetén
21
8. Eredmények 8.1
Az asszignáció eredménye
A felvett spektrumokat a Bruker TopSpin 3.1 programmal processzáltuk. A kész felvételeket a programban referálni kellett. A
1
H,
13
C és
15
N giromágneses-állandói
ismeretében a spektrumokat adott hőmérsékleten kalibráltuk, ahol a referenciajel a DSS 1Heltolódása. Majd a jelazonosítást a CARA (Computer Aided Resonance Assignment) nevű program segítségével végeztem.46 A 1H-15N HSQC spektrum (4. ábra) alapján a p53 TAD régiója a rendezetlen fehérjékre jellemző spektrumot adja:
15
N-1H jelek kisebb tartományban jelennek meg a 1H
dimenzióban, mint rendezetteknél, gyakori a jelátfedés. A 1H-15N HSQC spektrumon 50 major jelet és 30 minor jelet detektáltunk. A 62 aminosavból a prolinok nem adnak jelet, mivel nincs amid protonjuk. Az asszignálás végén azt az eredményt kaptuk, hogy a 10 prolinon kívül még két aminosavnak a jele hiányzott: a G1 és S2 lánckezdő aminosavaké. Az asszignáció során először a különböző aminosavak típusát célszerű meghatározni. Majd a jellegzetes eltolódásnál jelentkező jelek alapján több aminosav azonosíthatóvá vált. Az azonosítás könnyebb azoknál az aminosavaknál, mint esetünkben az alanin, glicin, szerin vagy a treonin, amelyekből csak kevés, például egy vagy két darab található a teljes szekvenciában. A többi aminosav azonosítása a különböző spektrumok alapján történt, ahol az (i-1)-edik aminosavhoz kapcsolódó jelek alapján összekapcsolhatókká váltak a különböző jelek. A spektrumon jellegzetes helyen, kis N-eltolódásnál (109,6 ppm) található a glicin jele. Könnyen azonosítható, mert a glicin az egyetlen aminosav, amelynek nincs C β-ja. A szekvenciában lévő két glicin megkülönböztethető, mivel az egyik a lánckezdő aminosav. Az asszignáció során látszik, hogy a glicin előtt lévő aminosav egy prolin, ezért csak a G61 jele lehet. Szintén kis N eltolódásnál, 114 és 118 ppm között találhatók a szerinek és a treoninok. Ezeknek jellegzetes a HNCACB spektruma: a Cβ eltolódása nagyobb, mint a Cα -é. A szerinnél ez kb. 58-59 ppm Cα, 63-64 ppm C β esetén, treoninnál 62 ppm Cα, 69 ppm Cβ esetén. A szekvenciában 8 szerin és 2 treonin van. Azonosításuk a szekvenciában előttük lévő aminosav Cα és Cβ eltolódása alapján történt. Könnyen azonosítható volt ezeken kívül az egyetlen alanin: jellegzetesen nagy N eltolódásnál található, és a C β eltolódása kis értékű, kb. 19 ppm. 22
A többi aminosav azonosítása a már asszignált aminosavak HNCACB spektruma alapján történt. Az (i-1)-edik aminosav látható és a Cα és Cβ eltolódásának ismeretében azonosítottam a többi aminosavat. A hagyományos méréssel ellentétben nagyszámú minor jelet észleltünk. A minor jelek közül 18 darabot azonosítani is lehetett. Az asszignációjuk a major jeleknél ismertetett módon történt. Az azonosított minor jelek a Q7-S8-D9, S11-V12-E13, K26-L27-L28 E30-N31-N32V33-L34-S35, S39, A41 és G61 aminosavakhoz tartoznak. Közös bennük, hogy a prolinok találhatók mellettük, amelyek különböző konformációs állapotban fordulhatnak elő. A stabilabb, transz-prolin gyakoribb, ez található a főkomponensben, a minor jelek a kevésbé stabil, ezért ritkábban előforduló cisz-prolinhoz tartoznak. A prolinok térállásának meghatározása a Cβ és Cγ eltolódása alapján történt a később ismertetett módon.
4. ábra: A p53 fragmens asszignált 1H-15N BEST-HSQC-spektruma
23
5. ábra: BEST-HNCA és BEST-HN(CO)CA spektrumok részletei a főkomponensből származó jelekkel
24
A hagyományos mérésnél 51 major és 8 minor jel található a 15N HSQC spektrumban. Itt a BEST méréstől eltérően az aminosavak közül W55 kivételével az összes jelet asszignálni lehetett, a lánckezdő G1 és S2 is adott jelet a 1H-15 N HSQC spektrumban. A minor jelek száma jóval kevesebb, és csak a Q7 aminosavat lehetett azonosítani. 8.2
A minor jelek
A spektrumban nagy számban jelennek meg minor jelek, amelyek a minor konformerhez tartoznak. Ezek a jelek a prolinok melletti aminosavak minor jelei. A 30 minor jel közül 18 darabot azonosítani is lehetett. Ezek a jelek tehát a Q7-S8-D9, S11-V12-E13, K26-L27-L28 E30-N31-N32-V33-L34-S35, S39, A41 és G61 aminosavakhoz tartoznak.
6. ábra: Asszignált minor jelek (K26-S35) BEST-HNCACB spektruma A K26-S35-ig összefüggő jelek, a major jelek másodlagos kémiai eltolódása alapján a naszcens helikális régióba tartoznak (erről bővebben lásd a másodlagos kémiai eltolódásoktól szóló következő fejezetet). A minor jelek Cβ és Cγ eltolódásából következtetni tudunk a prolinok térállására nemcsak a major, hanem a minor komponens esetében is. A transz térállás 25
stabilabb, mint a cisz, ezért gyakrabban fordul elő. Mivel a C γ eltolódása a térállástól független, viszonylag állandó, ezért a Cβ eltolódása alapján meghatározhatjuk a prolin térállását. A méréseink eredményét a 3. táblázatban foglaltam össze, ahol a szekvenciában előforduló 10 prolin Cα és C β kémiai eltolódása van feltüntetve a major és minor jelek esetében. A kémiai eltolódások a BEST-HN(CO)CACB spektrum alapján készültek, ahonnan az (i-1)-dik aminosav Cα és Cβ kémiai eltolódását határozhatjuk meg. Az oldallánc Cβ eltolódása alapján megállapítható a prolin térállása: a transz esetében 33-34 ppm körüli, míg a cisz esetében 31-32 ppm körüli értékű. A major jelek esetében, ahol a stabilabb térállás a valószínűbb az összes prolin transz, amíg a minor jelek közül P6, P10, P15, P29, P36 cisz térállásúak.
7. ábra: A prolin cisz-transz izomériája A spektrum alapján a 10 prolinból háromnak nincs minor jele. A P14 után szintén prolin áll, így a Cα és Cβ eltolódását nem ismerhetjük, P62 a terminális aminosav, a P49-t követő D50-nek nem található minor jele, így nem tudjuk meghatározni a prolin izomerizációs állapotát.
26
major
minor
Cα
Cβ
Cα
Cβ
(ppm)
(ppm)
(ppm)
(ppm)
P6
63,202
31,845
62,483
33,788
P10
63,513
31,936
62,501
34,358
P14
-
-
-
-
P15
62,501
31,466
62,768
33,778
P29
63,609
31,71
62,493
34,373
P36
63,012
32,025
62,737
34,464
P38
63,249
31,823
63,288
31,823
P49
63,873
31,823
-
-
P60
63,088
32,018
63,11
32,015
P62
-
-
-
-
prolin
3. táblázat: A prolinok Cα és Cβ kémiai eltolódása a major és a minor jelek esetében 8.3
Másodlagos kémiai eltolódás (SCS)
A kémiai eltolódás érzékeny a környezetre és a szerkezet hatásaira. A mért eltolódásokból következtethetünk a teljesen kialakult illetve a naszcens másodlagos szerkezeti elemekre, szekvencián belüli helyükre. Ezt a másodlagos kémiai eltolódások (SCS, Secondary Chemical Shift) segítségével jellemezhetjük. A másodlagos kémiai eltolódás a mért és a random coil eltolódás különbsége. SCS = δ mért – δszekvenciakorrigált random coil A random coil egy ideálisan rendezetlen állapot. A kiszámításához Wishart és munkatársai módszerét a Braun-féle korrekcióval vettük figyelembe.50,51 Ezt kiszámítottuk a N, az NH, C’, Cα, C β atomokra, illetve ábrázoltuk a szekvencia függvényében oszlopdiagramon az SCS (Cα) illetve SCS (Cα)-SCS (Cβ) értékeket. Ezek közül a SCS (Cα) és a SCS (Cα)- SCS (Cβ) használható megbízhatóan a szerkezeti elemek azonosítására. A többi másodlagos kémiai eltolódás diagram (N, NH, C’, Cβ) nem megbízható, mert a kémiai eltolódásaik kevésbé függnek a másodlagos szerkezettől. Ha egy szekvencia szerkezettel rendelkezik, akkor a másodlagos eltolódás értékek pozitív vagy negatív tendenciát mutatnak. Ahol legalább három egymást követő aminosav pozitív értéket vesz fel, az adott régió helikális jelleget mutat. Általánosságban az α-hélixeket 27
alkotó aminosavak SCS (Cα) pozitív, míg SCS (C β) negatív, addig a β-redőkben lévő aminosavak másodlagos kémiai eltolódásainál SCS (Cα) negatív, míg SCS (Cβ) pozitív.52
A 1,5 1 0,5
G1 M3 E5 Q7 D9 S11 E13 P15 S17 E19 F21 D23 W25 L27 P29 N31 V33 S35 L37 S39 A41 D43 L45 L47 P49 D51 E53 W55 T57 D59 G61
0 -0,5 -1
B 2 1,5 1 0,5 -0,5
G1 M3 E5 Q7 D9 S11 E13 P15 S17 E19 F21 D23 W25 L27 P29 N31 V33 S35 L37 S39 A41 D43 L45 L47 P49 D51 E53 W55 T57 D59 G61
0 -1 -1,5 -2 -2,5 -3 -3,5
8. ábra: A p53-fehérjefragmens aminosavainak másodlagos kémiai eltolódásai. Az A diagramon a Cα másodlagos eltolódásai, B diagramon a Cα és a Cβ másodlagos eltolódásainak különbsége található. A kék a major, a piros a minor jelek eltolódásiból számolt másodlagos kémiai eltolódást jelenti. A másodlagos kémiai eltolódás alapján látszik, hogy a vizsgált fehérje rendezetlen, az SCS értékek közel esnek a random coil értékekhez, a mért eltolódás és a random coil eltolódás közti különbség többnyire 1 ppm alatti. A Cα másodlagos eltolódásaiból, illetve 28
SCS (Cα)- SCS (Cβ) grafikonon jól látszik egy pozitív tendencia a S17 és S35 között, a szakasz tehát helikális jelleget mutat. A minor jelek kémiai eltolódásából számolt SCS értékek közül csak a szekvenciában közvetlenül egymást követő aminosavak értékei tartoznak biztosan össze. Jól látszik, hogy a prolinok értékei kiugróak. Ennek oka a cisz-transz izomériából következő eltérő eltolódás. Megfigyelhető, hogy az E5-Q7 és S8-E13 a főkomponenssel ellentétben nem mutat helikális jelleget, az E30-S35 régió másodlagos kémiai eltolódása pozitív tendenciát mutat, régiót naszcens helicitás jellemzi. Összevetés a predikcióval
8.4
Az IUPred analízis alapján a S17 és S35 közötti szakasz rendezetlensége kisebb, mint a fragmens többi szakaszán. Meg kell jegyezni, hogy még így sem kisebb, mint 0,5, tehát a szakasz rendezetlen, de a többihez képest rendezettebb, s a másodlagos kémiai eltolódások alapján helikális jelleget mutat. Az Eisenberg-féle hidrofobicitás és az Accessible Surface Area módszerek is az adott szakasz hidrofób jellegére utalnak. Az Eisenberg-féle hidrofobicitási index szerint 4 hidrofób szakasz található: E13-P15, S22-L27, L34-Q40 illetve D44-P49 aminosavak között. Jól látható, hogy e szakaszoknál a víz számára hozzáférhető felület kisebb, mint a hidrofil régiók esetében. A rendezetlenségük is valamivel kisebb, mint a környező hidrofil régióké. A másodlagos kémiai eltolódásuk is egyfajta tendenciát mutat: SCS (Cα)-SCS (Cβ) alapján jól látható, hogy a szakaszokra jellemző a naszcens helicitás. Összevetés a hagyományos méréssel
8.5
A hagyományos méréssel készült 1H-15N HSQC spektrum a 9. ábrán látható. A hagyományos mérés asszignációjához más spektrumok készültek mint a BEST mérések esetében. Itt
15
N-jelölt mintával is készültek spektrumok. A15N-jelölt minta tipikus mérési
körülményei: 500 μl 0,9 mM
15
N-jelölt p53-fehérjefragmens, referenciaanyagként DSS-t
alkalmazva, 20 mM MES és 2 mM TCEP pufferben, 10% D 2O, 20 mM NaCl, 3 mM NaN3, pH = 5,0-ös közegben; 303 K hőmérsékleten.
A
13
C,15N-jelölt minta tipikus mérési
körülményei: 300 μl 0,7 mM 13C, 15N-jelölt p53-fehérjefragmens, referenciaanyagként DSS-t alkalmazva, 20 mM MES és 2 mM TCEP pufferben, 10% D 2O, 20 mM NaCl, 3 mM NaN3, pH = 5,8-as közegben, 303 K hőmérsékleteken. A méréshez Shigemi-mérőcsövet használtunk.46 Az asszignációhoz a HSQC-TOCSY, HSQC-NOESY, HN(CO)CA, HNCA, HNCACB, (H)CC(CO)NH, HNCO spektrumokat használták fel. 46 29
Ha összevetjük a két mérési technikát, megfigyelhető, hogy a hagyományos mérésnél a BEST típusúval ellentétben jelentősen kevesebb, csak 8 db minor jelet detektáltunk a 1H-15N HSQC spektrumon. A major jelek száma is eltérő, itt 51 jelet találtunk. Az aminosavak közül a 10 prolin mellett a W55 nem adott jelet. A lánckezdő G1 és S2 jeleit azonban lehetett detektálni. A minor jelek száma a BEST-hez képest csekély, azonosítani közülük csak egyet, a Q7-et lehetett. A minor jelek hiánya miatt prolinok térállására a megadott adatokból nem tudtunk következtetéseket levonni.
9. ábra: A szabad p53-fragmens 303 K hőmérsékleten felvett hagyományos 1H15N HSQC-spektruma. Az ábra jobb alsó sarkában a triptofán indolgyűrűjének nitrogén jelei t a l á l h a t ó k, a m e l y e k a többitől elkülönülten nagyobb eltolódásnál jelentkeztek.46
30
A
B
C
D
E
F
G
10. ábra: A p53-fragmens 3 D spektrumainak részletei 303 kelvinen. Sorrendben: mintával készült hagyományos spektrumok: TOCSY (A), NOESY(B); készült
hagyományos
spektrumok:
HN(CO)CA (C), HNCA
(H)CC(CO)NH (F), HNCO (G)46 31
13
15
N-jelölt
15
C, N-jelölt mintával
(D), HNCACB
(E),
9. Összefoglalás Munkám során a p53 fehérje rendezetlen TAD régiójának vizsgálatát végeztük gyors NMR mérésekkel, BEST típusú pulzusszekvenciákkal. A kapott eredményeket összevetettük a már korábban elvégzett hagyományos mérés eredményeivel. A mérést megelőzően különböző predikciós módszerekkel következtettünk a fehérje szerkezetére. Az IUPred analízis szerint a vizsgált fragmens rendezetlen, de a F21-S35 régió rendezetlensége kisebb. Az Eisenberg-féle hidrofobicitási index az adott szakasz hidrofób jellegét mutatja, illetve az adott szakaszon kívül még három hidrofób karakterű szakaszt jelez. Ezen kívül még a víz számára hozzáférhető felület nagyságát is meghatároztuk az Accessible Surface Area módszerrel, ami az Eisenberg-féle hidrofobicitással hasonló helyzetű hidrofób régiókat prediktált. Az NMR-rel méréseket végeztünk: BEST típusú pulzusszekvenciákkal a HSQC,
HNCA,
HN(CO)CA,
HNCACB,
HN(CO)CACB,
HNCO
és
1
H-15 N
HN(CA)CO
spektrumokat vettük fel. A spektrumokat asszignáltam, a kapott eltolódásokból WishartBraun-féle módszerrel másodlagos kémiai eltolódást számoltam. Ez alapján a S17-V33, P36L45 és a S48-E53 régiók mutatnak helikális jelleget. A kapott eredményt összevetettük a predikcióval. A BEST mérést összehasonlítottuk a hagyományos méréssel. A méréshez szükséges idő jelentősen rövidült: a HNCO 71,1%-kal, a HNCA 56,12%-kal, a HN(CO)CA 59,33%-kal és a HNCACB 25,2%-kal csökkent. A major jelek alapján a hagyományos mérésnél a szekvenciából 51 aminosav, míg a BEST-nél 50 volt asszignálható. Minor jelek száma jóval kevesebb volt a hagyományos mérésnél: a 8 jel közül csak egyet, a Q7-et lehetett azonosítani. A BEST-nél minor jelek nagy számban jelentek meg, a 30 minor jel közül 18 asszignálható volt. Többek közt a L26-S35 régió, amely a predikció és a méréseink alapján naszcens helicitást mutat. Az irodalmi adatok alapján ez a régió helikális jellege figyelhető meg RDC-vel is. A BEST mérésnél a mért eltolódások alapján a prolinok térállása is meghatározható volt. A fő komponens jelei közt a stabilabb transz, míg a minor jelek között a prolinok főleg cisz térállásban fordulnak elő.
32
10. Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnék köszönetet mondani azoknak, akik dolgozatom megírásában segítségemre voltak. Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Bodor Andrea egyetemi adjunktusnak odafigyeléséért, mellyel munkámat irányította és tanácsaiért, melyekkel segítette dolgozatom elkészülését. Köszönöm Dudás Erikának, hogy a spektrumok feldolgozása során jelentkező problémák megoldásában segítséget nyújtott. Köszönettel tartozom Pálfy Gyulának a programok kezeléséhez nyújtott segítségéért és hasznos tanácsaiért.
33
11. Irodalomjegyzék 1
World Health Organization: http://data.euro.who.int/hfdb Letöltés ideje: 2015.11.12
2
Nemzeti Rákregiszter: http://www.onkol.hu/hu/nemzeti_rakregiszter Letöltés ideje: 2015.11.12
3
Semmelweis Egyetem, Népegészségtani Intézet: http://semmelweis.hu/nepegeszsegtan/oktatas/gyogyszeresztudomanyi-kar/ Letöltés ideje: 2015.06.04.
4
Központi Statisztikai Hivatal: Egészségügyi statisztikai évkönyv, 2013
5
Saha, T.; Kar, R. K; Sa, G.: „Structural and sequential context of p53: A review of experimental and theoretical evidence” Progress in Biophysics and Molecular Biology, 117 (2-3), 2015 :250-63, doi: 10.1016/j.pbiomolbio.2014.12.002
6
http://www.cancer.net/cancer-types/li-fraumeni-syndrome Letöltés ideje: 2015.08.15.
7
Olivier, M.; Goldgar, D.E.; Sodha, N.; Ohgaki, H.; Kleihues, P.; Hainaut, P.; Eeles, R. A.: „Li-Fraumeni and related syndromes: correlation between tumor type, family structure, and TP53 genotype.” Cancer Res. 63, 2003.: 6643-6650, doi: 10.1016/j.ccell.2015.04.005
8
Brutscher, B.; Schanda, P.: „Rapid Multidimensional NMR: Fast-Pulsing Techniques and their Applications to Proteins” eMagRes 2009, doi: 10.1002/9780470034590.emrstm1154
9
Lescop, E.; Schanda, P.; Brutscher, B.: „A set of BEST triple-resonance experiments for time-optimized protein resonance assignment” J. Magn. Reson. 187, 2007.: 163–169, doi: 10.1016/j.jmr.2007.04.002
10
Rovnyak, D.; Frueh, D. P.; Sastry, M.; Z.Y.J. Sun, Z.Y.J.; Stern, A.S.;Hoch, J.C.; Wagner, G.: „Accelerated acquisition of high resolution tripleresonance spectra using non-uniform sampling and maximumentropy reconstruction” J. Magn. Reson. 170, 2004.: 15–21, doi: 10.1016/j.jmr.2004.05.016
11
Marion, D.: „Fast acquisition of NMR spectra using Fourier transform of non-equispaced data” J. Biomol. NMR 32, 2005.: 141–150, doi: 10.1007/s10858-005-5977-5
12
Bersch, B.; Rossy, E.; Coves, J.;
Brutscher, B.: „Optimized set of twodimensional
experiments for fast sequential assignment, secondary structure determination, and
34
backbone fold validation of C-13/N-15-labelled proteins” J. Biomol. NMR 27, 2003.: 57– 67, doi: 10.1023/A:1024746306675 13
Atreya, H.S .; Szyperski, T.: „G-matrix Fourier transform NMR spectroscopy for complete protein resonance assignment” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2004.: 9642–9647, doi: 10.1073/pnas.0403529101
14
Kupce, E.; Freeman, R.: „Projection-reconstruction technique for speeding up multidimensional NMR spectroscopy” J. Am. Chem. Soc. 126, 2004.: 6429–6440, doi: 10.1021/ja049432q
15
Kupce, E.; Freeman, R.: „Fast multi-dimensional Hadamard spectroscopy” J. Magn. Reson. 163, 2003.: 56–63, doi: 10.1016/S1090-7807(03)00036-3
16
Brutscher, B.: „Combined frequency- and time-domain NMR spectroscopy. Application to fast
protein
resonance
assignment”
J.
Biomol.
NMR
29,
2004.:
57–64,
doi: 10.1023/B:JNMR.0000019501.21697.34 17
Frydman, L.; Lupulescu, A.; Scherf, T.: „Principles and features of single-scan twodimensional NMR spectroscopy” J. Am. Chem. Soc. 125, 2003.: 9204–9217, doi: 10.1021/ja030055b
18
Shrot, Y.; Frydman, L.: „Single-scan NMR spectroscopy at arbitrary dimensions” J. Am. Chem. Soc. 125, 2003.: 11385–11396, doi: 10.1021/ja0350785
19
Lescop, E.; Schanda, P.; Rasia, R. ; Brutscher, B.: „Automated spectral compression for fast multidimensional NMR and increased time resolution in real-time NMR spectroscopy” J. Am. Chem. Soc. 129, 2007.: 2756–2757, doi: 10.1021/ja068949u
20
Lescop, E.; Kern, T.; Brutscher, B.: „Guidelines for the use of band-selective radiofrequency pulses in hetero-nuclear NMR: Example of longitudinal-relaxationenhanced BEST-type 1H–15N correlation experiments” J. Magn. Reson 203, 2010.: 190– 198, doi: 10.1016/j.jmr.2009.12.001
21
McBride, O. W.; Merry, D.; Givol, D.: „The gene for human p53 cellular tumor antigen is located on chromosome 17 short arm (17p13)” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 83(1), 1986.:130–134, doi: 10.1073/pnas.83.1.130
22
Ko, L.J.; Prives, C.: „p53: puzzle and paradigm” Genes Development 10, 1996.: 10541072, doi: 10.1101/gad.10.9.1054
35
23
Lee, C. W.; Martinez-Yamout, M. A.; Dyson, H. J.; Wright, P. E.: „Structure of the p53 transactivtion domain in complex with the nuclear receptor coactivator binding domain of CREB binding protein” Biochemistry 49(46), 2010.: 9964-9971, doi: 10.1021/bi1012996
24
Garrett, S. C.; Varney, K. M., Weber, D. J.; Bresnick, A. R.: „S100A4, a Mediator of Metastasis” J. Biol. Chem. 281, 2006.: 677-680, doi: 10.1074/jbc.R500017200
25
van Dieck, J.; Teufel, D. P.; Jaulent, A. M.; Fernandez-Fernandez, M. R.; Rutherford, T. J.; Wyslouch-Cieszynska, A.; Fersht, A.R.: „Posttranslational Modifications Affect the Interaction of S100 Proteins with Tumor Suppressor p53”: J. Mol. Biol. 394(5), 2009.: 922–930, doi:10.1016/j.jmb.2009.10.002
26
Grigorian, M.; Andresen, S.; Tulchinsky, E.; Kriajevska, M.; Carlberg, C.; Kruse, C.; Cohn, M.; Ambartsumian, N.; Christensen, A.; Selivanova, G.; Lukanidin, E.: „Tumor suppressor p53 protein is a new target for the metastasis-associated Mts1/S100A4 protein: functional consequences of their interaction” J. Biol. Chem. 276(25), 2001.: 22699-22708. doi: 10.1074/jbc.M010231200
27
Darvas Zs, László V. Sejtbiológia 4. kiadás. Semmelweis Kiadó Budapest; 2005
28
Nyitray
L,
Pál
G.
A
biokémia
és
molekuláris
biológia
alapjai
http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/ABiokemiaEsMolekularisBiologiaAlapj ai/index.html Letöltés ideje: 2015.09.15. 29
May, P.; May, E.: „Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 protein” Oncogene 18(53), 1999.: 7621 – 7636, doi:10.1038/sj.onc.1203285
30
Ziemer, M. A.; Mason, A; Carlson, D.M.: „Cell-free translations of proline-rich protein mRNAs”
J.
Biol.
Chem.
257(18),
1982.:
11176-11180
http://www.jbc.org/content/257/18/11176.long 31
Wells, M.; Tidow, H.; Rutherford, T. J.; Markwick, P.; Ringkjobin Jensen, M.; Mylonas, E.; Svergun, D. I.; Blackledge, M.; Fersht, A. R.: „Structure of tumor suppressor p53 and its intrinsically disordered N-terminal transactivation domain” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(15), 2008.: 5762-5767, doi: 10.1073/pnas.0801353105
32
Lee, H.; Mok K. H.; Muhandiram, R.;Park, K. H.; Suk, J. E.; Kim, D. H.; Chang, J.; Sung, Y. C.; Choi, K. Y.; Han, K. H.: „Local Structural Elements in the Mostly Unstructured Transcriptional Activation Domain of Human p53” J. Biol. Chem. 275(38), 2000.: 2942632, doi: 10.1074/jbc.M003107200 36
33
Oldfield, C. J.; Cheng, Y.; Cortese, M. S.; Brown, C. J.; Uversky, V. N.; Dunker, A. K.: „Comparing and combining predictors of mostly disordered proteins” Biochemistry 44, 2005.: 1989–2000, doi: 10.1021/bi047993o
34
Kosol, S.; Contreras-Martos, S.; Cedeño, C.; Tompa, P.: „Structural Characterization of Intrinsically Disordered Proteins by NMR Spectroscopy” Molecules 18, 2013.: 1080210828, doi:10.3390/molecules180910802
35
Dyson, H. J.; Wright P. E.: „Intrinsically unstructured proteins and their functions” NATURE REVIEWS Molecular Cell Biology 6, 2005.: 197-208, doi:10.1038/nrm1589
36
Tompa, P.: „Intrinsically unstructured proteins” TRENDS in Biochemical Sciences 27 (10), 2002.: 527-533 doi: 10.1016/S0968-0004(02)02169-2
37
http://www.bmrb.wisc.edu/ref_info/statsel.htm Letöltés ideje: 2014.11.25.
38
http://iupred.enzim.hu/ Letöltés ideje: 2015.10.23.
39
Dosztányi, Zs.; Csizmók, V.; Tompa, P.; Simon, I.: „The Pairwise Energy Content Estimated from Amino Acid Composition Discriminates between Folded and Intrinsically Unstructured Proteins” J. Mol. Biol. 347, 2005.: 827–83, doi: 0.1016/j.jmb.2005.01.071
40
Romero, P.; Obradovic, Z.; Kissinger, C. R.; Villafranca, J. E.; Dunker, A. K.: „Identifying disordered regions in proteins from amino acid sequences” Proc. IEEE Int. Conf. Neural Netw. 1, 1997.: 90–95, doi: 10.1109/ICNN.1997.611643
41
Linding, R.. Jensen, L. J.; Diella, F.; Bork, P.; Gibson, T. J.; Russell, R. B.: „Protein disorder prediction: implications for structural proteomics” Structure 11, 2003.: 1453– 1459, doi: 10.1016/j.str.2003.10.002
42
Uversky, V. N.; Gillespie, J. R.; Fink, A. L.: „Why are ‘natively unfolded’ proteins unstructured
under
physiologic
conditions?”
Proteins
41,
2000.:
415–427,
doi: 10.1002/1097-0134(20001115)41:3<415::AID-PROT130>3.0.CO;2-7 43
Ward, J. J.; Sodhi, J. S.; McGuffin, L. J.; Buxton, B. F.; Jones, D. T.: „Prediction and functional analysis of native disorder in proteins from the three kingdoms of life” J. Mol. Biol. 337, 2004.: 635–645, doi: 10.1016/j.jmb.2004.02.002
44
Eisenberg, D.; Schwarz, E.; Komaromy, M.; Wall, R.: „Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic moment plot” J. Mol. Biol., 179(1), 1984.: 125142, doi: 10.1016/0022-2836(84)90309-7
37
45
Samanta, U.; Bahadur, R. P., Chakrabarti, P.: „Quantifying the accessible surface area of protein residues in their local environment” Protein Engineering 15, 2002.: 8.659–667 doi: 10.1093/protein/15.8.659
46
Széll A.: „A rendezetlen p53 fehérje TAD-régiójának szabad és az S100A4 fehérjével alkotott komplexének NMR-spektroszkópiai jellemzése” Szakdolgozat Eötvös Loránd Tudományegyetem, Kémiai Intézet, Analitikai Kémiai Tanszék, 2014
47
Rochus
L.J.
Keller:
„The
CARA/Lua
Programmers
Manual”,
2003
http://www.mol.biol.ethz.ch:8060/CARA L Letöltés ideje: 2014.11.25. 48
Goddard, T. D.; Kneller, D.G.: „Sparky 3” 2008; University of California, San Francisco http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ Letöltés ideje: 2014.11.25.
49
http://www.sisweb.com/referenc/source/exactmaa.htm Letöltés ideje: 2015.10.23.
50
Wishart, D. S.; Bigam, C. G.; Holm, A.; Hodges, R. S.; Sykes, B. D.: „ H,
1
13
15
C and
N
random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects” J. Biomol. NMR 5, 1995.: 67-81. doi:10.1007/BF00211764 51
Braun, D.; Wider, G.; Wüthrich, K.: „Sequence-Corrected
15
N "Random Coil" Chemical
Shifts” J. Am. Chem. Soc. 116(19), 1994.: 8466-8469 doi: 10.1021/ja00098a005 52
Wishart, D. S.; „Sykes, B. D.: „The 13C chemical-shift index: a simple method for the identification of protein secondary structure using NMR, 4, 1994.: 171–180, doi: 10.1007/BF00175245
38
13
C chemical-shift data” J. Biomol.
