Gyors mikrobiológiai vizsgálatok jelentősége az ivóvíz vizsgálatok területén Tabajdiné dr. Pintér Vera, Rohonczy Kata
Dr. E. Wessling Kft.-FoodMicro Kft.
1084 Budapest, Tolnai L. u. 25. www.foodmicro.hu ÖKOTECH Kiállítás 2006. október 10.
Szakterületeink
Környezetanalitika
Termékvizsgálatok
Tervezés és tanácsadás
•
Vízgazdálkodás
•
Élelmiszer
•
•
Talaj/Iszap
•
Gyógyszerek
•
Hulladékgazdálkodás
•
Takarmány
•
Műszaki ellenőrzés
•
Emisszió/Immisszió
•
Kozmetikumok
•
Ingatlanok
•
Azbeszt
•
Termékmegfelelőség
•
Talaj és talajvízkezelés
•
Anyag és termékbeviszgálás •
Tanácsadás
•
Projektvezetés
Környezetvédelmi
üzemeltetés
Környezetvédelem Vízgazdálkodás Talajvíz, vezetékes víz, felszíni víz Ivóvíz Fürdővíz Szennyvíz Vízvizsgálatok tisztító telepeken Idő és mennyiség arányos szennyvíz
mintavétel Csatornarendszer Szennyvíziszap
Az akkreditálás műszaki területe • élelmiszer-nyersanyagok, -adalékanyagok,- technológiai segédanyagok és késztermékek mikrobiológiai mintavétele és vizsgálata, • kozmetikai alapanyagok, -adalékanyagok, technológiai segédanyagok és késztermékek mikrobiológiai mintavétele és vizsgálata, • élelmiszergyártás melléktermékeinek és hulladékainak mikrobiológiai mintavétele és vizsgálata • élelmiszer – és kozmetikum-gyártással kapcsolatos környezeti higiéniai minták mikrobiológiai mintavétele és vizsgálata • ivóvíz, ásványvíz és palackozott víz mikrobiológiai mintavétele és vizsgálata • fürdővíz mintavétele és mikrobiológiai vizsgálata • takarmányok mintavétele és mikrobiológiai vizsgálata • állati eredetű élelmiszerek antibakteriális gátlóanyag vizsgálata • élelmiszerek vízaktivitásának vizsgálata • szakvélemény adása megfelelősségről vagy nem-megfelelőségről
SZOLGÁLTATÁSAINK • • • • • • • • • • • •
Az akkreditálás műszaki területéhez tartozó minták (élelmiszer, takarmány, higiéniai és környezeti minták, levegő, víz, fürdővíz, kozmetikai készítmények) mintavétele és vizsgálata klasszikus és gyors módszerekkel Élelmiszerbiztonsági paraméterek Bacillus cereus, Clostridium perfingens, Salmonella sp., Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Campylobacter, E.coli O157 Higiéniai paraméterek Pseudomonas aeruginosa, Szulfitredukáló Clostridium, Koliform, Escherichia coli, Enterobacteriaceae, Enterococcus, Enterococcus faecalis, Endoszám, Kokkusz-szám, Fekálkoliform, Fertőtlenítőszer hatékonyság vizsgálatok Minőségi paraméterek Alicyclobacillus acidoterrestris, Aerob és anaerob spóra, Laktobacillus sp., Mezofil aerob mikróba, Mezofil aerob spóra, Penész- és élesztőgomba, Ozmofil élesztőgomba, Bifidobaktérium, Psychrofil mikrobák Környezeti ártalom vizsgálata Levegő mikrobiológiai szennyezettségének mérése Legionella vizsgálat
Élelmiszer fogalma
2005. évi CLIX. Törvénnyel módosított 2003. évi LXXXII. Törvény és az abban hivatkozott 178/2002 EK rendelet értelmében Élelmiszer: minden olyan feldolgozott, részben feldolgozott vagy feldolgozatlan anyagot vagy terméket jelent, amelyet emberi fogyasztásra szánnak. Az élelmiszer fogalmába beletartozik a víz is. A víz a legnagyobb mennyiségben előállított élelmiszer. A Magyar Víziközmű Szövetség adatai alapján a vezetékes ivóvíz hálózatok üzemeltetői naponta 2 millió m3 vizet juttatnak el a fogyasztókhoz.
• „A levegő tisztasága, nedvességtartalma és hőmérséklete, a zaj, és az izgalom, a fizikai munka mennyisége stb. mind igen fontosak de környezetünkkel való kapcsolatunkban az egyik legalapvetőbb tényező az étel, mivel környezetünk az ételek formájában hatol be szervezetünkbe a legközvetlenebbül.” Szent-Györgyi Albert
Élelmiszerekkel szemben támasztott követelmények • • •
Egészségre ártalmatlan Jó minőség (érzékszervi tulajdonság, beltartalom) Gazdaságosan előállítható
•
Tömeges termelés, iparszerű állattenyésztés és
•
Nemzetközi kereskedelem, túrizmus (mikrobaforgalom)
• • • • •
•
Késztermék vizsgálat már túl késő Preventív, technológiába beépülő szabályozási rendszer Élelmiszeripar (2002) Vízi közművek (ivóvíz, egyedi vízellátás, vízkezelés, vizes technológiák)
növénytermesztés, központi vízellátás
•
Új táplálkozási szokások (új tartósítási technológiák) Új kereskedelmi formák (mmi) Feldolgozottsági fok növelése Immunrendszer gyengülése Kórokozók virulenciájának,patogenitásának növekedése Az első vízadó réteg irreverzibilis elszennyeződése HACCP, kockázat elemzés (becslés WHO, kezelés, kommunikáció) a teljes folyamatban Módszerekkel szemben új követelmények
Mikrobiológiai vizsgálatokkal szembeni új követelmények
• Gyors vagy gyorsított • Egyszerű • Munka és anyagtakarékos • Reprodukálható • Károsodott sejtek kimutatása • Nagyszámú kísérő flóra mellett kórokozó és romlást okozó mikroorganizmusok megkeresése • Biofilmet alkotó és VNC mikrobákat kimutatása
• • • • • •
Analitikai kémiai Enzimológiai Fizikai kémiai Immunbiokémiai Műszeres elektronikai Molekuláris biológiai
Gyors mikrobiológiai vizsgálatok csoportosítása
Hagyományos módszerek gyorsítása, automatizálása • • • • • • • • •
Kész táptalajok Gravimetriás adagolás, hígítás Spirál lemez módszer Telepszámlálás automatizálása Petri-film TEMPO Hidrofób hálózatos HGMF(Grid) Új szelektív táptalajok Egyszer használatos eszközök
Direkt sejtszámlálás újabb módszerei • • • • •
Részecskeszámlálás Flow citometria DEFT technika (COBRA, BACTO SCAN) Lézeres értékelés (ChemScan) Immunfluoreszcencia
Gyors mikrobiológiai vizsgálatok csoportosítása
Sejtalkotók szelektív elemzése
Mikroba metabolitok mérése
• ATP meghatározás • DNS hibridizációs módszer • PCR • Zsírsav analízis • Fehérje, aminosav analízis • LAL tesz (sejtfal lipopoloszacharid) • Patogenitási faktor (p60)
• • • • • • •
Gázösszetétel Toxinok Diacetil Titrálható savtartalom Alkoholok, szerves savak Nitrát/nitrit CO2, H2, H2S, NH4
Gyors mikrobiológiai vizsgálatok csoportosítása
Mikrobaszaporodás detektálása
Immunológiai módszerek
• Impedancia, konduktancia mérés (Malthus, Rabbit, BacTrac) • Turbidimetria (Bioscreen) • Mikrokalorimetria (DSC) • Radiometriás módszerek • Redoxpotenciál mérés
• • • •
ELISA, ELFA(VIDAS) RIA Immunfluoreszcencia Latex agglutináció
Sejtkoncentrálás • • • •
Szűrés IMS Immuncapture system PCR
Gyors mikrobiológiai vizsgálatok csoportosítása
Korszerű diagnosztikai eljárások • Immunológiai módszerek (Path stick, Single path, Reveal) • Molekuláris diagnosztika • Biokémiai módszerek (Identifikáló kitek:API, Crystal)
Mikrobiológiai vizsgálatok típusai
• Jelenlét/hiány • Szám meghatározás • Azonosítás
Víz mikrobiológiai paraméterek
Szám meghatározás
Jelenlét/hiány próba
• • • • • • • •
Salmonella Campylobacter E.Coli O157:H7 L.monocytogenes Shigella Y.enterocolitica
E.coli Koliform Mikrobaszám E.faecalis C.perfringens P.aeruginosa S.aureus Legionella
Kórokozó vizsgálatok időigénye IMS, PCR, 24-48 óra
48-52 óra
ICS, (TECRA UNIQUE, VIDAS) Célirányos FIZIKAI MÉRÉSEK vizsgálatok MSRV, Diassalm Célirányos ELFA (VIDAS), ELISA (TECRA, BIOLINE), FIA, vizsgálatok Latex agglutináció Gen próba Path stick, Single path,Reveal
Élelmiszer, Víz 25g x ml MF Elődúsítás 6-24 óra Szelektív dúsítás 24-48 óra Szelektív agar HARLEQIN, RapidLmono COMPASS, SM2, ALOA
24-48 óra Nutrient agar 24 óra 72-96 óra
API, BBLCrystal Micro ID, Enterotube II
Szerológiai vizsgálatok
Biokémiai reakciók 6-24 óra
Mikrobaszaporodás detektálása (hő, turbiditás, szín, konduktancia, beütésszám, redoxpotenciál)
PCR vizsgálatok folyamata
Elődúsítás 16-20 óra
24 óra
DNS preparálás (lízis, inaktiválás)
36 - 48 óra
Amplifikálás
Utódúsítás BHI 3 óra
Detektálás (vékonyréteg ELISA)
ELISA, ELFA vizsgálatok folyamata Élelmiszer, víz
24 óra
36 - 48 óra
Elődúsítás 6-24 óra
IMS, MF ICS (TECRA UNIQUE, VIDAS) Utódúsítás M-leves 5 ó
ELISA,ELFA (TECRA, VIDAS)
(MF)
(Utódúsítás) HŐKEZELÉS
Szelektív dúsítás 24-48 óra
Immunkromatográfia Path stick, Single path,Reveal
Reagens zóna
Minta
Arannyal konjugált antigén SZÍNINDIKÁTOR Arannyal konjugált Salmonella antitest KONJUGÁTUM
anti S.antitest Nitrocellulóz membrán
Negatív kontrol zóna
Kromogén táptalajok
Kromogén táptalajok
Compass 5 bromo 6 chloro 3 indolyl caprylate esterase 5 bromo 6 chloro 3 indolyl Kísérő flóra
Salmonella
Észteráz ß-D-glükozidáz
Harlequin alfa-galaktozidáz béta-galaktozidáz
+ piros
+ kék
+ + lila
színtelen
Salmonella
Kísérő flóra
+ zöld
fekete
Kromogén táptalajok
Kromogén táptalajok
COMPASS 5 bromo 6 chloro 3 indolyl D glukosidase ALOA 5 bromo 4 chloro 3 indolyl glukopyranozide L.monocytogenes: kék opálos udvarral körülvett telepek RapidL.mono Foszfolipáz-C és xylóz fermentáció
Jellemző paraméterek MSZ EN ISO 16140
Relatív pontosság: Relatív specitikusság: Relatív érzékenység:
Alternatív + Alternatív -
100 · (p+n) / N % 100 · n / (n+fp) % 100 · p / (p+fn) %
Referencia +
Referencia -
p fn
fp n
A módszerek jellemző paraméterei n=85 (MSZ EN ISO 16140) Relatív Relatív pontosság (%) specifitás (%)
Relatív érzékenység (%)
COMPASS
100
100
100
HARLEQUIN
100
100
100
SM2
100
100
100
VIDAS SLM
100
100
100
VIDAS ICS+SLM
99
100
98
TECRA ICS
99
100
95
A módszerek jellemző paraméterei n= 63 (MSZ EN ISO 16140)
Relatív pontosság (%)
Relatív specifitás (%)
Relatív érzékenység (%)
ALOA
100
100
100
COMPASS
100
100
100
VIDAS LMO2
100
100
100
• Az új alternatív vizsgálati módszerek segítik a vizsgáló laboratórium munkáját. • A kromogén szubsztrátot tartalmazó táptalajok szelektívebbek, és jól elkülöníthető telepeket képeznek. • A műszeres vizsgálatokkal pedig idő takarítható meg.
Következtetések • Olyan módszerek összehasonlítására került sor, melyek segítségével a patogén mikroorganizmusok kimutatása egyszerűbb, gyorsabb a hagyományos eljárásoknál. • Az általunk tesztelt vizsgálati módszereknek: – alacsony a kimutatási határa – nagyobb szelektivitás a kimutatandó kórokozóra – mind a fals pozitív eredmények aránya minimális – validáltak
A klasszikus vizsgálatok gyors diagnosztikai módszerekkel való helyettesítésével a jelenleg használatos minőségbiztosítási rendszereket maximálisan ki tudjunk szolgálni.
Mikrobaszám meghatározás Élelmiszer, víz Részecske számláló DEFT IF ATP meghatározás Lézeres (ChemScan) Metabolit mérés
Hígítási sor
Tenyésztés
Spirál lemez HGMF TEMPO
Konduktancia Turbidimetria Mikrokalorimetria Radiometria Redoxpotenciál
Petrifim Fibrinogén RPF
Kromogén Műszeres mérés
táptalaj (Colilert)
Átoltás, tenyésztés
Tenyésztés
Műszeres mérés
Értékelés 1-4 óra
2-5 nap
24 ó
6-24 ó
E.coli szabványok és definíciók
Élelmiszerek MSZ 3640/12-79, MSZ 3640/19-79 E.coli olyan koliform baktérium, amely epét, vagy epesót tartalmazó folyékony táptalajban a laktózt gázképződés mellett 30° és 44,5°C-on bontja, és amely az IMViC próbákban az E.colira jellemző reakciókat mutatja
Víz MSZ EN ISO 9308-1:2001 E.coli: epeellenálló baktériumok, amelyek indolt képeznek triptofánból 44°C-on 21+3 órán belül
Tej és tejtermékek MSZ EN ISO 3743/4-87 E.coli olyan koliform baktérium, amely epét, vagy epesót tartalmazó folyékony táptalajban a laktózt gázképződés mellett 30° és 44,5°C-on bontja, és amely az IMViC próbákban az E.colira jellemző reakciókat mutatja
Horizontális módszerek MSZ ISO 7251:2005 feltételezetten E.coli, mely 44°C-on a laktózt gázképződés mellett bontja, illetve a triptofánból indolt képez … MSZ ISO 16649-2:2004 ß-D-glükoronidáz pozitív E. coli olyan baktérium, amely jellegzetesen kék telepeket képez 44°C-on a tripton-epe-glükuronid (TBX ) táptalajon… MSZ ISO 16649-3:2004 feltételezetten E.coli , mely 4-metilumbelliferyl-ß-D-glükuronid (MUG) felhasználásával fluoreszcenciás reakciót ad, miközben a triptofánból indolt képez …
E. coli számának meghatározása
Klasszikus módszerrel : MPN módszer, lemezöntés, felületi szélesztés -Chromogén táptalajok -fluorocult táploldatok felhasználása ß-D-galaktozidáz ß-D-glükoronidáz
E.coli Coliform + + + -
Petri-film módszerek
Automatizált módszerek: -konduktometriás elven alapuló készülékek ( Bac-track, RABIT, Malthus), -MPN elven alapuló módszer (TEMPO)
Felhasznált tápközegek •
• Lemezes – Chromocult ( E.coli/Koliform) – Chromocult ES ( E.coli/Koliform) – Petri-film ( E.coli/Koliform) – Coli ID ( E.coli/Koliform) – TBX 1 (E.coli) – TBX 2 (E.coli) – Petri-film ( TBX ) (E.coli) – Rida Count ( TBX) (E.coli)
MPN – Fluorocult ( E.coli/Koliform) – Brila-fluorocult ( E.coli/Koliform) – Lauryl-szulfát + EC ( E.coli/Koliform) – TEMPO ( E.coli)
TEMPO KÉSZÜLÉK
Húsok, húskészítmények, tej, tejtermékek, ivóvíz
y=0,49+0,91x r=0,98
Módszerösszehasonlítás
E.coli meghatározási módszerek összehasonlítása 4,5 4
3,76 3,75
3,58 3,68 3,73
3,72 3,42
3,57 3,54
3,76
3,533,54 3,68
3,93
3,5 3 2,5
Táptalajok
po Te m
a Br il
uo r Fl
La ur il
C
ol i
ID
C R
BX PF T
4 TB X
3 TB X
2 TB X
1 TB X
/E
co li
ES PF C
hr om C
C
hr om
2
KÖVETKEZTETÉSEK
30 órán belül kiadható Salmonella, L. monocytogenes, E.coli 0157, Campylobacter, Staph. enterotoxin, E.coli, Mikrobaszám, Koag. pozitív Stahylococcus, Enterobacteriaceae eredmény , eleget téve az új EU direktíva előírásainak. CALITAX, FEPAS, OKI, OÉVI és általun szervezett körvizsgálatokban tesztelt módszerek
Mi határozza meg, hogy melyik módszert válasszuk?
• • • •
• • • • •
a vizsgálat célja biztonsági szint mintavételi terv validálás érzékenység specifikusság pontosság a vizsgált mátrix vizsgálati idő automatizálás lehetősége, adattárolás, adatelemzés szerviz és céginformációk vizsgálati költség
Akkreditált gyors vizsgálati módszerek Salmonella REVEAL módszerrel
KSZ 28
AOAC 998.09
Salmonella ELISA módszerrel
KSZ 14
AOAC 998.09
Salmonella MINIVIDAS-30 órás ICS+SLM
KSZ 31
BIO-12/06-03/99
Salmonella MINIVIDAS 48 órás SLM
KSZ 32
AOAC 996.08, BIO-12/1-04/94
Listeria spp gyors MINIVIDAS készülékkel 30 óra LSX
KSZ 33
BIO-12/12-07/04
Listeria monocytogenes MINIVIDAS 48 óra LMO2
KSZ 34
BIO-12/09-07/02
Campylobacter MINIVIDAS
KSZ 35
E.coli O157 MINIVIDAS ECO
KSZ 36 BIO-12/8-07/00
Staph enterotoxin MINIVIDAS SET2
KSZ 37 AOAC 070404
Mikrobaszám meghatározás Petri film típusú módszer
KSZ16 AFNOR 01/1-09/89 AOAC 990.12, AOAC-RI 01 1001
Koliform és E.coli szám meghatározás Petri film típusú módszer
KSZ17 AFNOR 01/4-09/92 AOAC 991.14, AOAC-RI 01 1001
Enterobektérium szám meghatározás Petri film típusú módszer
KSZ18 AFNOR 01/6-09/97
Penész és Élesztőszám meghatározás Petri film típusú módszer
KSZ19 AOAC 997.02 AOAC-RI 01 1001
Mikrobaszám meghatározás TEMPO készülékkel
KSZ 42
E.coli szám meghatározás TEMPO készülékkel
KSZ 43
Mikrobiológiai vizsgálatok a HACCP programokban
FOLYAMAT ELLENŐRZÉS – Fizikai indikátorok (oC, t, aw, pH..) – Kémiai indikátorok (tart.szer konc., fert.szer konc., savak..) – Direkt sejtszámlálás
KOCKÁZATBECSLÉS alap-, adalék-, segédanyag vizsgálat eloszlásvizsgálat, mintavételi terv matematikai modellezés technológiai műveletek méretezése környezet vizsgálatok challenge test HACCP verifikálás (késztermék vizsgálat) Megfelelő biztonságú becslés
nagyszámú vizsgálat
KÖSZÖNÖM A MEGTISZTELŐ FIGYELMÜKET !
Staphylococcus enterotoxin vizsgálatok European Screening Method (ESM)
• • • • • • • • • •
25 g minta 25-40 ml extraháló (deszt.víz, triklórecetsav) Homogenizálás Szobahőmérséklet 0,5-1 óra Savanyítás pH 3,5 Centrifugálás 3000-5000g Neutralizálás pH 7,3 Centrifugálás Dializálás (koncentrálás) v. szűrés TECRA SET VIA (TransiaPlate), TECRA SET UIQUE VIDAS SET2
Reveal Salmonella Test Élelmiszer 25 g
1 fiola táptalaj + 200 ml 42°C-os steril víz oldás
Homogenizálás Stomacher 2 perc
Elődúsítás (361°C) 2-4 óra
1 fiola táptalaj (d-RV) + 200 ml 37°C-os steril víz oldás
Szelektív dúsítás (421°C) 18-24óra
Reveal teszt 15 perc
