Szent István Egyetem Gödöll
ÚJ ELEMEK A FUSARIUM/GIBBERELLA FAJOK GENETIKAI KOMPATIBILITÁSÁNAK SZABÁLYOZÁSÁBAN
Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei
Oláh Brigitta
Gödöll 2006.
A doktori iskola neve:
Biológiatudományi Doktori Iskola
tudományága:
Biológia
vezet je:
Dr. Tuba Zoltán tanszékvezet egyetemi tanár Szent István Egyetem, Mez gazdasági- és Környezettudományi Kar, Növénytani és Növényélettani Tanszék
Témavezet k:
Dr. Kerényi Zoltán tudományos munkatárs Mez gazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Gödöll
Dr. Hornok László az MTA levelez tagja, tanszékvezet egyetemi tanár Szent István Egyetem, Mez gazdasági- és Környezettudományi Kar, Mez gazdasági Biotechnológiai és Mikrobiológiai Tanszék
...................................
...................................
..................................
Dr. Tuba Zoltán
Dr. Kerényi Zoltán
Dr. Hornok László
a doktori iskola vezet je
témavezet
2
témavezet
El zmények, kit zött célok
A különböz
Fusarium fajok által okozott növényi betegségek régóta ismertek. A fert zés
következtében csökken a termésmennyiség és romlik a termés min sége is, valamint a fert zött szemek vet magként sem használhatók fel. További probléma, hogy a Fusarium nemzetségen belül szinte az összes gomba termel valamilyen másodlagos anyagcsere terméket: gibberellinsavat, valamint különböz
mikotoxinokat. A mikotoxinnal szennyezett gabona fogyasztása mind az
emberre, mind az állatokra nézve veszélyes. Adott gomba populáción belül az ivaros és ivartalan szaporodás gyakorisága határozza meg például azt, hogy milyen gyorsan alakulnak ki új virulencia, vagy fungicid rezisztencia gének. A fonalas aszkomicétáknál a párosodási típus, illetve a vegetatív inkompatibilitás felel s a sajátidegen felismerésért az ivaros és a vegetatív reprodukciós fázisokban. Az ivaros szaporodás feltétele, hogy két olyan törzs találkozzon, amelyek eltér idiomorfokat tartalmaznak a párosodási típus (MAT
mating type) lókuszaikban. Az anasztomózis révén létrejött heterokarióta sejt
életképességét pedig, a het (heterokaryon) lókuszokban található gének szabályozzák. A fonalas aszkomicéták közül a Neurospora crassa és a Podospora anserina párosodási típus génjeit vizsgálták a legalaposabban. A N. crassa két eltér párosodási típusát A-val és a-val jelölik. A mat a idiomorf kett (Staben és Yanofsky, 1990; Pöggeler és Kück, 2000), a mat A idiomorf pedig három gént tartalmaz (Ferreira et al., 1996). A P. anserina két párosodási típusa mat+ és mat. Az egyik idiomorf (mat+) egy (FPR1), a másik idiomorf pedig szintén három (FMR1, SMR1, SMR2) gént tartalmaz (Debuchy, 1999). Gibberella moniliformis esetében is hasonló eredményeket kaptak. A MAT-1 idiomorf három gént tartalmaz, a MAT-2 idiomorf pedig egyet (Yun et al., 2000). Yun és munkatársai (2000) a homotallikus Gibberella zeaeben és az (eddigi ismereteink szerint) ivartalanul szaporodó a Fusarium oxysporumban is megtalálták a MAT idiomorfokat, a gének szervez dése a G. moniliformisban leírthoz hasonlít. A számítógépes szekvencia elemzések során kiderült, hogy a fonalas aszkomicéták MAT fehérjéi konzervatív régiókat tartalmaznak. A N. crassa és a P. anserina MAT A-1 és FMR1 fehérjéi egy -domént, a MAT A-2 és SMR1 fehérjék egy savas amfipatikus -helixet ( -helikális fehérjét), míg a MAT A-3 és SMR2 fehérjék egy HMG (high mobility group) domént (HMG-1) tartalmaznak. A MAT a-1 és FPR1 fehérjék szintén egy HMG domént (HMG-2) tartalmaznak. Az -domént és a HMG-2 régiót tartalmazó gének szükségesek a párosodási típus kialakításához. Ezek a gének nagyon konzervatívak, olyannyira, hogy a különböz
töml s gomba fajok között
felcserélhet ek (Shiu és Glass, 2000). A párosodási folyamat során a megfelel partner kiválasztása feromon jelek segítségével történik. Ez a kett s feromon
feromon receptor kölcsönhatás jelátviteli útvonalakat indít be, 3
amelyek megváltoztatják a génexpressziós mintázatot. A feromonok egy olyan sejtfelszíni receptorhoz kapcsolódnak, amely hét transzmembrán doménb l épül fel, és egy heterotrimer szerkezet G-fehérje kapcsolódik hozzá. Amikor a feromon a receptorhoz kapcsolódik, a G-fehérje aktiválódik, a G alegység leválik a G különböz
dimerr l. Ezután mindkét alegység tovább viheti a jelet
effektorok stimulálásával, mely lehet adenilát-cikláz, foszfolipáz C, MAP-kináz
kaszkád, vagy ion csatornák (Lee et al., 2003). A vegetatív inkompatibilitás mechanizmusa meglehet sen eltér a különböz él lényekben és sok esetben még ma sem teljesen érthet , hogy hogyan is m ködik. A het (heterokaryon) gének által szabályozott mechanizmus lehet allélos, vagy nem-allélos rendszer . Allélos szabályozás esetén, akkor jön létre stabil heterokarion ha két törzs azonos allélt hordoz a megfelel
het
lókuszaiban. A nem-allélos kölcsönhatásokban pedig, az inkompatibilitás nem egy, hanem két különböz lókuszban található het gén kölcsönhatásából adódik (Glass és Kuldau, 1992). A legtöbb gombában nagyszámú het lókusz található: Cryphonectria parasiticaban hét (Cortesi és Milgroom, 1998), P. anserinaban kilenc (Bégueret et al., 1994), N. crassaban pedig tizenegy (Glass és Kuldau, 1992). Az eddig vizsgált fajok nagy részénél a vegetatív inkompatibilitás allélos rendszer , azonban néhány fajnál, mint például P. anserina, C. parasitica és Heterobasidion annosum (Chase és Ulrich, 1990) esetében a nem-allélos rendszer inkompatibilitást is leírták. Az eddig klónozott het gének termékei nagyon eltér ek mind a szekvencia, mind a funkció és a lokalizáció tekintetében. A Fusarium nemzetségen belül legalaposabban a Fusarium verticillioides (G. moniliformis) rendszerét vizsgálták. Vegetatív inkompatibilitási csoportok vizsgálata során megállapították, hogy a faj vegetatív inkompatibilitási rendszerét legalább tíz het lókusz ellen rzi, melyek allélos rendszer ek (Leslie, 1993). A kórokozó gombák szaporodás- és populációbiológiai folyamatainak megértése gyakran nyújt segítséget a megfelel védekezési stratégiák kidolgozásához. Mivel a Fusarium fajok igen széles körben elterjedtek, nem meglep
tehát, hogy a tudomány nagy figyelmet fordít a
vizsgálatukra. A kórokozók azonosításában és jellemzésében a morfológiai, élettani, biokémiai jellegek mellett egyre nagyobb szerepet kapnak a molekuláris, fehérje és nukleinsav markerek. A növény-kórokozó kölcsönhatás vizsgálatában szintén tért hódít a molekuláris biológia. Munkánk célkit zései a következ k voltak: (1) Megvizsgálni, hogy aszexuálisnak ismert Fusarium fajokban vannak-e párosodási típus gének, és ezek m köd képesek-e, valamint diagnosztikai indítószekvenciák kifejlesztése párosodási típus gyors azonosításához az egész nemzetségen belül. (2) Adatokat gy jteni a párosodási folyamatokat befolyásoló jelátviteli rendszerek megismeréséhez, ezen belül a Fusarium proliferatum (Gibberella intermedia) adenilátcikláz génjének a vizsgálata. (3) A Gibberella fujkuroi fajkomplexumon belül nagy egyedszámú
4
mintán megvizsgálni a N. crassa het-c homológjának (hch) a jelenlétét, polimorfizmusát és funkcióját.
Módszerek
A gombatörzsek fenntartása és tenyésztése A párosodási típus gének konzervatív régióinak felszaporításához felhasznált Fusarium fajok a következ k voltak: F. acuminatum ssp. acuminatum (10 törzs); F. acuminatum ssp. armeniacum (7 törzs); F. avenaceum (12 törzs); F. camptoceras (2 törzs); F. cerealis (5 törzs); F. chlamydosporum (3 törzs); F. compactum (8 törzs); F. culmorum (18 törzs), F. decemcellulare (1 törzs); F. equiseti (8 törzs); F. graminearum (1 törzs); F. longipes (1 törzs); F. merismoides (1 törzs); F. poae (8 törzs); F. scirpi (3 törzs); F. semitectum (6 törzs); F. solani (2 törzs); F. sporotrichioides (10 törzs); F. torulosum (6 törzs); F. tricinctum (5 törzs); F. tumidum (3 törzs); F. verticillioides (2 törzs). A hch gén hipervariábilis doménjének a vizsgálatához felhasznált Fusarium fajok: F. proliferatum (76 törzs); F. verticillioides (2 törzs); F. sacchari (2 törzs); F. fujikuroi (2 törzs); F. subglutinans (2 törzs); F. thapsinum (2 törzs); F. nygamai (2 törzs). A gombákat burgonya glükóz agar táptalajon tartottuk fenn 4 C-on, steril paraffin olaj alatt. A gombatörzsek rázatott tenyésztését komplett (LCM) tápoldatban végeztük 108 db konídiummal inokuláltunk 100 ml tápoldatot, és három napig rázattuk (24 C, 120 rpm). Az inokulumként használt konídiumot a következ módon nyertük: a micéliumból egy kis agarkockányi mennyiséget CMC tápoldatba (Cappellini és Peterson, 1965) oltottunk és három napig rázattuk (23-24 C, 180 rpm). A csírázás vizsgálatához komplett táptalajról steril desztillált vízzel lemosott konídium szuszpenziót használtunk 106 db/ml végkoncentrációban.
Polimeráz láncreakciók A polimeráz láncreakciókat 50 l térfogatban hajtottuk végre Biometra T3 Biocycler segítségével. A reakcióelegy tartalma: 20 ng genomi DNS, 1x PCR puffer (MBI Fermentas), 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM dNTP, 0,25
0,25
M indítószekvenciák, 1 U Taq polimeráz (MBI Fermentas), steril
desztillált víz.
MAT specifikus régiók felszaporítása A MAT1-1-1 specifikus konzervatív -domének felszaporításához általunk tervezett (F 1 és F 2), a MAT1-2-1 specifikus HMG-2 domének felszaporításához Arie és munkatársai (1997) által leírt indítószekvenciákat (NcHMG1 és NcHMG2) használtunk. A teljes hosszúságú MAT gének 5
felszaporításához inverz PCR technikát alkalmaztunk (Triglia et al., 1988), ezekhez a reakciókhoz Herculase Taq polimerázt (Stratagene) használtunk, a gyártó utasításai szerint. Különböz Fusarium fajok párosodási típusának gyors azonosítására tervezett diagnosztikai indítószekvenciák: fusALPHAfor, fusALPHArev, fusHMGfor és fusHMGrev. A MAT gének átíródását az aszexuálisnak vélt Fusarium fajokban RT-PCR-rel vizsgáltuk. Sárgarépás táptalajról lekapart micéliumból TRI reagenssel (Sigma) összRNS-t izoláltunk a gyártó utasításai szerint. Ezt a lépést egy RQ1 DNase (Promega) kezelés, majd els szál cDNS készítés követte. A PCR-hez az els szál cDNS-eket használtuk.
Fusarium proliferatum genomi génkönyvtár készítése F. proliferatum ITEM 2287 törzsb l izolált genomi DNS-t Sau3AI enzimmel részlegesen emésztettük és a 9-23 kb nagyságú tartományba es fragmentumokat Lambda DASH II bakteriofág vektorba (Gigapack III Gold Cloning Kit, Stratagene) ligáltuk és fágburokba csomagoltuk. Az így kapott el könyvtárat amplifikáltuk és meghatároztuk a titerét (5,5 x 107 pfu/ml). Mindent a gyártó utasításai szerint végeztünk.
A fpac1 és a fphch gének izolálása A fpac1 gén 3 végét és a teljes fphch gént a fent leírt génkönyvtárból izoláltuk. A plakk hibridizációt, a fág DNS tisztítást és a térképezést hagyományos molekuláris biológiai módszerekkel végeztük (Sambrook és Russel, 2001). A plakk hibridizációhoz az fpac1 gén 3 végének izolálásához az ACkat_for és az ACkat_rev degenerált indítószekvenciákkal (200 bp hosszúságú), az fphch gén izolálásához pedig az Fs_hetc_for és Fs_hetc_rev degenerált indítószekvenciákkal (340 bp hosszúságú) F. proliferatum ITEM 2287 genomi DNS-r l felszaporított, és
32
P izotóppal radioaktívan jelölt DNS fragmentumokat használtuk (Sambrook és
Russel, 2001). Az fpac1 gén 5 végét nem tudtuk a génkönyvtárból izolálni, ezt a fragmentumot inverz PCR-rel szaporítottuk fel.
Szekvencia analízis A nukleotid szekvencia meghatározásokat és az oligonukleotid indítószekvencia szintéziseket a gödöll i Mez gazdasági Biotechnológiai Kutatóközpontban m köd Biomi Kft. laboratóriumában végezték. Az indítószekvenciák tervezéséhez a Lasergene szoftver csomag (DNAStar Inc., Madison, Wis.) PrimerSelect nev
programját használtuk. A szekvencia összehasonlításokat
BLAST módszerrel (Altschul et al., 1997) végeztük, az EMBL adatbázist és a GenomeNet nev internetes oldal (http://www.genome.jp) BLAST programját használva. A DNS szekvenciák
6
elemzéséhez a Lasergene szoftver csomagot (DNAStar Inc., Madison, Wis.) és az FGENESH programot (http://www.softberry.com) használtuk.
Kópiaszám meghatározások és az fphch gén expressziójának vizsgálata Mindkét gén (fpac1 és fphch) esetében a kópiaszám meghatározáshoz a F. proliferatum ITEM 2287 törzsb l izolált genomi DNS-t különböz restrikciós endonukleázokkal emésztettük és az agaróz gélen elválasztott fragmentumokat Hybond N+ (Amersham) membránra vittük át, majd
32
P
izotóppal jelölt próbát hibridizáltattunk hozzá (Sambrook és Russel, 2001). A próbaként használt DNS fragmentumokat a fent említett degenerált indítószekvenciákkal szaporítottuk fel F. proliferatum ITEM 2287 genomi DNS-r l. Az expresszió vizsgálatához LCM tápoldatba 106 db/ml konídiumot oltottunk és 5, 10, 24, 48, 72 és 96 órás korban mintát vettünk. 0 órás mintaként maga a konídium szolgált. A mintákból TRI reagenssel (Sigma) összRNS-t izoláltunk a gyártó utasításai szerint és denaturáló agaróz gélen történt elválasztás után Hybond N (Amersham) membránra vittük. Radioaktív próbaként az fphch gén egy 900 bp hosszúságú,
32
P izotóppal radioaktívan jelölt darabját használtuk. A kontroll
hibridizálást úgy hajtottuk végre, hogy a membránról lemostuk az fphch gén darabját tartalmazó radioaktív próbát és a G. zeae aktin génjére tervezett oligonukleotid indítószekvenciákkal F. proliferatum ITEM 2287 genomi DNS-r l felszaporított kb. 600 bp hosszúságú, és radioaktívan jelölt DNS fragmentumot hibridizáltattuk az RNS-hez (Sambrook és Russel, 2001).
PCR-RFLP vizsgálatok A 76 F. proliferatum törzsb l és a G. fujikuroi fajkomplexumhoz tartozó más Fusarium fajokból, az Fp_hchHVD_for és az Fp_hchHVD_rev indítószekvenciákkal felszaporítottuk a feltételezett hipervariábilis domént. Az így kapott fragmentumokat NcoI, SalI, HpaII és TaqI (MBI Fermentas) restrikciós endonukleázokkal emésztettük, majd agaróz gélen elválasztottuk az emésztés után kapott fragmentumokat. Kiüt konstrukciók és mesterséges fphch allél el állítása, protoplasztok transzformálása Felszaporítottuk az fpac1 gén feltételezett katalitikus doménjét is tartalmazó génrészletet, majd a katalitikus domént a 3800 bp nagyságú higromicin foszfotranszferáz génnel (hph kazetta, Punt et al., 1987) helyettesítettük és az így kapott konstrukciót használtuk a F. proliferatum protoplasztok transzformálásához. Az fphch gén esetén a teljes gént felszaporítottuk, majd EcoRV enzimmel egy 2299 bp hosszúságú fragmentumot eltávolítottunk az fphch génb l és a 3800 bp nagyságú hph kazettával (Punt et al., 1987) helyettesítettük, így használtuk fel F. proliferatum protoplasztok transzformálására. 7
A mesterséges allél el állításához a F.proliferatum fphch génjének feltételezett hipervariábilis doménjébe egy 18 bp hosszúságú inszerciót építettünk be. A hely specifikus mutagenezist (Higuchi et al., 1988) PCR indítószekvenciák segítségével hajtottuk végre. A protoplasztokat exponenciális növekedési fázisban lev , fiatal micéliumból nyertük Proctor módszerével (1997). A transzformálást szintén a Proctor által leírt módon, poli-etilénglikol és Ca2+ ionok jelenlétében végeztük. A transzformált protoplasztokat 5 ml, 50 oC h mérséklet regenerációs felülönt táptalajhoz kevertük és szilárd regenerációs táptalaj felületére rétegeztük. 6 óra elteltével a csészéket felülöntöttük higromicint tartalmazó, 50 oC h mérséklet
regenerációs felülönt
táptalajjal. A higromicin koncentrációja a csészében lév táptalaj végtérfogatára nézve 200 g/ml volt. A higromicin rezisztens transzformánsokat 200 g/ml higromicint tartalmazó LCM csészékre oltottuk át. A transzformánsokat monospóráztuk, DNS-t izoláltunk bel lük (Kerényi et al., 1999) és PCR-rel kisz rtük azokat, amelyekben kett s homológ rekombináció történt. Southern hibridizációval (Sambrook és Russel, 2001) igazoltuk a PCR-rel kapott eredményeket. A fumonizin B1 termelés mérése A fumonizin termelés meghatározásához 1% kukoricadara kivonatot tartalmazó módosított Myro tápoldatban rázattuk (125 rpm) a gombákat sötétben, 28oC-on, 5 napon át (Dantzer et al., 1996). A képz dött micélium feltárását acetonitril alapú oldatban való egy órás rázatással végeztük, majd centrifugálás után (2 perc, 12000 rpm) a felülúszót PBS (phospate-buffered saline) x Tween20 (0,1 %) oldattal ötszörösére hígítottuk (Barna-Vetró et al., 2000). Az FB1 mérés monoklonális antitesten alapuló ELISA eljárással történt a gyártó (Toxiklon ELISA kit) utasításai szerint.
Ivaros keresztezés és a vegetatív inkompatibilitás vizsgálata A vad típusú és mutáns törzsek párosodási képességeit sárgarépás táptalajon vizsgáltuk a Klittich és Leslie (1988) által leírt módon. A konídiumokat vizes agarról mostuk le és összekevertük a sárgarépás táptalajon kin tt micéliummal. A keresztezés után a törzseket 23/24 C-on inkubáltuk 56 héten át, 12 órás sötét periódust, 12 órás megvilágítottal váltogatva, amelyet fehér fény és sötétkék fluoreszcens lámpával biztosítottunk. A lejátszódó eseményeket (peritéciumok megjelenése, érése) sztereo mikroszkóp alatt rendszeresen nyomon követtük. A vegetatív inkompatibilitás vizsgálatához F. proliferatum ITEM 2287 vad típusú törzsb l és az fpac1 valamint az fphch mutáns törzsekb l nitrátot nem hasznosító (nit) mutánsokat szelektáltunk (Puhalla, 1985). A nit mutáns vonalakat különböz nitrogénforrásokkal kiegészített alaptáptalaj felületére oltottuk, és az egyes nitrogénforrásokon mutatott növekedésük alapján fenotípus osztályokba (nit1, nit3, nitM) soroltuk ket (Correll et al., 1987).
8
Kolonizálási képesség vizsgálata kukoricán A vad típusú törzs (F. proliferatum ITEM 2287) és az fpac1 mutánsok micéliumával s r n behálózott szalmát, cserepekbe helyezett sterilizált föld fels 5 centiméternyi rétegével kevertük össze (Oren et al., 2003). Az 1% (w/v) nátrium-hipoklorittal felületileg sterilizált kukorica magvakat 2,5 cm mélyre ültettük el. A kukorica növényeket üvegházban neveltük 3 héten át 25-28 C-on, természetes megvilágításban. A növények talaj feletti részét hetente levágtuk, és 1% (w/v) nátrium-hipoklorittal történt felületi sterilizálást követ en három részre daraboltuk a kukorica növényeket. A három részb l külön-külön DNS-t izoláltunk. A F. proliferatum kimutatásához polimeráz láncreakciót alkalmaztunk, specifikus indítószekvenciákat (Waalwijk et al., 2003) használva. Mind a három részb l Fusarium szelektív pepton-pentaklór-nitrobenzén (PCNB) táptalajra is helyeztünk le növénydarabokat, és 10 napon át inkubáltuk szobah mérsékleten (Papavizas, 1967).
Eredmények és megvitatásuk
Párosodási típus gének aszexuálisnak ismert Fusarium fajokban
Számos Fusarium faj szexuális ciklusát leírták már eddig, ezek között találunk homotalliás és heterotalliás fajokat is. Heterotalliás fajoknál a párosodási típust egy párosodási típus lókusz (MAT) két idiomorfja, MAT-1 és MAT-2 határozza meg és ahhoz, hogy két sejt párosodni tudjon, eltér idiomorfokat kell tartalmazniuk a párosodási típus lókuszaikban. A homotalliás fajok mindkét idiomorfot tartalmazzák egy lókuszban, szorosan egymáshoz kapcsoltan. Vannak olyan patogén fajok is, mint például Fusarium avenaceum, Fusarium cerealis, Fusarium culmorum, Fusarium equiseti, Fusarium poae és Fusarium sporotrichioides amelyek esetén még nem figyelték meg a szexuális szaporodás jelenségét. Feltételeztük, hogy ezek a fajok is tartalmaznak párosodási típus géneket, ugyanis a szintén aszexuálisnak ismert F. oxysporumban Yun és munkatársai (2000) korábban már azonosítottak ilyen géneket, s t azt is bizonyították, hogy ezek a gének átíródnak. Munkánk egyik célkit zése az volt, hogy egy teljes gombanemzetségben (amely nem monofiletikus) megvizsgáljuk, hogy általános jelenségr l van-e szó. A MAT gének klónozásához a konzervatív régiókat használtuk fel, a MAT1-1-1 gén -domén régióját és a MAT1-2-1 gén HMG-2 doménjét. A
konzervatív
-domének
felszaporításához
használt
degenerált
indítószekvenciák
tervezéséhez a GénBank-ban található G. moniliformis (AF100925), G. zeae (AF318048) és F. oxysporum (AB011379) MAT1-1-1-es gének szekvenciáit használtuk (Yun et al., 2000). A HMG-2 9
doméneket pedig az Arie és munkatársai (1997) által korábban már leírt indítószekvenciákkal szaporítottuk fel. Sikerült felszaporítani az - ill. HMG-2 doméneket a kiválasztott F. avenaceum, F. culmorum, F. poae és Fusarium semitectum törzsekb l. A kapott fragmentumok DNS szekvenciáit elküldtük az EMBL adatbázisba (génbanki azonosítók: AJ535625
AJ535632). Az -
és HMG-2 doméneket határoló régiókat inverz PCR technikával szaporítottuk fel. A négy Fusarium faj MAT szekvenciái, valamint a már korábban is felhasznált F. oxysporum, G. moniliformis és G. zeae MAT szekvenciák alapján új degenerált oligonukleotid indítószekvenciákat terveztünk. Ezeket a diagnosztikai célra is felhasználható indítószekvenciákat 9 szekció 22 faján teszteltük, amely 122 db különböz Fusarium törzset jelent. Az indítószekvenciák megfelel en m ködtek, sikerült felszaporítanunk a megfelel
(200 és 260 bp hosszúságú)
fragmentumokat. E módszer segítségével egyszer en azonosítható az adott törzs párosodási típusa és így könnyen kiválaszthatóak a potenciális keresztezési partnerek. A korábban kifejlesztett MATspecifikus indítószekvenciák (Arie et al., 1997; Steenkamp et al., 2000) erre nem voltak alkalmasak. Mivel az aszexuálisnak vélt Fusarium fajokban is megtaláltuk a párosodási típus géneket, megvizsgáltuk, hogy ezek a MAT gének átíródnak-e. Ennek kiderítésére RT-PCR technikát alkalmaztunk. A PCR-hez az - és HMG-2 domén specifikus, diagnosztikai indítószekvenciákat használtuk. Sikerült felszaporítani a várt (150 és 200 bp hosszúságú) fragmentumokat. A MAT gének tehát átíródnak ezekben az aszexuálisnak vélt fajokban is. A genomi DNS-r l felsokszorozott fragmentum mérete és a cDNS-r l felsokszorozott fragmentum mérete közötti különbség megfelel a genomi szekvenciában található intron méretének. Felmerül a kérdés, hogy miért vannak m köd képes MAT gének olyan gombákban, amelyeknek az ivaros formáját eddig még nem azonosították. Feltételezik, hogy az aszexuális fajok az ivaros szaporodási ciklussal rendelkez fajokból alakultak ki és ezek a gének a korábbi ivaros állapot maradványai. Ha az ivaros szaporodásra való képesség elvész, feltételezhetjük, hogy a MAT géneknek is változniuk kellett, mivel az eddig ismert egyetlen funkciójuk a párosodási folyamatban betöltött szerepük. Az aszexuális fajokban a nem használt MAT génekben bekövetkezett mutációk felhalmozódása vezethetett oda, hogy ezek a gének elveszítették a funkciójukat. Egy másik alternatíva, hogy az aszexuális fajok valójában rendelkeznek ivaros ciklussal, és mindössze arról van szó, hogy az ivaros ciklus nagyon rövid, alig észrevehet , esetleg csak nagyon szokatlan körülmények között indukálódik és ezért nem sikerült még megfigyelni (Turgeon, 1998). Sharon és munkatársai (1996) Bipolaris sacchari MAT-2 génjét Cryptococcus heterostrophus MAT nullmutáns törzsbe transzformálták, és azt tapasztalták, hogy a transzformánsok fertilisek voltak a keresztezési kísérletekben. Fordított esetben azonban ez nem m ködött, tehát a B. sacchariban a MAT géneken kívül más tulajdonság(ok) is hiányoznak, amelyek szükségesek az ivaros szaporodáshoz. 10
A kórokozó gombák reprodukciós stratégiáinak megértése nagyon fontos, hiszen az ivaros rekombináció által létrehozott magas fokú genetikai diverzitás biztosítja egy adott populáció számára a túlélést. Egy sokszín populációban nagyobb valószín séggel találhatók olyan törzsek, amelyek képesek új, ellenálló növényfajtákat megtámadni vagy gombaöl szerek jelenlétét tolerálni. Minél jobban megismerjük ket, annál pontosabban tudjuk felbecsülni az új kórokozó formák kialakulásának a lehet ségeit, felmérni a mikotoxin termelésben bekövetkezett változásokat, és annál hatékonyabban tudunk védekezni is ellenük.
Az fpac1 (adenilát-cikláz) gén izolálása és jellemzése
Az adenilát-cikláz fontos jelátviteli útvonalak közrem köd je a sejtekben, a plazmamembrán bels felületén az ATP
cAMP átalakulást katalizálja. A cAMP másodlagos hírviv ként funkcionál, a G-
fehérjékt l kapott jelet továbbítja cAMP-függ protein kinázok aktiválásával. Ezek a kinázok pedig képesek arra, hogy a megfelel transzkripciós faktorokat foszforilálják. Az adenilát-cikláz jelátviteli útvonalnak szerepe van többek között a gombák vegetatív növekedésében, az ivaros szaporodásban és befolyásolja a kórokozó képességet, valamint a vegetatív inkompatibilitást is (Choi és Dean, 1997; Flawia et al., 1976; Ivey et al., 2002; Loubradou et al., 1996; Matsumoto et al., 1982; Rocha et al., 2001). Más fonalas gombák konzervatív katalitikus domén régiójára tervezett degenerált indítószekvenciákkal sikerült felszaporítanunk a F. proliferatum ITEM 2287 (G. intermedia) adenilát-cikláz génjének egy rövid szakaszát. A teljes hosszúságú adenilát-cikláz gént (génbanki azonosító: DQ067619) genomi génkönyvtárból, illetve inverz PCR segítségével izoláltuk. Az általunk izolált fpac1 gén szekvenciája jó egyezést mutat más gombák adenilát-ciklázával, megtaláltuk az adenilát-ciklázokra jellemz
4 f
konzervatív domént (Ras GTP-köt
domén,
leucinban gazdag, ismétl d szekvenciákat tartalmazó domén, protein-foszfatáz katalitikus domén, adenilát-cikláz katalitikus domén) is. Az eredmények alapján elmondható, hogy tipikus gomba adenilát-ciklázról van szó, mivel hiányoznak a transzmembrán domének, az FPAC1 is a perifériális membránfehérjék csoportjába sorolható (Tang és Gilman, 1992). Az fpac1 gén elrontásával a fenotípusban bekövetkezett változások megfeleltek a várakozásoknak. A gomba növekedése lelassult és kés bb indult meg a mutáns törzsek konídiumainak a csírázása. A N. crassa adenilát-cikláz defektes mutánsai szintén csökkent növekedést mutatnak, kis kompakt telepeket képeznek, és a mutánsok nem növesztenek légmicéliumot (Flawia et al., 1976). A Magnaporthe grisea MAC1 génjének elrontásával keletkez mutánsok is hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek, lényegesen csökkent a vegetatív növekedés és kés bb indult meg a konídiumok csírázása (Choi és Dean, 1997). 11
Mivel a F. proliferatum azon gombák egyike, melyek legnagyobb mennyiségben termelnek fumonizint, megvizsgáltuk, hogy van-e számottev
különbség a vad típusú törzs és a
transzformánsok fumonizin B1 termelésében. A mérés Eliza eljárással történt (Barna-Vetró et al., 2000). A kapott eredmények nagyon hasonlóak voltak, minden törzs jelent s mennyiségben (2000 ng/g feletti koncentrációban) termelt a fumonizin B1-et. Tehát az adenilát-cikláz feltehet en nem befolyásolja a toxintermelést ebben a gombában. Az adenilát-cikláznak az ivaros szaporodásban betöltött szerepér l voltak már korábbi adatok. M. griseaban például teljes sterilitást okoz a gén elvesztése (Choi és Dean, 1997). A N. crassa cr1 mutánsai n i és hím partnerként egyaránt m köd képesek, azonban a vad típushoz képest késett a peritéciumok és az aszkospórák kifejl dése (Ivey et al., 2002). G. intermediaban az adenilát-cikláz gén elrontása részleges n i sterilitást okoz. Amikor a mutánsokat n i partnerként használtuk a párosítási kísérletekben, akkor kés bb jelentek meg a peritéciumok és jelent s csökkenést figyeltünk meg a mennyiségükben is. Ez arra utal, hogy a párosodás során az adenilát-cikláz jelátviteli útvonal részlegesen pótolható egy másik útvonallal, amely kevésbé hatékony, mint az eredeti. Az adenilát-cikláznak a vegetatív inkompatibilitásban betöltött szerepér l eddig nagyon keveset tudunk, de vannak olyan adatok, amelyek arra utalnak, hogy szerepet játszhat a saját-idegen felismerésben is. Loubradou és munkatársai (1996) olyan P. anserina mutánsokat vizsgáltak, amelyekben a vegetatív inkompatibilitás szabályozásában résztvev gének egyike (mod-D1) sérült volt. Azt tapasztalták, hogy az adenilát-cikláz gén képes volt a fenotípus részleges visszaállítására, tehát a mod-D1 az adenilát-cikláz aktivátora lehet. Az fpac1 mutánsokból és a vad típusú törzsb l nitrátot nem hasznosító (nit) mutánsokat szelektáltunk, hogy megvizsgáljuk az fpac1-nek van-e szerepe a vegetatív inkompatibilitásban. Az általunk kiválasztott F. proliferatum ITEM 2287 törzsr l kiderült, hogy egy ön-inkompatíbilis törzs. Ez meglehet sen ritka jelenség a gombák körében, elég keveset tudunk arról, hogy mi válthatja ki. Az fpac1 mutánsok képesek feloldani ezt az ön-inkompatibilitást. Nem csak az fpac1 mutánsok között, hanem a mutánsok és a vad típusú törzs között is megfigyelhet , hogy nit mutánsaik képesek komplementálni egymást a nitrogénforrásként csak nitrátot tartalmazó táptalajon. Ezek az adatok, egyértelm bizonyítékkal szolgálnak arra, hogy e fontos saját-idegen felismer rendszerben az adenilát-cikláz jelátviteli út m ködik. Az adenilát-cikláz a gombák kórokozó képességét is befolyásolja. A növénykórokozó M. grisea MAC1- mutánsai nem képesek appresszóriumot növeszteni, aminek következtében a patogenitásuk is csökkent, mivel appresszórium hiányában nem képesek behatolni a gazdanövénybe (Choi és Dean, 1997). A humánpatogén Candida albicans adenilát-cikláz defektes mutánsai is csökkent virulenciát mutatnak. Ez esetben az ok az lehet, hogy a mutánsok nem képesek átkapcsolni 12
az éleszt szer növekedési formából a fonalas növekedési formába (Rocha et al., 2001). A F. proliferatum a kukorica cs rothadás egyik okozója a F. verticillioidessel és a Fusarium subglutinanssal együtt (Miller, 1994). A F. vertocillioidest tünetmentes magokból is kimutatták már, képes kolonizálni a növényt, anélkül, hogy ennek lennének küls tünetei (Foley, 1962). Mivel a F. proliferatum leggyakrabban a F. verticillioidessel együtt fordul el , feltételeztük, hogy ez a faj is képes kolonizálni a kukoricát. A kolonizálási vizsgálatokhoz a vad típusú és az fpac1 mutáns törzsekkel fert ztünk kukorica növényeket. A vad típusú törzset az els hét után a növény minden részéb l sikerült kimutatnunk, az fpac1 mutánsokat viszont a csúcsi részben nem találtuk meg. A második héten már csak a kukorica növények középs harmadában találtuk meg a gombát (a vad típust és a mutánst is), a harmadik héten pedig egyáltalán nem tudtuk kimutatni. Küls tüneteket egyik esetben sem észleltünk. Megállapítható tehát, hogy a F. proliferatum is képes a kukorica növények endofiton kolonizációjára. Az fpac1 mutánsok kisebb kolonizálási képessége valószín leg a gyengébb növekedéssel magyarázható. Az eredményeink azért jelent sek, mert a közvetlen behatolással fert z növénykórokozó gombákban eddig nem voltak adataink arról, hogy az adenilát-cikláznak van-e bármilyen szerepe a fert zés kialakításában.
A hch (het-c homológ) gén elterjedtsége, egyöntet sége és szerepe Fusarium proliferatumban
A vegetatív inkompatibilitás mechanizmusa meglehet sen eltér a különböz él lényekben és sok esetben még ma sem teljesen érthet , hogy hogyan is m ködik. Fonalas gombákban a vegetatív inkompatibilitást a het (heterokaryon) lókuszokban található gének szabályozzák. A het lókuszok közül az egyik legalaposabban tanulmányozott lókusz a het-c (Saupe és Glass, 1997; Saupe et al., 1994). P. anserinaból izolálták és jellemezték a N. crassa het-c génjének a homológját is, amely nem játszik szerepet a vegetatív inkompatibilitásban (Saupe et al., 2000). A Fusarium nemzetségen belül még nincs túl sok adatunk ezekr l a génekr l. Legbehatóbban a F. verticillioides rendszerét vizsgálták. Azt tudjuk, hogy a faj vegetatív inkompatibilitási rendszerét legalább tíz het lókusz ellen rzi, melyek allélos rendszer ek (Leslie, 1993). Az ismeretek b vítése érdekében célul t ztük ki, hogy F. proliferatumban megvizsgáljuk a N. crassa het-c homológjának a funkcióját. A rendelkezésre álló F. sporotrichioides cDNS adatbankban találtunk olyan EST szekvenciát, ami hasonlít a N. crassa het-cOR génjéhez. A homológ régióra tervezett degenerált indítószekvenciákkal sikerült felszaporítanunk a F. proliferatum ITEM 2287 (G. intermedia) genomjából a het-c homológ (fphch) egy szakaszát. A teljes hosszúságú fphch gént (génbanki azonosító: DQ067618) genomi génkönyvtárból izoláltuk. A gén öt exonból áll, amelyek 117, 27, 159, 1251 és 753 bázispár hosszúságúak, a kódolt fehérje pedig, 770 aminosav hosszúságú. Az FPHCH fehérje szekvenciája jó egyezést mutatott a P. anserina HCH és a N. crassa HETCGR 13
fehérjékkel. Southern és Northern hibridizálással megállapítottuk, hogy az fphch gén egy kópiában fordul el a F. proliferatum genomjában és konstitutívan expresszálódik. Az fphch génen azonosítottuk azt a régiót, amely homológ a N. crassa het-c génjének hipervariábilis doménjével. N. crassaban e domén aminosav-sorrendjében lév eltérés felel s a hetc allélok által kiváltott vegetatív inkompatibilitási reakció beindításáért (Saupe és Glass, 1997). Azt feltételeztük, hogy ha az fphch esetén is kimutatható e szakasz jelent s mérték polimorfizmusa, akkor nagyon valószín , hogy a het-c homológ gén a F. proliferatum esetében is része a gomba vegetatív kompatibilitási rendszerének. 76 F. proliferatum és a G. fujikuroi fajkomplexumhoz tartozó többi párosodási populáció 2-2 törzsét vizsgáltuk PCR-RFLP módszerrel. 6 törzs esetén találtunk olyan nukleotid szubsztitúciót, amely aminosav cserét okoz a HCH fehérjében, de sem inszerciók, sem deléciók (amit a N. crassa esetében megfigyelhet inszerciós-deléciós jelenségek miatt vártunk) nem mutathatók ki a vizsgált mintákban. (A polimorfizmust mutató HVD régiók génbanki azonosítói: DQ329213-DQ329218.) Saupe és munkatársai (2000) hasonló eredményt kaptak a P. anserina hch gén esetében. Feltételeztük, hogy az fphch gén a F. proliferatumban nem vesz részt a vegetatív inkompatibilitási reakcióban. P. anserinaban a N. crassa mindhárom het-c allélja képes volt kiváltani az inkompatibilitási reakciót. Erre kétféle magyarázatot is adtak. Az egyik ok lehet, hogy a het-c gén downstream célgénjei konzerváltak P. anserinaban, a másik lehetséges ok pedig, hogy a HCH és a HET-C kölcsönhatása közvetlenül befolyásolja a sejtek életképességét. Nem zárható ki azonban, hogy ha lenne polimorfizmus a hch génben, akkor het génként funkcionálhatna (Saupe et al., 2000). Ezt próbáltuk kideríteni az fphch esetén úgy, hogy egy mesterséges fphch allélt állítottunk el inszerciós PCR mutagenezissel és F. proliferatum protoplasztokat transzformáltunk mind a vad típusú, mind a mesterséges alléllal. Nem volt különbség az életképes protoplasztok számában, tehát a mesterséges allél nem okozott inkompatibilitási reakciót. Ez újabb bizonyítéka annak, hogy az fphch nem vesz részt a vegetatív inkompatibilitásban. Ezt az állítást megalapozottnak tartjuk, bár elvben nem kizárt, hogy más eredményt kaptunk volna, ha az inszerciót egy másik régióba építettük volna be. Fphch mínusz mutánsokat állítottunk el , hogy kiderítsük, mi lehet a funkciója ennek a meglehet sen konzervatív génnek. A fphch mutánsok a növekedésben, a sporulációban és a konídiumok csírázásában nem különböztek a vad típusú törzst l. Természetesen megvizsgáltuk azt is, hogy vegetatív kompatibilitási kísérletekben hogyan viselkednek a transzformánsok. Mivel a vad típusú törzs ön-inkompatibilis, az
nit mutánsai nem voltak képesek komplementálni egymást a
nitrogénforrásként csak nitrátot tartalmazó táptalajon. Azonban a
fphch törzsekb l el állított nit
mutánsok sem voltak képesek erre. Tehát az fphch hiánya még az ön-inkompatibilitást sem oldja fel. Ez az eredmény szintén azt a feltevésünket er síti meg, hogy az fphch gén nem vesz részt a gomba
vegetatív
inkompatibilitási
rendszerében. 14
Különbséget
mindössze
párosodási
tulajdonságokban fedeztünk fel. A transzformánsokat n i partnerként alkalmazva a párosítási kísérletben jóval kés bb jelentek meg a peritéciumok, mint a vad típusú törzs esetén. A peritéciumok számában is jelent s csökkenést tapasztaltunk. A peritéciumok érése körülbelül azonos id ben következett be, és az érett peritéciumokban minden esetben megtaláltuk az aszkuszokat és az aszkospórákat. A het-c génnek az ivaros kompatibilitásban betöltött funkciója nem példátlan az aszkomicéták körében, het-c homológról azonban eddig nem voltak ilyen ismereteink. A P. anserina het-c (nem azonos a hch-val!) lókuszának inaktiválása például befolyásolja az aszkospóra képz dést. A P. anserina het-c2 allél egy glikolipid transzferproteinhez hasonló fehérjét kódol, ebb l arra következtetnek, hogy a het-c-nek a sejtmembránok megfelel összetételének a fenntartása és a sejten belül a vezikulumok szállítása lehet a feladata (Saupe et al., 1994). Feltehet en az FPHCH-nak is az ivaros struktúrák kialakításához szükséges membránok felépítésében lehet szerepe.
Új tudományos eredmények
A doktori értekezésem alapjául szolgáló kutatómunka elvégzésének eredményeként az alábbi új tudományos eredmények születtek:
1. Degenerált oligonukleotid indítószekvenciák segítségével sikerült felszaporítani a párosodási típus géneket olyan Fusarium fajokból, amelyeknél eddig még nem figyelték meg az ivaros szaporodást és RT-PCR segítségével azt is igazoltuk, hogy ezek a gének átíródnak ezekben a gombákban.
2. Olyan degenerált oligonukleotid indítószekvenciákat terveztünk, amelyekkel a Fusarium nemzetség bármelyik tagjának egyszer en meghatározható a párosodási típusa, így diagnosztikai célra is jól alkalmazhatóak.
3. Genomi génkönyvtárból izoláltuk a F. proliferatum adenilát-cikláz génjét (fpac1).
4. Az adenilát-cikláz funkciójának felderítésére fpac1 null-mutáns törzseket hoztunk létre. Megállapítottuk, hogy az fpac1 gén nem esszenciális a gomba számára, de fontos szerepet játszik a szexuális szaporodásban, a vegetatív inkompatibilitásban és az új környezeti feltételekhez való alkalmazkodásban.
15
5. Genomi génkönyvtárból izoláltuk a F. proliferatum het-c homológ génjét (fphch) és igazoltuk, hogy ez a gén feltehet en nem játszik szerepet a gomba vegetatív inkompatibilitási rendszerében.
6. Fphch null-mutáns törzseket hoztunk létre. Megállapítottuk, hogy az fphch génnek a szexuális szaporodásban van szerepe.
Irodalomjegyzék Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Millwer W. and Lipman D.J. (1997): Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, 25:3389-3402. Arie T., Christiansen S.K., Yoder O.C. and Turgeon B.G. (1997): Efficient cloning of ascomycete mating-type genes by PCR amplification of the conserved MAT HMG box. Fungal Genetics and Biology, 21:118-130. Barna-Vetró I., Szabó E., Fazekas B. and Solti L. (2000): Development of a sensitive ELISA for the determination of fumonisin B1 in cereals. Journal of Agricultural Food Chemistry, 48:2821-2825. Bégueret J., Turcq B. and Clavé C. (1994): Vegetative incompatibility in filamentous fungi: het genes begin to talk. Trends in Genetics, 10(12):441-446. Cappellini R. and Peterson J.L. (1965): Macroconidium formation in submerged cultures by a non-sporulating strain of Gibberella zeae. Mycologia, 57:962-966. Chase T.E. and Ulrich R.C. (1990): Genetic basis of biological species in Hetrobasidion annosum: Mendelian determinants. Mycologia, 82:67-72. Choi W. and Dean R.A. (1997): The adenylate cyclase gene MAC1 of Magnaporthe grisea controls appressorium formation and other aspects of growth and development. Plant Cell, 9:1973-1983. Correll J.C., Klittich C.J.R. and Leslie J.F. (1987): Nitrate nonutilizing mutants of Fusarium oxysporum and their use in vegetative compatibility tests. Phytopathology, 77:1640-46. Cortesi P. and Milgroom M.G. (1998): Genetics of vegetative incompatibility in Cryphonectria parasitica. Applied and Environmental Microbiology, 64:2988-2994. Dantzer W.R., Pometto A.L. 3rd and Murphy P.A. (1996): Fumonisin B1 production by Fusarium proliferatum strain M5991 in a modified Myro liquid medium. Natural Toxins, 4:168-173. Debuchy R. (1999): Internuclear recognition: A possible connection between Euascomycetes and Homobasidiomycetes. Fungal Genetics and Biology, 27:218-223. Ferreira A.V.B., Saupe S. and Glass N.L. (1996): Transcriptional analysis of the mtA idiomorph of Neurospora crassa identifies two genes in addition to mtA-1. Molecular Genomics and Genetics, 250:767-774. Flawia M.M., Terenzi H.F. and Torres H.N. (1976): Characterization of Neurospora crassa mutant strains deficient in adenylate cyclase activity. Archives of Biochemistry and Biophysics, 180:334-342. Foley D.C. (1962): Systemic infection of corn by Fusarium moniliforme. Phytopathology, 52:870-872. Glass N.L. and Kuldau G.A. (1992): Mating type and vegetative incompatibility in filamentous ascomycetes. Annual Review of Phytopathology, 30:201-224. Higuchi R., Krummel B. and Saiki R.K. (1988): A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Research, 16:7351-7367.
16
Ivey F.D., Kays A.M. and Borkovich K.A. (2002): Shared and independent roles for a G i protein and adenylyl cyclase in regulating development and stress responses in Neurospora crassa. Eucaryotic Cell, 1(4):634-642. Kerényi Z., Zeller K., Hornok L. and Leslie J.F. (1999): Molecular standardization of mating type terminology in the Gibberella fujikuroi species complex. Applied and Environmental Microbiology, 65:4071-4076. Klittich C.J.R. and Leslie J.F. (1988): Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi). Genetics, 118:417-423. Lee N., D Souza C.A. and Kronstad J.W. (2003): Of smuts, blasts mildews, and blights: cAMP signaling in phytopathogenic fungi. Annual Review of Phytopathology, 41:399-427. Leslie J.F. (1993): Fungal vegetative compatibility. Annual Review of Phytopathology, 31:127-150. Loubradou G., Bégueret J. and Turcq B. (1996): An additional copy of the adenylate cyclase-encoding gene relieves developmental defects produced by mutation in vegetative incompatibility-controlling gene in Podospora anserina. Gene, 170:119-123. Matsumoto K., Uno I., Oshima Y. and Ishikawa T. (1982): Isolation and characterization of yeast mutants deficient in adenylate cyclase and cAMP-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79:2355-2359. Miller J.D. (1994): Epidemiology of Fusarium diseases of cereals. 19-36. p. In: Miller J.D. and Trenholm H.L. (eds) Mycotoxins in grain: Compounds other than aflatoxin. Eagan Press, St. Paul, MN, USA. Oren L., Ezrati S., Cohen D. and Sharon A. (2003): Early events in the Fusarium verticillioides-maize interaction characterized by using a green fluorescent protein-expressing transgenic isolate. Applied and Environmental Microbiology, 69:1695-1701. Papavizas G.C. (1967): Evaluation of various media and antimicrobial agents for isolation of Fusarium from soil. Phytopathology, 57:848-852. Pöggeler S. and Kück U. (2000): Comparative analysis of mating-type loci from Neurospora crassa and Sordaria macrospora: identification of novel transcribed ORFs. Molecular Genomics and Genetics, 263:292-301. Proctor R.H., Hohn T.M. and McCormick S.P. (1997): Restoration of wild-type virulence to Tri5 disruption mutants of Gibberella zeae via gene reversion and mutant complementation. Microbiology, 143:2583-2591. Puhalla J.E. (1985): Classification of strains of Fusarium oxysporum on the basis of vegetative compability. Canadian Journal of Botany, 63:179 183. Punt P.J., Oliver R.P., Dingemanse M.A., Pouwels P.H. and van den Hondel C.A.M.J.J. (1987): Transformation of Aspergillus based on the hygromycin B resistance marker from Escherichia coli. Gene, 56:117-124. Rocha C.R.C., Schröppel K., Harcus D., Marcil A., Dignard D., Taylor B.N., Thomas D.Y., Whiteway M. and Leberer E. (2001): Signaling through adenylyl cyclase is essential for hyphal growth and virulence in the pathogenic fungus Candida albicans. Molecular Biology of the Cell, 12:3631-3643. Sambrook J. and Russell D.W. (2001): Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. Saupe S., Descamps C., Turcq B. and Bégueret J. (1994): Inactivation of the Podospora anserina vegetative incompatibility locus het-c, whose product resembles a glycolipid transfer protein, drastically impairs ascospore production. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 91:5927-31. Saupe S.J. and Glass N.L. (1997): Allelic specificity at the het-c heterokaryon incompatibility locus of Neurospora crassa is determined by a highly variable domain. Genetics, 146:1299-1309. Saupe S.J., Clavé C., Sabourin M. and Bégueret J. (2000): Characterization of hch, the Podospora anserina homolog of the het-c heterokaryon incompatibility gene of Neurospora crassa. Current Genetics, 38:39-47. Sharon A., Yamaguchi K., Christiansen S., Horwitz B.A., Yoder O.C. and Turgeon B.G. (1996): An asexual fungus has the potencial for sexual development. Molecular Genomics and Genetics, 251:60-68.
17
Shiu P.K.T. and Glass N.L. (2000): Cell and nuclear recognition mechanisms mediated by mating type in filamentous ascomycetes. Current Opinion in Microbiology, 3:183-188. Staben C. and Yanofsky C. (1990): Neurospora crassa a mating-type region. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87: 4917-4921. Steenkamp E.T., Wingfield B.D., Coutinho T.A., Zeller K.A., Wingfield M.J., Marasas W.F.O. and Leslie J.F. (2000): PCR-based identification of MAT-1 and MAT-2 in the Gibberella fujikuroi species complex. Applied and Environmental Microbiology, 66:4378-4382. Tang W-J. and Gilman A.G. (1992): Adenylyl cyclases. Cell, 70:869-872. Triglia T., Peterson M.G. and Kemp D.J. (1988): A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences. Nucleic Acids Research, 16:8186. Turgeon B.G. (1998): Application of mating type gene technology to problems in fungal biology. Annual Review of Phytopathology, 36:115-137. Waalwijk C., Kastelein P., de Vries I., Kerényi Z., van der Lee T., Hesselink T., Köhl J. and Kema G. (2003): Major changes in Fusarium spp. in wheat in the Netherlands. European Journal of Plant Pathology, 109:743-754. Yun S.H., Arie T., Kaneko I., Yoder O.C. and Turgeon B.G. (2000): Molecular organization of mating-type loci in heterothallic, homothallic and asexual Gibberella/Fusarium species. Fungal Genetics and Biology, 31:7-20.
18
Publikációk jegyzéke
Tudományos dolgozatok Kerényi Z., Moretti A., Waalwijk C., Oláh B. and Hornok L. (2004): Mating type sequences in asexually reproducing Fusarium species. Applied and Environmental Microbiology, 70:4419-4423.
Kerényi Z., Oláh B., Jeney A., Hornok L. and Leslie J.F. (2006): The homologue of het-C of Neurospora crassa lacks vegetative incompatibility function in Fusarium proliferatum. Applied and Environmental Microbiology, 72(10):6527-6532. Oláh B., Jeney A. and Hornok L. (2006): Monitoring the endophytic colonization of Fusarium proliferatum in maize tissues. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica, 41(3-4):185-191.
Más témában megjelent tudományos dolgozatok Emri T., Oláh B., Sámi L. and Pócsi I. (2003): Does the detoxification of penicillin side-chain precursors depend on microsomal monooxygenase and glutathione S-transferase in Penicillium chrysogenum? Journal of Basic Microbiology, 43:287-300. Emri T., Oláh B., Sámi L., Molnár Zs., Nagy M., Pusztahelyi T. and Pócsi I. (2002): Investigation of glutathione metabolism in filamentous fungi. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 49:267-276.
Konferencia el adások, poszterek Oláh B., Kerényi Z., Jeney A., Keszthelyi A. és Hornok L. (2005): Cloning and characterization of fpac1, an adenylate cyclase gene from Fusarium proliferatum. A Magyar Mikrobiológiai Társaság Nagygy lése és 1st Central European Forum for Microbiology, Keszthely Ádám A.L., Oláh B., Kerényi Z., Keszthelyi A. és Hornok L. (2004): Jelátviteli útvonalak Giberella fujikuroiban. A Magyar Mikrobiológiai Társaság Nagygy lése, Keszthely
19
This document was created with Win2PDF available at http://www.daneprairie.com. The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only.
