Genetikai vizsgálatok módszerei
Dr. Gál Anikó
[email protected]
Genetikai vizsgálat fogalma • A vizsgált egyén DNS állományában (genomjában) történő elkésések kimutatása • A genetikai vizsgálatot „A humángenetikai adatok védelméről, a humángenetikai vizsgálatok és kutatások, valamint a biobankok működésének szabályairól” szóló 2008. évi XXI. törvény alapján minden esetben genetikai tanácsadásnak kell megelőznie
Genetikai vizsgálat céljai 1. Betegség hátterében álló patogén mutációk kimutatása 2. Genetikai rizikófaktorok vizsgálata – hajlamosító és védő polimorfizmusok elemzése 3. Farmakogenomikai vizsgálatok 4. Személyazonosítás – igazságügyi DNS vizsgálatok 5. Apasági vizsgálatok 6. Prenatális vizsgálat – szűrés, ismert mutációk kimutatása
7. Szervezetben lévő vírusok, baktériumok kimutatása 8. Transzplantációs genetika – HLA tipizálás
• A talált eltérés patogenitásának eldöntése – Irodalmi adatok – Fenotípus – genotípus korreláció vizsgálata – Kontroll személyekben történő vizsgálat – Funkcionális vizsgálatok – RNS, fehérje szinten
Genetikai vizsgálatok főbb csoportosítása Citogenetika Molekuláris genetika „Biokémiai genetika”
Biokémiai genetika (protein- és metabolitrendellenességek) • Metabolitok: – hosszú szénláncú zsírsavak gázkromatográfiája
• Fehérje szerkezet: – dystrophin Western blot dystrophinopathiak esetében
• Enzimaktivitás: – foszforiláz aktivitás – McArdle betegség – alfa glükozidáz - Pompe kór
Citogenetika
A citogenetika feladata • Különböző genom- és kromoszómamutációk azonosítása a preimplantációs, preés posztnatális genetikában.
Citogenetikai módszerek Kariotipizálás FISH CGH
Vizsgálati minták • • • •
Lymphocyta – vér Csontvelő Fibroblast Amnionfolyadék
Kromoszómák morfológiája (NOR)
heterokromatin
eukromatin
Kromoszóma azonosítás szempontjai - méret - centromer helyzete - másodlagos befűződés helye - festési mintázat - heterokromatin eloszlása
• A számbeli elváltozások – leggyakrabban a nemi kromoszómákat érintik (Turner-, Klinefelter-szindróma). – A testi sejteket érintő számbeli (Patau-, Edwards-, Downszindróma) kromoszóma elváltozások több szerv rendellenességeihez vezetnek.
• Szerkezeti kromoszóma rendellenességek: – kromoszómaszakasz elvesztése (deléció). – kromoszómadarab áthelyeződése egy másik kromoszómára (transzlokáció) • Kiegyensúlyozott – a letörött nem vész el (más helyen megvan – másik kromoszómára rátapad) – az adott egyedre nincsen súlyos következményük – ivarsejteknél keletkezhetnek olyan ivarsejtek amelyek hiányos genetikai információval járó sejtek • Kiegyensúlyozatlan: a letört darab kikerül a rdsz-ből – azon lévő gének hiányoznak (több 100 gén hatása is kieshet
– Kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulása (inverzió).
• Kariotípus: – Az egyed kromoszómáinak összessége, iIl. az egyed kromoszómáinak száma, alak és nagyság szerinti meghatározottsága. – A kariotípust az idiogramm segítségével rögzítik. – Az eljárás segítségével felismerhetők egyes kromoszóma rendellenességek illetve öröklődő betegségek.
Kromoszóma sávok: • G-sávozás: savas-sós Giemsa festés • R-sávozás: (reverse) emelt hőmérsékleten történő Giemsa festés • C-sávozás: centroméra specifikus festés • T-sávozás: teloméra specifikus festés • Q-sávozás: quinacrin festés (fluoreszcens mikroszkópban vizsgálható)
Kariotipizálás • Phitohaemoglutinin növényi lektin) Go-G1 fázis átvitelét segíti • 1-3 napig tenyésztik • Colhicin kezelés – gátolja az osztódási orsó működését, de a mitózisba lépést nem • Hipotonizálás KCL hatására a sejtek megdúzzadnak, kromoszómák elkülönülnek egymástól • Fixálás – metanol-ecetsav keverék • Gimsa festés
Standard karyotípus Bármilyen metafázisos sejteket tartalmazó, osztódni képes sejtpopuláció Általában: lymphocyta (ezek proliferációját könnyű indukálni)
egyéb szövetek – – – – –
bőr (fibroblastok) Csontvelő amnion folyadék Chorionboholy szájnyálkahártya
Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) • • •
A DNS fragmentumokat fluoreszkáló festékkel jelölünk meg és ezáltal fénymikroszkóppal nem látható kromoszóma részleteket is azonosíthatunk. FISH-el kromoszómák, kromoszómaszegmentek, mint különálló egységek, vagy akár gének tehetők láthatóvá. Lehet – –
•
Direkt FISH - A fluoreszcensen jelölt Indirekt FISH - reporter molekula kell
A módszer használható – –
Interfázisos sejtmagokban (pl. vérkenet, vagy akár 10-100 mikrométer vastagságú szöveti metszet) Kromoszómapreparátumokon (metafázis)
• Jellemzői: – Nagy érzékenység – 100 bázisnyi méret alatti szekvencia is kimutatható – Lehetséges több DNS-szekvencia egyidejű kimutatása • A kicsiny kromoszóma részletek kiesésével járó ún. mikrodeléciós kórképek (Prader-Willi-, Angelman-, Williams-, DiGeorge-,Miller-Dieker-, Smith-Magenisszindróma) célzott FISH vizsgálattal diagnosztizálhatók. • Az ismeretlen eredetű értelmi fogyatékossággal társuló mikrodeléciókat a kromoszóma végdarabjait elemző szubtelomérikus próbákkal lehet kimutatni • Tumor specifikus transzlokációk kimutatása
Multikolor FISH (Spektrális kariotipizálás)
Komparatív genomikus hibridizáció (CGH) • Egészséges egyénből származó, tárgylemezen fixált, metafázisban lévő kromoszómákat denaturáljuk és etanolban dehidratáljuk • A beteg és a referencia DNS 1:1 arányú keverékét szintén denaturáljuk (a DNS – ket előzőleg eltérő fluoreszcens festékkel jelölik) • Ezt hibridizáltatjuk a normális kromoszómákat tartalmazó preparátumra • A nem hibridizált DNS-t eltávolítjuk • A kromoszómákat „antifase”-ban oldott DAPI-val (kék festék, amely a DNS-t specifikusan jelzi és a G-sávozáshoz hasonló mintázatban kötödö molekula: 1,6 diamino-fenil-indol) jelöljük • E három eredőjeként kapjuk meg a CGH képet
CGH értéklése • Ha citogenetikai eltérés nem található: a két szín egyenlő arányú kombinációját narancssárga fluoreszcenciaként látjuk • A fluoreszcencia intenzitás arányából valamennyi kromoszóma anomális feltérképezhető – deléció, duplikáció • Digitális image analízis: a három fluoreszcencia intenzitást zöld, piros, kék optikai szűrőkkel CCD kamerával rögzítjük. • A kromoszómák azonosítása a DAPI sávozott image segítségével automatizált színes kariotípus analizáló programmal történik. • Módszer előnye – A teljes genom vizsgálható egyetlen hibridizáció során – Sejtkultúra, vagy a vizsgálni kívánt sejtekből származó metafázis indukció nem szükséges – A korábban nem ismert duplikált vagy deletált DNS szakasz kimutatására is alkalmas
Deléció
Duplikáció
Molekuláris biológiai módszerek
• PCR alapú technikák – – – –
• • • •
VNTR meghatározás PCR-RFLP Multiplex PCR Trinukleotid repeat meghatározások
Real-time PCR MLPA Fragment elemzés Szekvenálási metodikák – Sanger – Piroszekvenálás – Újgenerációs szekvenálás
• GWAS vizsgálatok
PCR (polimeráz láncreakció) DNS megsokszorozása
Elektroforézis
_
A töltéssel rendelkező makromolekuláknak (pl. DNS) az a tulajdonsága, hogy elektromos erőtér hatására elmozdulnak. A negatív töltésű DNS a pozitív töltés felé vándorol
+
Nested PCR • PCR specificitását növeli
Multiplex PCR • Egyszerre több primerrel történő PCR vizsgálat • Pl. homozigóta exoni deléciók kimutatása (dystrophin)
VNTR vizsgálatok
Trinukleotid repeat kimutatás Huntington kór Spinocerebelláris ataxiák (SCA) Friedreich ataxia Dystonia myotonica
Huntington kór CAG repeats 4-es kromoszóma IT 15 gén - huntingtin protein
RFLP (restrikciós fragmenthossz polimorfizmus) Enzimatikus hasítás
Bioanalyser
Real-time PCR • PCR reakció eredménye valós időben követhető • PCR-t követően olvadáspont analízis is elvégezhető (olvadáspont arányos a DNS összetétellel – GC arány/ és hossz) a fragmensek azonosíthatók • SyberGreen – interkaláris festék, ha van termék zöld fluoreszcenciát mutat • TaqMan próba – két hagyományos próba és egy hibridizáló próba a kettő között • A PCR reakcióban a hibridizáló primer hozzátapad az egyszálúított DNS-hez • Taq poliemeráz 3’>5’ exonukleáz aktivitással a hibridizáló primert nukleotidokra bontja • A kioltótó enzim (qencer) nem gátolja a fluorokróm működését • Nagyon specifikus, könnyen multiplexezhető
TaqMan SNP assay CC
C allél
CT
C allél
T allél
T allél
TT
Génexpresziós változások mérése Bcl-2
Bcl-2 kezelt
Bax hypoxia normoxia
kontroll
Bcl-2 kezelt
Bcl-XL
Syn1
Bcl-XL kezelt
Bcl-XL kezelt kontroll
kontroll
Fluoreszcens fragment analízis
MLPA • Multiplex ligation-dependent probe amplification • Génen belüli nagyobb kópiaszám változások kimutatására használható • Egyszerre több gén is vizsgálható
Kontroll
PMP22 duplikáció
PMP22 deléció
DNS szekvenáló módszerek Sanger szekvenálás Piroszekvenálás Újgenerációs szekvenálás
Sanger szekvenálás
Felhasználás • Ismert gének szekvencia analízise • Patogén mutációk keresése
Piroszekvenálás • DNS másolásakor beépülő nukleotidról leszakad egy pirofoszfát • Ezt a luciferáz felvillanása jelzi
Felhasználás • Mutációk pontos mozaicizmus rátájának a megadása (pl. tumorokban szomatikus mutációk vizsgálata – KRAS 2.exon 12. és 13. kodon) • Pontos heteroplazmia arány
Újgenerációs szekvenálás • A genomot 50-1000bp közti darabokban lehet szekvenálni
• Ezt de novo módszerekkel lehet összerakni - min 30 millio fragment • Covarage (lefedettség) – 1 bp hányszor van előhívva – humánnál min 10x-es lefedettség kell
• Sanger szekvenálás – – – – – – –
Max 1000bp Nagy pontosság Kicsi akapcitás Drága Munka és időigényes Nem multiplexezhető Elektroforetikus elvű
• Újgenerációs – Több millió bp egyidejű szekvenálása – gyors – olcsóbb – Jól automatizálható – Nincs elektroforetikus elválasztás – multiplexezhető
NGS vizsgálatok felhasználhatósága • Teljes genom • Teljes exom • Teljes transzkriptom
• NGS panelek (enrichment) – Célzottan, betegségre specifikus gének egyidejű szekvenálása
NGS szakaszai • Könyvtárkészítés – A genomot szekvenálható darabokra bontjuk – Ismert szekvenciájú oligonukleotidokat mindkét végére hozzáadjuk - egységessen szekvenálható a minta – Barcode adható hozzá (megjelöli melyik minta)
• Klonális amplifikáció – 1 fragmentből kb 1 millió
• Szekvenálás • Bioinformatikai kiértékelés
Könyvtárkészítés
Klonális amplifikáció • Emúlziós PCR – Olajban vízcseppek vannak (mikroreaktorok) amiben minden benne van – Fragmentet juttatjuk bele – SOLID és Roche • Bridge amplifikáció – A komplamenter oligok üveglemezen vannak és a pH változás miatt lesz grid képzés – Illumina
Szekvenálás • Sanger alapú - Illumina • Piroszekvenálás alapú – SOLID és Roche • Proton detektálás - Iontorrent
Blot technikák Western blot – fehérje Southern blot - DNS Northern blot - RNS
Fehérje meghatározás Western blot • biomolekulák komplexében lévő fehérje kimutatására • Ez egy analitikus technológia, a fehérje expressziójának, mérésére • Detektálás: autoradiográfiával, rtg filmre • Kiértékelés: denzitometrálás Pl. Qantity One Software
Denzitás meghatározás meghatározás Kvantifikálás
Northern blot
Southern blot
GWAS
• A fenotípusos jellel (pl. beteg) rendelkező, illetve kontroll populációt genotipizálnak • Megkeresik, hogy melyik marker (SNP) gyakorisága különbözött a két populáció között • Multifaktoriális jellegek genomikai hátterének tisztázására
Microarray („génchip”) technológia • Nagyságrendekkel emelik az egyidejűleg vizsgálható gének számát •
Szerkezeti (nukleotidsorrend) és funkcionális (génkifejeződésmRNS) információk tömegét képes nyújtani
•
A génchipek (génlapok) rendezetten (microarray), sorokban és oszlopokban több tízezer ismert nukleotidszálat tartalmaznak, ezekhez kapcsolódik a jelzett minta nukleinsav
•
A fluoreszcens festékekkel láthatóvá tett kötődési mintázatot a komputer értékeli, és ismerve a génlapon levő elrendezést, a pozitív/negatív reakció alapján jellemzi a minta genetikai tartalmát
• Egyszerre több tízezer (akár a teljes genom) gén kifejeződése értékelhető ezzel az eljárással
