Genetické markery kvality hovězího masa

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Genetické markery kvality hovězího masa Bakalářská práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

Ing. Kateřina Kaplanová

Pavlína Dvořáková

Brno 2011

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Genetické markery kvality hovězího masa vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity. V Brně dne podpis studenta

Poděkování Na tomto místě si dovoluji poděkovat vedoucí bakalářské práce Ing. Kateřině Kaplanové za rady, které mi poskytovala při řešení mé bakalářské práce. Také za ochotu a trpělivost, kterou měla při zodpovídání mých dotazů ohledně genetiky a za všestrannou pomoc. Nemalé díky patří mé rodině, za psychickou a hlavně finanční podporu, kterou mi při studiu poskytují.

ABSTRAKT Se zvyšujícími se nároky konzumentů a spotřebitelů na zdravou výţivu je stále více ovlivněna spotřeba hovězího masa. Na kvalitě masa se podílí mnoho genů. Jedná se tedy o polygenní znak. V této práci jsou popsány kandidátní geny významných znaků kvality hovězího masa. Pro mramorování masa jsou to geny DGAT1 a TG a pro křehkost masa geny CAPN1 a CAST. V rámci bakalářské práce bylo zpracováno 10 vzorků genomické DNA skotu, u nichţ byl stanovován genotyp pro SNP v genu thyroglobulin (marker TG5). Pro marker TG5 je ţádoucí alela T, která indikuje vyšší marbling, tedy obsah intramuskulárního tuku v hovězím mase. U těchto 10 ti vzorků byly nalezeny všechny 3 moţné genotypy, tedy CT, TT i CC. Klíčová slova: kvalita hovězího masa, genetické markery, mramorování, křehkost

ABSTRACT The beef consumption is increasingly influenced by increasing demands of consumers on healthy eating. The quality of the meat involves many genes. It is therefore a polygenic character. In this bachelor thesis the candidate genes of important beef quality characters are described - the TG and DGAT1 for the meat marbling and CAPN1 and CAST genes for meat tenderness.. In this bachelor thesis 10 samples of cattle genomic DNA were used for analysis of marker TG5 of gene thyroglobulin. In this marker Allele T is preferable because of its positive effects on higher marbling score in beef. In our samples all three genotypes CC, TT and also CT were detected.

Key words: beef quality, gene marker, marbling, tenderness

OBSAH 1 ÚVOD ............................................................................................................................ 8 2 CÍL .............................................................................................................................. 10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED .......................................................................................... 11 3.1 CO JE TO MASO ....................................................................................................... 11 3.2 KVALITA MASA ...................................................................................................... 11 3.3 VÝŢIVNÁ HODNOTA MASA...................................................................................... 12 3.4 ZRÁNÍ MASA ........................................................................................................... 13 3.5 DRUHY MASA ......................................................................................................... 14 3.5.1 Hovězí maso.................................................................................................... 14 3.5.2 Telecí maso ..................................................................................................... 14 3.5.3 Vepřové maso ................................................................................................. 15 3.5.4 Skopové maso ................................................................................................. 15 3.5.5 Jehněčí a kůzlečí maso ................................................................................... 16 3.5.6 Drůbeží maso .................................................................................................. 16 3.5.7 Koňské maso ................................................................................................... 17 3.5.8 Rybí maso ...................................................................................................... 17 3.6 MASO JAKO SOUČÁST VÝŢIVY ................................................................................ 18 3.7 SVĚTOVÁ PRODUKCE MASA .................................................................................... 19 3.7.1 Hovězí maso.................................................................................................... 20 3.7.2 Vepřové maso ................................................................................................. 20 3.7.3 Drůbeží maso .................................................................................................. 20 3.8 SPOTŘEBA MASA .................................................................................................... 21 3.8.1 Hovězí maso.................................................................................................... 22 3.8.2 Vepřové maso ................................................................................................. 23 3.8.3 Drůbeží maso .................................................................................................. 23 3.9 GENETIKA KVALITY MASA...................................................................................... 23 3.10 GENETICKÉ MARKERY .......................................................................................... 24 3.11 TESTOVÁNÍ DNA ................................................................................................. 27 3.11.1 Agarózová elektroforéza ............................................................................... 27 3.11.2 PCR............................................................................................................... 27 3.11.3 PCR – RFLP ................................................................................................. 28 3.12 MRAMOROVÁNÍ MASA– MARBLING ...................................................................... 29 3.12.1 Gen DGAT1 .................................................................................................. 30 3.12.2 Gen TG ......................................................................................................... 31 3.13 KŘEHKOST MASA - TENDERNESS .......................................................................... 32 3.13.1 Gen CAPN1 .................................................................................................. 33 3.13.2 Gen CAST ..................................................................................................... 33

4 MATERIÁL A METODIKA .................................................................................... 35 4.1 IZOLACE DNA ZE SVALOVÉ TKÁNĚ ........................................................................ 35 4.2 PCR ....................................................................................................................... 35 4.3 RFLP ..................................................................................................................... 36 5 VÝSLEDKY ............................................................................................................... 37 5.1 VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: .................................................................................... 37 6 ZÁVĚR ....................................................................................................................... 39 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ...................................................................... 40 8 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ...................................................................... 44 9 SEZNAM POUŽITÝCH OBRÁZKŮ A TABULEK ............................................. 45

1 ÚVOD Abychom mohli vyuţívat klasické metody šlechtění, je nutné znát fenotyp daného jedince, jeho příbuzné a také ostatní jedince v populaci. Pro výběr daného jedince je důleţitý odhad jeho genetického zaloţení, coţ je u některých znaků dosti nepřesné např. u znaků s nízkou heritabilitou. Pokud provádíme selekci na jeden znak, můţe docházet k narůstání problémů s reprodukcí, sníţení odolnosti zvířat vůči stresu a chorobám. Ve šlechtění skotu se stále více uplatňují molekulárně-genetické metody, které odhalí genetickou podstatu sledovaných vlastností. Velice důleţité je studium kandidátních genů na úrovni DNA. Genetické markery, které jsou takto popsané, můţeme vyuţít pro konstrukci genetických map, detekci lokusů kvantitativních znaků a v praxi pro selekci zvířat. Od nepaměti je maso součástí jídelníčku člověka. Maso se stalo hlavní potravou lidí uţ v pravěku, proto byli nuceni lovit. S postupem času se spotřeba a vyuţití masa mění. Dříve se nejvíce konzumovalo maso hovězí a maso vepřové. To bylo dáno pořádanými zabíjačkami na vesnicích. V dnešní době je nejvíce preferováno maso kuřecí a krůtí, díky nízkému obsahu tuků a dietetickým vlastnostem. Vepřové maso je také hojně konzumováno, ale stále více jsou konzumenti upozorňováni dietology na jeho tučnost. Veliké zásahy do jídelníčku člověka dělají vědecké výzkumy, doporučení odborníků na výţivu, ale také nemoci, které zvířata postihují např. ptačí chřipka, prasečí chřipka, BSE. Skot je povaţován za nejvýznamnější druh hospodářského zvířete. Od počátku je skot chován pro produkci mléka a masa, poskytování pracovní síly, produkci kůţí a kostí, které se dále zpracovávaly. S postupem času se zvyšovaly poţadavky na uţitkovost a plemena byla rozdělena na mléčná, masná a kombinovaná si i nadále udrţovala své vlastnosti a význam. V dnešní době je vyšlechtěno více jak deset plemen masného uţitkového typu, ale poptávka spotřebitelů a konzumentů po hovězím mase se sniţuje. Proto je zde důvod zlepšit kvalitu nabízeného masa. Z důvodů variability poptávky není moţné docílit jedné ideální hodnoty kvality masa.

8

Je důleţité poskytnout konzumentům jistotu o kvalitě jimi zvoleného produktu a dodávat na trh co nejlépe připravené maso na kulinářskou úpravu tzn. dostatečně vyzrálé a hlavně zdravotně nezávadné. Důleţitou roli hraje také informovanost spotřebitele o sloţení a kvalitě masa.

9

2 CÍL Cílem této práce je zpracovat recentní literaturu, která se týká problematiky genetických markerů kvality hovězího masa. Charakterizovat vybrané vlastnosti kvality hovězího masa (mramorování, křehkost masa) a související markery. Detekovat alely vybraného markeru u 10 vzorků a porovnat genotypy daných jedinců. Dále charakterizovat vybrané markery – typ markeru, polymorfismy. Moţnosti testování pomocí molekulární genetiky – metody detekce markeru. Aktuální stav řešené problematiky – vyuţití vybraných genetických markerů ve šlechtění skotu, v genomické selekci.

10

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Co je to maso Maso je povaţováno za jednu ze základních potravin k lidské výţivě (KAVINA 1996). Lidé jej upřednostňují hlavně kvůli senzorickým vlastnostem (STARUCH, PIPEK, 1993). Z potravinářského hlediska do masa řadíme všechny čerstvé, chlazené nebo zmrazené jedlé části jatečných zvířat, drůbeţe, zvěřiny, ryb a jiných zvířat, která jsou vhodná pro lidskou výţivu a jsou zdravotně nezávadná. Maso je tvořeno z několika druhů tkání – svalové, kostní, vazivové, chrupavkové, tukové a nervové. Největší podíl masa tvoří svalovina. Svalová tkáň je sloţena z velmi jemných svalových vláken, které jsou viditelné pouze pod mikroskopem (KAVINA, 1996). Vzhledem k veliké rozmanitosti konzumačních zvyklostí různých národů a etnických skupin celého světa pokládáme za nutné pojem maso zúţit. Maso je pouze příčně pruhovaná svalovina z těl teplokrevných jatečných zvířat, včetně nedílných součástí svalových partií např. vazivové součásti svalů, povrchový a intramuskulární tuk, mízní uzliny, nervy a kosti (STEINHAUSER a kol., 2000).

3.2 Kvalita masa Kvalitu masa lze charakterizovat souborem hodnot fyzikálních, chemických a v poslední době se stále častěji provádějí analýzy senzorické. Mezi fyzikální hodnoty zahrnujeme měření pH, barvu masa, samovolnou ztrátu masové šťávy nebo vaznost. Chemické sloţení masa závisí na obsahu sušiny, bílkovin, tuku, vazivové tkáně, cholesterolu, jednotlivých mastných kyselin nebo aminokyselin. Senzorická analýza zahrnuje hodnocení vůně, chuti, křehkosti a šťavnatosti, která se odvíjí od anatomicky různých částí jatečného těla. V dnešní době bývá nejčastěji konzumována libová svalovina s nízkým podílem podkoţního a mezisvalového tuku. Chemické sloţení svaloviny ovlivňuje několik faktorů např. druh hospodářského zvířete, pohlaví, věk, jatečná partie, výţiva a hlavně zdravotní stav zvířete (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009).

11

3.3 Výživná hodnota masa Mezi hlavní sloţky masa patří voda, bílkoviny, lipidy, minerální látky a extraktivní látky (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009). Výţivnou hodnotu masa ovlivňuje obsah hlavních ţivin a obsah vody, proto tato hodnota kolísá podle druhu zvířete a podle části, ze které maso pochází. Je to dáno zastoupením typu tkání z různých částí těla různých zvířat. Energetickou hodnotu udává obsah energetických ţivin a obsah vody v mase. Obsah bílkovin a sacharidů se v různých druzích masa liší nepatrně (KAVINA, 1996). Bílkoviny, které hovězí maso obsahuje, jsou vysoce stravitelné a poskytují všechny esenciální aminokyseliny, které lidský organismus nedokáţe syntetizovat a musí je přijímat v potravě. Kvalita těchto bílkovin není nahraditelná bílkovinami rostlinného původu (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009). Obsah bílkovin udává biologickou hodnotu masa (KAVINA, 1996). Bílkoviny jsou povaţovány za nejvýznamnější sloţku masa jak z nutričního tak technologického hlediska. Jejich obsah je velmi vysoký. V libové svalovině se uvádí 18 – 22% bílkovin. Z hlediska nutričního se jedná o plnohodnotné bílkoviny (STEINHAUSER a kol., 2000). Tyto bílkoviny jsou stravitelnější a k tepelné úpravě

potřebují

kratší

dobu,

neţ

neplnohodnotné

bílkoviny.

Biologicky

neplnohodnotné bílkoviny se nacházejí v pojivových tkáních (chrupavky,vaziva) (KAVINA, 1996). Z technologického hlediska můţeme bílkoviny rozdělit do jednotlivých skupin podle toho, zda jsou rozpustné ve vodě nebo v solných roztocích. Rozdílná rozpustnost má význam pro další zpracování masa (STEINHAUSER a kol., 2000). Druh bílkovin, který v mase převládá, ovlivňuje stravitelnost a dobu tepelné úpravy masa. V mase je obsaţeno mnoho minerálních látek, které tvoří asi 1% hmotnosti masa. Většina minerálních látek je rozpustná ve vodě a ve svalovině je přítomna ve formě iontů. Významné minerální látky jsou fosfor, draslík, síra, vápník, hořčík, ţelezo, zinek. Maso je také významným zdrojem vitaminů, především skupiny B. Obsah vitaminů je vyšší v játrech a jiných drobech neţ v samotné svalovině. Veliký rozdíl je mezi polygastrickými a monogastrickými zvířaty. Dále jsou v mase obsaţeny extraktivní látky, jejichţ název je odvozen od extrahovatelnosti vodou. Obsah těchto látek je poměrně malý a jsou součástí enzymů. Je to nesourodá skupina sloţek, která vytváří typickou chuť a aroma masa. Extraktivní látky většinou vznikají v průběhu posmrtných změn. Obvykle se dělí na sacharidy, organické fosfáty a dusíkaté extraktivní látky (STEINHAUSER a kol., 2000). Maso obsahuje také lipidy, které se ve 12

svalovině nacházejí ve formě tukových buněk vyskytujících se mezi svalovými vlákny a snopci (tzv. mramorování masa), nebo jako strukturální fosfolipidy a cholesterol, které jsou součástí buněčných membrán. Díky malému obsahu tuku, který zřídka překročí hranici 5 % lze libové maso zařadit do kategorie nízkotučných potravin (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009). Tuky (estery mastných kyselin a glycerolu) tvoří v mase největší podíl (99 %) všech přítomných lipidů, zbytek zastupují polární lipidy (fosfolipidy) a doprovodné látky. Tuk, který se nachází v těle zvířat, je rozloţen velmi nerovnoměrně. Menší část je uloţena přímo uvnitř svaloviny (intramuskulární, vnitrosvalový) a dále tvoří tuk základ samostatné tukové tkáně (depotní, zásobní). Pro chuť a křehkost masa je velmi důleţitý tuk intramuskulární, který je rozloţen mezi svalovými vlákny ve formě ţilek a tvoří tzv. mramorování masa. Maso s vyvinutým mramorováním je v řadě zemí více ceněno neţ maso zcela libové. U nejdraţšího mramorovaného masa je obsah tuku aţ 50 % (STEINHAUSER a kol., 2000).

3.4 Zrání masa Zrání masa je celá řada biochemických procesů, které probíhají v mase po poráţce jatečných zvířat. Tyto procesy vedou k přeměně svaloviny zvířat. Změny nastávají hned po usmrcení zvířete, kdy se nahrazují aerobní procesy v buňkách za procesy anaerobní a to vede ke zvyšování koncentrace kyseliny mléčné ve svalovině a k poklesu pH. Dojde k fragmentaci dlouhých řetězců bílkovin a zvyšuje se křehkost masa. Zrání masa je ovlivněno mnoha faktory, proto není přesně stanovena doba zrání a podmínky, za kterých by mělo zrání probíhat. Nutné je zamezit přístupu kyslíku, tím se zabrání neţádoucím oxidačním procesům v mase. Obecně platí, ţe čím delší je doba zrání, tím se zvyšuje jeho křehkost. Nejvýraznější změny můţeme pozorovat během prvních 14- ti dnů. Velmi křehké maso se vyskytuje u plemen s dvojím osvalením, kde je optimální délka zrání v rozmezí 4 – 8 týdnů (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009).

13

3.5 Druhy masa 3.5.1 Hovězí maso Hovězí maso je získáváno z jalovic (mladých samic skotu do prvního otelení), krav, býků a volů (vykastrovaných býků). Obsahuje průměrně 19 % bílkovin, 5 – 6 % extraktivních látek, 8 % tuku a 70 % vody. Je povaţováno za biologicky nejhodnotnější druh masa. Bílkoviny, které hovězí maso obsahuje jsou velmi hodnotné. Jako nejlepší hovězí maso se povaţuje z dobře vykrmených mladých jalovic, kdy je maso světle červené, tuk světlý aţ bílý a kosti drobnější a tří aţ šestiletých volů, kdy je maso hnědočervené, mramorově prorostlé tukem, místy značně tučné a kosti poměrně mohutné (KAVINA, 1996).

Obr. 1 – Hovězí maso (http://www.mebio.cz). 3.5.2 Telecí maso Telecí maso se získává z mláďat hovězího skotu, které nejsou starší 4 měsíců. Nejlepší je ze tří – pětitýdenních kusů (tzv. savých telat). Maso obsahuje asi o 3 % více vody (tedy kolem 73 %) oproti masu hovězímu, přibliţně stejné mnoţství bílkovin a extraktivních látek a velmi málo tuku. Pro malý obsah vazivové tkáně je telecí maso lépe stravitelné a je měkké konzistence. Barva masa je světle růţová. Telecí maso obsahuje jemná vlákna, je libové a má osobitou vůni (KAVINA, 1996).

14

Obr.2 – Telecí maso (http://www.ssss.cz. ). 3.5.3 Vepřové maso Nejlepší vepřové maso je z kusů o hmotnosti 70 – 90 kg. Má světle růţové nebo červené zbarvení, je jemně vláknité a vyznačuje se osobitou lahodnou vůní. Obsahuje 41 % tuku, má méně vody proto se povaţuje za nejtučnější. Obsah bílkovin je niţší neţ u masa hovězího a to 15,5 %. Růţové maso můţeme získat z mladých vepřů, ze starších zvířat tmavočervené (KAVINA, 1996).

Obr. 3 – Vepřové maso (http://recepty.centrum.cz). 3.5.4 Skopové maso Skopové maso je ze skopového bravu kam patří ovce, berani, skopci a bahnice. Skopové maso obsahuje 14 – 23 % tuku, je velmi tučné, obsah vody je niţší a maso je hůře stravitelné. Nejţádanější maso je z mladých zvířat, které mají 1 – 2 roky. Obsah bílkovin je o něco větší neţ u masa vepřového 16 – 17 %. Podle věku poráţeného zvířete je maso cihlově červené aţ tmavočervené. Nevýhoda, kterou skopové maso má je osobitý pach a rychlé tuhnutí tuku. Skopové maso je jemně vláknité (KAVINA, 1996). 15

Obr. 4 - Skopové maso (http://www.sciencedaily.com).

3.5.5 Jehněčí a kůzlečí maso Jehněčí a kůzlečí maso je ze savých kusů obojího pohlaví. Můţeme zde zařadit i kusy dokrmované. Obsahuje 19 % bílkovin, 20 % tuku a 60 % vody. Maso je charakteristické bílou barvou. Je velmi jemné a dobře stravitelné. Kůzlečí maso je typické malým obsahem tuku a vysokým obsahem vody (74 %). Obsah bílkovin je 20,7 %, maso je bílé, jemné velmi dobře stravitelné (KAVINA, 1996). 3.5.6 Drůbeží maso Kuřecí maso si oblíbily všechny věkové kategorie, stoupenci zdravého stravování, sportovci, protoţe je výhodné při prevenci a léčbě řady metabolických onemocnění. Drůbeţí maso vykazuje ze všech druhů mas nejniţší energetickou hodnotu. Nejméně kalorií má čistá prsní svalovina bez kůţe. Kuřecího masa si ceníme především pro obsah hodnotných bílkovin. Největší mnoţství se nachází v nejméně tučných partiích. Pokud se obsah tuku zvyšuje, klesá podíl bílkovin a vody. V mase se dále nachází všechny nepostradatelné aminokyseliny, proto jej můţeme povaţovat za plnohodnotný zdroj bílkovin a je jedním z nejlepších proteinových zdrojů. Drůbeţí tuk je známý svým nízkým obsahem nasycených mastných kyselin oproti tuku hovězímu a vepřovému. Kuřecí maso je také bohaté na minerální látky (draslík, fosfor, síra, chlor a sodík), stopové prvky a vitaminy. Z výţivného hlediska je maso lehce stravitelné a má výborné nutriční sloţení (CHADIM,2011).

16

Obr. 5 – Kuřecí maso (http://recipe4you.blogspot.com). 3.5.7 Koňské maso Koňské maso je středně tučné, závisí to také na tom, ze které části zvířete pochází. Obsah tuku je 1 – 15 %. Je poměrně vodnaté, v průměru má 74 % vody. Bílkovina je zastoupena ve větším mnoţství neţ u masa hovězího 21,6 %. Koňské maso má nejvyšší obsah ţivočišného škrobu glykogenu (1 %) proto má nasládlou chuť. Stravitelnost masa je horší vyţaduje proto dokonalé odleţení. Svojí stravitelností se podobá zvěřině. Barva masa je tmavší neţ barva masa jiných jatečných zvířat. Je poměrně tuhé a hodně vláknité. Za nejlepší maso se povaţuje maso hříbat do věku dvou let (KAVINA, 1996).

Obr. 6 – Koňské maso (http://tuesdayshorse.wordpress.com). 3.5.8 Rybí maso Hlavní podíl, který se na rybím těle konzumuje, je svalovina. Nejčastěji z trupových a ocasních částí těla, která podle druhu ryby představuje 35 – 84 % její hmotnosti. Výţivová hodnota rybího masa závisí na mnoha faktorech např. druhu ryby, 17

pohlaví, věku, výţivě, podnebném pásmu. Rybí maso obsahuje aţ 26 % bílkovin sloţených z nezbytných (esenciálních) aminokyselin. Obsah purinových látek je podstatně niţší neţ u teplokrevných zvířat, proto je rybí maso zdravější (menší vznik kyseliny močové v lidském organismu). Tuk můţe dosahovat aţ 26 % v syrovém mase. Maso ryb neobsahuje ţádné sacharidy a obsah vody se pohybuje od 60 do 80 %. Mimořádný význam má obsah vitaminů v rybím mase a tuku. V tuku se nachází především vitaminy A, D a ve svalovině a vnitřnostech vitaminy A, vitaminy skupiny B, kyselina nikotinová, kyselina pantotenová, vitaminy C, D a E. Poměrně hodně jsou v rybím mase zastoupeny i minerální látky např. fosfor, draslík, chlor, fluor, síra, hořčík, ţelezo, měď, mangan, jod. Nejvíce stravitelné je vařené maso šupinatých ryb a je součástí četných diet (KAVINA, 1996).

Obr. 7 – Rybí maso (http://www.az-recepty.cz).

3.6 Maso jako součást výživy Konzumace masa je známá po více neţ 15 tisíc generací. Po celá léta bylo maso v jídelníčku symbolem síly. V mnoha případech to hraničilo aţ s představami mýtickými (zvěřina, medvědí maso). Z toho vyplývá, ţe největší mnoţství masa v rodinách konzumovali muţi, protoţe byli ţenami u stolu zvýhodňováni. Odhaduje se, ţe muţi konzumovali o 10 – 50 % více masa neţ ţeny. Jakmile došlo k rozvoji techniky, počítačových technologií a robotiky začali se nároky na fyzickou práci sniţovat a maso se stává pouze součástí potravy. Proto jsou v popředí zájmu konzumentů psychické, senzorické a estetické vjemy, které se dříve povaţovaly za vjemy sekundární (STEINHAUSER a kol., 2000). Významnou roli v konzumaci masa hrají také skutečnosti geografické, náboţenské, návykové, výchovné aj. Ve druhé polovině 20. století se v souvislosti s civilizačními nemocemi prosazuje zdravá výţiva. Začali se více prosazovat hygienické poţadavky na 18

produkci a zpracování masa. V bohatých státech západní Evropy a severní Ameriky spotřeba masa postupně klesá (INGR, GAJDŮŠEK, 2008). Potřeba červeného masa, které se vyznačuje svou energetickou hodnotou, je v trvale teplých oblastech niţší neţ v oblastech, kde se střídají roční období nebo s podnebím trvale chladným. Souvisí to hlavně s niţší energetickou potřebou těla, ale i s vyšší pestrostí nabídky ryb, mořských produktů, široké škály ovoce a zeleniny a na bílkoviny bohatých rostlin nebo jejich částí. Relativně vysoká spotřeba masa v mírném pásmu je dána vysokou produkcí, značnou kupní silou obyvatel a v neposlední řadě dlouhodobou oblibou masa v jídelníčku. Veliký vliv na druhy konzumovaného masa má vedle způsob přípravy hlavně náboţenství (STEINHAUSER a kol., 2000). Pozornost, na kterou se producenti a chovatelé stále více zaměřují, jsou poţadavky konzumentů. Charakteristiky jako barva, pevnost, textura, jemnost a mramorování masa velmi přispívají ke kvalitě hovězího masa. Producenti masa se snaţí, aby kvalitnější maso bylo co nejlépe ohodnoceno (GAZDOVÁ, 2006). Konzumenti hovězího masa stále častěji vyhledávají maso, které má vysokou a trvalou kvalitu (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009). Jednou z hlavních příčin proč lidé odmítají hovězí maso, je houţevnatost, která je přičítána mnoha faktorům např. velké mnoţství intramuskulární pojivové tkáně, intramuskulárního tuku a délky sarkomer. To ale nemění nic na tom, ţe rozsah proteolýzy proteinů uvnitř svalových vláken, je významným faktorem pro křehkost masa (HRUŠKA, 2010). To přimělo producenty k investování finančních prostředků na výzkum, který se zaměřuje na identifikaci ukazatelů kvality a na zvýšení porozumění zakládání a růstu svaloviny, coţ vede k produkci kvalitní potraviny (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009).

3.7 Světová produkce masa Celková světová produkce masa vzrostla ze 196 milionů tun v roce 1995 na 220 milionů tun v roce 1998. Meziroční nárůst je okolo 2,8 %, kdy se pohybujeme pod dlouhodobým historickým průměrem (INGR,GAJDŮŠEK, 2008). Největší nárůst v objemu 70 milionů tun způsobí maso drůbeţí z 52 % a maso vepřové z 31 %. Hovězí maso se bude podílet pouze 11,6 % a skopové a kozí maso 4,7 %. Během posledních 37 let vzrostla produkce masa o 300 %. Největší nárůst zaznamenalo maso drůbeţí, 19

nejmenší maso koňské (STEINHAUSER a kol., 2000). V České republice se v prvním čtvrtletí roku 2010 vyrobilo 131 000 tun masa, coţ je asi o 3,6 % masa méně jako ve stejném období roku 2009 ( TASR, 2010). 3.7.1 Hovězí maso Negativní vlivy jako je výskyt slintavky a kulhavky v Jiţní Americe a BSE v západní Evropě způsobují sníţení dynamiky růstu světové produkce na pouhé 1,3 % tj. zvýšení pouze o 8 milionů tun za 10 let. Hovězí maso bylo od začátku šedesátých let nejvíce konzumovaným a preferovaným druhem masa na světě. Nejprve jej předstihlo maso vepřové a v polovině devadesátých let i maso drůbeţí. Mezi světové výrobce hovězího masa patří USA, Austrálie, Nový Zéland a státy Jiţní Ameriky. Všechny tyto státy se specializovaly na masná plemena skotu a díky vlastní technologii výkrmu se rozdělila na cestu intenzivního výkrmu jádrem (USA, Kanada), tradiční pastevní chovy (Jiţní Amerika), případně vysoce intenzivní pastevní chovy (Nový Zéland). Do hovězího masa také řadíme maso z domestikované formy buvola indického a maso bizonů, které zvláště v Asii tvoří nezanedbatelný podíl (STEINHAUSER a kol., 2000). Produkce hovězího masa klesla nejvíce a to o 7,4 % (TASR, 2010). 3.7.2 Vepřové maso Vepřové maso zaujímá zhruba 40 % celkového objemu vyrobeného masa. Roku 1965 se stalo nejvíce produkovaným druhem masa. Bylo vyprodukováno 85,2 milionů tun z toho Čína 37,2 milionů tun (43,5 % celkové světové produkce). Mezi další významné producenty vepřového masa řadíme EU, USA a Kanadu. Celkový počet chovaných prasat ve světě je asi 800 milionů kusů, přičemţ se i nadále předpokládá roční růst o 2 %. Největší nárůst bude v Číně, USA a Kanadě. V zemích EU není další rozvoj chovu prasat příliš reálný díky investiční náročnosti především z hlediska ochrany ţivotního prostředí a také klesá zájem o maso v zemích EU (STEINHAUSER a kol., 2000). 3.7.3 Drůbeží maso Drůbeţí maso bude podle FAO i USDA stále nejvíce dynamickým sektorem světové produkce masa. Nejvíce vzrostla produkce v Číně, kde za pouhých devět let byl nárůst o více neţ 5 milionů tun drůbeţího masa. Od osmdesátých let je globální 20

meziroční nárůst o 5,6 %. Největšími světovými producenty drůbeţího masa jsou USA, EU, Čína a Thajsko. Ze zemí střední Evropy potom Maďarsko (STEINHAUSER a kol., 2000). Celosvětový růst výroby je od osmdesátých let výrazně způsoben především expanzí vepřového a drůbeţího masa. Světová produkce hovězího masa uţ třetí dekádu stagnuje. Hlavní příčiny je třeba hledat v relativně nízké ceně, kterou způsobuje světová nadprodukce a nezvyšující se případně klesající spotřeba masa u konzumentů. Dále to jsou zvýšené koncentrace chovů a intenzita výroby masa drůbeţího a vepřového, lepší konverze ţivin u drůbeţe a prasat v porovnání se skotem a mnoho dalších příčin (STEINHAUSER a kol., 2000).

3.8 Spotřeba masa Spotřeba masa závisí hlavně na produkčních moţnostech země, ale i na velikosti populace, kupní síle a konzumačních zvyklostech. Stále více spotřebitele ovlivňuje kvalita masa a významnou roli hraje nízký obsah tuku a vynikající senzorické vlastnosti. Konzumenti kladou čím dál větší poţadavky na zdravotní nezávadnost masa např. odmítání růstových stimulátorů, poţadavky na respektování ekologických a etologických zásad chovů zvířat, ale i na hygienické poţadavky zpracování masa aj. V minulých letech se velmi negativně zapsali do podvědomí široké veřejnosti aféry s anglickým BSE, belgickými dioxiny, americkými hormonálními přípravky a francouzskými paštikami kontaminovanými listeriemi. V dnešní době má na spotřebu masa negativní dopad ptačí chřipka, prasečí chřipka a v neposlední řadě dioxiny, které se objevily v Německu na začátku letošního roku. Dioxiny jsou nejvíce jedovaté látky na Zemi, které jsou toxické uţ ve stopovém mnoţství. Minimální koncentrace způsobuje hormonální a reprodukční poruchy, poškození imunitního systému a řadí se mezi karcinogenní látky. Populaci ohroţují nejen v potravinách, ale i v ovzduší, kam se dostávají spalováním pneumatik a PVC. V potravinách jsou více nebezpečné z důvodu dlouhodobého ukládání v tukových tkáních zvířat a následně i člověka. Kontaminovaný krmný tuk se přidával do krmení uţ od března 2010. Podle Evropské komise se závadné krmivo dostalo i do Dánska (VELEBA, 2010). Všechny tyto faktory působí velmi negativné na důvěru spotřebitelů 21

v jakosti a zdravotní nezávadnosti masa. Kolem roku 1998 byla průměrná světová spotřeba 37,1 kg/osoba/rok veškerého masa, v rozvinutých zemích dokonce 76,5 kg/osoba/rok, kdy v Evropě byla spotřeba masa na osobu třikrát větší neţ světový průměr. K porovnání v USA je současná spotřeba masa 110 kg/osoba/rok a v rozvojových zemích 27,6 kg/osoba/rok. Tento rozdíl ve spotřebě nevyplývá z problémů

uváděných

výše

ale

z ekonomické

situace

v daných

zemích

(STEINHAUSER a kol., 2000). Nejvyšší spotřeba masa byla v ČR zaznamenána v roce 1989, kdy dosahovala 97 kg/osoba/rok poté začala klesat. V posledních letech se spotřeba pohybuje okolo 80 kg/osoba/rok a to se výrazně nemění (ČTK, 2011). Celosvětová spotřeba hovězího masa by měla zaznamenat jeden z největších růstů ze zemědělských komodit, coţ je dáno především nárůstem produkce i spotřeby masa v Asii. Předpokládá se, ţe cena hovězího masa poroste, coţ platí i pro EU. Pokles produkce hovězího masa zaznamená EU kvůli doznívající ekonomické krizi, avšak nárůst spotřeby bude uhrazena větší mírou dovozů ze třetích zemí (MZE, 2010). 3.8.1 Hovězí maso Hovězí maso je nejvíce preferováno v USA, Kanadě, Austrálii, zemích latinské Ameriky a anglosaských zemích Evropy (STEINHAUSER a kol., 2000). Obliba a spotřeba masa v České republice se během posledních několika let výrazně měnila. Ve 30. letech minulého století byla průměrná spotřeba 15 kg/osoba/rok, koncem 80. let se spotřeba zvýšila na 80 kg/osoba/rok a v současné době je to pouze 10 kg/osoba/rok. Mezi země s nejvyšší spotřebou se řadí Argentina (65kg), USA (44kg) a Austrálie (37kg). Důvody, které zapříčiňují nízkou spotřebu hovězího masa je vysoká cena oproti jiným druhům zejména drůbeţího. Stravovací návyky obyvatel České republiky nás určitě neřadí mezi steakové země. Někteří lidé nekonzumují hovězí maso, protoţe se domnívají, ţe způsobuje obezitu, poruchy kardiovaskulárního systému nebo rozvoj některých nádorových onemocnění (rakovina tlustého střeva). V některých případech vede k nespokojenosti zákazníka i nedostatek informací a nevyrovnaná kvalita na trhu nabízeného masa (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009). Jeden z důleţitějších faktorů, který je důsledkem odmítání hovězího masa je jeho nevyzrálost na pultech prodejen. Hovězí maso zraje cca 14 dní a tím se zvyšuje jeho cena, coţ má za následek, ţe obchody prodávají maso nevyzrálé, které není chuťově tak zajímavé a špatně se upravuje. Některé ze zmíněných příčin poklesu obliby 22

hovězího masa se nepodaří odstranit (cena), kdeţto na jiné by mohla kladně zapůsobit větší informovanost zákazníka na běţné produkty z hovězího masa. Prvořadým cílem chovatelů masného skotu je uspokojit vysoké nároky zákazníka a tím zvýšit průměrnou spotřebu hovězího masa v České republice (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009). 3.8.2 Vepřové maso Vepřové maso je součástí diety obyvatel velké části Evropy (průměr 41,3kg). Do celkové spotřeby masa spadá celými 40 % a to i přesto ţe miliony lidí islámské a ţidovské víry vepřové maso zcela odmítají. Zvýšení ale i udrţení současné spotřeby vepřového masa v rozvinutých zemích závisí na sníţení energetické hodnoty způsobené odklonem spotřebitelů od tučných částí ke kvalitnímu libovému masu, které takto můţe konkurovat masu drůbeţímu (STEINHAUSER a kol., 2000). 3.8.3 Drůbeží maso Drůbeţí maso je povaţováno za druhé nejkonzumovanější maso na světě a díky tomuto se posunulo před maso hovězí. Tyto fakta jsou způsobena především nízkou cenou vzhledem k ostatním druhů masa, širokým rozšířením konzumentů drůbeţího masa po celém světě, relativní zdravotní bezpečností a větší akceptovatelností pro většinu kultur (STEINHAUSER a kol., 2000). Spotřeba drůbeţího masa v České republice vzrostla od roku 1948 ze 2 kg/osoba/rok na 24,8 kg/osoba/rok v roce 2009. Můţeme říct, ţe v rámci EU je nadprůměrná (ČSÚ, 2011).

3.9 Genetika kvality masa Genetický zisk je zisk, který přináší šlechtění hospodářských zvířat a je hlavním měřítkem úspěšnosti. Šlechtění zvířat usměrňujeme podrobnějším studiem genetické podstaty uţitkových vlastností. Veliký význam zde hraje studium genetických markerů, kdy jejich vyuţití přispěje k zefektivnění a zpřesnění selekce zvířat hlavně ve vztahu k masné uţitkovosti, plodnosti a zdraví zvířat. V současné době je genetika povaţována za hlavní biologickou disciplínu, která se při uplatnění svých poznatků stala velmi důleţitým prostředkem pro dosaţení lepší produkce. To se týká jak kvantity, tak kvality. V dnešní době jsou hodně rozšířené testy DNA, které umoţňují rychlou identifikaci alel

23

určitého genu testovaného zvířete. Zrychlení a upřesnění selekčního a šlechtitelského procesu je předpokládáno za vyuţívání genetických markerů. Kvantita a kvalita uţitkových vlastností nemůţe být jednoznačně stanovena, protoţe není dostatečně prozkoumán vliv genetické výbavy jedince na poţadovanou produkci. Není moţné stanovit, jak a kdy dochází k expresi genů, které mají nebo mohou mít vliv na uţitkovost zvířat a jak je exprese genů ovlivněna. Masná uţitkovost je ovlivňována geny s polygenním účinkem, jejichţ působení na konečné uţitkové vlastnosti se můţe zvyšovat, ale i sniţovat v důsledku specifických kombinací alel těchto genů (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009). V oblasti chovu skotu dochází v posledních letech k odklonu od pouhého zvyšování produkce masa a zlepšování jeho kvality. Nestačí vyuţít pouze zootechnických a manaţerských opatření zaměřených ke stanovenému cíli, ale je potřeba vyuţít nejnovější molekulárně-genetické metody ve šlechtitelské práci. Genomická selekce výrazně zlepší šlechtitelský proces a zpřesní odhad plemenné hodnoty zvířat. Jde o moţnost identifikace polymorfizmů DNA, kde se nachází příčinné lokusy, které ovlivňují ekonomicky významné uţitkové a zdravotní vlastnosti zvířat (ČÍTEK, 2010)

3.10 Genetické markery Marker je obecně chápán jako identifikační znak. Genetický marker je gen, nebo úsek na chromosomu, který lze identifikovat jednoduchou zkouškou (URBAN, 2008; MARSCHALL, 1999). Molekulární genetické markery mají oproti klasickým některé výhody např. jsou početně a relativně snadno identifikovatelné, vysoce informativní, mohou být typovány z malého mnoţství tkáně v libovolném věku a jsou dlouhodobě archivovaná (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002). Kaţdý jedinec nese ve svém genomu určitý marker, tudíţ má specifickou délku chromozomů tzn. markery přesně označují úsek genomu. V uţším slova smyslu můţeme genetický marker chápat jako konkrétní gen se známou funkcí a fenotypovým projevem v populaci (ZAHRÁDKOVÁ a kol.,2009). Tyto markery mají díky vlastnostem, které je charakterizují významné výhody. Jejich detekování je moţné u kaţdého zvířete bez ohledu na věk, dokonce i u embryí a spermií. Brzká detekce genotypu umoţňuje zkrácení generačního intervalu a tím se zvýší selekční pokrok za jednotku času. Varianty jednoho markeru mají mezi sebou 24

kodominanční vztah, který se dá vysvětlit tak, ţe přesně určí jednotlivý genotyp, i heterozygotní, který by se ve fenotypu neprojevil. Pomocí genetických markerů je moţné identifikovat např. determinované křehkosti masa. Výhoda spočívá v zařazení jatečných těl do skupin podle geneticky podmíněné křehkosti. Podle tohoto se učí variabilní doba zrání pro jednotlivé skupiny masa a tím získáme jednotné křehkosti a ušetříme finanční prostředky, které by byly vynaloţeny, na delší zrání některých skupin (URBAN, 2008). I přesto, ţe pouţívání markerů bylo drahé a jen málo jich bylo známých, vědci se ze začátku soustředili, aby našli markery, které jsou nejvíce výhodné v chovu skotu. Bylo testováno mnoho markerů, ale jen ty nejlepší se začali vyuţívat ve šlechtitelských programech (HRUŠKA, 2010). Podle O ´Briena (1999) se markery rozdělují do třech různých typů. Prvním typem jsou Genetické markery 1. typu kam zařazujeme markery pro masnou uţitkovost např. IGF-1, MSTN apod. (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009). Kodují exprimované geny, mohou být kandidátní geny pro QTL. Mají nízkou hladinu polymorfizmu, jsou málo pouţitelné pro studie diverzity rodin a populací. Jsou významné v komparativním (srovnávacím) mapování (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002). Druhým typem jsou Genetické markery 2. typu – vysoce variabilní úseky DNA, které vykazují mendelistickou dědičnost, ale neprojevují se na fenotypu, můţeme je najít v nekódujících oblastech DNA nebo i uvnitř samotných genů. Nejčastěji se vyuţívají k určování paternity, parentity a ke stanovení genetického typu (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009). Je zde vysoce variabilní sekvence DNA. Nejvíce se vyuţívají mikro a minisatelity. Kvůli vysokému stupni polymorfizmů jsou mikrosatelity vysoce informativní v populačních studiích. Jsou základem pro vazbové mapování genů. Nemají přímo vliv na variabilitu znaku, ale mohou se nacházet ve vazbě QTL (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002). Třetím

typem

jsou

Genetické

markery

3.

typu,

které

označujeme

jako

jednonukleotidové polymorfismy (SNPs) (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009). SNPs jsou genetické markery, které se nejčastěji pouţívají při určování variability na úrovni DNA u savců. Je to dáno tím, ţe v genomu savců se vyskytují velice často a jsou snadno detekované (BARENDSE a kol., 2004). Mohou leţet uvnitř kódujících genů nebo v nekódujících intronech nebo intergenových oblastech. Vyuţívají se pro populační a rodinné studie. Největší význam mají při rozvoji automatických metod skriningu (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002).

25

Velmi často jsou přenášeny s geny, u nichţ se projevil vliv na fenotyp jedince, proto mohou být povaţovány za markery. Vyuţívají se k detekci bezrohosti, kterou ovlivňuje neznámý gen (ZAHRÁDKOVÁ a kol., 2009). Genetické markery 2. a 3.typu se často objevují v genetické vazbě. Jsou přenášeny společně s lokusy kvantitativních vlastností, které se označují jako QLT (quantitative trait loci). Detekce QLT je důleţitá pro vyuţití ve šlechtění coţ by vedlo ke zlepšení ekonomické produkce v chovech. QLT mají většinou polygenní charakter s velkým mnoţstvím kombinací alel a jsou brány jako celek. Jelikoţ se o jejich sloţení prakticky nic neví, jejich vztah k uţitkovosti se vyjadřuje prostřednictvím genetických markerů (URBAN, 2001). K detekci QLT popř. genetických markerů se vyuţívají genomové mapy, které se vytváří pomocí mikrosatelitových segregačních analýz. U skotu je rozlišení genetických map poměrně vysoké (CASAS a kol., 2004).

26

3.11 Testování DNA 3.11.1 Agarózová elektroforéza Agarózový gel je polysacharid izolovaný z mořských řas. Slouţí jako prostředí pro dělení. Tento gel tuhne za pokojové teploty a připravuje se rozvařením práškové agarózy v elektroforetickém puf. Příprava gelu je velmi snadná a proto vyvaţuje nevýhodu, ţe homogenita a rozlišovací schopnost je niţší neţ u PAGE (polyakrylamidová elektroforéza) (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002). Přechod mezi kapalným a pevným stavem tvoří gely. Strukturální sloţení gelu je z 90% voda, kde se nachází trojrozměrná síť. Póry zde slouţí jako molekulové síto. Velikost těchto pórů je dána koncentrací gelu a odpovídá velikosti proteinů a nukleových kyselin. Elektroforéza vyuţívá schopnosti nabitých částic pohybovat se v elektrickém poli. Rychlost pohybu těchto částic je závislá na velikosti celkového povrchového náboje, velikosti a tvaru molekuly a její koncentrace v roztoku (MURRAY a kol., 2002). 3.11.2 PCR Polymerázová řetězová reakce je povaţována za základní molekulárně-genetickou metodu. Tato metoda slouţí k získání dostatečného mnoţství specifické DNA pro další analýzy. V některých svých modifikacích můţe slouţit i k identifikaci polymorfismů. PCR metoda byla poprvé popsána v roce 1985 (SAIKY a kol., 1985). Princip této metody byl popsán asi před 30 lety, ale jako praktická metoda se začala pouţívat aţ v roce 1985. Metodu PCR vyvinul Kary Mullisem v roce 1983. Od samotného počátku byla metoda patentována a v roce 1985 za svůj objev obdrţel Nobelovu cenu za chemii (DVOŘÁK, 2001). PCR slouţí k získání dostatečného mnoţství DNA pro další analýzy. Podstatou je enzymatická amplifikace (namnoţení) daného úseku DNA. Tento úsek je ohraničený specifickými fragmenty oligonukleotidů, které se označují jako primery. U primerů dochází k hybridizaci s oběma vlákny denaturované matricové DNA v opačné orientaci. Tímto se syntetizuje oblast mezi primery a vznikají dva dvouvláknové produkty, které slouţí jako templáty v dalším cyklu. V dalších cyklech dochází opět k namnoţení fragmentů, které byly vytvořeny v předchozím cyklu reakce. V praxi je amplifikace limitována koncentrací substrátu a aktivitou enzymů, proto je skutečná účinnost metody niţší asi 60 – 80% (SAIKY a kol., 1988). Reakce probíhá v tzv. termálním cykleru, kde 27

se opakuje sled optimálních teplot pro jednotlivé kroky amplifikace. Prvním krokem je denaturace, kde se vzorek dvouvláknové DNA zahřívá na 90°C a dochází k rozpojení vláken DNA. Druhým krokem je anealing neboli nasedání primerů při teplotě 40 – 60°C v závislosti na délce a sloţení jednotlivých primerů. Posledním krokem je elongace zahřátí na 72°C a dochází k prodlouţení připojených primerů pomocí enzymu Taq polymerasy (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002).

Dvoušroubovice Denaturace: rozpojení vláken

Anealing: nasedání primerů

namnoţení

Elongace: DNA primerů

úseku

vymezeného

párem

působením

enzymu

polymerasy Obr. 8 – Princip PCR (http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html ).

3.11.3 PCR – RFLP Pomocí metody PCR se na základě genomové DNA amplifikuje specifická sekvence např. úsek genu. Pomocí panelu restrikčních endonukleáz se tento fragment DNA štěpí. Pokud je v restrikčním místě bodová mutace toto místo zaniká nebo naopak vzniká nové. Na základě tohoto vznikají fragmenty DNA různé velikosti, které jsou separovány na agarózovém gelu. Pomocí ethidiumbromidu se provádí vizualizace DNA. Výhody, které tato metoda přináší, jsou nenáročnost a moţnost určení místa mutace. Jedna z nevýhod je, ţe pravděpodobnost detekce mutace je nízká a závisí na počtu 28

pouţitých enzymů. Metodu je vhodné vyuţívat pro geny s větším polymorfizmem nebo pro nekódující sekvence. Pouţitím RFLP (polymorfismus délky restrikčních fragmentů) se identifikují alely na základě přítomnosti nebo absence specifického restrikčního místa. Genomová DNA je štěpena za pomocí restrikční endonukleázy, separována elektroforézou na agarózovém gelu a přenesena na pevnou membránu. Velkou výhodou metody RFLP je schopnost identifikovat polymorfismus i uvnitř markerů typu I, pokud je jako sonda pouţita komplementární DNA. Dále se metoda pouţívá pro vazbové i komparativnní mapování a odhalení variability v kandidátních genech pro znaky, které jsou ekonomicky výhodné. Kvůli pracnosti této metody se dnes dává přednost její modifikaci vzniklé spojením s PCR (PCR-RFLP) (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002).

3.12 Mramorování masa– marbling V dnešní době je mramorování neboli marbling jednou z nejvíce poţadovaných vlastností masa (GAZDOVÁ, 2006). Mramorování je znak, který udává mnoţství tuku ve svalech. Název mramorování vzniklo od struktury, kterou pozorujeme na příčném řezu svalu, kde se střídá vmezeřený tuk se svalovými vlákny. Tento tuk se nazývá jako intramuskulární tuk (IMT), který se nachází mezi svalovými vlákny ve svalových snopcích a je nutné ho rozlišovat od podkoţního tuku. Podkoţní tuk má odlišné vlastnosti a v organismu zcela jiný význam např. obsahuje více cholesterolu neţ jiné tkáně v těle (WHEELER a kol., 1987). Nejčastěji se mramorování měří na zádovém svalu (m. longissimus). Měří se nejčastěji subjektivně visuální inspekcí na příčném řezu svalu za pomoci tzv. marbling skóre. Dále můţeme také vyuţít objektivní stanovení obsahu intramuskulárního tuku chemickou analýzou. Marbling skóre neboli stupeň mramorování se určuje vţdy aţ po poráţce zvířete. Posuzujeme oblast mezi 12. a 13. ţebrem. Toto hodnocení má několik nevýhod např. finanční i časová náročnost a není zcela objektivní. Mezi další negativa se řadí provádění hodnocení po poráţce zvířete, tedy aţ po jeho výkrmu nebo i případném pouţití v plemenitbě, coţ má ekonomický dopad. Proto je důleţité hledat alternativní metody predikce marbling skóre u ţivých zvířat. Plemena, u kterých je mramorování výrazné např. aberdeen anrgus, wagyu na rozdíl od plemen s běţným mramorováním např. charolais, holštýn svědčí o širším genetickém podmínění znaku a dává 29

předpoklady pro dobré výsledky šlechtitelské práce při šlechtění na mramorování. Genetické korelace ukazují, ţe obsah intramuskulárního tuku je středně antagonistický k výnosu libového masa u zvířat a mírně synergický s tloušťkou podkoţního tuku. Mramorování je polygenní znak (MARSCHALL, 1999).

Obr.9 - Stupně mramorování masa (http://openwaterchicago.com).

3.12.1 Gen DGAT1 Gen DGAT1 je velmi důleţitý v syntéze tuků. Kóduje enzym diacylglycerol Oacyltransferása, který katalyzuje poslední krok v syntéze triglyceridů. Enzym má za úkol ze substrátů acyl-CoA a diacylglycerolu vytvořit triacylglycerol a CoA. Má tedy význam v syntéze tuků. Výzkumy, které byly prováděny, prokázaly, ţe myši s nefunkčním genem nejsou schopny produkovat mléko a mají sníţenou schopnost vytvářet depotní a svalový tuk (SMITH a kol., 2000). Tento gen nesouvisí pouze s mramorováním masa, ale do popředí se dostává i jako kandidátní gen pro mnoţství tuku v mléce. U skotu se gen DGAT1 nachází na 14 chromozomu. Polymorfizmu, který je označován jako K232A je spojován se změnami v syntéze tuků. Nejdůleţitější je rozdílnost 10433. a 10434. nukleotidu v DNA sekvenci genu. Detekce tohoto genotypu se provádí metodou PCR-RFLP (WINTER a kol., 2002). Při zkoumání tohoto genu bylo zjištěno, ţe lysinová varianta genu významně zvyšuje obsah intramuskulárního tuku. Průkazný rozdíl byl zjištěn pouze mezi homozygoty a ostatními moţnými genotypy. Toto zjištění navrhuje lysinovou alelu jako recesivní. I joné studie 30

dokazují výraznější mramorování způsobené vlivem lysinové alely (SORENSEN a kol., 2006). 3.12.2 Gen TG Gen TG neboli thyroglobulin je povaţován za kandidátní gen pro obsah intramuskulárního tuku. Je udáván jako prekurzor pro hormony štítné ţlázy tzv. thyroidní hormony. Jedná se o triiodothyronin (T3) a tetraiodothyronin (T4). Funkce zmiňovaných hormonů je známa od poloviny 20. století. Hladina těchto hormonů ovlivňuje intenzitu metabolismu. Ukázalo se, ţe hladina thyroidních hormonů působí na vývoj tukových buněk (BARENDSE, 1999). U skotu je gen TG lokalizován na 14 chromozomu. Objevuje se tu několik mutací (SNP), u kterých nebyla nalezena asociace s mramorováním masa. Pro rozpoznání alely genu TG5 v jednotlivých SNPs se pouţívá metoda PCR-RFLP (THALLER a kol., 2003).

Obr. 10 - Vyšší mramorovaní hovězího masa (http://forum.nationstates.net/viewtopic.php?f=6&t=23593)

31

3.13 Křehkost masa - tenderness U kvality hovězího masa se stále častěji mluví o vlastnostech, které jsou výhodné pro konzumenty a které konzumenti preferují (ČÍTEK,2010). Křehkost je povaţována za jednu z nejdůleţitějších vlastností kvality masa. Většina konzumentů nepreferuje hovězího maso kvůli vyšší tuhosti, která je nejčastěji způsobena nesprávnou úpravou. Postmortální zrání masa je zhruba dvakrát pomalejší neţ u jiných druhů. Významnou roli hraje lokus CAPN1 pro mikromolárním vápníkem aktivovanou neutrální

proteázu.

Tato

vlastnost

je

mimo

jiné

podmíněna

i

geneticky

(KOOHMARAIE, 1996). U křehkosti se významnou měrou zapojuje calpainový enzymatický systém. Tento systém má pravděpodobně vliv na zrání masa, coţ je způsobeno rozdílným poměrem sloţek calpain systému. Calpainy jsou na kalciumdependentní proteázy, které hydrolyzují substráty ve vybraných oblastech. Celý tento systém se skládá ze dvou calpainů - µ calpain (CAPN1) a m-calpain (CAPN2) a jejich inhibitoru calpastatinu (CAST) (ČÍTEK, 2010). Ve studii byl prokázán epistatický vztah mezi lokusy pro calpain a calpastatin. Skutečností je, ţe vliv polymorfismů v lokusu pro CAPN1 je u jednotlivých plemen specifický. Je známo mnoho aspektů, které ovlivňují míru křehkosti, proto ji lze zařadit mezi komplikované vlastnosti. Aspekty ovlivňující křehkost jsou např. věk zvířete, výţiva, stupeň stresu před poráţkou, způsob přípravy masa při vaření a nejdůleţitější je doba zrání post-mortem (BARENDSE, 2002). Po poráţce zvířete je vyplavována kyselina mléčná, která ovlivňuje zvýšení křehkosti masa (SILVA a kol., 1999). Genetické testy umoţňují roztřídit jedince do tříd křehkosti, které by mohli splnit poţadavky konzumentů. Pokud zajistíme rozdělení jedinců do jednotlivých tříd, znamenalo by to zkrácení celkové doby zrání a úsporu finančních prostředků. Další moţností je šlechtěním sníţit variabilitu v genech, které ovlivňují křehkost a přitom zachovat poţadované alely. Postmortální zrání masa ovlivňuje několik endogenních enzymů, nebo proteinů, které ovlivňují jejich aktivitu. Koncentrace těchto látek a jejich biologická hodnota mají vliv na průběh proteolýzy post-mortem a tím na křehkost masa (MARSCHALL, 1999). Křehnutí

masa

post-mortem

způsobuje

enzymatická

degradace

klíčových

myofibrilárních a přidruţených proteinů, které mají za úkol udrţovat integritu 32

myofibril. Proteiny se nachází v intra a inter-myofibrilárních vazbách, váţí myofibrily v sarkolemě, nebo zajišťují připojení svalových buněk k basální membráně. Proto zmíněná degradace proteinů můţe způsobit ochabnutí myofibril a křehnutí masa (KOOHMARAIRE, 1996). Identifikace jednotlivých genetických markerů křehkosti masa by mohla zajistit selekční kritérium, které zajistí zlepšení v tomto znaku. K měření křehkosti masa se v praxi pouţívá nejčastěji sval m. longissimus. Měření jednoho svalu nemusí přesně určit hodnoty křehkosti jiných svalů. Další metoda je např. subjektivní smyslové hodnocení - ochutnávači. Tato metoda se nedá uplatnit při zkoumání většího počtu zvířat (MARSCHALL, 1999). Křehkost je polygenní znak. 30 % fenotypové variace se dá vysvětlit jako aditivní genotypový efekt a 70 % fenotypové variace je způsobeno vlivem prostředí neaditivní genovou sloţkou zvířat jednoho plemene (BARENDSE, 2002). Významné jsou i korelační znaky. Niţší střiţná síla byla spojena se zvýšeným obsahem intramuskulárního tuku a libovost masa má antagonistický vztah k jeho křehkosti a šťavnatosti (MARSCHALL, 1999). 3.13.1 Gen CAPN1 Calpain se také můţe označovat jako µ-calpain nebo calpain 1. Je to kalciem aktivovaná neutrální protéza 1, která je produkovaná genem CAPN1 (KOOHMARAIE, 1996). Calpain 1 je enzym, který štěpí svalovou bílkovinu a zvyšuje křehkost masa. Spolu s calpastatinem tvoří enzymový komplex, kde jejich vzájemný poměr má vliv na stupeň křehkosti masa (KAPLANOVÁ, 2009). V lokusu pro CAPN1 byly popsány 3 SNP markery, které ovlivňují proces, křehnutí masa postmortem (PAGE a kol., 2004). Působí jako specifický inhibitor µ-calpainu. Celkem bylo popsáno 12 SNP, ale pouze 4 mají za následek změnu aminokyseliny (ČÍTEK, 2011). Gen CAPN1 se u skotu nachází na telomerickém konci 29. chromosomu (SMITH a kol., 2000). Gen se skládá z 22 exonů a 21 intronů. V tomto genu, bylo identifikováno 38 bodových mutací. (PAGE a kol., 2002). 3.13.2 Gen CAST Calpastatin patří do Calpain systému, ve kterém působí jako inhibitor funkce µcalpainu a m-calpainu, proto můţeme předpokládat jeho vliv na postmortální proteolýzu. Se sníţením křehkosti masa byla spojena zvýšená postmortální aktivita calpastatinu.

33

U hovězího masa je poměr calpastatin:calpain ve svalech 4:1tento poměr se shoduje s rychlostí proteolýzy. Je zde doloţena inhibice calpainu calpastatinem (GOLL a kol., 2003). Calpastatin se vyskytuje na 7 chromozomu a je tvořen 35 exony. V sekvenci tohoto genu je lokalizováno mnoho bodových mutací (SCHENKEL a kol., 2006). Polymorfizmus genu CAST významně ovlivňuje proces zrání masa a jeho křehkost (KAPLANOVÁ, 2009).

34

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Izolace DNA ze svalové tkáně Vzorek svalové tkáně byl odebrán při pořáţce zvířat. DNA byla izolována pomocí JETQUICK Tissue DNA Spin Kit (Genomed) dle protokolu výrobce a získaná genomická DNA byla uchována při -20°C aţ do následného pouţití pro testování markerů kvality masa. Testovala jsem marker TG5 (v genu pro thyrogobulin) na pozici 422, kde dochází k záměně cytosinu za thymin (C422T). Casas a kol. (2007) uvádí, ţe toto SNP má průkazný vliv na ukládání intramuskulárního tuku a zvířata nesoucí genotyp TT mají vyšší marbling skóre, tedy vyšší procento intramuskulárního tuku v mase, neţ zvířata s genotypem CT a CC. Na analýzu markeru TG5 bylo pouţito 10 vzorků skotu ( kříţenci masných plemen s českým strakatým skotem).

4.2 PCR Sekvence a označení primerů: TG5U2 5‘ GGGGATGACTACGAGTATGACTG 3‘ TG5D1 5‘ GTGAAAATCTTGTGGAGGCTGTA 3‘ Tab. 1 – Sloţení amplifikační směsi Koncentrace v reakční Komponenta

Množství v reakční směsi

směsi

Combi PPP Master Mix

7,5 µl

1x

Primer TG5U2

0,6 µl

0,4 µM

Primer TG5D1

0,6 µl

0,4 µM

PCR dH2O

5,7 µl

-

DNA

0,6 µl

50 mg

Celkový objem

15 µl

35

Teplotní profil amplifikace: 94 °C/5min., 30x (94°C/30s, 60°C/30s, 72°C/30s), 72°C/7min., 4°C. Vizualizace PCR produktu o velikosti 548 bp. Vizualizaci jsme prováděli na 3% agarózovém gelu pomocí ethidium bromidu po elektroforéze, na gel bylo nanášeno 5 µl vzorku.

4.3 RFLP Tab. 2 – Sloţení restrikční směsi Komponenta

Množství restrikční směsi

Buffer (NEBuffer 2)

1,5 µl

BstYI

0,4 µl

H2O

3,1 µl

PCR produkt

10 µl

Celkový objem

15 µl

Podmínky restrikce: V případě pouţití restrikčního enzymu BstYI je nutná inkubace při 60°C, 16 h.

36

5 VÝSLEDKY 5.1 Vyhodnocení výsledků: Vizualizace štěpených PCR produktů se provádí na 3% agarózovém gelu pomocí ethidium bromidu po elektroforéze, na gel se nanáší 15 µl vzorku. Obr. 11 – Ověření přítomnosti a kvality PCR produktu po amplifikaci

Velikost fragmentů po restrikci: Podle velikosti těchto fragmentů jsme určili, jaké genotypy jednotlivé vzorky měly. Alela C = 75, 178, 295 bp Alela T = 75 a 473 bp Abychom určili délku fragmentů, vyuţíváme marker 50 (TG5). V laboratoři jsem určila genotypy jedinců. K dispozici jsem měla deset vzorků DNA skotu. Po restrikci vzorků, která probíhala celou noc, jsem pomocí velikosti fragmentů u alely C (75, 178, 295 bp) a alely T (75, 473 bp) určila genotypy následovně 1) CT

5) CC

9) CT

2) CC

6) CT

10) TT

3) CC

7) CC

4) TT

8) CC

Studie Barendse (1999) prokázaly, ţe hladina thyroidních hormonů ovlivňuje intenzitu metabolismu a působí na vývoj tukových buněk. Alela T má vliv na vyšší marbling skóre neţ alela C.

37

Obr. 12 – PCR - RFLP

38

6 ZÁVĚR Maso, které slouţí k lidské spotřebě, vykazuje různé senzorické vlastnosti, které jsou ovlivněny pohlavím, plemenem, výţivou jedince, způsobem chovu, ale také posmrtnými zásahy, které se na mase provádějí. Mramorování masa je významný ukazatel celkové kvality masa, které se dá ovlivnit různými způsoby. Vědci neustále přicházejí s novými studiemi. Co se týká plemenné příslušnosti, intramuskulární tuk lépe zakládají plemena masná neţ mléčná. Nejlepší mramorování je u plemene Wagyu. Do této práce jsem zařadila dva geny DGAT1 a TG, které výrazně ovlivňují ukládání intramuskulárního tuku. Křehkost masa je těţce hodnotitelná vlastnost, protoţe kaţdý spotřebitel má jiné poţadavky na tuhost nebo naopak křehkost masa. Vlivů, které působí na křehkost je celá řada. Mezi ty nejdůleţitější patří věk, se stoupajícím věkem se křehkost sniţuje a maso je méně šťavnaté. Studie prokázaly, ţe mezi další faktory, které negativně ovlivňují křehkost masa, je venkovní ustájení zvířat. Toto ustájení sniţuje i celkovou přijatelnost masa pro zákazníka. V mé práci se zabývám opět dvěma geny pro křehkost CAPN1 a CAST. Díky zvyšujícím se poţadavkům spotřebitelů na kvalitu masa se zřejmě bude pokračovat ve studii kandidátních genů, které řídí vlastnosti kvality masa. Lze předpokládat, ţe dojde k většímu začlenění genetických markerů do šlechtitelských programů. V rámci bakalářské práce bylo zpracováno 10 vzorků genomické DNA skotu, u nichţ byl stanovován genotyp pro SNP v genu thyroglobulin (marker TG5). Pro marker TG5 je ţádoucí alela T, která indikuje vyšší marbling, tedy obsah intramuskulárního tuku v hovězím mase. U těchto 10ti vzorků byly nalezeny všechny 3 moţné genotypy, tedy CT, TT i CC.

39

7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY BARENDSE, W.J. 2002. DNA markers for meat tenderness. Patent, Internacional Publication Number: WO02064820. World Internacional Property Organization.

CASAS, E., WHITE, S.N., SHACKELFORD, S.D., WHEELER, T.L., KOOHMARAIE, M., BENNETT, G.L., SMITH, T.P.L. 2007. Assessing the association of single nukleotide polymorphisms at the thyroglobulin gene with carcass trakte in beef cattle. Journal of Animal Science, vol. 85, no. 11, 2807-2814 s.

CASAS, E., a kol. 2007. Assesing the association of single nucleotide polymorhpisms at the thyroglobulin gene with carcass traits in beef cattle. Journal of Animal Science, 2007,

vol.

85.

2807

2814

s.

ISSN

1525-3163.

ČTK. 2011. Spotřeba drůbeţího vzrostla. Zemědělský týdeník. Mediaservis.s.r.o. Brno. Vol. 11. ISSN 1212-2246. ČÍTEK, J. 2010. Genetické markery pro kvalitu masa a mléka. Jihočeská univerzita, Zemědělská fakulta.České Budějovice. 29 s. ISBN 978-80-7394-254-0. ČSÚ. 2011. Drůbeţí maso na trhu. Zemědělský týdeník. Mediaservis s.r.o. Brno. Vol. 25.. ISSN 1212 – 2246.

DEKKERS, J.C.M. 2004. Commercial application of marker- and gene-assisted selection in livestock: Strategie and lessons. Journal of Animal Science, vol. 82, 313328 s. DVOŘÁK, J., VRTKOVÁ, I. 2001. Malá genetika prasat II, Brno: ES MZLU,. 91s. ISBN 80-7157-521-6 GAZDOVÁ, V. DVOŘÁK, J. 2006. Acta fytotechnica et zootechnica.

40

GOLL, D.E., THOMPSON V.F., LI, H., WEI, W., CONG, J. 2003. The Calpain System. Physiological Reviews, vol. 83, 731-801 s. HRUŠKA, R. 2010. Maso zvířat. Research center. Nebraska.USA. 68933-0166.

CHADIM, V. 2001. http://kureci-maso.ngsystem.cz/. KAPLANOVÁ,

K.

2009.

Biotechnologické

metody pro

inovace

hodnocení

zpracovatelské a spotřebitelské kvality hovězího masa jako potravinového zdroje ţivočišných proteinů. Výzkum v chovu skotu. Rapotín. Výzkumný ústav pro chov skotu. ISSN 0139-7265. KAVINA, J. 1996. Zboţíznalství potravinářského zboţí. 1.vyd. Praha : IQ 147. 261 s.

KOOHMARAIE, M. 1996.

Biochemical factors regulating the toughening and

tenderization processes of meat. Meat Science, vol. 43, 193-201 s. KNOLL, A., VYKOUKALOVÁ, Z. 2002. Molekulární genetika zvířat (Metody detekce polymorfizmů DNA genů). Mendlova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno. 100 s. ISBN 80-7157-616-6.

MARSCHALL, D.M. 1999.The genetics of meat quality. In Fries, R. and Ruvinsky, A. The Genetics of Cattle. Wallingford: CABI Publishing, 605–636 s. ISBN 0-85199258-7. MZE. 2010. Spotřeba masa ve světě. Zemědělský týdeník. Mediaservis s.r.o. Brno. Vol. 25.ISSN 1212-2246.

PAGE, B.T., CASAS, E., QUAAS, R.L., THALLMAN, R.M., WHEELER, T.L., SHACKELFORD, S.D., KOOHMARAIE, M., WHITE, S.N., BENNETT, G.L., KEELE, J.W., DIKEMAN, M.E., SMITH, T.P.L. 2004. Association of markers in the bovine CAPN1 gene with meat tenderness in large crossbred populations that sample influential industry sires. Journal of Animal Science, vol. 82, 3474-3481 s. 41

PIPEK, P.2002. Technologie masa. In KADLEC, P. a kol., Technologie potravin I. Praha: VŠCHT, 235-259 s. ISBN 80-7080-509-9.

SAIKI, R.K. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science., no. 239, s. 487-491.

SCHENKEL, F.S., MILLER, S.P., JIANG, Z., MANDELL, I.B., YE, X., LI, H., WILTON, W. 2006. Association of a single nucleotide polymorphism in the calpastatin gene with carcass and meat quality traits of beef cattle. Journal of Animal Science, vol. 84, 291-299 s. SIMEONOVOVÁ, J. INGR, I. GAJDŮŠEK, S. 2003. Zpracování a zboţíznalství ţivočišných produktů. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. Brno. 124 s. ISBN 80-7157-708-1.

SMITH, T.P., CASAS, E., REXROAD, C.E., KAPPES, S.M., KEELE, J.W. 2000. Bovine CAPN1 maps to a region of BTA29 containing a quantitative trait locus for meat tenderness. Journal of Animal Science, vol. 78, 2589-2594 s. SORENSEN, B., KÜHN, C., TEUSCHER, F., SCHNEIDER, F., WESELAKE, R., WEGNER, J. 2006. Diacylglycerol acyltransferase (DGAT) activity in relation to muscle fat content and DGTA1 genotype in two different breeds of Bos Taurus. Archiv Fur Tierzucht – Archives of Animal Breeding, vol. 49, 351-356 s.

STEINHAUSER, L., a kol. 2000. Produkce masa. Last, Praha. 464 s. ISBN 80-9002607-9. TASR. 2010. Zemědělský týdeník. Mediaservis s.r.o. Brno. vol. 19. ISSN 1212-2246. THALLER, G., KÜHN, C., WINTER, A., EWALD, G., BELLMANN, O., WEGNER, J., ZÜHLKE, J., FRIES, R. 2003. DGAT1, a new positional and functional candidate gene for intramuscular fat deposition in cattle. Animal Genetics, 354-357 s. 42

URBAN, T.2008. Virtuální svět genetiky 3 – genetika populací a kvantitativních znaků [online]. Verze 1.1 Brno: MZLU. Dostupné na WWW: http://old.mendelu.cz/~agro/af/genetika/vsg3/index.html. URBAN, Tomáš, a kol. 2001. Genetika : Návody do cvičení. 1. vyd. Brno : Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. 108 s. ISBN 80-7157-497-X. VELEBA, J. 2010. Dioxiny na pořadu dne. 17-18 s. Podohospodárská škola. Vol. 5. WINTER, A., KRÄMER, W., WERNER, F.A.O., KOLLERS, S., KATA, S., DURSTEWITZ, G., BUITKAMP, J., WOMACK, J.E., THALLER, G., FRIES, G. 2002. Association of a lysine-232/alanine polymorphism in a bovine gene encoding acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase (DGAT1) with variation at a quantitative trait locus for milk fat content. PNAS, vol. 99, 9305 s. ZAHRÁDKOVÁ, R. a kol. 2009. Masná uţitkovost. 231-257 s. Masný skot od A do Z. Český svaz chovatelů masného skotu, Praha. ISBN 978-80-254-4229-6. 397 s.

43

8 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK CAPN1

micromolar kalcium-activated neutral protease 1

CAST

calpastatin

DGAT1

dyacilglycerol O-acyltranferase 1

TG

thyroglobulin

IMT

intramuskulární tuk

MAS

marker asisted selection, selekce za pomoci markerů

PCR-RFLP

polymerase

chain

reaction

-

restriction

fragment

length

polymorphism, polymérázová řetězová reakce - polymorfismus délky restrikčních fragmentů SNP

single-nucleotide polymorphism, jednonukleotidová mutace

44

9 SEZNAM POUŽITÝCH OBRÁZKŮ A TABULEK Obr. 1 – Hovězí maso http://www.mebio.cz/clanky/biohovezi-zdrave-maso-chuti/ Obr. 2 - Telecí maso-kýta http://www.ssss.cz/files/kpucebnice/p/pv/1/maso/telecimaso.htm Obr. 3 – Vepřové maso http://recepty.centrum.cz. Obr. 4 - Skopové maso http://www.sciencedaily.com/releases/2009/05/090527175333.htm Obr. 5 – Kuřecí maso http://recipe4you.blogspot.com/2010/12/eliminate-stench-on-mutton-or-lamb.html Obr. 6 – Koňské maso http://tuesdayshorse.wordpress.com/2010/02/25/killer-buyer-whines-about-decline-inhorse meat-industry/ Obr. 7 – Rybí maso http://www.az-recepty.cz/maso/ryby/ Obr. 8 – Princip PCR http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.htm l Obr. 9 – Stupně mramorování hovězího masa http://openwaterchicago.com/2009/01/07/human-marbling/ Obr. 10 – Vyšší mramorovaní hovězího masa http://forum.nationstates.net/viewtopic.php?f=6&t=23593 Obr. 11 – Ověření přítomnosti a kvality PCR produktu po amplifikaci Obr. 12 – PCR – RFLP Tab. 1 – Sloţení amplifikační směsi Tab. 2 – Sloţení restrikční směsi

45