GENETICKÁ TRANSFORMACE OBILOVIN Pokročilé biochemické a biotechnologické metody 2.11.2015
K. Holubová
ÚVOD Kukuřice – pšenice – rýže - ječmen Obiloviny: potrava, krmivo, průmyslní výroba Klimatické změny: poptávka po odolnějších odrůdách Klasické šlechtění: časová náročnost Genové inženýrství: rychlejší, efektivnější Cíl: vnesení požadovaní genetické informace (DNA) do genomu rostliny • První genetické transformace: 80 léta 20. století • Agrobacterium tumefaciens: dvouděložní rostliny, pro obiloviny dlouhou dobu nevyužitelný • Vývoj alternativních – přímých metod transformace (DGT) • • • • • •
ÚVOD • Faktory ovlivňující úspěšnost transformaci: • A) dostupnost vysoce účinné a reprodukovatelné metody přenosu genu (přímé, nepřímé) • B) volba cílového explantátu, který bude lehce regenerovat (listy, embrya, protoplasty, atd.) • C) dostupnost metody regenerace pro danu rostlinu a kultivar • D) vhodná screeningová metoda pro selekci transgenních rostlin
ÚVOD • Další důležité faktory při transformaci: promotor (řídi expresi genu), terminátor (ukončuje transkripci), selekční gen • Konstitutivní promotory: exprese konstantní ve všech pletivech a po celou dobu života rostliny Vírové promotory: CaMV 35S (35S RNA vír květákové mozaiky, slabší exprese u obiloví); CmYLCV (vír žluté kudrnatosti listů cestrum aurantiacum) a RTBV (pararetrovirus rýže) Rostlinné promotory: Ubi (kukuřiční ubiquitinový promotor s prvním intronem), Act1 (aktinový promotor s prvním intronem z rýže), Ubi4 a Ubi9 (ubiquitinové promotory z cukrové třtin), atd.
ÚVOD • Pletivově-specifické promotory: exprese specifická v určitém orgáne anebo pletivu v závislosti na funkci daného genu Zrnově-specifické promotory: AsGlo (ovesný globulinový, v endospermu a aleur. vrstvě, Hor1-Hor3 (hordeinové promotory z ječmene), GLUB-1 (gluteninový, rýže), β-AMY (amylasa z ječmene) Kořenově-specifické promotory: NAS1 (nikotinaminsyntasa z ječmene), IDS (dioxygenasa z ječmene), PHT (fosfátový transportér z ječmene) Listově-specifické promotory: BTH7 (thionin, ječmen)
ÚVOD • Inducibilné promotory: exprese genu se zapíná a vypíná v závislosti na podnětu Chemicky-inducibilné promotory: glukokortikoidy, estradiol, etanol Abiotický/biotický stres-inducibilné promotory: chlad, tepelný šok, vodný stres, atd. • Terminátor: NOS (nopalinsyntasa z A.tumefaciens), CaMV 35S (35S RNA vír květakové mozaiky), atd. • Testování promotorů a exprese: reportérové gény
REPORTÉROVÉ GENY • Produkty netoxické • Snadná a levná detekce, ideálně in vivo • Nízká, příp. žádná endogenní exprese v transformovaných rostlinách •
ß-glukuronidáza (GUS) Nejčastěji používaný reportérovy gen v rostlinných transformačních vektorech Štěpí substrát na barevný anebo fluoreskující podukt Snadná detekce v živých i neživých rostlinách, vysoká citlivost Kvantitativní (míra exprese) a kvalitativní analýzy (lokalizace exprese) Minimální exprese v rostlinách Detekce histochemicky, spektrofotometricky nebo pomocí fluorogenního substrátu
REPORTÉROVÉ GENY • Fluorescenční proteiny Geneticky upravený zelený fluorescenční protein (GFP) z medúzy Odvozené žlté a modré fluorescenční proteiny Z korálu Discosoma – červený fluorescenční protein DsRed Není nutný substrát (kyslík a modré světlo) Detekce: zařízení pro detekci zeleného světla, fluorescenční anebo konfokální mikroskop Možnost detekce genové exprese, lokalizace proteinů a studium proteinových in vivo Kvantifikace fluorescence pomocí spektrofluorimetru na základě fluorescence čistého fluorescenčního proteinu.
REPORTÉROVÉ GENY • Luciferáza (LUC) Enzymy podílející se na bioluminiscenci Pro transformaci rostlin: geneticky upravená luciferáza světlušky (LUC, produkuje jasnější světlo než přirozená forma enzymu), luciferázy korálu Renilla (rLUC), bakteriální luciferázy (LUXA a LUXB z Vibrio harvei) Detekce v buněčných extraktech (luminometr, scintilační detektor) anebo in planta (speciální a nákladné zařízení s CCD systémem zobrazování) Menší využití vzhledem k nákladnosti Sledování dynamických změn genové exprese, studium proteinových interakcí a tranzientní exprese jako součást duálního reportérového systému spolu s GUS Výhoda: oproti fluorescenčním proteinům nízké pozadí (nespecifická bioluminiscence) v rostlinách.
REPORTÉROVÉ GENY • Akumulace antokyaninu Ve vodě rozpustné flavonoidní pigmenty, které se mohou ve velkém množství akumulovat ve vakuole buňky Vizuální detekce (bez nutnosti substrátu) - sledování tranzientní exprese Nutná přítomnost dvou skupin transkripčních faktorů - MYB a bHLH Detekce antokyaninů - v rostlinách, u kterých byla narušena přirozená dráha syntézy těchto pigmentů (nejsou pro rostlinu esenciální) Výhoda metody: přímé počítání individuálních pozitivních buněk
SELEKCE TRANSGENNÍCH ROSTLIN OBILOVINA Pšenice
Ječmen
Oves
SELEKČNÍ MARKER
SELEKČNÍ LÁTKA
bar (phosphinothricinacetyltransferasa) hptII (hygromycinphosphotransferasa) cah (cayanamidhydratasa) nptII (neomycin phosphotransferasa) manA (phosphomannosaisomerasa) CP4 epsps (5-enolpyruvylshikimát-3-fosfatsynthasa) codA (cytosindeaminasa) pat (phosphinothricinacetyltransferasa) bar hpt manA nptII nptII bar
L-fosfinotricin; Bialaphos; Basta (herbicidy) Hygromycin B (ATB) Cyanamid Geneticin (aminoglykosidové ATB) Manosa (alternativní zdroj uhlíku) Glyfosát (herbicid) 5-fluorocytosin L-fosfinotricin; Bialaphos; Basta (herbicidy)
hpt
Přímé metody transformace (DGT) • Cílový explantát: protoplasty odvozené z různých pletiv, mikrospory • Transformace pomocí polyethylenglykolu Destabilizace plazmatické membrány protoplastů v přítomnosti Ca2+ umožní proniknutí požadované DNA do buňky Nutná izolace protoplastů, problematická regenerace rostlin Tranzietní exprese: lokalizace proteinů, testování promotorů Elektroporace Transformace rostlinných buněk a protoplastů Elektrický impuls o vysokém napětí – póry v cytoplazmatické membráně Množství DNA, které se dostane touto metodou do buněk je malé – nízký počet integrací požadované DNA Účinnost elektroporace je srovnatelná s biolistickou transformací •
Přímé metody transformace (DGT) • Silikon karbidová vlákna K suspenzi obsahující rostlinný materiál a DNA se přidají silikon-karbidová vlákna, která pronikají buněčnou stěnou a umožní vstup DNA do buňky Nevýhoda: nízká efektivita transformace a poškození buněk, které negativně ovlivní jejich regenerační schopnost • Mikroinjekce zavedení DNA do jádra nebo cytoplazmy prostřednictvím skleněné mikrokapilární injekční pipety za užití mikromanipulátoru Využití zejména pro živočišné buňky, jelikož rostlinné buňky obsahují buněční stěnu, která tvoří bariéru pro mikroinjekci Mikroinjekce protoplastů po odstranění vakuol snižuje schopnost regenerace.
Biolistická transformace • Vnesení požadované DNA do buněk, ze kterých je možné nejsnáze regenerovat celou rostlinu (kalusové kultury nebo embryonální tkáň skutela) • Uplatnění pro transformaci obilovin • Studium tranzietní exprese různých genových konstruktů • Testování promotorů • Nižší nároky na vektor, explantát a genotyp rostliny • Nevýhody: nižší efektivita transformaci ve srovnání s A. tumefaciens, nestabilita exprese genů, vyšší počet integrací může vést k umlčení exprese, ztráta transgenů v potomstvu
Biolistická transformace • První transgenní rostlina kukuřice v roku 1989 - významný krok na poli gen. modifikace obilovin • Poprvé připraven transgenní ječmen a pšenice (Obr.1)
Obr. 1 Chronologické řazení transformací hlavních obilovin pomocí biolistických metod a A. tumefaciens
Biolistická transformace •
• •
•
Biolistické metody jsou založeny na urychlení kovových částic (nejčastěji zlatých) o průměru kolem 1 µm obalených požadovanou DNA pro přímé vnesení do rostlinných buněk Genové dělo PDS 1000/He od firmy BioRad, genová pistole Evakuace přístroje a puštění helia (1 100 psi) → praskne “rupture” disk → náraz plynu do makronosiče s kovovými čás cemi s navázanou DNA → vystřelení čás c, které vniknou do pletiva embrya. Transformační účinnost do 10 %
Biolistická transformace • Ideální explantát pro transformaci - nezralá embrya nebo skutelum (největší schopnost regenerace) – pěstování donorové rostliny až do fáze vývoje nezralých semen • Regenerace rostliny na čtyřech odlišných médiích: kalus-indukční médium (dediferenciace buněk působením auxinu dicamby) kalus-indukční médium s manitolem (osmotické působení manitolu) tranzitní médium (indukce diferenciace vlivem auxinu 2,4-D a cytokininu BAP) regenerační médium bez hormonů. A
B
Obr. 2 Nezralé zrno pšenice (A), vyizolovaná skutela (B)
Biolistická transformace • 8 hod před a 16 hod po bombardování kultivace na médiu s manitolem při 25°C ve tmě • 6 týdnů kultivace na kalus-indukujícím médiu se selekčním tlakem (25°C, tma) • 2 týdny kultivace na tranzitním médiu v polotme – začína růst listů (Obr. 3A) • 2-4 týdní regenerace při plném svetle na médiu bez hormonů (Obr. 3B) • Přesazení rostlin do hlíny A
B B
Obr. 3 Diferenciace buněk na povrchu kalusu (A), zregenerovaná rostlina (B)
Transformace pomocí A. tumefaciens • Agrobacterium tumefaciens: tumor u rostlin • Schopnost vnést cizorodou DNA do genomu hostitele • Hostitelská tkáň: exprese genů, kódujících auxiny, cytokininy, a enzymy řídící syntézu derivátu aminokyselina cukrů – vznik tumoru • Ti plazmid, T-DNA – využití v gen. inženýrství po odstranění genů, způsobujících tumor • První pokusy – přímá transformace Ti plazmidu do rostlinných buněk • První transgenní rostliny (dvouděložné) připravené v r. 1984 • První jednoděložní rostlina – chřest • 1993 – transg. rýže, 1998 – transg. kukuřice B • V posledních 10 letech úspěšné vyvinuté protokoly pro transformaci obilovín (rýže Japonica, Indica a Javanica, jarní a zimní odrůdy pšenice a ječmene, hybridní kukuřice, čiroku, žita a několika pícnin a travin)
Agrobacterium tumefaciens Rostlinná buňka Regenerace rostlin
Pomocný plazmid
Binární plazmid
T- DNA Vnášený gen
1.
Vnesení T-DNA s požadovaným genem do genomu rostlinných buněk
2.
T-DNA integrovaná vT-DNA rostlinném chromozomu
Rostlina se změněnou genetickou informací
Transformace pomocí A. tumefaciens • Kmene: AGL1 nebo AGL0, případně LBA 4404 • Cílový explantát: nezralé embryo, mikrospory • Značné množství binárních plazmidových konstruktů pro transformaci obilovin, např. vektory série pBract • Výhody: vysoká transformační účinnost (až 30 %), nízký počet integraci transgenu, stabilnější dědičnost, nízká míra umlčení transgenu • Produkce velkého množství nezávislých transgenních linií schopných reprodukce • Studium funkce genů v obilovinách B
Transformace pomocí A. tumefaciens • PROVEDENÍ: • 1. Klonování genu Vnesení požadovaného genu do jednoduché plazmidové DNA podporujicí nejlépe tzv. Gateway technologii klonování Rekombinace požadovaného genu do cílového - binárního vektoru (dvojí selekce) Často používané cílové binární vektory odvozené od vektoru pGreen (malé, snadná manipulace v E. coli) Transformace binárního vektoru s požadovaným genem do A.tumefaciens B (AGL1) spolu s vektorem pSoup pomocí elektroporace.
Transformace pomocí A. tumefaciens pSa-ORI npt1
LB
colEI ori RB
35S-Hyg-nos
Stu I (7154) SacI (6752)
pBrac t2 14
nosterm 3' Reverse primer
SacI (2315)
9165 bp
nos terminator attR2
XhoI (2653)
ccdb
HindIII (2674)
Sma I (6004) XmaI (6002)
XhoI (3383)
Cm(R)
Ubi promoter attR1
ApaI (3742)
pAH Ubi promD primer forward
Vstupní vektor
Rekombinace
Cílový vektor
Transformace pomocí A. tumefaciens • •
PROVEDENÍ: 2. Transformace ječmene Sterilizace zrn ječmene hypochloridem. Izolace nezralých embryí (velikost embrya 1.5-2 mm) a oddělení osy embrya pod stereoskopem ve sterilních podmínkách laminárního boxu. Umístění embryí na kalus-indukční médium (CIM) -dediferenciace buněk a růst kalusů (Dicamba) Kultivační média: tří základní složky a stužovací látka (phytagel) na báze agaru: esenciální prvky nebo minerální ionty (makroelementy, mikroelementy a zdroj B železa ) organické látky (vitamíny a aminokyseliny) zdroj vázaného uhlíku - pletivo kalusu nefotosyntetizuje - zdroj uhlíku 3% maltosa.
Transformace pomocí A. tumefaciens
epicotyl
radicle
Zrno ječmene
Transformace pomocí A. tumefaciens • •
PROVEDENÍ: 3. Inokulace Do 24 hod po izolaci Nutná přítomnost fenolických látek (acetosyringone) – spouštění virulace Ko-kultivace v přítomností A.tumefaciens – 3 dni
B
Transformace pomocí A. tumefaciens • PROVEDENÍ: • 3. Selekce transgenních buněk Kalus-indukující medium obsahující selekční prvek (fosfinotricin,hygromycín 100 % selekce) a antibiotikum timentin (zabíjí agrobakterium) 6 týdnů ve tmě, pasáž po dvou týdnech Tvorba kalusů – beztvárná masa volně uspořádaných parenchymatických buněk
B
Transformace pomocí A. tumefaciens • PROVEDENÍ: • 4. Regenerace rostlin 2 týdny na tranzitním médiu – diferenciace buněk (BAP, 2,4-dichlorofenoxyoctová kyselina), slabé světlo, růst prýtu 2-4 týdny: regenerační médium bez hormonu, plné osvětlení, vývoj kořenů a listů Transgenní rostliny přenesené zpět na kalus-indukující medium bez hormonu – růst a vývoj rostliny, kořenů Přenos rostlin do rašelinových disků (2 Btýdny) a přesazení do hlíny
Transformace pomocí A. tumefaciens Izolace a ko-kultivace Osvětlení:
Selekce
-
-
Izolované skutelum nezralých embryí na kalus-indukujícím Ko-kultivace s A. tumefaciens, přesun na kalus-indukujícím médiu médiu s antibiotikem
Tranzitní médium 50 μmol/m 2 /s
6-ti týdenní selekce transformovaných embryí/ kalusů na antibiotiku
Regenerace 500 μmol/m 2 /s
Regenerace rostlin na médiu bez hormonů
2-týdenní kultivace na tranzitním médiu s rostlinnými hormony
Transformace pomocí A. tumefaciens
Přesun rostlin s 2-3 cm listy
Zregenerované rostliny s listy a kořeny
Přesazení do disků se zeminou
Kultivace jednotlivých rostlin na základním médiu bez hormonů
Přesazení do květináčů se zeminou
Pěstování rostlin v hlíně ve skleníku
Příklady využití transgenních obilovin • Molekulární farmaření, produkce farmaceuticky účinných látek (antimikrobiální peptidy) • Obohacení esenciálních aminokyselin v zrnech rostlin (kukuřice s vyšším obsahem lyzinu) • Transgenní rostliny s vyšší kvalitou škrobu v zrnech • Zlepšení sladovnické kvality ječmene • Zlepšení rezistenci rostlin vůči škůdcům: Bt kukuřice • Zlepšení tolerance vůči abiotickým stresům: kukuřice odolná vůči suchu (nadprodukce „cold shock“ proteinu B) • Zvýšení tolerance obilovin vůči herbicidům
