Functionele en fenotypische karakterisatie van plasmacytoïde dendritische cellen bij rokers en patiënten met Chronisch Obstructief Longlijden (COPD)

Functionele en fenotypische karakterisatie van plasmacytoïde dendritische cellen bij rokers en patiënten met Chronisch Obstructief Longlijden (COPD).

Sarah Van den Broeck

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promoter: Prof. Dr. G. Brusselle Begeleider: Dr. G. Vanpottelberge Vakgroep: Inwendige ziekten Academiejaar: 2008-2009

Functionele en fenotypische karakterisatie van plasmacytoïde dendritische cellen bij rokers en patiënten met Chronisch Obstructief Longlijden (COPD).

Sarah Van den Broeck

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promoter: Prof. Dr. G. Brusselle Begeleider: Dr. G. Vanpottelberge Vakgroep: Inwendige ziekten Academiejaar: 2008-2009

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopïeren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruikt valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef. "

Gent, 25 mei 2009

Van den Broeck Sarah

Prof. Dr. Guy Brusselle

Voorwoord. Na 5 jaar hard werken is het einde bijna in zicht. Enkel nog het uitvoeren van mijn thesis diende te gebeuren. Deze thesis zou niet tot stand gekomen zijn zonder de hulp van enkele mensen die ik zeer graag zou bedanken.

Mijn Ouders, Bedankt om me de kans te geven om te studeren, voor jullie onvoorwaardelijke steun en interesse in mijn thesis en natuurlijk voor alle aanmoedigingen de afgelopen 5 jaar.

Brecht, Yentl, Sofie, Jessie, Dorien, Steffen en Jolien, Bedankt voor alle onvergetelijke momenten van de voorbije 5 jaar. Bedankt om naar al mijn thesis verhalen te luisteren, ook al verstonden jullie er dikwijls niet veel van, en me steeds te blijven stimuleren.

Dr. Geert Vanpottelberge, Bedankt voor je uitstekende begeleiding, tijd en antwoorden op al mijn vragen. Bedankt voor alle uitdagingen die je me hebt gegeven en de voortdurende motivatie. Bedankt voor alle kennis die je me hebt bijgebracht en je blijvende steun doorheen het jaar.

Dr. Ken Bracke, Ann, Katleen, Annouk, Indra, Greet, Marie-Rose, Eliane, Philippe, Evelyn en Christelle, Bedankt om me wegwijs te maken op jullie labo, voor alle fijne momenten en alle hulp die ik van jullie heb gekregen. Bedankt voor alle motivatie.

Prof. Dr. G. Brusselle (Promotor) en Prof. Dr. G. Joos Bedankt om me de mogelijkheid te geven om dit onderzoek uit te voeren en voor het verbeteren en van mijn thesis.

Inhoudstafel. Samenvatting.

1

1. Inleiding.

2

1.1. Chronisch Obstructief Long Lijden.

2

1.1.1. Definitie.

2

1.1.2. Epidemiologie.

3

1.1.3. Pathologie.

4

1.1.3.1. Chronische obstructieve bronchiolitis.

4

1.1.3.2. Chronische bronchitis.

4

1.1.3.3. Emfyseem.

5

1.1.4. Pathogenese. 1.1.4.1. De aangeboren immuunrespons.

6 7

1.1.4.1.1. Epitheelcellen.

7

1.1.4.1.2. Eosinofielen.

8

1.1.4.1.3. Macrofagen.

8

1.1.4.1.4. Neutrofielen.

8

1.1.4.2. De adaptieve immuunrespons.

9

1.1.4.3. Rol van proteasen.

11

1.1.4.4. Chemokines in COPD.

11

1.1.4.5. Systemische inflammatie in COPD.

12

1.2. Dendritische Cellen.

13

1.2.1. Localisatie.

13

1.2.2. Oorsprong.

14

1.2.3. Activatie, maturatie en functie.

14

1.2.4. Subsets van DC’s.

15

1.2.5. DC’s in de long.

16

1.2.6. DC’s en pathologie.

18

2. Matherialen en methoden.

19

2.1. Algemene materialen.

19

2.2. Scoring van BDCA-2 op immunohistochemische coupes.

19

2.3. Bereiding van single cell suspensie van de long.

20

2.4. Labeling van single cell suspensie voor flowcytometrische analyse.

21

2.5. Bereiding van Cigarette Smoke Extract (CSE).

21

2.6. Isolatie van plasmacytoïde dendritische cellen uit bloed.

22

2.6.1. Principe.

22

2.6.2. Materialen.

22

2.6.3. Methode.

22

2.7. Viabiliteitsbepaling.

23

2.7.1. Principe.

23

2.7.2. Viabiliteitsbepaling zonder toevoeging van CSE.

23

2.7.3. Viabiliteitsbepalint met toevoeging van CSE.

24

2.8. Cultuur van pDC’s in aan- of afwezigheid van CSE.

24

2.9. Detectie van IFN-α in bewaard supernatans dmv Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay- ELISA.

25

2.9.1. Materialen.

25

2.9.2. Methode.

25

2.10. Detectie van inflammatoire cytokines in bewaard supernatans dmv Cytometric Bead Array.

26

2.10.1. Principe.

26

2.10.2. Materialen.

26

2.10.3. Methode.

26

2.10.3.1. Bereiding van de Human Inflammatory Cytokine Standaard.

26

2.10.3.2. Bereiding van de Mixed Human Inflammatory Cytokine

26

Capture Beads. 2.10.3.3. Uitvoering van Human inflammatory Cytokines Kit Assay Procedure. 3. Resultaten.

27 27

3.1. Aanwezigheid van pDC’s in de humane long.

27

3.2. Karakterisatie van chemokinereceptoren bij pDC’s in de humane long.

29

3.3. In vitro functionele evaluatie van pDC’s.

30

3.3.1. Zuiverheidsbepaling van Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit.

30

3.3.2. Viabiliteitsbepaling van pDC’s met en zonder toevoeging van CSE.

31

3.3.3. Expressie van costimulatoire moleculen (maturatiemerkers) na blootstelling aan verschillende concentraties CSE – gebruikte venster-methode.

32

3.3.4. CSE inhibeert expressie van costimulatoire moleculen van pDC na toediening van CpG.

34

3.3.5. Viabiliteit na toediening van CpG en CSE.

36

3.3.6. CSE inhibeert expressie van costimulatoire moleculen van pDC na toediening van imiquimod.

37

3.3.7. Viabiliteit na toediening van imiquimod en CSE.

39

3.3.8. Analyse van cytokine vrijsstelling door pDC’s na stimulatie

40

van TLR met imiquimod en CpG. 4. Discussie.

42

5. Referenties.

48

Samenvatting. COPD staat voor ‘Chronic Obstructive Pulmonary Disease’ en levert wereldwijd een grote bijdrage aan de chronische morbiditeit en mortaliteit. COPD mag aanzien worden als een toenemend globaal gezondheidsprobleem. Jaarlijks sterven er meer dan 2 500 000 mensen vroegtijdig aan COPD. COPD wordt omgeschreven als een te voorkomen en te behandelen ziekte gekarakteriseerd door beperking van de luchtstroom die niet volledig reversibel is. Deze beperking is zowel progressief als geassocieerd met een abnormale inflammatoire reactie van de longen op schadelijke partikels of gassen. De pathologie van COPD bevat chronische obstructieve bronchiolitis en emfyseem met destructie van het longparenchym en vergroting van de alveolaire ruimten. COPD wordt gekenmerkt door luchtstroombeperking veroorzaakt door luchtwegobstructie en emfyseem. De aangeboren en adaptieve inflammatoire en immuunresponsen verzorgen de verdediging tegen geïnhaleerde toxines en dragen zowel locaal als systemisch bij tot de pathogenese van COPD. Dendritische cellen (DC) zijn antigenpresenterende cellen (APC) en vormen een essentiële link tussen het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. DC’s zijn in staat de immuunrespons te activeren. Er bestaan 2 subsets van DC’s, namelijk plasmacytoïde DC’s en myeloïde DC’s. In deze studie gaan we onderzoeken welke rol pDC’s spelen in de pathogenese van COPD. Hiervoor voeren we functionele en fenotypische studies uit bij rokers, niet-rokers, nooit-rokers en patiënten met COPD. We maken gebruik van immunohistochemische kleuringen, flowcytometrische analyses, ELISA en CBA. Als conclusie kunnen we stellen dat pDC’s aanwezig zijn in de adventitia en lamina propria van de kleine luchtweg van de humane long en in associatie met lymfoïde aggregaten. CXCR3 en CXCR4 staan in voor de influx van pDC’s in de long. Er zijn geen verschillen tussen het aantal pDCs in de kleine luchtweg van COPD patiënten, rokers zonder COPD en niet-rokers. Sigarettenrook vermindert de maturatie van pDC’s na blootstelling aan virale stimulantia, waardoor er een verminderde activatie is van het adaptieve immuunsysteem. Sigarettenrook beïnvloedt eveneens de vrijstelling van (inflammatoire) cytokines door pDC’s na virale stimulatie. Sigarettenrook stimuleert de productie van interferon alfa en IL-8 door mature pDCs, maar veroorzaakt geen wijziging in de cytokines die de adaptieve immuniteit sturen. 1

1. Inleiding. 1.1.

Chronisch Obstructief Long Lijden – COPD.

COPD staat voor ‘Chronic Obstructive Pulmonary Disease’ (Chronisch Obstructief Long Lijden) en levert wereldwijd een grote bijdrage aan de chronische morbiditeit en mortaliteit [1,2,3]. COPD mag aanzien worden als een toenemend globaal gezondheidsprobleem: het reduceert de kwaliteit van het leven, is verantwoordelijk voor het stijgend contact met gezondheidswerkers, frequentere hospitalisering en toegenomen risico op vroegtijdige dood [3]. Jaarlijks sterven er meer dan 2 500 000 mensen vroegtijdig aan COPD [2].

1.1.1. Definitie.

COPD wordt omgeschreven als een te voorkomen en te behandelen ziekte gekarakteriseerd door beperking van de luchtstroom die niet volledig reversibel is. Deze beperking is zowel progressief als geassocieerd met een abnormale inflammatoire reactie van de longen op schadelijke partikels of gassen [2,3,5,6]. Deze definitie werd opgesteld in 2001 door ‘the Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease’ (GOLD) [2]. De graad van luchtstroombeperking wordt weergegeven door de maximale hoeveelheid lucht die in 1 seconde geforceerd kan uitgeademd worden (FEV1 – Forced expiratory value) in verhouding met de capaciteit die geforceerd kan uitgeademd worden wanneer er geen limiet van toepassing is (FVC – Forced Vital Capacity) [7]. De onderverdeling van GOLDstadia gebeurt op basis van de FEV1 (Tabel 1) [2,7]. Tabel 1. GOLD-stadia. FEV1/ FVC

FEV1

COPD

> 70% < 70 % < 70 % < 70 % < 70 %

Absent > 80 % Mild 50% - 80% Moderate 50% - 30% Severe < 30% Very severe

GOLD-stadia

GOLD-1 GOLD-2 GOLD-3 GOLD-4

Op basis van FEV1/FVC wordt COPD verdeeld in 4 stadia.

Het Fletcher-Peto diagram geeft het natuurlijke verloop en de veranderingen over de tijd weer van FEV1 in niet-rokers en rokers [2]. Bij niet-rokers daalt deze waarde naarmate de leeftijd 2

toeneemt. De longfunctie, die gedefinieerd wordt door FEV1 vertoond een versnelde achteruitgang bij rokers die vatbaar zijn voor het ontwikkelen van COPD. Stoppen met roken doet op elk ogenblik de graad van afname van FEV1 terugkeren naar het niveau van de nietroker. De graad van daling is consistent met de GOLD-stadia [8]. De horizontale lijnen zijn de grenzen van de verschillende GOLD-stadia.

Figuur 1: Het Fletcher-Peto diagram.

1.1.2. Epidemiologie. COPD speelt een grote rol in de globale mortaliteit en morbiditeit, deze zal blijven stijgen naarmate de wereldpopulatie veroudert. De wereldwijde prevalentie bedraagt 0.9% bij mannen en 0.7% bij vrouwen. De globale prevalentie bij volwassenen ouder dan 40 jaar wordt geschat op 9-10% [9]. In 1990 stond COPD op de 6e plaats in ‘Global Burden of Disease’. In 2002 stond COPD reeds op de 5e plaats. Er wordt verwacht dat COPD zal stijgen tot de 4e grootste doodsoorzaak ter wereld tussen 1990 en 2030 [2,10]. Jaarlijks sterven er meer dan 2 500 000 mensen aan COPD [2]. De prevalentie wordt zwaar onderschat, aangezien COPD pas herkend wordt wanneer er sprake is van klinische verschijnselen. Omwille van de hoge prevalentie vertegenwoordigd COPD een groot deel van de economische en sociale lasten. De economische lasten van COPD worden net als de prevalentie hoogstwaarschijnlijk onderschat, gezien er geen rekening wordt gehouden met de economische waarde van de hulpverlening van familieleden van patiënten. Langdurige thuisverzorging van patiënten heeft een effect op de professionele carrière van zowel de patiënten als andere familieleden [1,2]. De incidentieratio (IR) van COPD bedraagt 9,2/1000 persoonsjaren. De IR van COPD is hoger bij mannen dan bij vrouwen en hoger in rokers dan bij niet-rokers [11]. 3

1.1.3. Pathologie.

De pathologie van COPD bevat chronische obstructieve bronchiolitis en emfyseem met destructie van het longparenchym en vergroting van de alveolaire ruimten (Figuur 2-3, Addendum I) [5-8,16]. 1.1.3.1.

Chronische obstructieve bronchiolitis.

Bronchiolitis wordt omschreven als inflammatie en obstructie van de kleine luchtwegen [8,13,14]. In 1968 werd voor het eerst gedemonstreerd dat bij rokers met toegenomen luchtwegobstructie, de perifere luchtwegen, met name de bronchioli kleiner dan 2mm, de belangrijkste sites waren van toegenomen weerstand. Deze dragen weinig bij aan de totale luchtwegresistentie. Er kan hier schade optreden zonder bijdrage aan vermindering van de luchtdoorstroming. Hierdoor kan er reeds lang sprake zijn van bronchiolitis zonder dat er zich enige symptomen voordoen zoals significante reductie in respiratoire mogelijkheden [6]. De componenten van bronchiolitis bestaan uit globletcelhyperplasie met mucushypersecretie, oedeemontwikkeling door inflammatie, gladdespiercelhyperplasie en fibrose. Eén van de effecten is een daling van de bronchiolaire antiproteasen wat leidt tot een proteolytische digestie en ontwikkeling van emfyseem [9,15]. Emfyseem draagt bij tot de airflowlimitation maar is zelf geen onderdeel van bronchiolitis. Bronchiolitis draagt op zijn beurt bij tot de vernauwing en verstopping van het lumen en draagt hierdoor actief bij aan de verstopping van de luchtwegen. De obstructie wordt veroorzaakt door accumulatie van mucus of van inflammatoire excudaten [8,13,14]. In emfyseem is er vooral sprake van afzetting van bindweefsel in de adventitia van de luchtwegen. Deze verdikking van de wand draagt bij aan de vernauwing van het lumen [7,8]. De inflammatoire processen die voorkomen in de adventitia dragen ook bij tot de destructie van de alveolaire septa. Hoewel er een correlatie is tussen de daling in het aantal septa en obstructie van de kleine luchtwegen, is dit verlies aan alveolaire ondersteuning een minder belangrijke oorzaak van obstructie dan de pathologie van de luchtwegwand en het lumen [6,7].

1.1.3.2.

Chronische bronchitis.

Chronische bronchitis wordt klinisch gedefinieerd als hoest en sputumproductie gedurende tenminste 3 maand per jaar in 2 opeenvolgende jaren. In chronische bronchitis is 4

de inflammatie vooral gelokaliseerd in het epitheel van de centrale luchtwegen (> 4mm) en de mucus producerende klieren. Bij deze laatste komt de inflammatie voor in de ducti. Geassocieerd aan deze inflammatie is de toename van mucusproductie, verminderde mucociliaire klaring en verstoring van de epitheliale barrière voorzien door de aangeboren immuunrespons. Deze schade wordt veroorzaakt door infiltratie van cellen van zowel de aangeboren als de adaptieve immuunrespons op toxische partikels en gassen in sigarettenrook (CS) [6-9,15]. Chronische bronchitis is ook geassocieerd met verdikking van de bronchiale luchtwegen, wat gerelateerd is aan een toename van afzettingen van bindweefsel (collageen) [8] en vergroting van bronchiale gladde spiercellen [15]. Het is belangrijk om weten dat de lage luchtwegen in gezonde omstandigheden bacterievrij zijn. Deze bacteriële steriliteit gaat verloren in de aanwezigheid van COPD. Dit leidde tot de hypothese dat er een natuurlijke progressie is van eenvoudige mucushypersecretie geassocieerd met sigarettenrook naar purulente hypersecretie en obstructieve bronchitis [8].

1.1.3.3.

Emfyseem.

Emfyseem wordt gekenmerkt door vergroting van de alveolaire ruimten, welke veroorzaakt wordt door destructie van de alveolaire wand. Emfyseem bij COPD kent verschillende oorzaken (Tabel 2) [8,9]. Tabel 2. Ontwikkelingsmechanismen van emfyseem in COPD [8,9]. Mechanismen van emfyseem in COPD Stoornis in het protease-antiprotease evenwicht Vrijstelling van perforine en granzyme door CD8+ cellen Apoptose van alveolaire cellen Toename van veroudering van de long en senecentie Onvoldoende klaring van apoptotische cellen door macrofagen wat leidt tot daling in antiinflammatoire/immunologische mechanismen Dysfunctie van de mitochondriën met toename van oxidatieve stress.

Alveolaire destructie wordt veroorzaakt door destructie van elastine in de long en vrijstelling van neutrofiel elastase en metalloproteinasen door inflammatoire cellen. Deze stijging onderdrukt de antiproteinase capaciteiten van de long en induceert vernietiging van de long. Sigarettenrook verhindert niet enkel herstel van de long door de novo synthese van longweefsel, maar ook van weefselaccumulatie van elastine en collageen, het inhibeert ook de 5

proliferatie van fibroblasen en induceert celcyclusarrest van deze cellen. Verder is sigarettenrook ook verantwoordelijk voor celdood van endotheliale cellen en endotheliale precursorcellen en voor inhibitie van de chemotaxis en proliferatie van de epitheliale cellen in de luchtwegen [9]. Er bestaan 2 soorten van emfyseem: centriacinair (centrilobulair) en panacrinair emfyseem [6-8,15]. Het onderscheid wordt gemaakt door de locatie van de destructie van het longparenchym (Figuur 3 – Addendum I) [8]. Bij centriacinair emfyseem is er destructie van de respiratoire bronchioli. De centrale delen van de acinus worden omgeven door gebieden van normaal longparenchym. Dit type van emfyseem is meer geassocieerd met sigarettenrook en wordt gevonden in de bovenste lobben van de long waar verschillende kleine lesies grote cavities vormen. Bij panacrinair emfyseem is de volledige long aangetast. Door vergroten van de alveoli gaat de omlijning en contrast in grootte en vorm met de ducti verloren, waardoor er geen onderscheid meer is tussen beide. Deze vorm is meestal geassocieerd met α1antitrypsine deficiëntie en komt meer voor in de lagere lobben waar het zorgt voor een nog grotere dilatatie en destructie over gans de acinus [6-8].

1.1.4.

Pathogenese.

COPD wordt gekenmerkt door luchtstroombeperking. Deze wordt veroorzaakt door luchtwegobstructie door bronchiolitis samen met een daling in de elastische recoil en door emfyseem, wat zorgt voor een daling van het oppervlakte voor gasuitwisseling [6]. COPD wordt in de ontwikkelde landen voor 95% veroorzaakt door sigarettenrook, maar ook luchtvervuiling, arm dieet en beroepsmatige blootstelling aan gassen kan COPD veroorzaken (Tabel 3). In de ontwikkelingslanden zorgt binnenhuis koken op een open vuur (biomass fuel) voor een grote bijdrage tot de ontwikkeling van COPD. Ook genetische factoren (α1antitrypsine deficiëntie) kunnen aan de basis liggen van COPD [2,3,5]. De aangeboren en adaptieve inflammatoire en immuunresponsen verzorgen de verdediging tegen deze geinhaleerde toxines [7,8]. Zowel locale als systemische inflammatie draagt bij tot de pathogenese van COPD.

6

Tabel 3. Risicofactoren voor de ontwikkeling van COPD.

Risicofactoren voor COPD Tabak roken - actief: sigaretten, pijp, sigaren - passief Beroepsmatige blootstelling aan stof Beroepsmatige blootstelling aan chemicaliën Binnenhuis vervuiling Buitenhuis vervuiling Respiratoire infecties Genetische factoren 1.1.4.1.

De aangeboren immuunrespons.

De aangeboren inflammatoire immuunrespons zorgt voor een primaire bescherming en is essentieel voor het behouden van de steriliteit in de lagere luchtwegen [7]. De aangeboren immuunrespons bestaat uit een mucosale barrière en cellen van hematopoetische origine. De barrière bestaat uit een mucociliaire klaring van de luchtwegen, waardoor partikels uit de luchtwegen worden getransporteerd en tight junctions die zorgen voor de verbinding van epitheliale cellen van de long waardoor er een fysische barrière ontstaat tussen het weefsel en de luchtruimte. Vernietiging van het epitheel initieert een acute inflammatoire respons, waar inflammatoire cellen migreren naar het epitheel. Dit is de 2e lijn van defensie van het innate immuunsysteem, waar er sprake is van exudatie van circulerende effectorcellen in het beschadigde weefsel. Dit proces wordt uitgelokt door een grote waaier van pro-inflammatoire chemokines en cytokines [8]. De hematopoetische cellen die deelnemen aan de innate immuunrespons zijn eosinofielen, macrofagen, neutrofielen cellen, natural killer cellen (NK) en mastcellen [7,8]. Figuur 2 (Addendum I) geeft de link weer tussen de pathogenese en de pathologie van COPD [16].

1.1.4.1.1.

Epitheelcellen.

Epitheelcellen van de luchtwegen en alveolen zijn belangrijk voor het initiëren en onderhouden van de inflammatie in COPD. Na prikkeling door sigarettenrook (CS) reageert het epitheel via vrijstelling van een grote variatie van inflammatoire mediatoren, inclusief cytokines en chemokines zoals IL-8 (interleukine-8) en CCL20 (Chemokineligand 20). Epitheelcellen in de luchtwegen vormen ook een bron van TGF-β (Transforming Growth Factor-β), wat voor remoddelering van de luchtwegen kan initiëren [5,9,12,16]. 7

1.1.4.1.2.

Eosinofielen.

De rol van eosinofielen niet nog niet duidelijk, maar ze vormen een subgroep in COPD. Een toegenomen aantal eosinofielen in BAL (Broncheo-alveolair) vocht en sputum wordt gerelateerd aan een goede klinische respons op corticosteroïden behandeling [9]. Enerzijds tonen studies aan dat het aantal inactieve eosinofielen is toegenomen in luchtwegen en lavagevocht van COPD-patiënten. Andere studies vinden geen stijging in BAL en sputum. Eosinofiel basis proteïne gestegen is in COPD-patiënten ondanks de afwezigheid van eosinofielen welke dus gedegranuleerd zijn en niet zichtbaar meer via microscopie [5,9].

1.1.4.1.3.

Macrofagen.

Macrofagen spelen een centrale rol in de pathogenese van COPD aangezien ze kunnen gelinkt worden aan de meeste kenmerken van de ziekte [12]. Macrofagen komen tot 5 tot 10 keer meer in de luchtwegen, longparenchym, BAL vocht en sputum bij patiënten met COPD en tot 25 keer meer in het weefsel en alveolaire ruimte [5,16]. Ze komen voornamelijk voor op de plaatsen waar er sprake is van destructie van de alveolaire wall in patiënten met emfyseem. Er is sprake van een correlatie tussen de graad van COPD en het aantal macrofagen in de luchtwegen [5,9,16]. Eenmaal geactiveerd door sigarettenrook stellen ze verschillende inflammatoire mediatoren vrij die een rol spelen in het inflammatoir proces in COPD door aantrekking van neutrofielen, monocyten en cellen van het adaptieve immuunsysteem. Alveolaire macrofagen secreteren ook elastolytische enzymen zoals MMP-2, MMP-9 en MMP12 (Matrix Metalloproteasen). De inflammatoire mediatoren zorgen voor een cellulair mechanisme dat roken linkt met inflammatie in COPD [5,9,12,16]. Macrofagen zijn verantwoordelijk voor inflammatie en emfyseemontwikkeling door activatie van resp. monocyten, neutrofielen, CD8+ T-cellen (Cluster of Differentiation) en vrijstelling van proteasen. Ze dragen ook bij tot de ontwikkeling van fibrose (remoddelering van de luchtwegen) door productie en vrijstelling van TGF-β. In vergelijking met normale rokers secreteren alveolaire macrofagen bij patiënten met COPD ook meer

inflammatoire proteïnen en hebben ze een grotere elastolytische

activiteit [12].

1.1.4.1.4.

Neutrofielen.

De rol van neutrofielen in COPD is nog niet duidelijk. Er wordt een verhoging gevonden van geactiveerde neutrofielen in sputum en BAL-vocht van COPD-patiënten. In de

8

luchtwegen en longparenchym wordt slechts een kleine toename gezien welke correleert met de graad van ziekte [5,9,16]. Neutrofielen stellen verschillende serineproteasen vrij zoals neutrofiel elastase, cathepsin G en proteinase-3 welke bijdragen aan de destructie van het parenchym. De serine-proteasen vertonen nog een ander kenmerk. Ze zijn in staat om mucus hypersecretie te stimuleren, wat ook bijdraagt tot de limitatie in luchtwegdoorstroming in COPD. Aangezien neutrofielen niet prominent aanwezig zijn in COPD, kan destructie van het parenchym niet beschouwd worden als de belangrijkste rol van neutrofielen in COPD. Studies tonen aan dat er sprake is van een negatieve correlatie tussen het aantal neutrofielen en de parenchymale destructie [5].

1.1.4.2.

De adaptieve immuunrespons.

In tegenstelling tot de aangeboren immuunrespons heeft de adaptieve respons een uitstekend geheugen voor zowel oplosbare als particulaire antigenen die geinhaleerd zijn in de long. De adaptieve immuunrespons bestaat uit 2 componenten, nl. de cellulaire en de humorale respons. Antigenen worden getransporteerd door het epitheel in gespecialiseerde Mcellen of via penetratie van het epitheel op de plaats van schade. Dendritische cellen (DC’s), gelegen in een netwerk aan de basis van het epitheel en in de lamina propria onder het basale membraan nemen deze antigenen op en transporteren ze naar BALT (Bronchial Associated Lymphatic Tissue) of naar de regionale lymfeknoop [8]. DC in de luchtwegen komen ook niet enkel voor aan de basis van het epitheel, maar ook in het epitheel met extensies tot in het lumen van de luchtweg. Na antigenherkenning differentiëren naïeve T-cellen in verschillende functionele klassen van effector T-cellen die gespecialiseerd zijn voor verschillende activiteiten. CD8+ T- cellen herkennen pathogene peptiden gepresenteerd door MHC-І (Major Histocompatibility Complex) moleculen en naïve CD8+ T-cellen differentiëren in cytotoxische effector T-cellen die geinfecteerde cellen herkennen en doden [17]. CD4+ T-cellen vormen een 2e klasse van Tcellen. Deze cellen hebben een groter repertoire aan effectoractiviteiten dan CD8+ cellen. CD4+ cellen differentiëren na herkenning van pathogenen gepresenteerd door MHC-ІІ moleculen in verschillende richtingen die verschillende subsets van effectorcellen genereren met verschillende immunologische functies. De voornaamste CD4 effector subsets zijn Thelper1 (Th1), Thelper2 (Th2) en

Thelper17 (Th17), welke zorgen voor activatie van hun

targetcellen (Figuur 2, Addendum I). Tregulatoir (Treg) verhinderen verdere immuunreacties door 9

hun inhibitoire activiteit. TH17 is betrokken bij de verdediging tegen extracellulaire bacteriën via productie van IL-17. IL-17 heeft ook schadelijk effecten in autoimmuunziekten (Figuur 4, Addendum I) [17,18]. In patiënten met COPD is er in het longparenchym, de perifere en centrale luchtwegen een toename in aantal T-lymfocyten. Zowel het aantal van CD4+ als CD8+ T-cellen is toegenomen, met een grotere stijging van CD8+ T-cellen t.o.v. CD4+. Hierdoor is de ratio CD4+ : CD8+ cellen omgekeerd bij patiënten met COPD. CD8+ T-cellen veroorzaken cytolyse en apoptose van alveolaire epitheliale cellen en longparenchym door de vrijstelling van perforine, granzyme-B en TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α) [5,13,14,19]. De concentratie van perforine aanwezig in de cellen is ook hoger bij patiënten met COPD [9]. Er is dus sprake van een associatie tussen CD8+ T-cellen en apoptose van alveolaire cellen in emfyseem. CD8+ cellen faciliteren een snelle resolutie van acute virale infecties via cytolyse of apoptose van geinfecteerde cellen [6,9]. Virale infecties komen frequenter voor bij patiënten met COPD, wat ook bijdraagt tot een hogere concentratie aan CD8+ T-cellen. In aanwezigheid van respiratoire virale infecties induceren CD8+ T-cellen met hun cytotoxische functie longschade. COPD wordt vnl. beschouwd als een Th1 gedreven ziekte met hoge niveau’s van Th1 cytokines zoals IFNγ. Th2 cytokines zijn ook goed beschreven in COPD, waaruit men kan conluderen dat er ook Th2 responsen kunnen aanwezig zijn in COPD [16]. De verhoogde CD4+ T-cellen in COPD zijn Th1-cellen. Deze expresseren CXCL10 dat de vrijstelling van elastolytische metalloproteinasen controleert [9]. Bij gezonde rokers komt er een prominente opregulatie voor van Treg in BAL-vocht. In rokers met COPD komt deze opregulatie niet voor. De opregulatie bij gezonde rokers kan geïnterpreteerd worden als een poging om de inflammatoire immuunrespons veroorzaakt door rook te regelen en minimaliseren. Dit mechanisme faalt in patiënten met COPD en draagt bij tot de bevordering/disregulatie van de inflammatoire immuunrespons, waardoor Treg een bijdrage leveren aan de pathogenese van COPD [21]. Naïve T lymfocyten worden geactiveerd door antigenpresenterende cellen. De belangrijkste APC is de zeer gespecialiseerde dendritische cel. Dendritische cellen in het weefsel nemen antigenen op op de plaats van infectie/schade en worden geactiveerd als deel van het innate immuunsysteem. Dit zorgt voor migratie naar het lokale lymfoïde weefsel en maturatie van de cellen. Mature cellen zijn zeer effectief in het presenteren van antigenen aan recirculerende naïve T-cellen. Dendritische cellen vormen aldus de link tussen het innate en adaptieve immuunsysteem en zullen later nog uitvoerig besproken worden [5,7,8,16].

10

1.1.4.3.

Rol van proteasen.

Inflammatoire cellen spelen een belangrijke rol bij COPD aangezien zij verantwoordelijk zijn voor de vrijstelling van proteasen. Door de overmatige productie van proteasen ontstaat er een onevenwicht tussen deze proteasen en hun inhibitoren (antiproteïnasen). Samen met hun elastolytische activiteit spelen ze een essentiële rol in de ontwikkeling van emfyseem en zodus ook in de ontwikkeling van COPD. Het onevenwicht wordt niet enkel veroorzaakt worden door een stijging in proteïnasen, maar ook een verminderde synthese van antiproteïnasen of een verhoogde afbraak hiervan kan hiervoor verantwoordelijk zijn [12]. In COPD spelen 3 proteasen een belangrijke rol: Neutrofiel elastase (NE), Cathepsine G en Matrix Metallo proteasen. Neutrofiel elastase is een serine protease en wordt geinhibeerd door antiproteinase α1-antitrypsine (α1-AT). NE verhoogt ook de capaciteit van andere proteasen, nl. MMP’s en vice versa. Tissue Inhibitors of Matrix metalloproteasen (TIMP) zijn de antiproteïnasen van MMP’s en worden zelf geinhibeerd door NE. α1-AT wordt afgebroken door MMP. Cathepsine G is een cysteïne protease dat ook geproduceerd wordt door neutrofielen [12]. De functie van MMP’s bestaat uit degradatie van verschillende componenten van de extracellulaire matrix en spelen op deze manier een rol in de celmigratie en weefseldestructie. MMP’s worden geproduceert door inflammatoire cellen, maar kunnen ook zelf cytokines en chemokines activeren en zo een verdere bijdrage leveren aan de inflammatoire reacties in COPD. Momenteel zijn er 24 MMP’s geidentificeerd in zoogdieren. Figuur 5 (Addendum I) geeft de mogelijke pathogene acties weer van MMP. Zoals reeds vermeld worden MMP’s geinhibeerd door 4 TIMPs welke binden op de katalytische deel van de MMP’s [19].

1.1.4.4.

Chemokines in COPD.

Chemokines zijn chemotactische factoren die verantwoordelijk voor de aantrekking als migratie van inflammatoire cellen naar het beschadigde weefsel, wat omschreven wordt als de 2 lijn van verdediging van het innate immuunsysteem [21]. Er bestaan meer dan 50 verschillende types van chemokine liganden die verdeeld worden in 4 verschillende families van chemokines bepaald door de positie van het cysteïne residu (CXC, CC, C en CX3C). Chemokines worden gesecreteerd door oa epitheelcellen en macrofagen en binden op hun receptoren die geklassificeerd worden volgens hun affiniteit voor 1 van de chemokine

11

families (CXCR, CCR, CR en CX3CR). Verschillende CXC- en CC-receptoren worden geexpresseerd op inflammatoire cellen geassocieerd met COPD. Na binding van liganden op hun receptor, zorgen ze voor de migratie van de geactiveerde cellen naar de plaats van inflammatie [7,12]. In deze studie gaan we ons concentreren op CXCR3, -4 en CCR7. De cellen waarop deze receptoren geexpresseerd worden en hun liganden zijn weergegeven in tabel 3. CXCR3 wordt voornamelijk gezien bij CD8+ cellen. T-cellen die geïnfiltreerd zijn in de longen van COPD patiënten vertonen ook een hogere expressie van CXCR3. Bij epitheelcellen is er een opregulatie van CXCR3 en van zijn ligand CXCL10. Activatie hiervan zorgt voor proliferatie van de epitheelcel en draagt bij aan de remoddelering van de luchtweg [19]. Tabel 4. Overzicht van chemokinereceptoren. Chemokine receptoren Naam cel type expressie chemokine ligand CXCR3 T-cellen , B-cellen, gladde spiercellen, mesenchiale cellen CXCL9, CXCL10, CXCL11 CXCR4 T-cellen, B-cellen, DC’s, monocyten, neutrofielen

CXCL12

CCR7

CCL19, CCL21

T-cellen, B-cellen, mature DC, NK cellen

1.1.4.5.

Systemische inflammatie in COPD.

Naast lokale inflammatie treedt er bij patiënten met COPD ook systemische inflammatie op [9,22]. Een belangrijke rol wordt gespeeld door cytokines en chemokines. Een verhoogd niveau van cytokines in het bloed duidt op een systemische component van het inflammatoir proces in COPD. Dit correleert met de klinische associatie van COPD met metabole abnormaliteiten,

gewichtsverlies,

spierverzwakking,

cardiovasculaire

aandoeningen,

depressie, osteoporose, kanker en anemie. Een verhoogde toename van cytokines zoals IL-6, IL-8, TNF-α, TNF-receptor (TNFr) en C-reactive protein (CRP) levert het bewijs voor systemische inflammatoire processen in COPD. Ook een daling van FEV1 is geassocieerd met systemische inflammatie. Oxidatieve stress geassocieerd aan inflammatie draagt bij tot spiercel apoptose en dysfunctie en kan instaan voor de relatie tussen inflammatie en gewichtsverlies in COPD. Het verhoogde niveau aan circulerende cytokines is enerzijds afkomstig van overmate aan pulmonaire cytokines en anderzijds zijn ze afkomstig van andere bronnen zoals monocyten, striated spieren of concomitante atherosclerotische lesies [9, 22].

12

1.2.

Dendritische cellen.

Dendritische cellen werden het eerst in 1868 geïdentificeerd als Langerhans cellen (LC) in de epidermis en in 1973 voor het eerst beschreven door Ralph Steinman in lymfoïde organen. Dendritische cellen zijn antigen presenterende cellen (APC) en vormen een essentiële link tussen het aangeboren en adaptieve immuunsysteem door activatie van B-cellen, macrofagen NK-cellen, NKT-cellen (Natural Killer T-cellen) en T-cellen [23-25]. DC spelen een duale rol in de inductie van de adaptieve immuunrespons tegen vreemde antigenen (AG) en in het onderhoud van T-cel tolerantie t.o.v. eigen AG [26]. DC zijn van alle cellen het meest capabel om de primaire en secundaire immuniteit te induceren. Er bestaan verschillende subsets van DC welke onderscheiden worden door oppervlakte en intracellulaire fenotypische merkers, immunologische functie en anatomische distributie [22,26,27].

1.2.1.

Localisatie.

Steinman en Cohn identificeerden DC voor het eerst in de perifere lymfoïde organen van de muis [23,24]. Verschillende studies hebben sinds dan reeds aangetoond dat de aanwezig van DC niet enkel beperkt is tot de lymfoïde organen en epidermis. DC komen ook voor in bloed, beenmerg, long, bovenste luchtwegen, urogenitaal stelste, gastrointenstinaal stelsel, lever en hart. In het perifeer lymfoïde weefsel worden de DC beschreven als cellen met cytoplasmatische uitlopers (cfr dendrieten) met hoge expressie van MHC antigenen en met hoge T-cel proliferatie capaciteiten [18]. Afhankelijk van de gebruikte technieken worden DC ook anders omschreven. Bij cytospins vertonen ze fijne dendrieten. Wanneer gebruik gemaakt wordt van EM zijn de uitlopers eerder lang, dun en kunnen ze spiny of sheet-like voorkomen. Als de cellen bekeken worden via fase-contrast microscoop (viabele cellen) vertonen ze grote, delicate uitlopers in alle richtingen op het celoppervlakte. De vorm en mobiliteit van deze uitlopers is noodzakelijk voor het correct uitvoeren van hun functie, nl vangen van AG en selecteren van AG-specifieke T-cellen [17,27]. In vergelijking met andere weefsels bevat de huid en mucosale oppervlakten meer DC, dit omdat deze weefsels de meest voorkomende sites zijn entry van microbiële pathogenen [26].

13

1.2.2. Oorsprong.

Alle DC zijn afkomstig van hematopoietische stam en progenitorcellen (HSPC’s) uit het beenmerg. Progenitorcellen ontstaan uit HSPC’s en differentiëren in 1 of meerdere DC subsets. Facultatieve DC zijn niet beperkt tot het beenmerg en worden ook gevonden in de thymus, bloed, lymfeweefsel en viscerale organen. Deze progenitors differentiëren in DC na activatie in de perifere weefsels. Volledig gedifferentiëerde DC komen voor in gezond weefsel als immature cellen die reeds endocytotische capaciteiten beschikken, maar nog niet in staat zijn om naive T-cellen te primen [26]. Meer en meer worden DC aanzien als gedifferentieerde monocyten [24].

1.2.3. Activatie, maturatie en functie.

DC’s zijn gespecialiseerd in de opname, transport, verwerking en presentatie van AG aan het adaptieve immuunsysteem. DC zijn efficiënte stimulators van B en T-lymfocyten . Bcellen zijn in staat om op directe wijze AG te herkennen via hun B-cel receptoren. Dit is niet zo bij T-cellen. Activatie van T-cellen gebeurt door APC. DC spelen een cruciale rol in de initiatie en modulatie van het immuunsysteem als reactie op gevaarsignalen. In de meeste weefsel komen DC voor in immature toestand, ze bezitten nog geen signalen die noodzakelijk zijn voor T-cel activatie (CD40, CD54, CD86), maar zijn wel goed uitgerust voor het herkennen van AG. De herkenning van AG gebeurt via verschillende mechanismen zoals fagocytose, macropinocytose en endocytose via receptoren [27]. DC progenitors migreren van het bloed naar de plaats van inflammatie waar ze screenen naar gevaarsignalen (pathogenassociated molecular patters – PAMPs). Deze screening gebeurt via pattern recognition receptors (PRR). PAMPs worden herkent door tenminste 3 PRR-families: Toll-like receptoren (TLR), cell surface C-type lectine receptoren (CLR) en intracytoplasmatische nucleotide oligomerisatie domein (NOD) achtige receptoren (NLR) [24]. Wanneer immature DC deze signalen herkennen worden ze geactiveerd en migreren ze naar de lymfeknopen [18,24]. Tijdens de migratie verwerken ze de opgenomen AG en presenteren ze deze via MHC-Ι en MHC-ΙΙ moleculen. De opregulatie van MCH-Ι, MHC-ΙΙ en costimulatoire moleculen wordt omgeschreven als de maturatie-stap van DC’s en is belangrijk voor het uitvoeren van hun functie nl activatie van T-cellen [24,25]. Tijdens de maturatie wijzigt de DC van een antigenopnemende cel, naar een APC. Hierbij ondergaan DC verschillende wijzigingen zoals, verlies

14

van adhesieve structuren, reorganisatie van het cytoskelet, verhoging van motiliteit, verlies van endocytotische of fagocytotische receptoren, secretie van chemokines en cytokines, upregulatie van costimulatoire moleculen (CD40, CD80, CD86), translocatie van MHC-ΙΙ naar het oppervlakte [25]. Deze mechanismen zijn nodig voor een efficiënte activatie van Tcellen, dewelke afhankelijk is van 3 signalen die door DC worden geleverd nl, herkenning van AG door presentatie via MHC-Ι en ΙΙ, costimulatoire factoren en cytokines en chemokines welke verantwoordelijk zijn voor migratie van T-cellen naar DC [24]. Geactiveerde DC vertonen zelf een verhoogde expressie van CCR7 en migreren hierdoor naar de drainerende lymfeknopen en naar de centrale T-cel zone [18]. De reden waarom DC noodzakelijk zijn wordt verklaard door de lage MHC presentatie door geïnfecteerde cellen zelf, door de kleine hoeveelheid en lage affiniteit van TCR op Tcellen en door gebrek aan costimulatoire moleculen (IL-12), nodig voor de clonale expansie van T-cellen, en productie van cytokines [27]. Studies hebben ook aangetoond dat AG ook migreren naar drainerende lymfeknopen via lymfevaten en hierdoor DC’s activeert die in de lymfeknoop zelf gelegen zijn. De colocalisatie van DC en T-cellen in de secundaire lymfoïde organen maakt inductie van effector T-cell respons mogelijk. Afhankelijk van de manier van presentatie van AG door DC prolifereert een naive T-cell in cytotoxische T-cel (CD8) of een T-helper cellen (CD4). De T-helper cellen kunnen verder onderverdeeld worden in T-helper 1, T-helper 2, T helper 17 of regulatoire T-cellen (Tregs) [17,18,25]. DC zijn dus in staat de immuunrespons te activeren, hun regulaire functie zorgt ook voor controle van de inflammatoire respons via voorkomen van tissue damage door chronische immuunrespons en inflammatie [18]. DC vormen dus een link tussen de periferie, waar activatie door pathogenen plaatsvindt, en de lymfeknopen, waar het adaptieve immuunsysteem geïnduceerd wordt. Ze vormen een sleutelpositie in het immuunsysteem [24].

1.2.4. Subsets van DC’s.

Afhankelijk van de pathway die HSPC’s volgen, ontwikkelen ze zich in 2 subsets van DC. nl myeloïde DC’s en plasmacytoïde DC’s (Figuur 6. Addendum I) [17,24-26,28-30]. mDC’s komen in vivo voor in 3 compartimenten, nl perifere weefsel, secundaire lymfoïde organen en in bloed. In de huid worden DC onderverdeeld in 2 types. LC worden gevonden in de epidermis en interstitiële DC (intDC) zijn aanwezig in de dermis. Door gebruikt te maken van in vitro modellen kunnen mDC nogmaals onderverdeeld worden in 3

15

types: CD14+ blood monocyte derived DC, langerhans cellen en intDC. Afhankelijk van hun locatie expresseren mDC verschillende subsets van molecules [18,25]. pDC’s komen net als mDC’s voor in het bloed. Er kan een onderscheid gemaakt worden om basis van 4 kenmerken nl morfologie, expressie van merkers, migratieroute en oorsprong. pDC worden onderscheiden van mDC door hun plasmacelachtige morfologie. Ze vertonen ook geen myeloide merkers zoals CD11c en CD33. Dit wordt in 2.2.5. nog uitvoerig besproken. De route waarmee de secundaire lymfoïde organen worden bereikt is verschillend tussen deze 2 subsets. Hoewel mDC’s gebruik maken van de afferent lymfatische route om de lymfeknoop vanuit het perifeer weefsel binnen te dringen, is er bij pDC’s sprake van een directe pathway (direct homing). pDC’s dringen van uit het bloed direct de lymfeknoop binnen via High Endothelial Venules (HEV) en niet via perifeer weefsel zoals mDC (Figuur 7, Addendum I) [25,31]. Een 4e onderscheid kan gemaakt worden op basis van verschil in origine [18]. Hier wordt gebruik gemaakt van 2 modellen om het onderscheid te maken: ‘het functional plasticity model’ en ‘specialized lineage model’. In het 1e model ontwikkelen de verschillende subtypes zich uit een common lymfoïd progenitor. Afhankelijk van de activatiemechanismen verschillende subtypes ontwikkelen. In het 2e model zijn de subtypes afkomstig van volledig gescheiden ontwikkelingslijnen, waarbij de precursoren reeds commited zijn.

1.2.5. DC’s in de long.

DC komen in de long voor net boven en onder het basale membraan, tussen de basale epitheliale cellen, in het interstitium en in de alveolaire ruimte en in BAL vocht (Figuur 8) [29-32].

16

Figuur 8. Localisatie van DC in luchtwegen. DC komen in de long voor net boven en onder het basale membraan, tussen de basale epitheliale cellen, in het interstitium en in de alveolaire ruimte en in BALF (BAL-fluid, BAL-vocht)

In de long worden DC’s onderverdeeld in 3 subsets: mDC type 1, mDC type 2 en pDC’s. Dit onderscheid wordt gemaakt op basis van specifieke merkers. mDC en pDC komen voor in een laag autofluorescente (LAF) populatie in long mononucleaire cellen. mDC zijn CD11c+CD14-, pDC zijn CD11c-CD14- [33]. DC zijn ook lineage negatief, dwz dat DC CD3, -14, -16, -19, -20 en -56 negatief zijn [34]. In humaan bloed wordt LAF-populatie onderverdeeld op basis van BDCA (Blood Dendritic Cell Antigen) [25,26,33-35]. De mDC populatie wordt onderverdeeld in 2 subsets. mDC type 1 wordt gekenmerkt door expressie van BDCA1 en MHC-ΙΙ, mDC type 2 door BDCA-3 en MHC-ΙΙ. BDCA-2 [26,33-35] en BDCA-4 [26,36] zijn merkers voor pDC’s. Enkel BDCA-2 is een specifieke merker voor pDC maar wordt neerwaarts gereguleerd tijdens de maturatie. CD123, receptor voor IL-3 wordt ook geëxpresseerd door pDC’s, maar is hiervoor niet specifiek [33]. De co-expressie van BDCA-2 en CD123 is specifiek voor pDC [35]. pDC worden gedefinieerd als LAF, CD3-, CD19-, BDCA-2+, CD123+ [33-34]. De expressie van maturatiemerkers CD80,CD86 en CD40L is hoger bij mDC’s in vergelijking met pDC’s [33]. De expressie van TLR, verantwoordelijk voor inductie van T-cel proliferatie is ook verschillend tussen de subsets [18,33]. Zowel mDC1 en mDC2 expresseren hoge hoeveelheiden TLR-1, -2, -3, -4, -6 en -8 ivm pDC’s. pDC’s expresseren ivm mDC subsets TLR-7 en -9 [18]. TLR herkennen PAMPS en initiëren de immuunrespons. Na stimulatie met PGN (Peptidoglycaan) en LPS (Lipopolysacchariden)produceren mDC’s IL-6, -8 ,-1β en TNF-α. Deze cytokines worden niet vrijgesteld door pDC’s [35]. Na stimulatie met imiquimod en CpG oligo-deoxy-nucleotieden (ODN) (TLR-7, -9) produceren pDC ivm mDC respectievelijk TNF-α en IFN-α [25,35,37]. Stimulatie met imiquimod en CpG imititeert stimulatie van TLR-7 en -9 na virale infectie. De geproduceerde IFN hebben een direct inhibitoir effect op de virale replicatie en activeren NK-cellen, B-cellen, T-cellen en mDC’s [25,33,38], wat zorgt voor amplificatie van de aangeboren immuunrespons en inductie van het adaptieve immuunsysteem [33].

17

1.2.6. DC’s en pathologie.

Zoals reeds vermeld spelen DC een rol in de bescherming tegen pathogenen. DC kunnen ook verantwoordelijk zijn voor de inductie van onnodige immuunreacties tov onschadelijke antigenen (allergie) of tov zelf-antigenen (auto-immuniteit). DC spelen een rol in verschillende aandoeningen. Een verhoogd aantal DC werd reeds waargenomen in rheumatoïde arthritis, allergische rhinitis, atopische dermatitis. Een daling in aantal DC in kanker draagt bij aan de van faling van het immuunsysteem. Deze daling aan DC wordt veroorzaakt door vrijstelling van immunosuppressieve signalen door tumorcellen waardoor de respons van DC vermindert [18]. Ook in de longpathologiën spelen DC een belangrijke rol. DC’s zijn een zeer grote sensor van gevaarsignalen en reageren op elke wijziging van het mucosale oppervlakte door initiatie van de aangeboren respons en door controle van de ontwikkeling van specifieke immuunreacties. Gezien DC de link vormen tussen aangeboren en adaptieve immuniteit en gezien deze componenten verhoogd zijn in de luchtwegen van patiënten met COPD kan men besluiten dat pulmonaire DC’s verhoogd zijn als reactie op CS-blootstelling [12,18,39]. Recentere studies hebben aangetoond dat DC’s een functie uitoefenen in de pulmonaire respons op CSE [40], er een toename is van DC in de luchtwegen en alveolaire wand van rokers en dat DC een inflammatoire respons initiëren in COPD dmv MMP [28,41]. Deze bevindingen suggereren dat DC kunnen deelnemen in de ontwikkeling van pulmonaire ziekten. DC spelen een rol in de ontwikkeling van asthma waar ze T-cellen stimuleren tot Th2 respons wat lijdt tot eosinofiele inflammatie, mucus hypersecretie en hypergevoeligheid van de bronchus. Ook bij longkanker spelen DC een belangrijke rol. Ze zijn in staat om tumor antigenspecifieke T-cel reacties te induceren, maar locale omgevingsfactoren zoals VEGF onderdruk de infiltratie van DC. Bij een 3e aandoening, LCH (pulmonary langerhans cell histiocytose) spelen Langerin+ DC een belangrijke rol in de pathogenese, het mechanisme waarmee LC geactiveerd worden is onbekend. Ook bij respiratoire virale infecties werd een rol beschreven voor DC. In RSV (Respiratory Syncytial Virus) werd een toegenomen hoeveelheid mDC en pDC waargenomen. Depletie van pDC zorgde voor een daling in klaring van het virus, wat een belangrijke rol van pDC bij virale klaring suggereert [18]. pDC’s produceren na herkenning van viraal nucleïnze zuur grote hoeveelheden type-1 interferonen [37]. Herkenning van virussen door pulmonaire DC’s kunnen longziekten zoals astma en COPD beïnvloeden. Respiratoire virale infecties zijn 1 van de voornaamste oorzaken van

18

COPD-opstoten. Men kan vermoeden dat interactie tussen virale infecties en DC een rol kunnen spelen in de pathogenese van exacerbaties van COPD. Deze hypothese werd nog niet onderzocht [18]

2. Materialen en methoden. 2.1.

Algemene materialen.

Coulter counter (Beckman Coulter, 6605700) 5ml pipet (LP Italiano Spa, 160510) 10ml pipet (BD 357551), 25ml pipet (BD, 357525), Finntip Filter (Thermo Scientific, 94052000 – 94052200 – 94052410), ethanol (Chemlab 16.1281811.1000), Spuiten (BD, 5ml;301603, 10ml;300613) , naald op 5ml spuit (BD, 301155), vlindernaald op 10ml spuit (BD, 381344), MultiwelTM 6 well (BD, 353046), MultiwelTM 24 well (BD, 353504), FACS Calibur (BD 342975), FACS tubes (BD, 8215115), CalibriteTM 3 beads (BD, 340486), CalibriteTM APC, (BD, 340487) FACS-buffer (500ml PBS, 5% 100mM EDTA, 5g BSA, 500mg Na-azide), FACS-flow (BD 342003), FACS clean (BD 340345), FACS Rince (BD 340346), Dendritic Cell Culture Medium- DCM (500ml RPMI-1640, 10% FCS, 5ml L-glutamine, 5ml Streptomycine /peniciline, 500µl β-mercapto-ethanol).

2.2.

Scoring van BDCA-2 op immunohistochemische coupes.

Om de aanwezigheid van BCDA-2+ pDC aan te tonen en te quantificeren werden vriescoupes gekleurd. De coupes zijn afkomstig van niet-rokers, rokers, patiënten met COPD. De immunohistochemische werd uitgevoerd in het AMC in Amsterdam onder leiding van Prof. Dr. Van Drunen en Dr. S. Reinart, departement Neus-Keel-Oorziekte. Het protocol is aanwezig in Addendum II.2. De beelden worden geanalyseerd op de image analyser (Zeiss, Ks400). In een eerste stap wordt het epitheel afgelijnd en opgevuld waarmee het oppervlakte wordt bepaald. Nadien moeten de positieve cellen aangeduid worden met een stip. Deze stap wordt herhaald voor de lamine propria en adventitia. Nadien heeft men nog de mogelijkheid aanwezige follikels aan te duiden. De volledige scoringsmethode is te vinden in Addendum II.3. Statistische analyse wordt uitgevoerd via Statistical Package for the Social Siecnse versie 16.0 (SPSS Inc.,Chicago, IL). Er worden niet-parametrische testen uitgevoerd (Kruskal Wallis Test). De waarden zijn significant als p<0,05. 19

2.3.

Bereiding van single cell suspensie van de long.

Longweefsel is afkomstig van patiënten die een lobectomie of pneumectomie hebben ondergaan. Een informed consent werd bekomen van alle patiënten volgens het protocol goedgekeurd door het Medisch Ethisch Commitee van de Universiteit Gent (Addendum II.4). Het longweefsel wordt op de dienst pathologie gespoeld met een fysiologische oplossing (Baxter, NaCl 0.9%, AKF7123) mbv 10ml spuit met daarop vlindernaald. Hierdoor wordt het resterende bloed verwijderd. Het bruikbare weefsel moet op een voldoende afstand gelegen zijn van het pathologische weefsel. Het longweefsel wordt overgebracht in 6 well plaat in digestiemedium (TCM gesupplementeerd met 100µl/ml collagenase (Worthington) en 10µl/ml DNase (Boehringer Mannheim 2184932)). Het digestiemedium moet vooraf 30’ in incubator. Het noodzakelijke volume digestiemedium is afhankelijk van de grootte van de long. Er wordt standaard altijd 80ml bereid. Het longweefsel wordt fijngeknipt en overgebracht in 2-4 Falcons van 50ml. 20-40ml digestiemedium wordt over de falcons verdeeld. Na 30’ incubatie (37°C) wordt het resterende volume van het digestiemedium toegevoegd en wordt er krachtig geresuspendeerd. Na 15’ incubatie wordt opnieuw sterk geresuspendeerd en wordt het weefsel gecentrifugeerd. Nadien wordt het medium verwijderd en wordt PBS/EDTA (10mM) toegevoegd. Dit wordt geresuspendeerd en 5’ op kamertemperatuur op het shakerplatform (Phadia, Shaker incubator SI100) geplaatst. Na centrifugatie wordt het weefsel geresuspendeerd in TCM en vindt digestie plaats door 40µm nylon cell strainer (BD 352340). Het doorgelopen medium wordt gepoold over 2 falcons van 50ml en wordt aangevuld tot 35ml met TCM. Pulmonaire mononucleaire cellen worden bekomen door gebruik te maken van Ficoll densiteits gradient (GE healthcare, 71-7167-00 AG). Hiervoor wordt 35ml van de celsuspensie op 15ml ficoll aangebracht en gecentrifugeerd. De mononuclaire cellaag wordt overgebracht in nieuwe falcons en gecentrifugeerd. Na centrifugatie wordt 10ml ACK (pH 7,2-7,48, 29g NH4Cl, 1g KHCO3, 3702mg 0,1mM Na2EDTA, 1l H20) toegevoegd voor lyse van rode bloedcellen. Na 3 min incuberen wordt een overmaat FACS buffer toegevoegd en gecentrifugeerd. De celpellet wordt geresuspendeerd in 10ml TCM (Tissue Culture Medium). De celsuspensie wordt opgetrokken in 5ml spuiten en gefilterd over groene filters (BD, 50µm 340603). De bekomen fractie wordt aangevuld met TCM tot 10ml. De cellen worden verdund in TURC-oplossing (Merck, 1.09277.0500) en geteld via burkertelkamer (Blau Brand, 718920). Er worden 22 vakjes geteld. Het totale aantal cellen = aantal cellen in 22 vakjes * verdunningsfactor * 104 * 20

totaal volume van oplossing (10ml). De cellen worden op ijs bewaard tot met immunofluorescente labeling wordt verder gegaan.

2.4.

Labeling van single-cell suspensie voor flow cytometrische analyse.

Na het overbrengen van 106 cellen in facs-tubes, worden ze gecentrifugeerd en wordt het supernatans verwijderd. De cellen worden gepreincubeerd met 100µl humaan IgG (500µg/ml) en geincubeerd gedurende 20’. Na incubatie worden de cellen gecentrifugeerd en het supernatans verwijderd. De cellen werden nadien gelabeled met monoclonale antilichamen (AL) (20 µl, Lin-Fitc, BDCA-2 APC, CD197-PE, CD183-PE, CD184-PE) en bijhorende isotypes (Tabel 5, Addendum I). Na 30’ incubatie wordt een overmaat aan FACS-buffer toegevoegd, gecentrifugeerd en wordt het supernatans verwijderd. De cellen worden bewaard in 1ml PFA 2% en overnacht in het donker in koelkast geplaatst. Hierdoor kunnen de cellen tot 5 dagen later geanalyseerd worden. Flow cytometrische data acquisitie werd uitgevoerd op FACS Calibur met 488 nm en 633 nm lasers met Cellquest software (Becton dickinson, San Diego, CA). FlowJo software wordt gebruikt voor data-analyse op PowerMac G4. Er wordt gegated op Lin-/BDCA-2+ cellen om zo de expressie van de gekozen receptoren te analyseren. De lineage Cocktail bevat antilichamen die in combinatie lymfocyten, monocyten, eosinofielen en neutrofielen kleuren. De cocktail bevat anti-CD3, CD14, CD19, CD20 en CD56 (Tabel 6, Addendum I). Perifere bloed dendritische cellen en basofielen kunnen onderscheiden worden van de rest van de cellen door gebrek aan expressie van de bovenstaande merkers. Toevoeging van BDCA-2 maakt het mogelijk om pDC te isoleren. Deze merker wordt enkel geexpresseerd op pDC en niet op andere types van DC.

2.5.

Bereiding van Cigarette Smoke Extract (CSE).

Het rookapparaat bestaat uit 5 kunststof spuiten waarop sigaretten (Reference Cigarette 3R4F zonder filter, University of Kentucty, Lexington, KY, USA) worden aangebracht. Het apparaat is via de buizen verbonden met de steriele tip van de gaswasfles (Fischer Scientific). RPMI-1640 (Gibco, 31870) wordt gedurende 25’ voorverwarmd op 37°C. Het einde van de steriele tip wordt ondergedompeld in het verwarmd RPMI-1640. Per 10ml medium wordt 1 sigaret gebruikt. De rook wordt opgenomen door het rookapparaat en door het medium 21

geborreld. De sigaretten worden opgerookt tot 0,5cm van het einde. De oplossing wordt nadien gefilterd over 0,20µm porie Nalgene Unit filter en overgebracht in epjes ter bewaring op -80°C.

2.6. 2.6.1.

Isolatie van plasmacytoïde dendritische cellen uit humaan bloed. Principe.

Er wordt gebruik gemaakt van de Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit van Miltenyi Biotec. Humane pDC’s worden geisoleerd door depletie van niet-pDC’s (negatieve selectie). Deze worden indirect magnetisch gelabeled met een cocktail van biotin geconjugeerde monoclonale antilichamen als primaire labeling en anti-biotin monoclonale antilichamen geconjugeerd op Microbeads als secundaire labeling. De magnetisch gelabelde niet-pDC’s ondergaan depletie omdat deze op de MACS®-kolom in het magnetisch veld van de MACS®-Separator worden gehouden terwijl de niet-gelabelde pDC’s door de kolom gaan.

2.6.2.

Materialen.

Li-heparine bloed van gezonde vrijwilligers, niet rokers. Een informed consent werd bekomen (Addendum II.4). 50ml falcons (BD, 8247185), PBS (Phosphate Buffer Saline) (Lonza BE 17-516F) gesuplementeerd met 2mM EDTA, Ficoll-Paque (1.077g/ml, GE Healthcare 71-7167-00), Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit (130-092-207), MACSbuffer (MACS BSA Stock Solution ( #130-091-376) 1/20 verdund met autoMACS® Rinsing Solution (#130-091-222). LS-MACS kolom en tubes (#130-042-401), VarioMACS® separator. Deze materialen zijn afkomstig van Milteyni Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland.

2.6.3.

Methode.

Het humane bloed wordt overgebracht in 50ml falcons, ¼ verdund met PBS/EDTA (ethylenediaminetetraamino zuur) en geresuspendeerd. Op 15ml Ficoll wordt voorzicht 35ml verdund humaan bloed toegevoegd. Na centrifugatie (30 tot 40 min, 400g, 20°C, zonder rem) wordt de mononucleaire laag overgebracht in nieuwe falcons en werden deze aangevuld tot 50ml (1/2 verdunnen). Dit wordt opnieuw gecentrifugeerd (200g, 10’ 20°C) en het supernatans wordt verwijderd. Deze stap wordt 2x herhaald. De cellen wordt nadien geresuspendeerd in MACS®-buffer. De cellen worden geteld en opnieuw gecentrifugeerd alvorens over te gaan naar de magnetische labeling. De cellen worden geresuspendeerd in 22

400µl MACS® buffer per 108 cellen en 100 µl per 108 cellen PDC antibody cocktail wordt toegevoegd. Na 10’ incubatie op ijs wordt 10ml MACS®-buffer toegevoegd, gecentrifugeerd (200g,10’) en wordt het supernatans verwijderd. Deze wasstap wordt nogmaals herhaald. Nadien wordt er 400µl MACS® buffer per 108 cellen en 100 µl per 108 anti-biotin microbeads toegevoegd, gevolgd door 15’ incubatie op ijs. Na incubatie wordt 10ml MACS®-buffer toegevoegd, gecentrifugeerd (200g, 10’) en wordt het supernatans verwijderd. Deze wasstap wordt nogmaals herhaald. Er wordt 500µl MACS®-buffer toegevoegd. De cellen zijn nu klaar voor depletie. De LS kolom wordt in de VarioMACS® separator gebracht en gespoeld door 3ml MACS®-buffer toe te voegen. De celsuspensie wordt op de kolom gebracht. Nadat deze door de kolom is gegaan, wordt de kolom 3 maal gespoeld met 3 ml MACS®-buffer. De cellen worden geteld en zijn gebruiksklaar voor verdere experimenten.

2.7.

Viabiliteitsbepaling.

Viabiliteit van pDC’s werd bepaald met de Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (#556547, BD Pharmingen). Na isolatie van pDC’s uit humaan bloed wordt de viabiliteit bepaald zonder toevoeging van CSE en met toevoeging van CSE.

2.7.1.

Principe.

Detectie via Annexin V en PI steunt op 2 principes. Zowel detectie van cellen die in apoptose zijn als reeds apoptische cellen vindt plaats. Annexin V wordt gebruikt voor detectie van cellen die in apoptose zijn, PI voor detectie van apoptitische, niet-viabele cellen. Cellen die als viabel worden beschouwd zijn Annexin V-FITC negatief en PI negatief. Verdere informatie omtrent dit principe is beschikbaar in Addendum II.3.

2.7.2.

Viabiliteitsbepaling zonder toevoeging van CSE.

De cellen worden na isolatie gewassen met PBS en geresuspendeerd in Annexin Binding Buffer (1/10 verdund, 1x106 cellen/ml, 51-66121E). In 4 facstubes wordt 100µl van de oplossing (1x105 cellen) gebracht. De eerste tube is een blanco tube, dwz dat er enkel buffer aanwezig is en geen Annexin V-FITC (Fluorescent Isothiocyanaat) en PI (Propidium Jodide). In de 2e en 3e tube wordt resp. enkel 5µl Annexin V-FITC (51-64874X) en 5µl PI (5166211E) toegevoegd. In de 4e tube werd Annexin V-FITC en PI toegevoegd. De cellen 23

worden 15’ geincubeerd op kamertemperatuur. Nadien wordt 400µl Binding Buffer toegevoegd en worden de cellen geanalyseerd via flow cytometrie. Door de combinatie PI en Annexin te gebruiken worden cellen gekleurd die reeds apoptose hebben ondergaan als cellen in de vroege apoptotische fase.

2.7.3.

Viabiliteitsbepaling met toevoeging van CSE.

De cellen worden na isolatie in cultuur gebracht in 24 well-plaat met 10ng/ml IL-3 en CSE 0-5%. Na overnacht incuberen wordt het protocol gevolgd dat hierboven werd vermeld.

2.8.

Cultuur van pDC in aan- of afwezigheid van CSE.

Gezuiverde pDCs werden overnacht in cultuur gebracht in 1ml DCM in aanwezigheid van 10 ng/ml IL-3 (Peprotech, London, UK), wat de viabiliteit bevordert van pDC’s. Dit volume wordt verdeeld over 4 wells van een 24 well plaat. 250µl van de celsuspensie wordt overgebracht naar een 24-well plaat. In het resterende volume wordt ofwel gestimuleerd met 1 µg/ml CD40L (L21456c, Alexis Corporation, San Diego, CA), met TLR-liganden nl, 3 µg/ml CpG-oligodeoxynucleotiden (ODN 2216, Invivogen, San Diego, CA) of 10µg/ml imiquimodR837 (Invivogen, San Diego, CA). Het resterende volume wordt verdeeld over 3 andere wells. Hieraan wordt 0% , 0,5% en 1% CSE toegevoegd. Na overnacht incubatie (18-24h) wordt het supernatans verzameld voor cytokine bepaling en worden de cellen gewassen met FACS-buffer. 105 cellen worden overgebracht in FACS-tubes, gecentrifugeerd en het supernatans wordt verwijderd. pDC werden gepreincubeerd met humaan IgG (100µl, 500µg/ml) om niet specifieke bindingen te minimaliseren en geincubeerd op ijs gedurende 20’. Na incubatie worden de cellen gecentrifugeerd en het supernatans verwijderd. De cellen werden nadien gelabeled met monoclonale antilichamen (Tabel 5) en bijhorende isotypes. Flow cytometrische data acquisitie werd uitgevoerd op FACS Calibur met 488 nm en 633 nm lasers met Cellquest software (Becton dickinson, San Diego, CA) FlowJo software werd gebruikt voor data analyse op PowerMac G4 (www.treestar.com/flowjo). Er werd gegated op CD123+/PI- cellen om de expressie van de antigenen te bepalen.

24

Tabel 7. Monoclonale antilichamen met vermelding van isotype en fluorochroom.

Antigen CD80 CD83 CD86 HLA-DR CD123 PI

2.9.

clone BB1 HB15e 2331 (FUN-1) TU36 7G3

isotype mouse IgMκ mouse IgG1κ mouse IgG1κ mouse IgG2bκ mouse IgG2a,κ

fluorochroom FITC FITC FITC PE APC

bedrijf BD BD BD BD BD BD

cat nr 555683 556910 555657 555561 560087 55654c

volume 20µl 20µl 20µl 20µl 20µl 5µl

Detectie van IFN-α in bewaard supernatans dmv Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - ELISA

2.9.1.

Materialen.

Human IFN-α ELISA Kit ( PBL Interferon Source , #41100). De stalen bestaan uit het supernatans dat bewaard werd na overnacht incubatie van pDC na blootstelling aan CpG, imiquimod en verschillende concentraties aan CSE.

2.9.2.

Methoden.

Alvorens te starten met de ELISA wordt de reagentia bereidt. 50ml wasbuffer wordt verdund tot een volume van 1000ml. Nadien werd de standaard gemaakt zoals aangegeven. We maken gebruik van de ‘Extended Range standard curve’ (5000 pg/ml, 2500 pg/ml, 1250 pg/ml, 625 pg/ml, 312 pg/ml, 156 pg/ml). Het supernatans wordt verdund (1/2 – 1/50). Nadien wordt het aantal microtiterplaten bepaald, nodig voor de standaards, blanco en stalen in duplo. 100 µl van deze standaarden, blanco en stalen worden in de wells gebracht. Na 1h incubatie op KT worden de wells 1x gewassen met wasbuffer. Nadien wordt 100 µl van het AL op de wells gebracht en geincubeerd voor 1h. Na incubatie worden de wells 3x gewassen. Na het wassen wordt 100µl van de HRP (Horse Radisch Peroixidase) oplossing aan de wells gevoegd. Na 1h incubatie worden de cellen 4x gewassen en 100µ TMB (Tetramethylbenzidine dihydrochloride) substraat wordt toegevoegd. Na 15’ wordt er 100 µl stopoplossing toegevoegd per well. De absorbantie wordt bepaald bij 450nm na max 5 min na toediening van de stopoplossing.

25

2.10. Detectie van inflammatoire cytokines dmv Cytometric Bead Array CBA. 2.10.1.

Principe.

De 6 beads die dienen voor de bepaling van IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF en IL-12p70 hebben een verschillende fluorescentie intenstiteit en zijn specifiek gecoat voor binden van antilichamen. De fluorescentie wordt gedetecteerd in een rood kanaal (FL3/FL4) Deze populatie vormt de CBA. De detector antilichamen zijn PE-geconjugeerd. De beads, antilichamen en stalen worden samen geincubeerd waardoor ze sandwichcomplexen vormen. Na data acquisitie door de flow cytometer wordt via BD CBA Analysis Software de date gegenereerd in grafische of tabelvorm.

2.10.2.

Materialen.

Voor de detectie van inflammatoire cytokines wordt gebruik gemaakt van de Human Inflammatory Cytokines Kit (551811 – BD). Deze kit bevat het nodige materiaal voor analyse van 50 stalen via CBA: Human inflammatory Cytokins Capture BeadsCytometer Setup Beads, Human inflammatory Cytokines PE Detection Reagent, Human inflammatory Cytokines Standards, PE Positieve Control Detector, FITC Positive Control Detector, Buffer Reagentie: Wasbuffer, Assay Diluent, Serum Enhancement Buffer. Het supernatans dat bewaard werd is afkomstig van celculturen na stimulatie.

2.10.3. 2.10.3.1.

Methode. Bereiding van de Human Inflammatory Cytokine Standaard.

De gelyofilliseerde standaard wordt overgebracht in een 15ml tube. Hier wordt 2ml Assay Diluent aan toegevoegd. Voor het resuspenderen mag er geen gebruik gemaakt worden van vortex enkel resuspenderen met pipet is toegestaan. De standaard moet 15’ rusten alvorens de verdunningen worden gemaakt. De volgende verdunningen worden gemaakt: ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256. Dit gebeurd door elke 15ml falcon te vullen met 300µl Assay Diluent. Er wordt gebruikt gemaakt van een serie-verdunning. Hierbij wordt 300µl van de standaard overgebracht naar de ½-tube. Dit wordt telkens verder verdund.

2.10.3.2.

Bereiding van de Mixed Human Inflammatory Cytokine Capture Beads.

Alvorens te starten dient het aantal tubes bepaalt te worden. Dit aantal bestaat het uit 26

het aantal stalen dat geanalyseerd moet worden, 9 standaard verdunningen en 1 negatieve controle. De beads worden voor een paar seconden stevig gevortexd. Per staal is 10µl Capture Beads nodig. Dit volume wordt vermenigvuldigd met het aantal stalen en overgebracht in tube. Dit wordt uitgevoerd voor alle beads.

2.10.3.3.

Uitvoering van Human inflammatory Cytokines Kit Assay Procedure.

De Mixed Capture Beads worden gevortexd en in elke tube wordt 50µl gebracht. Aan elke tube wordt ook 50µl Human Inflammatory Cytokines PE Detection Reagent toegevoegd. In de controle tubes wordt 50µl van de Human Inflammatory Cytokines Standard Dilution toegevoegd. In de staaltubes wordt 50µl van elke staal toegevoegd. Na 3h incubatie op kamertemperatuur en afgeschermd van licht wordt 1ml Wash Buffer toegevoegd en gecentrifugeerd (200g- 5’). Na verwijdering van supernatans wordt 300µl Wash Buffer toegevoegd en wordt de pellet geresuspendeerd. De stalen zijn nu klaar voor analyse op flowcytometer.

3. Resultaten. 3.1.

Aanwezigheid en karakterisatie van pDC’s in de kleine luchtwegen..

De aanwezig van pDC werd onderzocht in 79 personen: 10 nooit-rokers, 12 huidige rokers zonder COPD, 14 ex-rokers zonder COPD, 22 rokers met COPD I-II en 12 ex-rokers met COPD I-II, 9 ex-rokers met COPD I-IV. De karakteristieken van de patiënten worden weergegeven in Tabel 8.

Representatieve vriescoupes, gekleurd met de anti-humaan BDCA-2 (Blood Dendritic Cell Antigen 2) zijn afgebeeld in figuur 9. BDCA-2 is een specifieke merker voor pDCs. Deze cellen zijn voornamelijk gelocaliseerd in de lamina propria en adventitia van de kleine luchtweg (Figuur 9A.)

BDCA-2+ pDC’s worden frequent aangetroffen in lymfoide

aggregaten (Figuur 9B.)

27

Tabel 8. Patiënt karakteristieken: Immunohistochemische analyse van pDC’s. Waarden worden

Never smokers

Current smokers without COPD

Ex-smokers without COPD

COPD I-II Current smokers

COPD I- II Ex-smokers

COPD III-IV Ex-smokers

gegeven als gemiddelde (SD).

10

12

14

22

12

9

56,3 ±11,2

55,2 ± 10,9

63, 7 ± 7,4

62,7 ± 9,1

68,9 ± 6,9

57,1 ± 5,23

-

30,8 ± 12,8

39,1 ± 35,8

47,6 ± 20,9

40,5 ± 23,1

44,5 ± 2,73

-

0,2 ± 0,23

18 ± 10,3

-

9,8 ± 7,6

5,1 ± 2,73

FEV1 (% )

100,6 ± 12,1

103,2 ± 13,9

102,6 ± 19,1

75,2 ± 12,6

83,7 ± 11,5

26,7 ± 10,4

FEV1 (L)

2,8 ± 0,9

3,1 ± 0,5

3,2 ± 0,9

2,4 ± 0,49

2,6 ± 0,4

0,7 ± 0,29

Tiffeneau (%)

77,3 ± 7,3

77,8 ± 5,7

76,2 ± 5,8

57,6 ± 8,0

60,1 ± 6,2

36 ± 10,37

N (79) Age Smoking history (py) Quit smoking (in years)

A

B

Figuur 9. Accumulatie van plasmacytoïde dendritische cellen in de luchtwegen. pDC worden geïdentificeerd als roos kleurende BDCA-2+ cellen door gebruik te maken van immuhistochemische kleuring voor BDCA-2. A) aanwezigheid van BDCA-2+ cellen in de lamina propria en adventitia. B) Associatie van BDCA-2+ cellen met lymfoïde aggregaten. De zwarte pijl duidt BDCA-2+ cellen aan.

Tabel 9 geeft het gemiddeld aantal BDCA-2+ cellen per mm2 weer die aanwezig zijn in het epitheel, lamina propria en adventitia bij de groepen patiënten. BDCA-2+ cellen zijn vooral aanwezig in de lamina propria en adventitia. Zowel in het epitheel, lamina propria en adventitia werd er tussen de groepen geen significant verschil behaald (resp. p = 0,601, p = 6,14, p = 0,835). Figuur 10 geeft grafisch de resultaten weer uit tabel 2 (Addendum I).

28

Tabel 9. Gemiddelde waarden van BDCA-2+ cellen in epitheel, lamina propria en adventitia. Epitheel (mean ± SD) Lamina propria (mean ± SD) Adventitia (mean ± SD)

Never smokers

Smokers Ex-smokers without COPD without COPD

COPD I-II Smokers

COPD I-II ex-smokers

4,67 ± 6,27

2,67 ± 7,20

10,7 ± 21,31

8,15 ± 13,89 6,5 ± 9,53

4,77 ± 6,74

COPD III-IV ex-smokers

9,17 ± 12,64 5,05 ± 12,17 17,23 ± 31,16 18,27 ±38, 95 10,15 ±15,61 3,5 ± 6,77 13,69 ±18,07 27,12 ±43,12 24,71 ±30, 83 20,49 ± 28,51 17,35 ±20,63 20,7 ±21,09

De waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SD. BDCA-2+ cellen zijn vooral gelokaliserd in het epitheel en lamina propria. Er wordt geen significant verschil gezien tussen de groepen.

3.2.

Karakterisatie van chemokinereceptoren bij pDC’s in de humane long.

Teneinde inzicht te krijgen in de infiltratie van de long door pDCs werd de expressie van chemokinereceptoren op pDCs geëvalueerd. De expressie van CXCR3, CXCR4 en CCR7 werd bestudeerd. Figuur 11 geeft de gekozen venstermethode weer. Binnen de Lin- cellen (CD3-CD19-) werd er gekeken naar de expressie van CXCR3-4 en CCR7 bij BDCA-2+ cellen. De expressie van de receptoren wordt weergegeven in histogramvorm. De cellen werden als positief beschouwd als hun fluorescentiesignaal hoger is dan het punt waar het isotype de as snijdt. De resultaten weergegeven in figuur zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. De expressie van CXCR3 bedraagt 76,6% ± 5,0 (gemiddelde ± SD). De expressie van CXCR4 bedraagt 44,5% ± 26,3 (gemiddelde ± SD). De expressie van CCR7 bedraagt 2,25% ± 0,86 (gemiddelde ± SD). B)

10 4

10

4

10 3

10

3

10 2

10

1

9.41 9.55

80

200

400 600 800 FSC-H: FSC-Height

1000

60

40 98.2

1

1.77

20

7.1 0

0.14

10 2

10

10 0

C) 100

% of Max

FL4-H: BDCA-2 APC

FL1-H: CD3 and CD19 FITC

A)

89.8

10 0 10

0

0.68 10

1

10

2

10

3

10

CCR7

0 4

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

CCR7 -

Figuur 11. Gebruikte vestermethode. A) Venstering op Lin -cellen. B) beeld van A. venstering op BDCA-2+ -cellen. C-F) Histogram van resp. CCR7, CXCR3-4-expressie zonder en met isotype. In deze figuur (c) wordt de expressie van CCR7 getoond met isotype.Volledige figuur is aanwezig in addendum I.

29

3.3.

In vitro functionele evaluatie van pDC’s.

3.3.1.

Zuiverheidsbepaling van pDC’s geisoleerd via Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit.

Om de zuiverheid te bepalen werden de cellen na isolatie geanalyseerd via FACS. Er werd gekeken naar het aantal BDCA-2+ cellen en CD123+ cellen. BDCA-2 is een merker specifiek voor pDC’s, CD123 (IL-3R) wordt geëxpresseerd door pDC’s maar is nietspecifiek. Beide analyses werden uitgevoerd op CD45+ cellen. Telkens werden er 2 populaties waargenomen. Het percentage van CD123+ cellen bedroeg 90,8% (Figuur 12A). Het percentage van BDCA-2+ cellen 89.5% (Figuur 12B). De CD123- cellen kunnen niet-pDC’s zijn die de kit niet heeft tegen gehouden. BDCA-2- cellen zijn ofwel mature pDC’s of nietpDC’s die niet werden tegen gehouden.

CD123+ cellen.

A.

10 4

1000

9.09

89.4 200

10 FL4-H: CD45 APC

SSC-H: SSC-Height

800

600

400

6.87

200

0 0

200

400 600 800 FSC-H: FSC-Height

3

150

10

97.8

2

100

10

1

10

0

1000

1.02 10

0

0.52 10

1

Ungated

2

10 10 FL2-H: CD123 PE

3

10

90.8

9.25

50

0 10 0

4

10 1

10 2

10 3

10 4

BDCA-2+ cellen.

B.

10 4

1000

10.3

88.5 60

600

400

3.05

200

10

3

10

2

10

1

98.6

# Cells

FL4-H: CD45APC

SSC-H: SSC-Height

800

40

20 10.5 89.5

0

10 0

Ungated

200

400 600 FSC-H: FSC-Height

800

1000

0.46

0

10

0

0.79 10

1

2

10 10 FL2-H: BDCA2 PE

3

10

0 4

10

0

10

1

2

10 10 FL2-H: BDCA2 PE

3

10

4

Figuur 12. Zuiverheidsbepaling. A) Expressie van CD123+ cellen bedraagt 90,8%. B) Expressie van BDCA-2+ cellen bedraagt 89,5%. Beide expressies werden bepaald op CD45+-cellen.

30

3.3.2.

Viabiliteitsbepaling van pDC met en zonder toevoeging van CSE.

Alvorens het effect van cigarette smoke (CSE) op de costimulatoire moleculen van pDC te bepalen bij verschillende concentraties van CSE werd het effect van CSE op de viabiliteit van pDC bepaald. Dit gebeurde door toevoeging van Annexin-V en PI. Eerst werd de viabiliteit bepaald van pDC vlak na isolatie en zonder toevoeging van CSE. Figuur 13 geeft de gebruikte venstermethode weer. Deze methode werd ook gebruikt in de andere viabiliteitsexperimenten. De gewenste cellen worden geselecteerd (Figuur 13A) en hierin wordt naar PI en Annexin-V expressie gekeken (Figuur 13B). Viabele cellen zijn cellen die dubbel negatief zijn voor PI en Annexin-V. De viabiliteit bedraagt 90%. 10 4

1000

FL1-H: Annexin-FITC

SSC-H: SSC-Height

800

600

400

81.8

10

7.06

1.6

3

10 2

10 1 200

A

B

0 0 Ungated

200

400 600 FSC-H: FSC-Height

800

10 0

90 10 0

1000

1.36 10 1

10 2 FL3-H: PI

10 3

10 4

pDC

Figuur 13. Venstermethode voor viabiliteitsbepaling. Viabele cellen zijn annexin-V en PI negatief. Na overnacht cultuur bedraagt de viabiliteit 90%

In 3 experimenten wordt het effect van overnachting op de viabiliteit van pDC bij verschillende concentraties aan CSE bepaald. De viabiliteit van de cellen die niet werden blootgesteld aan CSE bedraagt gemiddeld 91,7%. Wanneer aan de overnacht cultuur, welke reeds IL-3 bevat CSE, werd toegediend, treedt er een dosisafhankelijke daling van de viabiliteit op. Tabel 10 geeft de bekomen resultaten weer van 3 experimenten (Addendum I). In een 1e experiment werd de viabiliteit bepaald bij 1-5% CSE. Bij concentratie groter dan 2% werd een te sterke daling van viabiliteit gezien. Omwille van deze reden werd in verdere experimenten niet meer gewerkt met concentratie hoger dan 2-3%. Bij het 2e experiment bleef de viabiliteit groter dan 90% bij concentraties lager dan 2%. Bij een concentratie van 2% bedraagt de viabiliteit 89,7%. In een 3e experiment bedraagt de viabiliteit reeds 77% zonder toevoeging van CSE (Tabel 10, Addendum I). Uit alle experimenten blijkt dat bij concentraties groter dan 2% CSE er een te sterke daling in viabiliteit optreedt. Tabel 11 geeft de relatieve daling weer van viabiliteit van pDC’s. De eerste waarden werden beschouwd als maximale viabiliteit die bekomen werd. Deze werd voorgesteld als 100%. t.o.v maximale 31

viabiliteit die bekomen werd. Tabel 11. Absolute viabiliteit. Experiment 1 Relatieve viabiliteit Daling Experiment 2 Relatieve viabiliteit Daling Experiment 3 Relatieve viabiliteit Daling

1% CSE 100

2% CSE 99 1 0,5% CSE 99,2 0,8 0,5% CSE 93,6 6,4

0% CSE 100 0% CSE 100

3% CSE 94,5 5,5 0,75 % CSE 99,5 0,5 1% CSE 100,9 + 0,9

4% CSE 81,1 18,9 1% CSE 98,9 1,1 2% CSE 84,7 13,3

5% CSE 75,9 24,1 2% CSE 97,5 2,5 3% CSE 77,8 22,2

De eerste waarden vormen de maximale viabiliteit die bekomen werden in de experimenten. Deze worden voorgesteld als 100%. T.o.v deze waarde werd de absolute viabiliteit en de relatieve daling in viabiliteit bepaald.

Figuur 14 geeft de gemiddelde waarden weer van viabele cellen bij verschillende concentraties CSE. Hierop is duidelijk dat bij een concentraties van CSE hoger dan 2% de viabiliteit te sterk daalt. Er wordt gekozen om de expressie van costimulatoire moleculen te bepalen bij een concentratie van 0 - 0,5 - 1% CSE. Bij elk experiment dat overnacht incubatie vereist van pDC wordt IL-3 toegevoegd. In verscheidene studies wordt vermeld dat de aanwezigheid van IL-3 noodzakelijk is voor viabiliteit van pDC’s [27,30]. 1 experiment wordt uitgevoerd zonder toevoeging van IL-3. De viabiliteit wordt hier bepaalt op CD123+ cellen en door toediening van enkel PI. De viabiliteit bedraagt 24,7%. Hiermee tonen we aan dat toevoeging van IL-3 essentieel is voor celculturen met pDC’s (Figuur 15 Addendum I). Viabiliteitsbepaling bij verschillende concentraties CSE

100

91.7

91

91.3

91.65 90.60

87.50

75.1

70.30

m ean %

Viabiliteit

75 50 25 0 E E E E E E E E CS CS CS CS CS CS CS CS % % % % % % % % 0 0.5 .75 1 2 3 4 5 0

Figuur 14. Viabiliteitsbepaling bij verschillende concentraties CSE. De waarden worden weergegeven als gemiddelde. Enkel de viabiliteit van bij 1% en 2% CSE werd 2x bepaald (SEM resp. 0,9 en 1,2)

32

3.3.3.

Expressie van costimulatoire moleculen (maturatiemerkers) na blootstelling aan verschillende concentraties CSE – gebruikte venster-methode.

Voor de analyse van de expressie van de maturatiemerkers CD80, CD83, CD86 en HLA-DR, werd bij FlowJo analyse gekeken naar CD123+ PI- cellen. Figuur 15 geeft de gebruikte gate-methode weer. De bekomen histogrammen werden vergeleken met de isotypes controle kleuringen, zodat de positieve cellen kunnen geselecteerd worden. De cellen worden als positief beschouwd als hun fluorescentiesignaal hoger is dan het punt waar het isotype de

10

1000

800

4

70.6 70.9

26.6

10 3 FL4-H: CD123 APC

SSC-H: SSC-Height

as snijdt.

600

400

10 2

10 1 200

A

B

0 0

200

400 600 FSC-H: FSC-Height

800

Expressie CD80

C

10 0

2.15 10 0

1000

0.68 10 1

10 2 FL3-H: PI

Isotype CD80

10 3

10 4

Expressie + Isotype 100

30

80

55.3

55.3

80 42.3

42.3 % of Max

# Cells

# Cells

60 20

40

60

40

10 20

0

20

0 10 0

10 1

10 2 10 3 FL1-H: CD80 FITC

10 4

0 10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2 10 3 FL1-H: mIgM k FITC

10 4

CD80

Figuur 15. Vensteringsmethode bij de analyse van maturatiemerkers van pDC na blootstelling aan CSE. A) Eerste beeld dat wordt verkregen via analyse op FlowJo. De omkaderde cellen worden gebruikt voor verdere analyse. B) Deze cellen zijn dezelfde als in punt A. Er wordt hierin geselecteerd op CD123+ PI- - cellen. C) CD80. D) CD83. E) CD86. F) HLA-DR. De gegeven waarden vormen de negatieve en positieve populatie. K-N. Figuur 15D-F zijn beschikbaar in Addendum I.

33

3.3.4.

CSE inhibeert expressie van costimulatoire moleculen van pDC na toediening van CpG.

Om na te gaan of CSE de maturatie van pDC inhibeert of activeert na stimulatie met CpG werden pDC overnacht geincubeerd bij verschillende concentraties van CSE (0-1%). pDC zijn afkomsting uit PBMC na isolatie. Uit humaan bloed werden voor isolatie gemiddeld 1,15x108 ± 0,17x108 PBMC’s geisoleerd (gemiddelde ± SEM) . Na verdere isolatie met Milteyni pDC isolatie kit werden gemiddeld 1,0357x106 ± 0,05x106 (gemiddelde ± SEM) pDC bekomen. Dit wordt weergegeven door figuur 16. De p-waarde is 0.0002. p<0.05

10 9

# cellen

10 8 10 7 10 6 10 5 PBMC

pDC

Figuur 16. Isolatie van PMBC en pDC uit humaan bloed. Aantal PBMC na isolatie uit bloed bedraagt 1.15x108 ± 0,17x108. Aantal pDC’s aanwezig in PBMC bedraagt 1,0357x106 ± 0,05x106 De gebruikte test is de Mann Witney U-test (n=8, p=0,0002). Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM.

Na 18-24h incubatie met 3µg/ml CpG werd maximale expressie bekomen van costimulatoire moleculen (in figuur weergegeven als 100%, 0% CSE). De % vertegenwoordigen een procentuele verandering in de expressie, waarbij 100% de maximale respons is van de maturatiemerker op toediening van CpG zonder CSE.

Na overnacht

incubatie met CpG en 0,5% en 1% CSE werd de opregulatie van CD80, CD83 en CD86 geinhibeerd. De graad van inhibitie was verschillend tussen de verschillende proeven, maar de trend van inhibitie is consistent tussen alle proeven (CD80; n=2, CD83; n=3, CD86; n=2). Figuur 17 geeft duidelijk weer dat de inhibitie dosisafhankelijk is en dat in vergelijking met CD83 en CD86 de inhibitie van opregulatie van CD80 het minst beïnvloed werd . Figuur 18 (Addendum I) geeft een overzicht weer van de verschillende merkers uit een individuele proef.

34

In vergelijking met CD80, CD83 en CD86 was de expressie van HLA-DR (MHC-ΙΙ) reeds hoog zonder toediening van CpG. De expressie bedroeg gemiddeld 99,1% (n=3). Het is duidelijk dat toediening van CpG niet voor bijkomende expressie van HLA-DR kan zorgen. De bijkomende expressie is hierdoor niet duidelijk zichtbaar. Wanneer naar het gemiddelde gekeken werd van de 3 proeven stijgt de expressie na toediening van CpG licht. Toediening van CSE gaf geen consistente resultaten bij de 3 proeven. Bij toediening van 0,5% en 1% CSE bedroeg de expressie van CD80 ivm de maximale expressie van 100% resp. nog 77,6% ± 22,6 en 61,1% ± 28,5 (resp. p = 0,451, p = 0,603, n=2). De expressie van CD83 bedroeg resp. 53,46% ± 6,16 en 38,78% ± 13,1 (resp. p= 0,017, p = 0,043, n=3). De expressie van CD86 bedroeg resp. 44,70% ± 15,70 en 33,25% ± 11,25 (resp. p = 0,176, p = 0,106, n=2). De waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. De resultaten worden als significant beschouwd als p<0.05

Expressie van maturatiemerkers

% of change

* 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

*

1%CSE 0,5% CSE 0%CSE * p < 0,05

CD80

CD83

CD86

HLA-DR

Figuur 17. CSE inhibeert de opregulatie van co-stimulatoire merkers na stimulatie met CpG. Gating op PI negatieve cellen. De trend van inhibitie is consistent in alle proeven. De grafieken worden weergegeven al gemiddelde ± SEM. De % vertegenwoordigen een procentuele verandering in de expressie, waarbij 100% de maximale respons is van de maturatiemerker op toediening van CpG zonder CSE. Na toediening van 0,5% CSE en 1% CSE bedraagt de expressie van CD80 resp. nog 77,6% ± 22,6 en 61,1% ± 28,5 (resp. p = 0,451, p = 0,603, n=2). De expressie van CD83 bedroeg resp. 53,46% ± 6,16 en 38,78% ± 13,1 (resp. p= 0,017, p = 0,043, n=3). De expressie van CD86 bedroeg resp. 44,70% ± 15,70 en 33,25% ± 11,25 (resp. p = 0,176, p = 0,106, n=2). De waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. De resultaten worden al significant beschouwd als p<0. % CSE bedraagt nog 100.66% ± 0.82, bij 1% CSE 101.72 ± 1.56 (n=3). De resultaten worden al significant beschouwd als p<0.05. (*, p<0.05 vergeleken met cultuur zonder blootstelling aan CpG en CSE.)

35

3.3.5. Viabiliteit na toediening van CpG en CSE.

Om aan te tonen dat de inhibitie van opregulatie niet veroorzaakt wordt door cellulaire toxiciteit en celdood, werd de viabiliteit bepaald van CD123+ cellen. De expressie van de costimulatoire moleculen werd geanalyseerd op viabele CD123+ cellen. De gebruikte venstermethode werd reeds besproken evenals de viabiliteit van pDC zonder blootstelling aan CpG en CSE. Figuur 19A geeft de gemiddelde viabiliteit weer bij de verschillende concentraties CSE. Er treedt een daling op van viabiliteit na toediening van CpG in aan of afwezigheid van CSE. De viabiliteit in een resp CpG-/CSE-, CpG+/CSE-, CpG+/CSE 0,5% en CpG+/CSE 1% cultuur bedraagt 72,33% ± 11,8, 65,98% ± 5,187, 56,92% ± 5,312 en 56,88% ± 5,605. Deze waarden worden weergegeven als gemiddeld ± SD. Figuur 19B geeft de viabiliteit weer van een individueel experiment. Viabiliteit bij CpG en/of CSE stimulatie 72.33%

80

65.98%

56.92%

56.88%

mean%

CpG-/CSECpG+/CSECpG+/CSE 0.5%

70

Viabiliteit

60 50

CpG+/CSE 1%

40 30 20 10

A

0

50 30

30

20

20

50

40

# Cells

# Cells

# Cells

# Cells

40 30

20

20

81

10

10

B

74.2

19.6

10 2 FL3-H: PI

CpG-/CSE-

103

104

100

10 1

10 2 FL3-H: PI

CpG+/CSE-

103

10

23.5

25.8

0

0 101

76.5

10

80.4

19

100

30

104

0

0 100

101

10 2

10 3

104

10 0

101

10 2

10 3

10 4

PI CpG+/CSE0,5%

CpG+ /CSE 1%

Figuur 19. Viabiliteit van pDC’s bij CpG en CSE stimulatie. A) De viabiliteit in een resp CpG/CSE-, CpG+/CSE-, CpG+/CSE 0,5% en CpG+/CSE 1% -cultuur bedraagt 72,33% ± 11,8, 65,98% ± 5,187, 56,92% ± 5,312 en 56,88% ± 5,605. Deze waarden worden weergegeven als gemiddeld ± SD. B) geeft de viabiliteit weer van een individueel experiment. Een grotere grafiek is aanwezig in addendum I.

36

3.3.6.

CSE inhibeert expressie van costimulatoire moleculen van pDC na toediening van imiquimod.

Om na te gaan of CSE de maturatie van pDC inhibeert of activeert na stimulatie met imiquimod worden pDC overnacht geincubeerd bij verschillende concentraties van CSE (01%). pDC zijn afkomsting uit PBMC na isolatie. Uit humaan bloed werden voor isolatie 8,14x107 ± 3,45x107) PBMC’s geisoleerd. Na verdere isolatie met milteyni pDC isolatie kit werden 1,08x106 ± 0,34x106 pDC bekomen. Dit wordt weergegeven door onderstaande figuur. De p-waarde is 0.0002. (Figuur 20) p<0,05

number of cells

10 9 10 8 10 7 10 6 10 5 PBMC

pDC

Figuur 20. Isolatie van PMBC en pDC uit humaan bloed. Aantal PBMC na isolatie uit bloed bedraagt 8,14x107 ± 3,45x107. Aantal pDC’s aanwezig in PBMC bedraagt 1,08x106 ± 0,34x106. De waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SD. De gebruikte test is de Mann Witney U-test. (n=4, p=0,0182).

Na 18-24h incubatie met 10µg/ml imiquimod wordt maximale expressie bekomen van costimulatoire moleculen (voorgesteld in de figuur als 100%, zonder CSE toediening). De % vertegenwoordigen een procentuele verandering in de expressie, waarbij 100% de maximale respons is van de maturatiemerker op toediening van CpG zonder CSE. Na overnacht incubatie met imiquimod en 0,5% en 1% CSE wordt de opregulatie van CD80, CD83 en CD86 geïnhibeerd. Net zoals bij stimulatie met CpG is ook hier de graad van inhibitie verschillend tussen de verschillende experimenten, maar de trends van inhibitie is eveneens consistent tussen alle groepen. De resultaten die bekomen worden zijn vergelijkbaar met de resultaten bekomen na stimulatie met CpG. Figuur 21 geeft duidelijk weer dat de inhibitie van de costimulatoire moleculen dosisafhankelijk is. Ook in deze experimenten was de expressie van HLA-DR reeds maximaal zonder toevoeging van imiquimod en CSE. Toediening van 37

imiquimod kan voor geen extra expressie meer zorgen. De toediening van 0,5% en 1% CSE gaf geen daling in expressie van HLA-DR. Dit in tegenstelling tot CD80, CD83 en CD86. Bij toediening van 0,5% CSE en 1% CSE bedroeg de expressie van CD80 ivm de maximale expressie van 100% naar resp. 88,5% ± 9,19 en 72,6% ± 4,24 (resp. p = 0,328, p = 0,069, n=2) ivm de maximale expressie van 100%. De expressie van CD83 daalde resp. naar 57,05 % ± 7,41 en 0,03% ± 0,04 ( resp. p = 0,077 en p<0,05, n=2) ivm de maximale expressie van 100%. De expressie van CD86 daalde resp. naar 56,1% ± 4,99 en 48,7% ± 2,4 (p<0,05, n=2). De expressie van HLA-DR daalde naar resp 99,5% ± 0,6 en 99,85 ±0,25 (n=2). De waarden worden weergegeven als gemiddeld ± SEM. Figuur 21 wordt ook weergegeven als gemiddelde met SEM. De waarden zijn significant als p<0,05. Figuur 22 geeft de histogrammen weer van een individueel experiment.

% of change

Expressie van maturatiemerkers 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

*

* *

0% CSE 0,5% CSE 1 % CSE * p<0,05

CD80

CD83

CD86

HLA-DR

Figuur 21. CSE inhibeert de opregulatie van costimulatoire moleculen na blootstelling aan imiquimod. Gating op PI negatieve cellen. De trend van inhibitie is consistent in alle proeven. De grafieken worden weergegeven al gemiddelde ± SEM. De % vertegenwoordigen een procentuele verandering in de expressie, waarbij 100% de maximale respons is van de maturatiemerker op toediening van CpG zonder. In vergelijking met de maximale expressie bedraagt na toediening van 0,5% en 1% CSE de expressie van CD8 resp. 88,5% ± 9,19 en 72,6% ± 4,24 (resp. p = 0,328, p = 0,069, n=2) ivm de maximale expressie van 100%. De expressie van CD83 bedraagt resp. naar 57,05 % ± 7,41 en 0,03% ± 0,04 ( resp. p = 0,077 en p<0,05, n=2). De expressie van CD86 bedraagt resp. naar 56,1% ± 4,99 en 48,7% ± 2,4 (p<0,05, n=2). De expressie van HLA-DR daalde naar resp 99,5% ± 0,6 en 99,85 ±0,25 (n=2). De resultaten worden al significant beschouwd als p<0.05. De p-waarde van niet-significante resultaten wordt vermeld in de figuur. (*, p<0.05, vergeleken met cultuur zonder blootstelling aan imiquimod en CSE.)

38

3.3.7.

Viabiliteit na toediening van imiquimod en CSE.

Om aan te tonen dat ook hier de inhibitie van opregulatie niet veroorzaakt werd door cellulaire toxiciteit en celdood, werd de viabiliteit bepaald van CD123+ cellen. De expressie van de co-stimulatoire moleculen werd geanalyseerd op viabele CD123+ cellen. Figuur 23A geeft de viabiliteit weer bij verschillende concentraties CSE. De viabiliteit in cultuur met resp. IMQ-/CSE- , IMQ+/CSE-, IMQ+/CSE 0,5% CSE, IMQ+/CSE 1% bedraagt 84,9% ± 13,17, 87,8% ± 3,93, 86,08% ± 4,2, 86,83% ± 3,75. De resultaten zijn weergegeven als gemiddelde ± SD. Figuur 23B geeft de viabiliteit weer van 1 individueel experiment. De resultaten zijn representatief voor alle experimenten. viabiliteit bij imiquimod en/of CSE

Viabiliteit

100

84.9%

87.8%

86.08%

86.83%

mean

75

IMQ-/CSEIMQ+/CSE-

50

IMQ+/CSE 0.5% IMQ+/CSE 1%

25

A 0

30

15

20

10

40

40

30

87.2

5

10

# Cells

# Cells

# Cells

# Cells

30

20

12.9

20

89.3 10

91.8

91.4

10

10.7

8.03

9.05

0

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

0

0

10

0

10

1

2

10 FL3-H: PI

10

3

10

4

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

0

10

1

10

2

10 3

10 4

PI

B IMQ-/CSE-

IMQ+/CSE-

IMQ+/CSE0,5%

IMQ+ /CSE 1%

Figuur 23. Viabiliteit bij imiquimod en CSE stimulatie. A) De viabiliteit in cultuur met resp. IMQ/CSE- , IMQ+/CSE-, IMQ+/CSE 0,5% CSE, IMQ+/CSE 1% bedraagt 84,9% ± 13,17, 87,8% ± 3,93, 86,08% ± 4,2, 86,83% ± 3,75. De resultaten zijn weergegeven als gemiddelde ± SD. B) viabiliteit van 1 individueel experiment. De resultaten zijn representatief voor de verschillende experimenten. Een grotere grafiek is aanwezig in addendum I.

39

3.3.8.

Analyse van cytokine vrijsstelling door pDC’s na stimulatie van TLR met imiquimod en CpG.

TLR herkennen pathogen associated molecular patters en zorgen voor de initiatie van de immuunrespons. Om de functie van pDC’s te achterhalen werden ze gestimuleerd met imiquimod en CpG. Na stimulatie met imiquimod (TLR-7 ligand) stelden bloed pDC’s significant meer TNF-α en IL-8 vrij (68,98 pg/ 105 cellen ± 8,35 en 417,62pg/105cellen ± 46,57) in vergelijking met niet gestimuleerde pDC’s (3,39pg/105 cellen ± 0,9, en 17,27pg/105cellen ± 1,94, p<0,05 voor beide cytokines) (Figuur 24a,c). Alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Deze resultaten bevestigen de resultaten van Demedt I, et al op long pDC’s [35]. In tegenstelling tot de resultaten van Demedts I, resulteert stimulatie met imiquimod ook in een significante vrijstelling van IL-6 (8,58pg/105 cellen ± 2,55) in vergelijking met niet gestimuleerde pDC’s (0,73pg/105 cellen ± 0,33) (Figuur 24e), maar niet van IL-1β. Stimulatie met imiquimod resulteerde niet in een verhoogde vrijstelling van IL-12p70, IL-10, IL-1β (resp. p=0,502, p=0,196, p=0,876) (Figuur 25, Addendum I). Imiquimod zorgde voor een verhoogde vrijstelling van IFN-α

(63,50pg/105cellen ± 38) in vergelijking met

niet

gestimuleerde pDC’s (0,14pg/105 cellen ± 0,07) maar de resultaten zijn niet significant (p=0,534) (Figuur 14g). Toediening van resp 0,5% en1% CSE aan pDC’s die reeds met imiquimod gestimuleerd zijn, resulteert in een niet-significante gedaalde vrijstelling van TNF-α (resp. 52,35pg/105cellen ± 6,29, p= 0,065 en 58,19pg/105cellen ± 11,08, p= 0,375) in vergelijking met pDC’s die enkel met imiquimod gestimuleerd zijn (Figuur 14a). De vrijstelling van IL-8 blijft ongewijzigd na toediening van 0,5% (410,72pg/105cellen ± 49,94, p=0,391) in vergelijking toediening van enkel imiquimod (Figuur 24c). Er treedt een stijging op na toediening van 1%CSE (470,82pg/105cellen ± 53,54, p= 0,391). Toediening van CSE zorgt ook voor daling van IL-6 ( resp. 16,52pg/105cellen ± 4,24, p=0,098 en 16,87pg/105cellen ± 5,55, p=0,249) (Figuur 24e). Toediening van CSE had geen significant effect op de vrijstelling van IL-12p70, IL-10 en IL-1β. De vrijstelling van IFN-α stijgt na toediening van 0,5% en 1% CSE (resp. 77,55pg/105cellen ± 50,58 p=0,858 en 114,98pg/105cellen ± 67,36, p=0,564) (Figuur 24g). Net zoals stimulatie met imiquimod, stellen pDC significant meer TNF-α vrij

40

(62,54pg/105cellen ± 13,87, p=0,01) na stimulatie met CpG-oligonucleotiden (TLR-9 ligand) in vergelijking met niet gestimuleerde pDC’s (Figuur 24b.). Er is ook verhoogde vrijstelling van IL-8 (74,64pg/105 cellen ± 17,12) in vergelijking met niet gestimuleerde cellen (50,06pg/105 cellen ± 17,12). Het basisniveau van IL-8 vrijstelling is wel reeds verhoogd. Deze resultaten zijn rand - significant (p=0,062) (Figuur 24d). Net als TNF-α, verhoogt CpG ook de vrijstelling van IL-6 en IFN-α (resp. 8,58pg/105cellen ± 6,25, p=0,032 en 536,27pg/105 cellen ± 276, p=0,008) ivm niet gestimuleerde pDC’s (resp. 0,72pg/105 cellen ± 0,81, 24,01pg/105 cellen ± 23,72) (Figuur 24f,h). Stimulatie met CpG resulteerde niet in een verhoogde vrijstelling van IL12-p70, IL-10 en IL-1β ( resp. p = 0,945, p = 0,640, p = 0,867) (Figuur 25, Addendum I.). Toediening van 0,5% CSE en 1% CSE aan pDC’s die met imiquimod gestimuleerd zijn, resulteert in een niet significante dosisafhankelijke verhoogde vrijstelling van TNF-α (resp. 69,14pg/105 cellen ± 15,35, p=0,152 en 98,89pg/105 cellen ± 20,18, p=0,189) (Figuur 24b). Toediening van 0,5% CSE resulteert in een significant verhoogde vrijstelling van IL-8 (98,56pg/105cellen ± 23,69, p<0,05). Toediening van 1% CSE resulteert in een niet significantie verhoogde vrijstelling van IL-8 (124,1pg/105cellen ± 39,46, p= 0,083) (Figuur 24d). Toediening van 0,5% en 1% CSE zorgt voor een niet significante daling van IFN-α. (471,7pg/105cellen ± 297,64 en 518,3ng/105cellen ± 387, resp. p = 0,131, p = 0,858) (Figuur 24h). Toediening van CSE had geen significant effect op de vrijstelling van IL12-p70, IL-10, IL-1β en IL-6 (Figuur 24f - 15). Er werd geen verschil gezien tussen de basisniveaus van IL12-p70, IL-10 en IL-1β en de niveau’s na toediening van CSE. De hoeveelheid IL-6 is wel verhoogd, maar is niet significant met de hoeveelheid bekomen bij pDC’s die reeds aan CpG zijn blootgesteld.

b. * 80 70 60 50 40 30 20 10 0 QIM

E/CS

% % SE 0.5 E1 +/C SE Q /CS + C / IM Q Q+ IM IM

α (pg/ 100 000 cells) Expre ssion TNF-α

− α (pg/ 100 000 cells) Expre ssion TNF−

a.

120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

*

% ESE . 5% E1 CS /C E0 CS +/ S G/ G C p / C G+ CP G+ Cp Cp

41

d. 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

Expression IL-8 (pg/ 100 000 cells)

Expression IL-8 (pg/ 100 000 cells)

c. *

/C QIM

SE

/C Q+ IM

SE

E /CS Q+ IM

% 0.5

/CS Q+ IM

*

125 100 75 50 25 0

C

-/ C pG

SE

/C G+ Cp

SE

% .5% E1 E0 /CS /CS + + G G Cp Cp

f. * 30

20

10

0 Q IM

SE -/C

IM

E/ CS Q+

Expression IL-6 (pg/ 100 000 cells)

Expression IL-6 (pg/ 100 000 cells)

150

% E1

e.

*

12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0

% 1% 0.5 SE SE /C C + / Q Q+ IM IM

/C GCp

SE

/ G+ Cp

ECS

% 1% 0.5 SE SE /C C / + G G+ Cp Cp

h. 200 150

*

100 50 0 % % ESE 0.5 E1 /CS -/C + Q SE /CS Q C + M IM / I Q Q+ IM IM

Expression IFN-α (pg/100 000 cells)

g. α (pg/100 000 cells) Expression IFN-α

175

*

800 600 400 200 0 /C GCp

SE

G+ Cp

E/CS G Cp

SE +/C

% 0.5 Cp

/ G+

E CS

1%

Figuur 24. Analyse van cytokinevrijstelling door pDC’s na stimulatie met imiquimod, CpG , 0,5% en 1% CSE. De vrijstelling van TNF-α (a,b), IL-8 (c,d), IL-6 (e,f) wordt bepaald uit cultuursupernatans door cytometric bead array. De vrijstelling van IFN-α (g,h) wordt bepaald uit cultuursupernatans door ELISA. De gegevens zijn representatief voor 6 (CpG) en 4 (imiquimod) experimenten.

4. Discussie pDC’s werden voor het eerst aangetoond in humane long door studies van Demedts et al. en Masten et al. [33,34]. Demedts et al. toonde ook aan dat in tegenstelling tot mDC’s, pDC’s geen expressie van TLR4 en TLR2 vertoonde, maar wel hoge expressie van TLR7 42

(herkenning van enkelstrengig viraal RNA) en TLR9 (herkenning van viraal en bacterieel niet-gemethyleerd DNA) [35]. De studie toont voor het eerst aan dat pDC’s aanwezig zijn in de humane long ter hoogte van de kleine luchtweg. Sigarettenrook inhibeert de maturatie geassocieerde opregulatie van costimulatoire moleculen wat resulteert in een arrest in maturatie van pDC’s. Deze resultaten werden bekomen door onderzoek te verrichten naar de locatie van pDC’s in de long en bepaling van fenotypische en functionele karakterisatie van pDC’s in de humane long. Door uitvoering van immunohistochemische kleuring wordt in deze studie voor de eerste keer aangetoond dat immature pDC’s (BDCA-2+) aanwezig zijn in kleine luchtweg en dan voornamelijk in de lamina propria en adventitia. pDCs werden frequent aangetroffen in associatie met lymfoide aggregaten. Tussen de verschillende groepen patiënten (nooit rokers, rokers zonder COPD, ex rokers zonder COPD, rokers met COPD I-II, ex-rokers met COPD III en ex-rokers met COPD III-IV) werd geen significant verschil in aantal pDC in de kleine luchtwegen gezien. Dit betekent dat roken op zich geen invloed heeft op het aantal pDCs in de kleine luchtweg, hetgeen in contrast staat met het toenemend aantal myeloide DCs in de luchtweg van rokers versus niet-rokers [43]. Bovendien hebben patiënten met COPD geen gewijzigd aantal pDCs ten opzichte van personen zonder luchtstroombeperking. Dit toont aan dat er in de pathogenese van COPD tijdens exacerbatie-vrije periodes geen rol is weggelegd voor een gewijzigde infiltratie van pDCs in de kleine luchtweg. Deze studie geeft echter geen informatie over het aantal pDCs in de kleine luchtweg tijdens exacerbaties van de ziekte. Teneinde inzicht te krijgen in de infiltratie van de long door pDCs werd de expressie van chemokinereceptoren op pDCs geëvalueerd. Tijdens hun levensduur migreren DC uit het bloed naar perifeer weefsel en lymfoïde organen [31]. Deze recruitering van DC naar de lymfeknoop is een belangrijk onderdeel van de immuunrespons. Hoewel mDC’s gebruik maken van de afferent lymfatische pathway om de lymfeknoop vanuit het perifeer weefsel binnen te dringen, is er bij pDC’s sprake van een directe pathway. pDC’s dringen van uit het bloed direct de lymfeknoop binnen via HEV en niet via perifeer weefsel zoals mDC’s [31]. Voor deze directe homing zijn pDC’s afhankelijk van CXCL9 en E-selectine [43]. Chemokinereceptoren zijn verantwoordelijk voor migratie van inflammatoire cellen naar beschadigd weefsel. Deze migratie wordt sterk gereguleerd door chemotactische factoren vrijgesteld door het beschadigde weefsel. Gebruik makend van flowcytometrie evalueerden wij voor het eerst de expressie van chemokine receptoren CXCR3, CXCR4 en CCR7. Deze chemokinereceptoren zijn betrokken bij de migratie van pDCs naar lymfoid weefsel.

43

Een recente studie toonde aan dat CXCR3 expreserende B- en T-cellen worden aangetrokken naar lymfoïde follikels door vrijstelling van CXCL9 en CXCL10 door structurele en folliculaire cellen in en rond de lymfefollikels [44]. T-cellen, B-cellen, macrofagen en DC’s aggregeren in georganiseerde lymfefollikels in de nabijheid van de luchtwegen en longparenchym, hieruit kan men besluiten dat lymfefollikels deelnemen aan zowel de aangeboren als de adaptieve humorale en T-cel gemediëerde respons. De vrijstelling van CXCL9 en CXCL10 door structurele en folliculaire cellen in en rond de lymfefollikels en de expressie van CXCR3 op pDC’s verklaart het migratiemechanisme van pDC’s naar de long en vooral hun associatie met lymfoïde aggregaten. pDC’s die CXCR3 tot expressie brengen zijn verantwoordelijk voor een Th1 respons [16,44]. CXCR4 wordt aangetrokken naar de long door binding van zijn ligand CXCL12. CXCL-12 wordt tot expressie gebracht door stromale cellen van de long. Een hypothese die hier naar voor gebracht wordt, is dat CXCL12 net zoals CXCL9 en CXCL10 geëxpresseerd wordt door structurele en folliculaire cellen in associatie met lymfefollikels. Dit kan dan eveneens de aanwezigheid van CXCR4 in de adventitia, lamina propria en lymfoïde aggregaten verklaren. In tegenstelling tot CXCR3 en CXCR4 is CCR7 niet aanwezig op pDC’s. Een eerste mogelijke verklaring ligt in de keuze van de gebruikte merker. In deze studie werd de expressie van chemokinereceptoren onderzocht op BDCA2+ cellen, zoals reeds vermeld is BDCA2 een merker voor immature DC. Verscheidene onderzoeken vermelden dat CCR7 niet geexpresseerd wordt op immature DC, enkel na activatie en maturatie vertonen DC een opregulatie van CCR7 [23]. Zo spelen CCR7 liganden een sleutelrol in de migratie van mature, met antilichamen bezette DC’s naar T-cel rijke regio’s en drainerende lymfeknopen [31,45]. Vassallo et al. toonde ook reeds aan dat sigarettenrook de opregulatie van CCR7 inhibeert [40]. Dit vormt een mogelijke 2e verklaring voor de afwezigheid van CCR7 expressie op pDC’s. Ook in dit onderdeel van het onderzoek is het longweefsel afkomstig van stabiele patiënten, zonder exacerbaties van COPD. Naast de evaluatie van het aantal en de distributie van plasmacytoide DCs in de kleine luchtwegen, waren we ook geïnteresseerd in de functionele wijzigingen van deze cellen onder invloed van sigarettenrook.

In dit kader werden pDCs opgezuiverd uit bloed in vitro

gestimuleerd met TLR liganden en blootgesteld aan sigarettenrookextract, waarbij het effect op de maturatierespons werd bestudeerd. Deze studie bevestigd de resultaten van Demedts et al [35]. pDC’s expresseren TLR7 , waardoor enkelstrengig viraal RNA herkend wordt, en TLR9, een intracellulaire receptor die

44

verantwoordelijk is voor herkenning van niet-gemethyleerde DNA sequenties van virussen of bacteriën. Stimulatie met CpG (TLR9) en imiquimod (TLR7) zorgde voor een opregulatie van de costimulatoire molecules CD80, CD83 en CD86. In tegenstelling tot deze moleculen, vertoonde pDC’s reeds een uitermate hoge expressie van HLA-DR (MHC-II) zonder toediening van virale en bacteriële stimulantia. Hierdoor kan stimulatie met CpG en imiquimod niet bijdragen tot een extra opregulatie van HLA-DR. Deze resultaten zijn overeenkomstig met de resultaten behaald in een andere studie [34]. Zelfs zonder verdere stimulantia zijn pDC’s door hun hoge expressie van MHC-II moleculen reeds verantwoordelijk voor interactie met en activatie van CD4+ T-cellen. Blootstelling van pDC’s aan sigarettenrook inhibeert de CPG- of imiquimod geinduceerde opregulatie van CD80, CD83 en CD86. De inhiberende werking van sigarettenrook is zo sterk, dat de opregulatie van CD83 volledig wordt tegengewerkt. Sigarettenrook is verantwoordelijk voor een daling van de costimulatoire moleculen CD80, CD83 en CD86 van geactiveerde pDC’s. CD80, CD83 en CD86 zijn verantwoordelijk voor interactie met T-cellen en initiëren hierdoor de adaptieve immuunrespons. CD80 (B7.1) en CD86 (B7.2) vormen beide liganden voor CD28 en CTLA4 op T-cellen. Deze costimulatoire moleculen vormen een 2e signaal, wat nodig is voor activatie van T-cellen. CD86 is van beide de belangrijkste molecule voor activatie en maturatie van T-cellen. De interactie tussen CTLA4/CD28 en CD80/86 speelt een rol in de regulatie van Th1 of Th2 respons: CD80 promoot Th1 respons, CD86 promoot Th2 respons [23]. De 3 merkers volgen consistent hetzelfde patroon [46]. Uit deze studie kan men concluderen dat sigarettenrook verantwoordelijk is voor de attenuatie van de maturatierespons onder condities die een virale infectie nabootsen. Dit zorgt voor een mogelijke verminderde adaptieve immuunrespons tegen virale infecties. Sigarettenrook speelt een mogelijke rol in het ontstaan van laaggradige virale infecties die bijdragen tot de pathogenese van COPD doordat het een rol speelt in de vatbaarheid voor virale infecties die lijden tot exacerbaties van COPD. Naast expressie van costimulatoire moleculen, beïnvloeden pDC’s ook de immuunrespons door vrijstelling van cytokines. pDC’s stellen TNF- α, IL-8, IL-6 en IFN-α vrij wanneer ze gestimuleerd worden met TLR7 (Imiquimod) en TLR9 liganden (CpG) [35]. pDC’s stellen ook IFN- α en IL-6 vrij als reactie op imiquimod en TNF- α, IL-8 en IL-6 als reactie op CpG. In deze studie werd er geen vrijstelling van IL-1β vastgesteld. Sigarettenrookextract bevordert de IFN-α productie door TLR7 gestimuleerde pDCs. De stimulatie blijkt dosisafhankelijk te zijn. IFN-α is een lid van de type 1 interferon familie

45

(IFN-α/β) en heeft sterke antivirale capaciteiten. De vrijstelling van IFN-α door pulmonaire pDC’s in respons op virale infectie werd reeds eerder bestudeerd [35]. IFN-α werkt als een autocriene overlevingsfactor voor DC en verhoogt de expressie van CD80, CD83, CD86 en MHC I en II [47]. IFN-α is ook verantwoordelijk verhoogde AL-respons waardoor het een langdurige AL-productie en langdurig immunologische geheugen [47]. Naast deze activiteiten is IFN-α ook verantwoordelijk voor een verhoogde macrofaag en NK cel activiteit, samen met een verhoogde MHC klasse I en II presentatie van vreemde AG aan T-cellen [31,35,47]. Sigarettenrookextract bevordert de IFN-α productie door TLR9 gestimuleerde pDC’s niet. TLR-7 geactiveerde pDCs zullen in de aanwezigheid van sigarettenrook de aangeboren immuunrespons stimuleren met verhoogde macrofaagactivatie en NK cellen, doch de klaring van het virus kan vertraagd of verhinderd worden door een verminderde maturatie van de pDC (zoals hierboven beschreven). Dit is een mogelijk mechanisme voor verhoogde vatbaarheid voor luchtweginfecties bij rokers en dit fenomeen kan bijdragen tot de pathogenese van COPD met lokaal geactiveerde DCs die de aangeboren immuniteit overstimuleren (macrofaagactivatie), doch de virale load inefficiënt klaren (deficiente adaptieve immuunrespons door verminderde maturatie) Sigarettenrookextract bevordert de productie van IL-8 door TLR-7 of –9 gestimuleerde pDCS. De vrijstelling van IL-8 vertoont zowel na TLR7 als TLR9 stimulatie een stijgende trend in aanwezigheid van sigarettenrookextract. Deze trend is het meest uitgesproken na TLR7 stimulatie en blijkt dosisafhankelijk te zijn. Deze verhoogde productie van IL-8 kan bijdragen tot een activatie van de aangeboren immuunrespons via aantrekking van neutrofielen via binding op zijn receptoren CXCR1 en CXCR2. Neutrofielen spelen een belangrijke rol in de pathogenese van COPD als bron van oxidatieve stress en proteolyse. Sigarettenrook is verantwoordelijk voor een niet significante daling van TNF-α na TLR7 stimulatie. Sigarettenrook had geen effect op de TNF-α productie na TLR9 stimulatie. In tegenstelling tot de vrijstelling van IL-8, vertoont IL-6 enkel na stimulatie met TLR7 een dalende trend na blootstelling aan sigarettenrook. Bovendien heeft sigarettenrook geen significante invloed op andere cytokines die de richting van de T cel respons bepalen. De productie van IL-12 (als stimulator van Th1 respons), IL-6 (als stimulator van Th2 respons), IL-1b (als stimulator van Th17 respons) en IL-10 (als stimulator van regulatoire T cell

respons)

door

sigarettenrookextract.

maturerende

pDCs

worden

immers

niet

beïnvloed

door

Dit staat in contrast met de studies op myeloide DCs, waar

sigarettenrook de interstitieel type DCs een Th2 stimulerende functie geeft [40].

46

Het is noodzakelijk om ook rekening te houden met de beperkingen die dit onderzoek met zich meebrengt. Het longweefsel dat gebruikt werd voor IHC, waarmee de locatie en kwantificatie van pDC’s werd bepaald, is afkomstig van patiënten met een longtumor. Het gebruikte weefsel is gezond longweefsel dat op een afstand van de tumor werd weggenomen. Toch moet er rekening gehouden worden met het mogelijke effect dat deze tumor op de aanwezigheid van pDC’s kan hebben. Zo kan de aanwezigheid van een tumor verantwoordelijk zijn voor gewijzigde aanwezigheid van immuuncellen in de long. Patiënten met ernstig COPD zijn onder behandeling met corticosteroïden, zowel via inhalatie als via systemische toediening. Corticosteroïden zorgen voor een daling in inflammatie bij COPD-patiënten. Op deze manier kunnen ze indirect een invloed uitoefenen op de localisatie van pDC’s in de long. De aanwezigheid van pDC’s zou hoger kunnen liggen wanneer patiënten met COPD III-IV geen corticosteroïden toegediend zouden krijgen. Als laatste punt is het ook noodzakelijk te vermelden dat we in vitro enkel het directe effect van sigarettenrook op pDC’s hebben bepaald. Sigarettenrook heeft ook een indirect effect op pDC’s. Sigarettenrook prikkelt de epitheelcellen in de long waardoor deze inflammatoire mediatoren vrijstellen, welke op hun beurt zorgen voor ofwel de activatie van cellen van de aangeboren immuniteit, ofwel rechtstreeks effect hebben op pDC’s. Als conclusie kunnen we stellen dat: 1. pDC’s aanwezig zijn in de kleine luchtweg van de humane long en dan voornamelijk in de adventitia, lamina propria en in associatie met lymfoïde aggregaten. 2. Er geen verschillen zijn tussen het aantal pDCs in de kleine luchtweg van COPD patiënten, rokers zonder COPD en niet-rokers. 3. Immature pulmonale pDCs chemokine receptoren CXCR3 en CXCR4 tot expressie brengen, die kunnen instaan voor de influx van pDCs in de long, voornamelijk thv lymfoide aggregaten. 4. Sigarettenrook de maturatie van pDC’s na blootstelling aan virale stimulantia vermindert, waardoor er een verminderde activatie is van het adaptieve immuunsysteem. 5. Sigarettenrook eveneens de vrijstelling van (inflammatoire) cytokines door pDCs beinvloedt na virale stimulatie. Sigarettenrook stimuleert de productie van interferon alfa en IL-8 door mature pDCs, maar veroorzaakt geen wijziging in de cytokines die de adaptieve immuniteit sturen.

47

5. Referenties. 1. Mannino D.M. & Buist A.S. 2007. Global burden of COPD: risk factors, prevalence, and future trends. Lancet. 370:765-773. 2. Pauwels R.A. & Rabe K.F. 2004. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364:613-620. 3. Viegi G. et al. 2007. Definition, epidemiology and natural history of COPD. European Respiratory Journal. 30:993-1013. 4. www.goldcopd.com 5. Barnes P.J. et al. 2003. Chronic obstructive pulmonary disease : molecular and cellular mechanisms. European Respiratory Journal. 22:672-688. 6. Turato G. et al. 2001. Pathogenesis and Pathology of COPD. Respiration. 68:117-128. 7. Hogg J.C. 2008. Lung structure and function in COPD. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 12(5):467-479. 8. Hogg J.C. 2004. Pathophysiology of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease. 364:709-721. 9. Chung K.F. & Adcock I.M. 2008. Multifaceted mechanisms in COPD: inflammation, immunity, and tissue repair and destruction. European Respiratory Journal. 31:1334-1356. 10. Murray C.J.L. & Lopez A. D. 1997. Alternative projections of mortality and disability by cause 1990-2020: Global burden of disease study. Lancet. 349:1498-1504. 11. Van Durme Y.M.T.A. et al. 2009. Prevalence, incidence, and lifetime risk for the development of COPD in the Elderly. Chest. 135:368-377. 12. Mathers C.D. & Loncar D. 2006. Projections of Global Mortality and Burden of Disease from 2002 to 2030. PLoS Medicine. 3:2011-2030. 13. Saetta M. et al. 1994. Morphological and cellular basis for airflow limitation in smokers. European Respiratory Journal. 7:1505-1515. 14. Saetta M. et al. 1998. CD8+ T-Lymphocytes in Peripheral Airways of Smokers with Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 157:822-826. 15. Jeffery P.K. 1999. Difference and similarities between chronic obstructive pulmonary disease and asthma. Clinical and Experimental Allergy. 29:14-26. 16. Barnes P.J. 2008. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nature revieuws. 8:183-192. 17. Janeway. 2005. Immunobiology. ISBN: 0-4430-7309-0. 18. Demedts I.K. 2007. Role of Dendritic Cells and Matrix Metalloproteinase-12 in the 48

Pathogenesis of COPD (Universiteit Gent; ISBN: 978-90-9021722-2). 19. Demedts I.K. 2005. Matrix metalloproteinases in asthma and COPD. Current Opinion in Pharmacology. 5:257-263. 20. Barceló B. et al. 2008 Phenotypic characterisation of T-lymphocytes in COPD: abnormal CD4+CD25+ regulatory T-lymfocyte response to tobacco smoking. European Respiratory Journam. 31:555-562. 21. Barnes P.J. 2008. The cytokine network in asthma and chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Clinical Investigation. 118:3546-3556. 22. Dourado V.Z. 2006. Systemic manifestations in chronic obstructive pulmonary disease. Jornal Brasileire de Pneumologia. 32(2):161-71. 23. Palucka K. & Banchereau J. 1999. Dendritic cells: a Link Between Innate and Adaptive Immunity. 19(1):12-25. 24. Wan H. & Dupasquier M. 2005. Dendritic Cells in vivo and in vitro. Cellular & Molecular Immunology. 2(1):28-35. 25. Ueno H. et al. 2007. Dendritic cell subsets in health and disease. Immunological Reviews. 219:118-142. 26. Alvares D. et al. 2008. Mechanisms and Consequences of Dendritic Cell Migration. Immunity 29:325-342. 27. Banchereau J & Steinman R.M. 1998. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392:245-252. 28. Tsoumakidou M. et al. 2008. Dendritic Cells in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177:1180-1186. 29. Tsoumakidou M. et al. 2006. Isolation of myeloid and plasmacytoid dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. Immunology and Cell Biology. 84:267-273. 30. Janke. M. et al. 2006. Eminent role of ICOS costimulation for T cells interacting with plasmacytoid dendritic cells. Immunology. 118:353-360. 31. Liu Y.J. 2005. IPC: professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Reviews of Immunology. 23:275-306. 32. Lambrecht B.N. & Hammad H. 2003. Taking our breath away: dendritic cells in the pathogenesis of asthma. Nature Reviews Immunology. 3:993-1003. 33. Masten B.J. et al. 2006. Characterization of Myeloid and Plasmacytoid Dendritic Cells in Human Lung. The Journal of Immunology. 177:7784-7793. 34. Demedts I.K. et al. Identification and Characterization of Human Pulmonary Dendritic

49

Cells. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 32:177-184. 35. Demedts I.K. et al. Different Roles for

Human Lung Dendritic Cell Subsets in

Pulmonary Immune Defense Mechanisms. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 35:387-393. 36. Dzionek A. et al. Plasmacytoid Dendritic Cells: From Specific Surface Markers to Specific Cellular Functions. Human Immunology. 63:1133-1148. 37. Gilliet M. et al. 2008. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8:594-606. 38. Poeck H. et al. Plasmacytoid dendritic cells, antigen and CpG-C license human B cells for plasma cell differentiation and immunoglobulin production in t he absence of T cell help. Blood. 1-29. 39. D’hulst A.I.

et al. 2005. Time course of cigarette smoke-induced pulmonary

inflammation in mice. European Respiratory journal. 25:204-213. 40. Vassallo R. et al. 2005. Cigarette Smoke Extract Suppresses Human Dendritic Cell Function Leading to Preferential Induction of Th-2 Priming. The Journal of Immunology. 175:2684-2691. 41. Demedts I.K. et al. 2007. Accumulation of Dendritic Cells and Increased CCL20 Levels in the Airways of Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175:998-1005. 42. Lommatzsch M. et al. 2007. Airway dendritic cell phenotymes in inflammatory diseases of the human lung. European Respiratory Journal. 30:878-886. 43. Yoneyama H. et al. 2004. Evidence for recruitment of plasmacytoïde dendritic cell precursors to inflamed lymph nodes through high endothelial venules. International Immunology. 16(7): 915-928. 44. Kelsen S.G. et al. 2009. Lymphoid Follicle Cells in Chronic Obstructive Pulmonary Diseas overexpress the chemokine receptor CXCR3. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179:799-805. 45. REg of DC recruitment by chemokines. 46. Lechmann M. et al. 2002. Role of CD83 in the immunomodulation of dendritic Cells. International Archives of Allergy and Immunology. 129:113-118. 47. Le Bon A & Tough D.F. 2002. Links between innate and adaptive immunity via type 1 interferon. Current opinion in Immunology. 14:432-436.

50

Addendum I I.1. I.2.

Figuren. Tabellen.

I.I Figuren. Figuur 1. Het Fletcher-Peto diagram [2,8]. Het Fletcher-Peto diagram geeft het natuurlijke verloop en de veranderingen over de tijd weer van FEV1 in niet-rokers en rokers. Bij nietrokers daalt deze waarde naarmate de leeftijd toeneemt. De longfunctie, die gedefinieerd wordt door FEV1 vertoond een versnelde achteruitgang bij rokers die vatbaar zijn voor het ontwikkelen van COPD. Stoppen met roken doet op elk ogenblik de graad van afname van FEV1 terugkeren naar het niveau van de niet-roker. De graad van daling is consistent met de GOLD-stadia. De horizontale lijnen zijn de grenzen van de verschillende GOLD-stadia.

Figuur 2. Inflammatoire en immuuncellen betrokken in COPD [16]. Deze figuur geeft de link weer tussen de pathogenese en pathologie van COPD. Geïnhaleerde sigarettenrook activeert epitheliale cellen en macrofagen waardoor deze verschillende chemotactische factoren vrijstellen die een influx van inflammatoire cellen naar de long veroorzaken. Deze inflammatoire cellen samen met macrofagen en epitheliale cellen stellen proteasen vrij zoals MMP9 die verantwoordelijk zijn voor elastine degradatie en emfyseemontwikkeling. Neutrofielelastase veroorzaakt mucushypersecretie. Epitheliale cellen en macrofragen stellen transforming growth factor-β wat fibroblast proliferatie stimuleert, resulterend in fibrose in de kleine luchtwegen.

Figuur 3. Vergelijking van centrilobulair en panacrinair emfyseem [8]. Bij centriacinair emfyseem is er destructie van de respiratoire bronchioli (a,c). De centrale delen van de acinus

worden omgeven door gebieden van normaal longparenchym Dit type van emfyseem is meer geassocieerd met sigarettenrook en wordt gevonden in de bovenste lobben van de long waar verschillende kleine lesies grote cavities vormen. Bij panacrinair emfyseem is de volledige long aangetast (b,d).

Figuur 4. De rol van effector T cellen in de adaptieve immuunrespons [17].

Figuur 5. Mogelijke pathogene acties van MMP’s in COPD [19]. MMP’s zijn mogelijks betrokken in de migratie van inflammatoire cellen vanuit het bloed naar het interstitium (1). De degradatie van de extracellulaire matrix door MMP’s laat verdere migratie van inflammatoire cellen zoals DC’s, neutrofielen en eosinofielen naar het epitheel toe (2). Door cel-cel en cel-matrix adhesies faliciteren MMP’s de migratie van inflammatoire cellen doorheen het epitheel (3). De vrijstelling van een grote hoeveelheid MMP’s veroorzaakt destructie van gezond longweefsel (4). Verschillende MMP’s hebben een effect op de chemokines en proinflammatoire cytokines (5).

Figuur 6. Conventionele en plasmacytoide dendritische cellen[17].

Figuur 7. Migratieroute van plasmacytoïde DC’s versus myeloïde DC’s [31]. De recrutering van DC’s naar de lymfeknoop is een belangrijk onderdeel van de immuunrespons. Hoewel mDC’s gebruik maken van de afferent lymfatische pathway om de lymfeknoop vanuit het perifeer weefsel binnen te dringen, is er bij pDC’s sprake van een directe pathway. pDC’s dringen van uit het bloed direct de lymfeknoop binnen via high endothelial venules (HEV) en niet via perifeer weefsel zoals mDC’s. Zowel pDC’s als mDC’s zijn gelokaliseerd in de T-cel rijke zones van de secundaire lymfeknoop. Deze unieke migratie van pDC’s is geassocieerd met de expressie van CCR7, wat zowel bindt op L-selectine geexpresseerd door HEV als aangetrokken wordt door CCL19 en CCL21, geexpresseerd door HEV en stromale cellen binnen de T-cel rijke regio.

Figuur 8. Localisatie van DC in luchtwegen [32]. DC zijn gelocaliseerd in een netwerk vlak boven en onder het basale membraan, tussen de basale epitheliale cellen, in het interstitium, in de alveolaire ruimte en in BALF.

Figuur 9. Accumulatie van plasmacytoïde dendritische cellen in de luchtwegen. pDC worden geïdentificeerd als roos kleurende BDCA-2+ cellen door gebruik te maken van immuhistochemische kleuring voor BDCA-2. A) aanwezigheid van BDCA-2+ cellen in de lamina propria en adventitia. B) Associatie van BDCA-2+ cellen met lymfoïde aggregaten. De zwarte pijl duidt BDCA-2+ cellen aan. A.

B.

Figuur 10.

De gemiddelde waarden van BDCA-2+ cellen in a) epitheel, b) lamina

propria, c) adventitia. pDC’s komen voornamelijk voor in de adventitia en zijn geassocieerd met lymfoïde aggregaten. Zowel in het epitheel, lamina propria als de adventitia is er geen significant verschil tussen de groepen patiënten. A.

B.

C.

Figuur 11. Gebruikte vestermethode. A) Venstering op Lin- -cellen. B) beeld van A. venstering op BDCA-2+ -cellen. C-F) Histogram van resp. CCR7, CXCR3-4-expressie zonder en met isotype. 10 4

10

3

10

10 2

10

10 4

B. FL4-H: BDCA-2 APC

FL1-H: CD3 and CD19 FITC

A.

1

9.41 9.55

0.14

3

10 2

10 1

7.1

10 0 0

200

400 600 800 FSC-H: FSC-Height

10

89.8

0

1000

10

0

Expressie

0.68 10

1

10

2

10

3

10

4

3

10

4

3

10

4

3

10

4

Isotype en Expressie 100

80

6

60

% of Max

8

# Cells

C. CCR7

4

40

98.2

98.2 1.77

2

1.77

20

0

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

D. CXCR3

0

10

1

100

2

10 10 FL2-H: mIgG2a PE

6

% of Max

# Cells

80

4

2

60

40

17.6

17.6 20

82.4

0

82.4

0

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

E. CXCR4

0

10

1

10

2

10

100 8 80

% of Max

# Cells

6

4

60

40

60.5

60.5

2

20

39.5

0

39.5

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

0

10

1

2

10 10 FL2-H: mIgG2a PE

Figuur 12. Zuiverheidsbepaling. A) Expressie van CD123+ cellen bedraagt 90,8% B) Expressie van BDCA-2+ cellen bedraagt 89.5% . Beide expressie werden bepaald op CD45+cellen. A. CD123+ cellen. 1000

10

4

10

3

10

2

9.09

89.4 200

FL4-H: CD45 APC

SSC-H: SSC-Height

800

600

400

100

10 1

6.87

200

150

97.8

1.02

10 0

0 0

200

400 600 800 FSC-H: FSC-Height

1000

10

90.8

9.25

50

0.52

0

10

Ungated

1

2

10 10 FL2-H: CD123 PE

3

10

0

4

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

B. BDCA-2+ cellen. 10

1000

4

10.3

88.5 60

10 3

600

400

3.05

200

98.6 10

2

10

1

# Cells

FL4-H: CD45APC

SSC-H: SSC-Height

800

40

20 10.5 89.5

0

10 0

200

400 600 FSC-H: FSC-Height

800

1000

0.46

0

10

0

Ungated

0.79 10

1

2

10 10 FL2-H: BDCA2 PE

3

10

0 4

10

0

10

1

2

10 10 FL2-H: BDCA2 PE

3

10

4

Figuur 13. Venstermethode voor viabiliteitsbepaling. Viabele cellen zijn annexin-V en PI negatief. Na overnacht cultuur bedraagt de viabiliteit 90%

B

1000

FL1-H: Annexin-FITC

800 SSC-H: SSC-Height

A

600

400

81.8

10 4

7.06

1.6

10 3

10 2

10 1

200

10 0

0 0 Ungated

200

400 600 800 FSC-H: FSC-Height

90 10 0

1000 pDC

1.36 10 1

10 2 FL3-H: PI

10 3

10 4

Figuur 14. Viabiliteitsbepaling bij verschillende concentraties CSE. De waarden worden weergegeven als gemiddelde. Enkel de viabiliteit bij concentratie van 1 en 2% CSE werd 2 keer bepaald (SEM resp. 0,9 en 1,2)

Viabiliteitsbepaling bij verschillende concentraties CSE

100

91.7

91

91.3

91.65 90.60

87.50

75.1

70.30

m ean %

Viabiliteit

75 50 25 0 E E E E E E E E CS CS CS CS CS CS CS CS % % % % % % % % 0 0.5 .75 1 2 3 4 5 0

Figuur 15. Viabiliteit pDC’s zonder toevoeging van IL-3. Viabele cellen worden omschreven als PI- cellen. 31,5% van de pDC populatie is viabel. 68,5% van de populatie is niet viabel. 80

# Cells

60

40

31.5

20

68.5

0 10

0

10

1

2

10 FL3-H: PI

10

3

10

4

Figuur 15. Vensteringsmethode bij de analyse van maturatiemerkers van pDC na blootstelling aan CSE.

A) Eerste beeld dat wordt verkregen via analyse op FlowJo. De

omkaderde cellen worden gebruikt voor verdere analyse. B) Deze cellen zijn dezelfde als in punt A. Er wordt hierin geselecteerd op CD123+ PI- - cellen. Voorbeelden verkregen histogram en isotypes. C) Expressie van CD80. D) Expressie van CD83. E) Expressie van CD86. F) Expressie van HLA-DR 10

1000

800

4

70.6 70.9

26.6

FL4-H: CD123 APC

10 3

600

400

10

2

10

1

10

0

200

A

B

0 0

200

400 600 FSC-H: FSC-Height

800

1000

Expressie

2.15 10

0

0.68 10

1

2

10 FL3-H: PI

Isotype

10

3

10

4

Expressie + Isotype

C. CD80 100 30

80

55.3

55.3

80 42.3

42.3 % of Max

20

# Cells

# Cells

60

40

60

40

10

20

0

20

0

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

0

10

1

10

2

10

3

10

D. CD83 100 80

50

80

30

% of Max

60 # Cells

# Cells

40

40

90.6

20

9.39

20

10

0 10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

60

40

90.6 9.39

20

0

0 10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

4

E. CD86 100 60

40

80

20

% of Max

# Cells

# Cells

30

40

60

40

20 10

95

95

20

5.05

5.05 0

0

0 10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 0

10 1

102

10 3

10 0

10 4

101

10 2

10 3

104

F. HLA-DR 100 80

50

80

30

0.21

% of Max

60 # Cells

# Cells

40

40

60 0.21 40

20 20

99.8

10

0

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

99.8

20

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

Figuur 16. Isolatie van PMBC en pDC uit humaan bloed. Aantal PBMC na isolatie uit bloed bedraagt 1.15x108 ± 0,17x108. Aantal pDC’s aanwezig in PBMC bedraagt 1,0357x106 ± 0,05x106 De gebruikte test is de Mann Witney U-test. (n=8, p=0,0002) (Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM.

. p<0.05

10 9

# cellen

10 8 10 7 10 6 10 5 PBMC

pDC

Figuur 17. CSE inhibeert de opregulatie van co-stimulatoire merkers na stimulatie met CpG. Gating op PI negatieve cellen. De trend van inhibitie is consistent in alle proeven. De grafieken worden weergegeven al gemiddelde ± SEM. De % vertegenwoordigen een procentuele verandering in de expressie, waarbij 100% de maximale respons is van de maturatiemerker op toediening van CpG zonder CSE. Na toediening van 0,5% CSE en 1% CSE bedraagt de expressie van CD80 resp. nog 77,6% ± 22,6 en 61,1% ± 28,5 (resp. p = 0,451, p = 0,603, n=2). De expressie van CD83 bedroeg resp. 53,46% ± 6,16 en 38,78% ± 13,1 (resp. p= 0,017, p = 0,043, n=3). De expressie van CD86 bedroeg resp. 44,70% ± 15,70 en 33,25% ± 11,25 (resp. p = 0,176, p = 0,106, n=2). De waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. De resultaten worden al significant beschouwd als p<0. % CSE bedraagt nog 100.66% ± 0.82, bij 1% CSE 101.72 ± 1.56 (n=3). De resultaten worden al significant beschouwd als p<0.05. (*, p<0.05 vergeleken met cultuur zonder blootstelling aan CpG en CSE.)

Expressie van maturatiemerkers

% of change

* 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

*

1%CSE 0,5% CSE 0%CSE * p < 0,05

CD80

CD83

CD86

HLA-DR

Figuur 18. Expressie van CD80 – CD83 – CD86 – HLA-DR na blootstelling aan CpG en 0 – 0,5 – 1% CSE. Resultaten van 1 experiment. Zowel bij CD80, CD83 en CD86 wordt een opregulatie gezien door toevoeging van CpG. Er treedt een dosisafhankelijke daling op na toediening van 0,5% en 1% CSE. De expressie van HLA-DR is reeds maximaal zonder toediening van CpG. Hierdoor is er geen opregulatie meer mogelijk na toediening van CpG. Histogram resp van CD80, CD83, CD86 en HLA-DR. De bekomen histogrammen (Blauw) worden vergeleken met de isotypes controle kleuringen (Rood), zodat de positieve cellen kunnen geselecteerd worden. De cellen worden al positief beschouwd als hun fluorescentiesignaal hoger is dan het punt waar het isotype de as snijdt.

0µg/ml CpG 0% CSE

3µg/ml CpG 0% CSE

3µg/ml CpG 0,5% CSE

3µg/ml CpG 1% CSE

100

100

80

80

80

80

60

60

60

60

40

40

% of Max

100

% of Max

100

% of Max

% of Max

CD80

40

40

85 20

85.8

20

92.9

20 15

7.33 0

14.7

0 10

0

10

1

2

10 10 FL1-H: mIgM k FITC

3

10

4

20

85.3

14.2 0

0 10

0

10

1

2

10 10 FL1-H: mIgM k FITC

3

10

4

10

0

10

1

2

10 10 FL1-H: mIgM k FITC

3

10

4

10

0

10

1

2

10 10 FL1-H: mIgM k FITC

3

10

4

10

4

100

100

80

80

80

80

60

60

60

60

40

40

% of Max

100

% of Max

100

% of Max

% of Max

CD83

40

40

95.6

96.9

92.5

99

20

20

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

20 3.11

0

0

4.41

20

7.52

1

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

0

10

1

10

2

10

3

0µg/ml CpG 0% CSE

3µg/ml CpG 0% CSE

3µg/ml CpG 0,5% CSE

3µg/ml CpG 1% CSE

CD86 100

100

100

100

80

80

80

80

60

60

% of Max

95.7 60

60

95

40

40

96.9

40

40

5.03

4.26

97.8 2.24

20

20

20

0

0 10 0

10 1

10 2

10 3

3.06

0 10 0

10 4

20

10 1

10 2

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

0 10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

% of Max

HLA-DR 100

100

100

100

80

80

80

80

60

60

60

60

40

40

40

40

0.81 1.49

1.57 99

99.2

20

20

0

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

98.4

20

20

0

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

98.5

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

0

1 0

1

10

2

1 0

3

10

4

Figuur 19. Viabiliteit bij CpG en/of CSE stimulatie. A) De viabiliteit in een resp CpG/CSE-, CpG+/CSE-, CpG+/CSE 0,5% en CpG+/CSE 1% -cultuur bedraagt 72,33% ± 11,8, 65,98% ± 5,187, 56,92% ± 5,312 en 56,88% ± 5,605. Deze waarden worden weergegeven als gemiddeld ± SD. B) geeft de viabiliteit weer van een individueel experiment. A) Viabiliteit bij CpG en/of CSE stimulatie 72.33%

80

65.98%

56.92%

56.88%

mean%

CpG-/CSECpG+/CSECpG+/CSE 0.5% CpG+/CSE 1%

70

Viabiliteit

60 50 40 30 20 10 0

B) 50

CpGCSE-

CpG+ CSE-

30

30

# Cells

# Cells

40

20

20 81

10

10

80.4

19

19.6

PI

PI 0

0 10

CpG+ CSE 0,5 %

0

10

1

2

10 FL3-H: PI

10

3

10

10 0

4

10 1

10 2 FL3-H: PI

10 3

CpG+ CSE 1%

50

30

10 4

20

# Cells

# Cells

40

30

20 76.5

10 74.2

PI

10

PI

25.8

0

23.5

0 10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

Figuur 20. Isolatie van PMBC en pDC uit humaan bloed. Aantal PBMC na isolatie uit bloed bedraagt 8,14x107 ± 3,45x107. Aantal pDC’s aanwezig in PBMC bedraagt 1,08x106 ± 0,34x105. De waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SD. De gebruikte test is de Mann Witney U-test. (n=4, p=0,0182).

p<0,05

number of cells

10

9

10 8 10 7 10 6 10 5 PBMC

pDC

Figuur 21. CSE inhibeert de opregulatie van costimulatoire moleculen na blootstelling aan imiquimod. Gating op PI negatieve cellen. De trend van inhibitie is consistent in alle proeven. De grafieken worden weergegeven al gemiddelde ± SEM. De % vertegenwoordigen een procentuele verandering in de expressie, waarbij 100% de maximale respons is van de maturatiemerker op toediening van CpG zonder. In vergelijking met de maximale expressie bedraagt na toediening van 0,5% en 1% CSE de expressie van CD80 resp. 88,5% ± 9,19 en 72,6% ± 4,24 (resp. p = 0,328, p = 0,069, n=2) ivm de maximale expressie van 100%. De expressie van CD83 bedraagt resp. naar 57,05 % ± 7,41 en 0,03% ± 0,04 ( resp. p = 0,077 en p<0,05, n=2). De expressie van CD86 bedraagt resp. naar 56,1% ± 4,99 en 48,7% ± 2,4 (p<0,05, n=2). De expressie van HLA-DR daalde naar resp 99,5% ± 0,6 en 99,85 ±0,25 (n=2). De resultaten worden al significant beschouwd als p<0.05. De p-waarde van niet-significante resultaten wordt vermeld in de figuur. (*, p<0.05, vergeleken met cultuur zonder blootstelling aan imiquimod en CSE.)

% of change

Expressie van maturatiemerkers 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

*

* *

0% CSE 0,5% CSE 1 % CSE * p<0,05

CD80

CD83

CD86

HLA-DR

Figuur 22. Expressie van CD80, CD83, CD86 en HLA-DR na blootstelling aan 0-0,5%1% CSE en 10µg/ml imiquimod. Zowel bij CD80, CD83 als CD86 treedt er opregulatie voor na toediening van imiquimod. Er treedt een dosisafhankelijke inhibitie op na toediening van 0,5% en 1% CSE. De expressie van HLA-DR is reeds maximaal zonder toevoeging van imiquimod. Toediening van CSE heeft geen effect. De histogrammen zijn representatief voor alle experimenten.

10µg/ml IMQ 0% CSE

10µg/ml IMQ 0% CSE

10µg/ml IMQ 0,5% CSE

10µg/ml IMQ 1% CSE

100

100

80

80

80

80

60

60

60

60

83.4 40

40

16.6

% of Max

100

% of Max

100

% of Max

% of Max

CD80

36.9 40

40

63.1

44.6

29.5 20

20

20

20

54.1

70.5 0

0 10 0

10 1

10 2 10 3 FL1-H: mIgM kFITC

10 4

0 10 0

10 1

10 2 10 3 FL1-H: mIgM kFITC

10 4

0 10 0

10 1

10 2 10 3 FL1-H: mIgM kFITC

10 4

10 0

10 1

10 2 10 3 FL1-H: mIgM kFITC

10 4

100

100

80

80

80

80

60

60

60

60

40

98.2

20

1.8

0 10 0

10 1

10 2 FL2-H: mIgG1k PE

10 3

10 4

40

40

20 2.23

1.32

0

0 0

10

1

10

2

10

98.7

20

2.63

10

40

97.8

97.4

20

% of Max

100

% of Max

100

% of Max

% of Max

CD83

3

10

4

0 10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2 FL2-H: mIgG1k PE

10 3

10 4

10µg/ml IMQ 0% CSE

10µg/ml IMQ 0% CSE

10µg/ml IMQ 0,5% CSE

10µg/ml IMQ 1% CSE

% of Max

CD86 100

100

100

100

80

80

80

80

60

60

60

60

40

40

40

40

96.4

98.9

3.58 96.1

20

20

1.06

20

20

93.6 3.87

6.4 0

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

0

10

1

10

2

10

3

10

% of Max

HLA-DR 100

100

100

100

80

80

80

80

60

60

60

60

40

40

40

40

0.14

0.22 0

0.15

20

20

20

99.8 0

0 10

0

10

1

10

2

10

3

20

99.9

99.9

100

10

4

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

0

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

4

Figuur 23. Viabiliteit bij imiquimod en CSE stimulatie. A) De viabiliteit in cultuur met resp. IMQ-/CSE- , IMQ+/CSE-, IMQ+/CSE 0,5% CSE, IMQ+/CSE 1% bedraagt 84,9% ± 13,17, 87,8% ± 3,93, 86,08% ± 4,2, 86,83% ± 3,75. De resultaten zijn weergegeven als gemiddelde ± SD. B) viabiliteit van 1 individueel experiment. De resultaten zijn representatief voor de verschillende experimenten. A) viabiliteit bij imiquimod en/of CSE

Viabiliteit

100

84.9%

87.8%

86.08%

86.83%

mean

75

IMQ-/CSEIMQ+/CSE-

50

IMQ+/CSE 0.5% IMQ+/CSE 1%

25 0

B) 15

20

10

# Cells

# Cells

30

87.2

5

10

12.9

91.8

PI

8.03

PI 0

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

10 0

4

40

10 2 FL3-H: PI

10 3

10 4

30 # Cells

30 # Cells

10 1

40

20

20

89.3 10

91.4

10

10.7

PI

PI

9.05

0

0 10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

Figuur 24. Analyse van cytokinevrijstelling door pDC’s na stimulatie met imiquimod, CpG , 0,5% en 1% CSE. De vrijstelling van TNF-α (a,b), IL-8 (c,d), IL-6 (e,f) wordt bepaald uit cultuursupernatans door cytometric bead array. De vrijstelling van IFN-α (g,h) wordt bepaald uit cultuursupernatans ELISA. De gegevens zijn representatief voor 6 (CpG) en 4 (imiquimod) experimenten.

b. *

α (pg/ 100 000 cells) Expression TNF-α

− α (pg/ 100 000 cells) Expression TNF−

a. 80 70 60 50 40 30 20 10 0 QIM

E/ CS

Q+ IM

/ CS

E-

Q IM

SE +/C

% 0.5 Q IM

+/ C

SE

1%

*

/C GCp

E1% .5% /CS SE E0 C + S / G /C G+ CP G+ Cp Cp

SE

550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

IM

/C Q-

Expre ssion IL-8 (pg/ 100 000 cells)

d. Expre ssion IL-8 (pg/ 100 000 cells)

c.

120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

*

SE IM

/C Q+

SE I

% % E1 0.5 SE /CS C + / Q + IM MQ

150

*

125 100 75 50 25 0 /C GCp

SE

% % E0.5 E1 /CS + SE G /CS C / p + C G G+ Cp Cp

* 30

20

10

0 % 1% SE SE 0.5 /C -/ C SE + Q SE Q /C C + M IM / I Q Q+ IM IM

Expression IL-6 (pg/ 100 000 cells)

f. Expression IL-6 (pg/ 100 000 cells)

e.

175

*

12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 /C GCp

E1% .5 % CS / SE E0 C + S / G /C G+ CP G+ Cp Cp

SE

Expression IFN-α (pg/100 000 cells)

h. Expression IFN-α α (pg/100 000 cells)

g. 200

*

150 100 50 0

IM

E/CS Q

Q IM

SE +/C Q IM

0 SE +/C

.5% IM

1% SE C / Q+

800

*

600 400 200 0

Cp

SE /C G

% SE 1% 0.5 /C + SE SE G C / C p / C G+ G+ Cp Cp

Figuur 25. Analyse van vrijstelling van cytokines door pDC’s na stimulatie met imiquimod, Cpg en 0,5% en 1% CSE. De vrijstelling van IL12p70(a,b), IL-10 (c,d) en IL1β (e,f) worden bepaalt uit cultuursupernatans door cytometric bead array en ELISA. De gegevens zijn representatief voor 6 (CpG) en 4 (imiquimod) experimenten

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Q IM

SE -/C I

+ MQ

E/CS

% .5% E1 E0 CS S / C + / Q Q+ IM IM

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 % E1% SE 0 .5 /CS /C SE E C + S G / G /C Cp G+ CP G+ Cp Cp

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 /C QIM

SE

% SE .5 % E1 /C E0 + CS S Q / + C / IM Q Q+ IM IM

Expre ssion IL-10 (pg/ 100 000 cells)

d. Expression IL-10 (pg/ 100 000 cells)

c.

Expression IL-12p70 (pg/ 100 000 ce lls)

b. Expression IL-12p70 (pg/ 100 000 cells)

a.

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 % ESE .5% E1 /CS /C E0 CS + S G / G C p / C G+ CP G+ Cp Cp

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 % % SE SE E1 0.5 /C /C + SE /CS Q Q + C / M I Q IM Q+ IM IM

β (pg/ 100 000 cells) Expression IL-1β

f. Expression IL-1β β (pg/ 100 000 cells)

e.

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 SE .5% 1% SE E0 SE /C +/C S C G / G /C Cp Cp G+ G+ Cp Cp

I.II Tabellen Tabel 1. GOLD-stadia [2,7].

FEV1/ FVC > 70% < 70 % < 70 % < 70 % < 70 %

FEV1 > 80 % 50% - 80% 50% - 30% < 30%

COPD afwezig Mild Moderate Severe Very severe

GOLD-stadia GOLD-1 GOLD-2 GOLD-3 GOLD-4

Tabel 2. Mechanismens van emfyseem in COPD [8,9]. Mechanismen van emfyseem in COPD Stoornis in het protease-antiprotease evenwicht Vrijstelling van perforine en granzyme door CD8+ cellen Apoptose van alveolaire cellen Toename van veroudering van de long en senecentie Onvoldoende klaring van apoptotische cellen door macrofagen wat leidt tot daling in antiinflammatoire/immunologische mechanismen Dysfunctie van de mitochondriën met toename van oxidatieve stress.

Tabel 3. Risicofactoren voor COPD Tabel 2. [2,3,5]. Risicofactoren voor COPD Tabak roken actief: sigaretten, pijp, sigaren passief beroepsmatige blootstelling aan stof beroepsmatige blootstelling aan chemicaliën Binnenhuis vervuiling buitenhuis vervuiling respiratoire infecties Genetische factoren Tabel 4. Chemokinereceptoren [12].

Chemokine receptoren Naam

cel type expressie

CXCR3

T-cellen , B-cellen, gladde spiercellen, mesenchiale cellen

CXCR4

T-cellen, B-cellen, DC’s, monocyten, neutrofielen

chemokine ligand CXCL9, CXCL10, CXCL11 CXCL12

CCR7

T-cellen, B-cellen mature DC, NK cellen

CCL19 , CCL21

Tabel 5. Antilichamen gebruikt bij longdigestie.

geconjugeerde antilichamen Lin-FITC BDCA-2 APC CD197-PE CD183-PE CD184-PE

receptor

CCR7 CXCR3 CXCR4

isotype

mouse IgG2a-PE mouse IgG1a-PE mouse IgG2a κ-PE

bedrijf BD Milteyni Biotec R&D BD BD

cat nr 340546 130-090-905 FAB197P 557185 555974

volume 20µl 10µl 20µl 20µl 20µl

Tabel 6. Lineage cocktail – aanwezige antigenen. Antigen CD3 CD14 CD16 CD19 CD20 CD56

Expressie T-cellen monocyten, macrofagen, neutrofielen, eosinofielen NK-cellen in rust, lymfocyten, macrofagen, monocyten in cultuur, neutrofielen B-cellen B-cellen actieve en niet-actieve NK-cellen

Tabel 7. Monoclonale antilichamen met vermelding van isotype en fluorochroom. Antigen CD80 CD83 CD86 HLA-DR CD123 PI

clone BB1 HB15e 2331 (FUN-1) TU36 7G3

isotype mouse IgMκ mouse IgG1κ mouse IgG1κ mouse IgG2bκ mouse IgG2a,κ

fluorochroom FITC FITC FITC PE APC

bedrijf BD BD BD BD BD BD

cat nr 555683 556910 555657 555561 560087 55654c

volume 20µl 20µl 20µl 20µl 20µl 5µl

Tabel 8. Patiënt karakteristieken: Immunohistochemische analyse van pDC’s. Waarden

Never smokers

Current smokers without COPD

Ex-smokers without COPD

COPD I-II Current smokers

COPD I- II Ex-smokers

COPD III-IV Ex-smokers

worden gegeven als gemiddelde ± SD.

10

12

14

22

12

9

56,3 ±11,2

55,2 ± 10,9

63, 7 ± 7,4

62,7 ± 9,1

68,9 ± 6,9

57,1 ± 5,23

-

30,8 ± 12,8

39,1 ± 35,8

47,6 ± 20,9

40,5 ± 23,1

44,5 ± 2,73

-

0,2 ± 0,23

18 ± 10,3

-

9,8 ± 7,6

5,1 ± 2,73

FEV1 (% )

100,6 ± 12,1

103,2 ± 13,9

102,6 ± 19,1

75,2 ± 12,6

83,7 ± 11,5

26,7 ± 10,4

FEV1 (L)

2,8 ± 0,9

3,1 ± 0,5

3,2 ± 0,9

2,4 ± 0,49

2,6 ± 0,4

0,7 ± 0,29

Tiffeneau (%)

77,3 ± 7,3

77,8 ± 5,7

76,2 ± 5,8

57,6 ± 8,0

60,1 ± 6,2

36 ± 10,37

N (79) Age Smoking history (py) Quit smoking (in years)

Tabel 9. Gemiddelde waarden van BDCA-2+ cellen in het epitheel, lamina propria en Adventitia. De waarden worden weergeven als gemiddelde ± SD.

Epitheel (mean ± SD) Lamina propria (mean ± SD) Adventitia (mean ± SD)

Never smokers

Smokers Ex-smokers without COPD without COPD

COPD I-II Smokers

COPD I-II ex-smokers

4,67 ± 6,27

2,67 ± 7,20

10,7 ± 21,31

8,15 ± 13,89 6,5 ± 9,53

4,77 ± 6,74

COPD III-IV ex-smokers

9,17 ± 12,64 5,05 ± 12,17 17,23 ± 31,16 18,27 ±38, 95 10,15 ±15,61 3,5 ± 6,77 13,69 ±18,07 27,12 ±43,12 24,71 ±30, 83 20,49 ± 28,51 17,35 ±20,63 20,7 ±21,09

Tabel 10. Viabiliteit van pDC’s na overnachting met IL-3 en CSE. Resultaten van 3 onafhankelijke experimenten.

Experiment 1 viabiliteit (%) Experiment 2 viabiliteit (%) Experiment 3 viabiliteit (%)

1% CSE 92,6 0% CSE 91,7 0% CSE 77,9

2% CSE 91,8 0,5% CSE 91 0,5% CSE 72,9

3% CSE 87,5 0,75% CSE 91,3 1% CSE 78,6

4% CSE 75,1 1% CSE 90,7 2% CSE 66

5% CSE 70,3 2% CSE 89,4 3% CSE 60,6

Tabel 11. Absolute viabiliteit. De eerste waarden vormen de maximale viabiliteit die bekomen werden in de experimenten. Deze worden voorgesteld al 100%. T.o.v deze waarde werd de absolute viabiliteit en de relatieve daling in viabiliteit bepaald.

Experiment 1 Absolute viabiliteit Daling in viabiliteit Experiment 2 Absolute viabiliteit Daling in viabiliteit Experiment 3 Absolute viabiliteit Daling in viabiliteit

1% CSE 100 0% CSE 100 0% CSE 100

2% CSE 99 1 0,5% CSE 99,2 0,8 0,5% CSE 93,6 6,4

3% CSE 94,5 5,5 0,75 % CSE 99,5 0,5 1% CSE 100,9 + 0,9

4% CSE 81,1 18,9 1% CSE 98,9 1,1 2% CSE 84,7 13,3

5% CSE 75,9 24,1 2% CSE 97,5 2,5 3% CSE 77,8 22,2

Addendum II

II.1. II.2. II.3. II.4 II.5.

Afkortingen. IHC kleuringsprotocol voor BDCA-2. Scoring BDCA-2 – protocol. Informed Consent. Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I principe.

II.1. Afkortingen. α1-AT:

α1-antitrypsine

AG:

Antigen

AL:

Antilichaam

APC:

Antigen Presenterende Cel

APC:

Allophycocyanine

BAL:

Broncheo Alveolair Lymfevocht.

BALT:

Broncheal Associated Lymphatic Tissue

BDCA-2:

Blood Dendritic Cell Antigen - 2

CCL:

Chemokine ligand

CCR:

CC-Chemokinereceptor

CD:

Cluster of Differentiation

CLR:

C-type Lectine Receptor

COPD :

Chronic Obstructive Pulmonary Disease.

CRP:

C-Reactive Protein

CS:

Cigarette Smoke

CSE:

Cigarette Smoke Extract.

CXCR:

CXC-Chemokinereceptor

DC:

Dendritische Cellen

EDTA:

Ethylenediaminetetraamino zuur

ELISA:

Enzym Linked Immuno Sorbent Assay

FACS:

Fluorescent Activated Cell Sorting

FEV1:

Forced Expiratory Value – 1 seconde waarde

FITC:

Fluorescent Isothiocyanaat

FVC:

Forced Vital Capacity

GOLD:

Global Initiative for chronic obstructive Lung Disease.

HEV:

High Endothelial Venules

HRP:

Horse Radish Peroxidase

HSPC :

Hematopoïetische Stam en Progenitor Cel

IFN :

Interferon

IL-8:

Interleukine 8

IntDC:

Interstitiële DC

IR:

Incidentie Ratio

LAF:

Laag Autofluorescent

LC:

Langerhanscellen

LCH:

Pulmonary Langerhans Cell Histiocytose

LPS:

Lypopolysacchariden

mDC:

Myeloïde DC

MHC :

Major Histocompatibility Complex

MMP :

Matrix Metallo Proteasen

NK-cellen:

Natural Killer cellen

NKT-cel :

Natural Killer T-cel

NOD :

Nucleotide Oligomerisatie Domein

NLR :

NOD-like Receptoren

ODN:

Oligodeoxynucleotiden

PAMP :

Pathogen Associated Molecular Patters

PBS:

Phosphate Buffer Saline

pDC :

Plasmacytoïde DC

PGN :

Peptidoglycaan

PI:

Propidium Jodide

PRR:

Pathogen Recognition Receptor

PY:

Person Years

RSV :

Respiratory Syncitial Virus

SPSS:

Statistical Package for Social Sience

TCM:

Tissue Culture Medium

TGF-β:

Tranforming Growth Factor-β

Th:

T-helper

TIMP:

Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteasen

TLR:

Toll Like Receptor

TMP:

Tetramethylbenzidine dihydrochloride

TNF-α:

Tumer Necrosis Factor- α

TNF-R:

TNF-receptor

II2. IHC kleuringsprotocol voor BDCA-2.

Materials and methods

Lung tissue at a distance from the pulmonary lesion was collected by a pathologist. From this specimen, small tissue blocks from the subpleural parenchyma were selected for immunohistochemical analysis.

Samples were immediately placed in OCT (Tissue-Tek,

Sakura Finetek, Zoeterwoude, the Netherlands), snap-frozen in liquid nitrogen cooled isopentane and stored at minus 80° Celsius. 7 µm thick cryosections were cut on poly-Llysine-coated microscopic slides (Sigma, Bornem, Belgium). Sections were dried for 24 hours and stored at minus 80° Celsius until use. Prior to the immunohistochemical procedure, cryosections were defrosted to room temperature, dried and fixed in aceton for 10 minutes. After fixation, tissue sections were rinsed with phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.8) Sections were incubated with mouse anti-human monoclonal antibody directed against BDCA-2 (AC144) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) for 1 hour at room temperature following incubation with normal goat serum (CLB, Amsterdam, the Netherlands) for 10 minutes. These primary antibodies were diluted in PBS containing 1% blocking reagent (Roche, Basel, Switserland) . Sections were then rinsed with PBS for 5 minutes and incubated with biotinylated goat anti-mouse antibody (Biogenics, Klinipath, Duiven, the Netherlands) for 30 minutes at room temperature. Next, sections were rinsed with PBS and incubated with streptavidin alkaline phosphatase (ss-AP, Biogenics, Klinipath, Duiven, the Netherlands) for 30 minutes at room temperature. Sections were then rinsed with PBS containing TRIS buffer (0.2 mol/L, pH 8.5) and incubated with new fuchsine (Chroma, Kongen, Germany) substrate (containing levamisole to block endogenous alkaline phosphatase enzyme activity) for 20 minutes at room temperature.

Cryosections were

counterstained with hematoxylin, rinsed with distilled water, and mounted in Vecta Mount (Vector, Burlingame, CA, USA).

II.3 Scoring BDCA-2. Na het openen van het programma KS400 van Zeiss verschijnen de te volgen instructies op het scherm. De stappen die worden ondernomen om een goede scoring te verkrijgen zijn hieronder vermeld.

1. Macro human long2.mcr openen. 2. Start macro. 3. User: naam kiezen 4. Name of file: bv: GVP20061 5. (1) Visualisation. 6. Nr van lijn invullen van de coupe die men wil meten. 7. Name of directory: bv: C:/images/Geert/HLO1/Test. 8. Afbeelding van coupe wordt opgeladen. 9. anykey 10. 2x exit 11. Anykey 12. Sec: bv: A1 13. Meten: Lijndikte nr 3 kiezen -

1e en 2e lijn (Blauw): omlijnen van epitheel

-

Kleur de ruimte tussen de 2 blauwe lijnen blauw

-

Anykey

-

Cellen aanduiden in epitheel (blauw, dikte 6)

-

3e lijn (Rood): Lamina propria aanduiden (gladde spieren)

-

Anykey

-

Cellen aanduiden tussen blauwe en rode lijn (rood, dikte 6)

-

Anykey

-

4e lijn (Groen): Adventitia aanduiden ( tot aan het parenchym).

-

Anykey.

-

Cellen aanduiden tussen rode en groene lijn (groen, dikte 6).

-

Anykey

-

Eventuele follikels aanduiden (Violet, dikte 6)

-

Anykey

14. Anykey 15. Keuze: Verder doen op hetzelfde plaatje? (0) No → Next cross-section? (0) No → Copy to Excel? (0) No (1) Yes (Excel openen, anykey, end) (2) Yes → start bij punt 12. (1) Yes → start bij lijn 13. (9) Stop → End

II.5 Informed Consent Titel: Cellulaire en moleculaire mechanismen in de pathogenese van COPD Onderzoeker: Dr. lngel Dernedts en Prof.Dr.R.Pauwels 1. Patiënteninformatie U wordt gevraagd om vrijwillig deel te nemen aan bovenvermeld onderzoek. Wij vragen u om de volgende informatie aandachtig te lezen. Als u sommige woorden of informatie niet begrijpt, vraag dan om uitleg aan uw dokter of aan het verplegend personeel. Wat u zeker dient te weten is dat u geen proefmedicatie dient te nemen en dat er van u ook geen enkele extra inspanning wordt verwacht. Inleiding Mensen die roken hebben een verhoogd risico op het ontstaan van hart- en vaatziekten, longkanker en andere rookgerelateerde ziekten zoals Chronisch Obstructief Longlijden (COPD). COPD is een medische term die een chronische (langdurige) toestand van de longen omschrijft gekenmerkt door ontsteking en vernauwing van de kleine luchtwegen. Opvallend is echter dat slechts 20 % van alle rokers COPD ontwikkelt .. Het is gekend dat sigaretterook een chronische ontsteking van de kleine luchtwegen veroorzaakt maar in hoeverre deze ontsteking verschilt van rokers die geen COPD ontwikkelen is onduidelijk . Doel van de studie Met behulp van deze studie willen wij meer inzicht krijgen in het ontstaan en verloop van COPD en op die manier hopelijk ook aanknopingspunten vinden voor nieuwe therapieen. Studiebeschrijving Deze studie zal een vergelijking trachten te maken tussen rokers met en rokers zonder COPO" Hiervoor zouden wij graag de kleine luchtwegen vergelijken tussen rokers met en zonder COPD. U dient binnenkort een longoperatie te ondergaan. Het stuk longweefsel dat weggenomen wordt gaat naar de dienst anatornopathologie voor verder onderzoek. Voor dit onderzoek is echter maar een klein stuk nodig, wat overblijft zouden wij verder onderzoeken op het niveau van de kleine luchtweg. U dient absoluut te weten dat niks extra wordt

weggenomen voor ons onderzoek! Uw deelname aan deze studie is vrijblijvend. U mag weigeren deel te nemen zonder dat dit in de toekomst uw recht op medische behandeling in gevaar brengt. Dit onderzoek is goedgekeurd door een commissie voor medische ethiek met als doel uw rechten te vrijwaren.U mag zich op eender welk ogenblik terugtrekken zonder dat dit uw medische zorgen in gevaar brengt. Het onderzoek Voor u deel kunt nemen aan dit onderzoek moet bepaald worden of u ervoor in aanmerking komt. Hiertoe wordt uw medische voorgeschiedenis met u besproken en zal u gevraagd worden welke medicijnen u gebruikt. Verder dienen we te weten of en hoeveel u rookt en gerookt heeft. De verdere onderzoeken die gebeuren zijnde een algemeen lichamelijk onderzoek, een bloedonderzoek, een onderzoek van uw slijmen, een longfoto en longfunctietest dienen te gebeuren in het kader van uw preoperatieve voorbereiding. Die resultaten zouden wij echter ook voor ons onderzoek gebruiken.

Mogelijke voordelen Voor u persoonlijk zijn geen voordelen aan dit onderzoek verbonden, uw deelname kan echter leiden tot vooruitgang in de kennis en behandeling van de ziekte COPD zodat mensen met dezelfde aandoening in de toekomst beter behandeld kunnen worden. "

Risico's/ongemakken Er zijn voor u geen risico's of ongemakken als u deelneemt aan deze studie Vertrouwelijkheid Men zal erop toezien dat de informatie die ingezameld is als deel van het onderzoek vertrouwelijk blijft. De besluiten van dit onderzoek kunnen op congressen voorgesteld of in een tijdschrift gedrukt worden. Maar uw identiteit zal niet bekend gemaakt worden. Bijkomende informatie Indien u vragen of zorgen hebt betreffende dit onderzoek, kan u ons altijd contacteren op het

nummer 09-2402605 Toesfemmingsformulier Ik verklaar mij akkoord, na voorgaande informatie te hebben gelezen en besproken met de arts, om deel te nemen aan deze klinische studie. Ik weet dat mijn deelname vrijwillig is en dat ik op elk ogenblik kan weigeren om verder deel te nemen. Dit zal geen invloed hebben op mijn huidige of toekomstige behandeling .. Ik heb een kopie van dit toestemmingsfonnulier ontvangen . • Het onderzoek is volledig en duidelijk aan mij uitgelegd • Ik heb een schriftelijk patienteninformatieformulier gekregen. Ik zal een kopie van dit toestemmingsformulier meekrijgen. • Mijn vragen zijn volledig en duidelijk beantwoord. • Ik weet wie ik kan bellen wanneer ik verdere vragen heb . • Ik heb voldoende tijd gehad om over mijn beslissing na te denken. • Ik weet dat de deelname geheel vrijwillig is. Ik weet dat ik mij kan terugtrekken' zonder het' opgeven van redenen en dat dit geen invloed zal hebben op mijn behandeling of op de relatie met mijn arts. • Ik weet dat alle informatie die over mij wordt verzameld vertrouwelijk behandeld zal worden .. • Ik weet dat andere mensen inzage kunnen krijgen in mijn medische gegevens. Getekend (patiënt)

Datum

Naam +handtekening

Getekend (Onderzoekers of medewerkers)

Datum

Naam + handtekening

Getekend (Diensthoofd)

Datum

Naam +handtekening

PREOPERATIEVE GEGEVENS THORAXHEELKUNDE

-

NAAM:

-

GEBOORTEDATUM:

-

OPERATIEDATUM:

-

NICOTINEGEBRUIKT (pack year): o Niet-roker o Actuele roker – gebruik: o Gestopt

Hoelang: Vroeger gebruik

-

Longfunctie (voor en na bronchodilatatie): o UZ Gent o Andere locatie:


FEV1 .

Voor: Na:




-

FVC

ml ml

% verwachte waarde

Voor ml

% verwachte waarde

Na:

% verwachte waarde

ml




Tiff:

%




DLCP

% verwachte waarde

Pathologie:

% verwachte waarde

II.5 Annexin V- FITC Apoptosis Detaction Kit I Principe