FONTOS! a március 14-i előadás március 19-én (szombat) 9 h-kor lesz
2008 Small World contest - 4th Prize - Dr. Matthew Springer (University of California, San Francisco, United States) Specimen: Differentiation of unicellular Dictyostelium discoideum into multicellular slugs (100x) Technique: Stereomicroscopy
Mikroszkóp - mikroszkópia görögül: mikron = kicsi + szkopein = nézni MIKROSZKÓP olyan eszköz, mely megjeleníti az emberi szem számára láthatatlan parányokat MIKROSZKÓPIA a szabad szemmel láthatatlan parányok mikroszkóppal való tanulmányozásának tudománya CÉL 1. NAGYÍTOTT 2. MEGFELELŐ FELBONTÁSÚ 3. KONTRASZTOS kép
A fény (optikai) mikroszkópia felületi módszerek NSOM
TIRF
3D módszerek
SPR
hagyományos
nem-lineáris
interferencia
konfokális
dekonvolúciós SRM
több foton reverzibilis szaturáció
SHG
CARS
2P, 3P
ApoTome
SSIM
HELM
I5M
4Pi
STED MMM-4Pi
Garini és mtsai Current Biology 2005
Geometriai optika - Lencsék Gyűjtőlencsék képalkotása t
k
t
F
F
f
f
nevezetes sugármenetek fókuszpont, távolság (f) tárgy-, képtávolság (t, k) valós, látszólagos kép
t
k
F
F f
f
k=∞
F
F
f
f
LENCSETÖRVÉNY
NAGYÍTÁS
1 1 1 f t k
K k N T t
Geometriai optika - Lencsehibák KROMATIKUS ABERRÁCIÓ Diszperzió
n ( )
különböző hullámhosszúságú fénysugarak ↓ különböző fókuszpont
SZFERIKUS ABERRÁCIÓ A lencsék gömbszerű geometriája
különböző görbületet elérő fénysugarak ↓ különböző fókuszpont
Geometriai optika - Fénytörés
beeső
megtört
megtört
SNELLIUS-DESCARTES TÖRVÉNY
sin n2 sin n1
A fénymikroszkóp képalkotása - Alapelvek
TÁRGY KÉP1 (valódi, nagyított, fordított állású) KÉP2 (látszólagos, nagyított, egyenes állású) TÁRGY KÉP2 (látszólagos, nagyított, fordított állású)
1. NAGYÍTÁS 2. FELBONTÁS 3. KONTRASZT
1. Nagyítás OBJEKTÍV: Nobjektív = 1 – 150 OKULÁR: Nokulár = 5 – 30 MIKROSZKÓP: Nmikroszkóp = Nobjektív x Nokulár
2. Felbontóképesség az a legkisebb távolság (d), amelyre lévő két pont (tárgypont) képe még megkülönböztethető egymástól
RAYLEIGH EGYENLET XY irányban – a minta síkjában
d x , y 0.61
NA
Z irányban – optikai tengely mentén
2 dz NA2 d: két pont távolsága λ: a megvilágítás hullámhossza NA: numerikus apertúra 1/d: a mikroszkóp feloldóképessége
2. Felbontóképesség - Hullámhossz d 0.61 NA = 1.4
2 dz NA2
NA
HULLÁMHOSSZ nm
FELBONTÁS - XY nm
FELBONTÁS - Z nm
360
156
367
400
174
408
450
196
459
500
217
510
550
239
561
600
261
612
650
283
663
700
305
714
növelésével a felbontóképesség csökken
2. Felbontóképesség - Numerikus apertúra egy optikai rendszernek (pl. egy mikroszkóp lencsének) az a legnagyobb nagyító képessége, amellyel még éles képet ad. az optikai lencserendszerek fénygyűjtő képességének egység nélküli mérőszáma, mely meghatározza a felbontóképességet és a mélységélességet.
NA n sin n: a tárgy és az objektív közötti anyag törésmutatója μ: az objektív félnyílásszöge
NA = 0.04 – 1.45
2. Felbontóképesség - Airy korong a tárgy egyes pontjairól érkező fénysugarak az objektív nyílásán elhajlást szenvednek a képpontok helyett koncentrikus körök formájában megjelenő erősítési és kioltási helyek sorozata alakul ki Egyetlen tárgypont elhajlási képe: AIRY KORONG (George Biddel Airy 1801-1892)
TÁRGY
KÉP erősítés
kioltás
3 2
1
0
2. Felbontóképesség - Airy korong d 0.61
d ? d ?
Airy korong
NA
d
d
felbontott
nem felbontott
az egyik maximuma éppen a másik első minimumába esik
2. Felbontóképesség - Airy korong
NA
NA növelésével a felbontóképesség növekszik
3. Kontraszt A minta optikai inhomogenitása miatt (törésmutató, alak, ..) a rajta áthaladó a fénysugarak sajátságai (irány, sebesség, fázis, …) megváltozhatnak KONTRASZT
3. Fázis-kontraszt mikroszkópia A mintára eső fénysugarak a mintán áthaladva annak törésmutatójától, geometriájától (alakjától), vastagságától függően eltérülhetnek. nem eltérített (S) nem lépett kölcsönhatásba a mintával: HÁTTÉR
fáziskésés
minta eltérített (D) kölcsönhatásba lépett a mintával: DIFFRAKCIÓ
3. Fázis-kontraszt mikroszkópia VILÁGOS LÁTÓTERŰ MIKROSZKÓPIA AZONOS FÁZIS ↓interferencia AZONOS AMPLITÚDÓ
HOMOGÉN KÉP
FÁZIS-KONTRASZT MIKROSZKÓPIA KÜLÖNBÖZŐ FÁZIS ↓interferencia KÜLÖNBÖZŐ AMPLITÚDÓ
KONTRASZTOS KÉP
3. Fázis-kontraszt mikroszkópia kép
diffrakció (D) nincs diffrakció (S) FÁZISGYŰRŰ objektív
minta
rápárologtatott réteggel ellátott lemez a hengerpalást mentén jövő (összehasonlító) fénysugarat a hullámhossz negyedrészével fázisban eltolja KÜLÖNBSÉGEK MAXIMALIZÁLÁSA
a fénysugár henger- vagy kúppalást mentén halad
kondenzor
KONDENZOR MASZK fényzáró réteg gyűrű alakú áteresztő területet „gyűrű-diafragma”
2008 Small World contest -18th Prize - Dr. Tamily Weissman (Harvard University - Cambridge, Massachusetts, United States) Specimen: “Brainbow” transgenic mouse hippocampus (40x) Technique: Confocal
Fluoreszcencia mikroszkópia
A mintának a megvilágító fény által kiváltott fluoreszcenciáját képezzük le. A képalkotáshoz használt fény fluorofórok emissziójából származik.
Fluorofórok BELSŐ (INTRINSIC) FLUORESZCENCIA klorofil KÜLSŐ (EXTRINSIC) FLUORESZCENCIA fluoreszcens molekulák kvantum gyöngy (d = 2-10 nm, 100-100000 atom) fehérje (GFP) (d = 10 nm, 26 kDa) kis molekula (d = 1 nm, 20 atom)
Mikroszkóp
Mikroszkóp
GERJESZTÉS SZEMLENCSE
MINTA
DETEKTOR OBJEKTÍV
SZŰRŐK
TÜKRÖK
Mikroszkóp ÁTESŐFÉNY
INVERTÁLT
Gerjesztés: Lámpák, lézerek LÁMPA: xenon ív, higanygőz
LÉZER, LED
Szűrők: gerjesztési/emissziós egy meghatározott hullámhossztartomány kiválasztása
Dikroikus tükör egy meghatározott hullámhossztartományban visszaveri a fényt, a többi hullámhossztartományon átenged (NYALÁBOSZTÓ)
Szűrők + tükrök EMISSZIÓ emissziós szűrő
dikroikus tükör szűrő kocka
GERJESZTÉS
gerjesztési szűrő
Objektív
nagyítás
típus immerzió típusa immerzió típusa NA fedőlemez típusa nagyítás színkód
fedőlemez tárgylemez
munka távolság
Detektorok foton elektromos jel FOTOELEKTRON SOKSZOROZÓ FOTODIÓDA CCD KAMERA (charged coupled device)
Fluoreszcencia mikroszkópia – Probléma 1 emisszió
m
gerjesztés HÁTTÉRFLUORESZCENCIA!!!
Z IRÁNYÚ FELBONTÁS JAVÍTÁSA konfokális technika evaneszcens mező alkalmazása több foton gerjesztés
Konfokális mikroszkópia
Konfokális mikroszkópia - Alapelvek KONJUGÁLT FOKALITÁS : KONFOKÁLIS detektor emisszió apertúra fókuszponton kívüli fókuszpontból
gerjesztő lézer
gerjesztés apertúra
fókuszsíkok
Konfokális mikroszkópia
Konfokális mikroszkópia
felbontás XY: 200 nm Z :600 nm
TIRFM Total Internal Reflection Microscopy Teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia mikroszkópia
TIRFM - Alapelvekc TELJES BELSŐ VISSZAVERŐDÉS
sin n2 sin n1 kritikus n2 n1
megtört
teljes belső visszaverődés
90o
TIRFM - Alapelvek EVANESZCENS MEZŐ
I ( z ) I 0 exp( z / d )
[z], nm
I(z) %-ban
0
100
1
99
10
92
100
43
1000
0
TIRFM - Alapelvek nagy NA immerziós olaj (n) a gerjesztő nyaláb tengelyen kívüli helyzete
TIRFM
TIRFM
felbontás XY: 200 nm Z :100 nm
Több-foton gerjesztéses mikroszkópia
Több-foton gerjesztéses mikroszkópia Alapelvek Nemlineáris optika E
Jablonski diagram
hc
1
2 21 t 10 18 s
LÉZER!! impulzuslézer
Több-foton gerjesztéses mikroszkópia
Fluoreszcencia mikroszkópia – Probléma 2 FELOLDÓKÉPESSÉG RAYLEIGH EGYENLET
d 0.61
NA
HULLÁMHOSSZ FELBONTÁS - XY nm nm 360
156
400
174
450
196
500
217
550
239
600
261
650
283
700
305
XY FELBONTÁS JAVÍTÁSA fizikai módon matematikai módon
STED Stimulated Emission Depletion Microscopy Fluoreszcencia emisszió stimulált gyengítésén alapuló mikroszkópia
STED - Alapelvek Fluoreszcencia emisszió stimulált gyengítése gerjesztés fluoreszcencia
nem lineáris le-gerjesztés alapállapot - nonfluoreszcens
maradék fluoreszcencia
STED - Alapelvek fázislemez
gyengítő lézer STED lézer
gerjesztés gyengítés red shift
gerjesztő lézer
dikroikus tükrök objektív
minta
széleslátóterű
STED
STED
Aktin filamentumok Elise Stanley, Division of Genetics & Development, Toronto Western Research Institute (TWRI), Canada
STED
felbontás XY: 20- 40 nm Z :100 nm
SIM Structured Illumination Microscopy
Struktúrált megvilágítás mikroszkópia
SIM - Alapelvek
rács forgatása + képkészítés képanalízis fontos: rács geometriája forgatások száma
SIM
felbontás XY: 100 nm Z :150 - 300 nm
FRAP Fluorescence Recovery After Photobleacing Fluoreszcencia intenzitás visszatérése kioltás után
FRAP kinetikai analízis
intenzív lézerimpulzus ↓ kioltás
fluoreszcencia intenzitás visszatérésének sebessége mennyisége
Fluoreszcencia intenzitás
visszatérés kioltás mobilis
50%
idő (t)
immobilis
FLIM Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy FADIM Fluorescence Anisotropy Decay Imaging Microscopy Fluoreszcencia élettartam/anizotrópia mikroszkópia
FLIM - FADIM
További érdekességek
2010 Small World contest - 7th Prize - Mr. Yongli Shan (UTSW - Dallas, Texas, USA) Specimen: Endothelia Cell attached to synthetic microfibers (2500x) Technique: Epifluorescence, Confocal
