DETEKSI DAN ANALISIS EKSPRESI TRANSGEN (PhGH) PADA IKAN LELE DUMBO (Clarias gariepinus) TRANSGENIK F3 (Detection and Analysis Expression of transgene (PhGH) in Dumbo Catfish (Clarias gariepinus) Transgenic F3) 1
Fery Jaksen Sihotang1),Budi Utomo2),Indra Lesmana3),Huria Marnis4) Program Studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara (Email :
[email protected]) 2 Staf Pengajar Program Studi Kehutanan, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara 3 Staf Pengajar Program Studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Universitas Sumatera Utara 4 Staf Peneliti Balai Penelitian dan Pemuliaan Ikan (BPPI) Sukamandi, Subang Jawa Barat
ABSTRACT Fisheries output need tobe increased to meet the rising demands for fish incoming years as the increasing of human population. Biotechnology approach has used for increasing production on aquaculture sector. One of the advances biotechnologies that used for aquaculture development is transgens technology. Transgenic fish is a species that experience alteration of genetic structure that introduced from other organisms, with the result that change the their genetic function in accordance with the introduced gene. One of the things that support the development of transgenic fish strain formation is the ability of individual transgenic to bequeath the transgenes to the next generation, so that the genetic trait target genes stable in the resulting offspring. This study aims to detect and determine the expression of growth hormone gene (PhGH) on dumbo catfish (Clarias gariepinus) transgenic F3. Transgene detection performed on embryos and larvae of catfish transgenic F3 using PCR with primers ACT 107 and PhGH2. Transgene expression was analyzed by using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) methods with primers β-actin and ACT 107 and PhGH2. The results showed that the transgene was detected in some of the embryos and larvae according to Mendel principle. β-actin primer amplification compared to primary ACT 107 and PhGH2 showed that transgene can be expressed in some of the embryos and larvae. Keywords: biotechnology, aquaculture, transgenic, detection, expression, growth hormone PENDAHULUAN Latar Belakang Ketersediaan induk unggul dalam bidang akuakultur merupakan hal yang sangat pokok dalam menunjang proses keberlanjutan kegiatan budidaya dan hasil produksi untuk dapat memenuhi kebutuhan manusia akan konsumsi ikan yang merupakan salah satu penyumbang
protein hewani bagi manusia. Sehingga untuk memenuhi kebutuhan tersebut, maka produksi dalam kegiatan perikanan harus terus ditingkatkan melalui ketersediaan benih unggul maupun induk unggul. Menurut Dewi dkk (2013) produk perikanan tersebut dapat diperoleh dengan beberapa teknik/strategi yaitu
diantaranya menggunakan metode seleksi induk, hibridasi, poliploidasi dan transgenesis melalui teknologi rekayasa genetika. Perkembangan aspek teknologi molekuler dalam bidang akuakultur saat ini telah banyak dilakukan melalui teknik rekayasa genetika dengan memanfaatkan hormon tertentu yang diisolasi dari spesies ikan lain yang memiliki keunggulan karakter tertentu, kemudian diintroduksikan pada hewan target, sehingga ikan target mengalami perubahan pada karakteristik genetiknya sesuai dengan keunggulan gen target yang diintroduksikan. Perkembangan aspek teknologi rekayasa genetika pada saat ini memungkinkan untuk memproduksi induk dengan karakteristik tertentu seperti pertumbuhan yang cepat pada ikan salmon (Devlin dkk., 1994), resistensi terhadap bakteri patogen pada channel catfish (Ictalarus punctatus) (Dunham dkk., 2002) atau ikan zebra (Brachydanio rerio) (Yazawa dkk., 2005), dan meningkatkan daya tahan terhadap suhu dingin (antifreeze protein) terhadap atlantic salmon (Salmo salar) (Du dkk., 1992). Penelitian ikan transgenik dengan mentransfer gen hormon pertumbuhan pada beberapa ikan budidaya telah berkembang dengan baik dan diharapkan pertumbuhannya lebih cepat dan dapat diproduksi untuk produk pangan komersial (Marnis dkk., 2014). Dengan demikian teknologi transgenesis tersebut dapat dijadikan suatu strategi untuk memenuhi kebutuhan akan produksi perikanan. Menurut Marnis dkk., (2014) dalam pembentukan strain ikan transgenik, transgen yang ditransfer pada ikan target harus dapat terdeteksi dan terintegrasi pada germline dan dapat ditransmisikan atau diturunkan pada keturunan selanjutnya. Namun meskipun
transgen dapat terintegrasi ke dalam semua jaringan tubuh ikan target, namun transgen tersebut kemungkinan tidak terekspresi di seluruh jaringan tubuh ikan (Marnis dkk., 2013). Maka diharapkan transgen tidak hanya dapat ditransmisikan namun juga dapat terekspresi pada keturunan selanjutnya. Penelitian tentang deteksi dan ekspresi transgen pada beberapa spesies ikan transgenik telah dilakukan yaitu pada ikan zebra (Brachydanio rerio) (Bayer dan Jose, 1992), ikan nila (Oreochromis niloticus) (Kobayashi dkk., 2007), ikan medaka (Oryzias latipes) (Chong danVielkind,1989) dan mud loach (Misgurnus mizolepis) (Nam dkk.,1999). Hasil dari penelitian menunjukkan bahwa transgen dapat terdeteksi dan terekspresi pada keturunan selanjutnya. Pada penelitian sebelumnya telah dihasilkan ikan lele dumbo trasngenik F2 yang merupakan hasil persilangan sesama ikan transgenik F1, dimana hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen (PhGH) terdeteksi dan terekspresi pada ikan transgenik F2 (Marnis dkk., 2013). Diharapkan populasi transgenik F2 dapat mewariskan transgen pada gnerasi berikutnya. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengetahui ekspresi gen hormon pertumbuhan (PhGH) pada ikan lele (Clarias gariepinus) transgenik F3. Tujuan Penelitian 1. Untuk mendeteksi gen hormon pertumbuhan ikan patin siam pada ikan lele dumbo transgenik F3. 2. Untuk mengetahui apakah gen hormon pertumbuhan ikan patin siamyang berhasil ditransfer ke dalam jaringan tubuh ikan lele dumbo dapat terekspresi pada generasi F3.
METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari sampai dengan April 2015 di Balai Penelitian Pemuliaan Ikan Sukamandi, Subang, Jawa Barat. Prosedur Penelitian Hewan Uji Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah embrio dan larva yang berasal dari perkawinan silang antara sesama induk ikan lele dumbo transgenik F2 dan sesama induk ikan lele dumbo non-transgenik. Induk ikan lele dumbo transgenik F2 yang digunakan adalah induk yang membawa konstruksi transgen pCcBA-PhGH. Adapun konstruksi transgen tersebut dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Peta konstruksi gen pCcBAPhGH (6,6 kb). pCcBA = promoter β-aktin ikan mas. PhGH = gen hormon pertumbuhan ikan patin siam. PolyA = poliadenilasi pada vektor pEGFP-N1. KpnI, ApaI, AgeI, NotI = enzim restriksi (Dewi et al., 2013). Deteksi PhGH Pada Lele Dumbo Transgenik F3 Ekstraksi DNA Embrio dan Larva Deteksi transgen dilakukan pada 30 embrio dan 20 ekor larva dari masing-masing perkawinan silang sesama induk ikan lele transgenik F2 dan sesama induk non-transgenik.
Sampel embrio dan larva masingmasing digerus (pooling) menjadi satu. DNA genom masing- masing sampel yang telah digerus diekstraksi menggunakan kit ekstraksi DNA (GeneJet Genomic DNA Purification, Thermo Scientific) sesuai dengan petunjuk penggunaan. Cek Genom DNA Cek kuantitas dan kualitas genom dilakukan menggunakan alat Qubit 2.0 fluorometri (invitrogen) dengan metode spektrofotometer fluorescent dan kit (Qubit dsDNA HS Assay Kit, 100 Assays). Untuk melihat kualitas DNA maka selanjutnya genom dielektroforesis dengan menggunakan gel agarose 2% dan pewarna DNA yaitu gel red (nucleid acid strain). Amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction) Amplifikasi PCR pada DNA genom hasil ekstraksi dilakukan menggunakan mesin Thermal cycler (ESCO) dengan menggunakan kit fast start PCR master kit (Roche, Germany) dengan volume akhir sesuai standar PCR yaitu 25 µL. Primer yang digunakan adalah ACT 107-F (5’- GTG TGT GAC GCT GGA CCA ACT – 3’) dan PhGH2-R (5'CGA TAA GCA CGC CGA TGC CCA TTT-3 ') (Marnis dkk., 2014) dengan ukuran fragmen 1500-bp. Hasil amplifikasi PCR dielektroforesis menggunakan gel agarose (vivantis) 2 % dalam TAE Buffer 1x yang diberi pewarna DNA yaitu gel red (Nulceid acid strain). Hasil elektroforesis kemudian divisualisasi menggunakan UV Transilluminator. Analisis ekspresi transgen PhGH Analisis ekspresi gen PhGH dilakukan menggunakan metode Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).
Ekstraksi RNA Total RNA diekstraksi dari 30 embrio dan 20 larva (pooling). Sampel diekstraksi dengan menggunakan kit ekstraksi RNA (Tri Reagent Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA) sesuai dengan petunjuk penggunaan. Cek Genom RNA Untuk melihat keberhasilan ekstraksi RNA maka dilakukan cek kuantitas dan kualitas RNA genom yang dilakukan menggunakan alat Qubit 2.0 fluorometri (invitrogen) dan kit (Qubit dsDNA HS Assay Kit, 100 Assays). Untuk Melihat kualitas RNA maka selanjutnya genom dielektroforesis menggunakan gel agarose 2% dengan marker 100-3000 bp (vivantis) dan pewarna yaitu gel red (nucleid acid strain). Sintesis DNA (cDNA) Hasil Ekstraksi RNA Amplifikasi cDNA dilakukan dengan menggunakan metode Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)dankit Ready-To-Go You-Prime First Strand Beads (GE Healthcare).Kemudian sampel hasil sintesis DNA dapat langsung dirunning melalui elektroforesis ataupun disimpan pada suhu -25 – 40C. Amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction) Amplifikasi PCR pada DNA genom hasil ekstraksi dilakukan menggunakan mesin Thermal cycler (ESCO) dengan menggunakan kit fast start PCR master kit (Roche, Germany) dengan volume akhir sesuai standar PCR yaitu 25 µL. Primer yang digunakan adalah primer forward (ACT 107) yaitu ACT 107-F (5’- GTG TGT GAC GCT GGA CCA ACT – 3’), primer reverse (PhGH2) yaitu PhGH2-
R (5'CGA TAA GCA CGC CGA TGC CCA TTT-3 ') (Marnis dkk., 2014) dengan ukuran fragmen 1500-bp dan primer β-actin yaitu bact-F (5’-TAT GAA GGT TAT GCT CTG CCC-3’) dan bact-R (5’-CAT ACC CAG GAA AGA TGG CTG-3’) (Dewi dkk., 2013). Hasil amplifikasi PCR kemudian dielektroforesis dengan menggunakan gel agarose (vivantis) 2 % dalam TAE Buffer 1x yang diberi pewarna DNA yaitu gel red (Nulceid acid strain) serta loading dye. Kemudian amplikon dielektroforesis selama 50 menit dengan tegangan 100 volt. Kemudian hasil elektroforesis selanjutnya divisualisasi menggunakan alat Gel Doc (UV Transilluminator). HASIL DAN PEMBAHASAN Deteksi Transgen (PhGH) Pada Embrio dan Larva Lele Dumbo Transgenik F3 Kualitas dan kuantitas genom DNA Embrio dan Larva Cek kualitas genom DNA dilakukan melalui elektroforesis dengan menggunakan loading dye sebagai pemberat dan pewarna molekul DNA. Hasil elektroforesis pada genom embrio dan larva menunjukkan bahwa ekstraksi DNA berhasil dilakukan, dimana genom sampel muncul dengan ketebalan pita DNA yang berbeda (Gambar 2).
A
B
Gambar 3. A = genom DNA Embrio. B = genom DNA larva
Berdasarkan hasil cek Qubit fluorometri (invitrogen) diperoleh beberapa data konsentrasi DNA pada tabel berikut: Tabel 1. Cek Konsentrasi DNA pada Beberapa Genom Embrio Ikan Lele Transgenik F3 Rata-rata Kemurnian konsentrasi (Absorban (ng/mL) 280/260) Embrio Larva 1494 ± 83340 ± 1 45,60 1304,99 3716 ± 86160 ± 2 1,8 – 2,0 70,92 433,58 1664 ± 59720 ± 3 32,86 549,54 Tabel 1 menunjukkan jumlah konsentrasi sampel DNA hasil ekstraksi embrio dan larva, dimana jumlah ratarata konsentrasi tertinggi yaitu pada sampel larva 2 dengan rata-rata 86160 ng/mL dan rata-rata terendah yaitu pada sampel embrio 1 dengan rata-rata 1494 ng/mL. Hasil Deteksi Transgen (PhGH) Pada Ikan Lele Transgenik F3
Hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen dapat terdeteksi pada beberapa embrio dan larva pada ikan lele transgenik F3 dengan ukuran fragmen sebesar 1500 bp, sementara pada ikan non-transgenik tidak terdeteksi (Gambar 4).
Gambar 5. Genom RNA embrio dan larva ikan lele Transgenik F3. M adalah marker DNA (100-3000 bp) (Vivantis). 1-8 = embrio. 10-14 = larva. N= sampel ikan non-transgenik. Ukuran fragmen = 18S rRNA dan 28S rRNA. Analisis ekspresi Transgen (PhGH) Pada Embrio dan Larva Lele Dumbo Transgenik F3 Kualitas dan kuantitas genom RNA Embrio dan Larva Cek kualitas genom RNA dilakukan melalui elektroforesis dengan menggunakan loading dye sebagai pemberat dan pewarna molekul RNA. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa RNA total berhasil diekstraksi. Hal tersebut dapat dilihat dari genom sampel yang muncul dengan ketebalan pita RNA yang berbeda dan terdapat dua baris pita RNA dengan ukuran 18S rRNA dan 28S rRNA (Gambar 5). M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1500 bp
28S rRNA
800 bp
18S rRNA
M (+) 1 2 3 4 5 6 7 8 N 10 11 12 13 (-)
k.positif 1500 bp
Deteksi transgen 1500 bp
1000bp 500bp M (+) 14 N
Gambar 5. Genom RNA embrio dan larva ikan lele Transgenik F3. M adalah marker DNA (100-3000 bp) (Vivantis). 1-9 = embrio. 10-15 = larva. Ukuran fragmen = 18S rRNA dan 28S rRNA.
Cek kuantitas RNA dilakukan untuk mengukur konsentrasi genom hasil ekstraksi RNA dengan kemurnian berkisar antara 1,8–2,0. Hasil pengukuran konsentrasi genom akan menunjukkan kuantitas dan kualitas RNA. Berdasarkan hasil cek konsentrasi RNA melalui Qubit fluorometri (invitrogen), maka diperoleh data konsentrasi RNA embrio dan larva pada tabel berikut : Tabel 2. Cek Konsentrasi RNA Genom Embrio dan Larva Ikan Lele Transgenik F3 Rata-rata konsentrasi Kemurnian (ng/ml) (Absorban 280/260) Embrio Larva 1792000 1111000 1 ± ± 53572,38 42485,29 1410000 960000 2 ± ± 64420,49 51478,15 2201000 1112000 ± 3 ± 105261,5 28853,07 7 1,8 – 2,0 1190000 1665000 4 ± ± 41683,33 47565,74 1537000 1235000 5 ± ± 47775,51 32015,62 2040000 1360000 6 ± ± 68282,50 23184,04 Tabel 2 menunjukkan jumlah rata-rata tertinggi konsentrasi RNA hasil ekstraksi yaitu pada sampel embrio 3 dengan rata-rata konsentrasi sebesar 2201000 ng/mL dan rata-rata terendah yaitu pada sampel larva 2 dengan rata-rata konsentrasi sebesar 1190000 ng/mL.
Hasil ekspresi Transgen (PhGH) Pada Ikan Lele Transgenik F3 Transgen dapat terekspresi pada beberapa embrio dan larva ikan lele transgenik F3, sementara pada ikan non-transgenik tidak terekspresi. Hasil ekspresi transgen dibandingkan dengan gen β-actin sebagai controlinternal (Gambar 6). M E1 E2 E3 E4 E5 E6 L1 L2 L3 L4 L5 L6 (-)
Β-act 300 bp
A
M (+) E1 E2 E3 E4 E5 E6 L1 L2
L3 L4 L5 L6 (-)
K.positif 1500 bp
B Gambar
Ekspresi Transgen 1500 bp
6. Ekspresi transgen pada embrio dan larva ikan lele dumbo transgenik F3. A = amplifikasi primer β-aktin dengan ukuran fragmen 300 bp. B = amplifikasi primer ACT 107 dan primer PhGH2 dengan kuran fragmen 1500 bp.
Keterangan: M = Marker DNA (1003000 bp) (Vivantis). Tanda (+) = kontrol positif plasmid (pCcBa-PhGH). Tanda (-) = kontrol negatif. E1-E5= embrio transgenik. L1-L5 = larva transgenik. E6 dan L6 = embrio dan larva Ikan lele dumbo non-transgenik.
Pembahasan Deteksi Transgen (PhGH) Pada Embrio dan Larva Ikan Lele dumbo Transgenik F3 Kualitas dan kuantitas genom DNA Embrio dan Larva Hasil penelitian menunjukkan ekstraksi DNA dari sampel embrio dan larva (pooling) berhasil dilakukan dengan menggunakan kit ekstraksi DNA (GeneJet Genomic DNA Purification, Thermo Scientific). Hal tersebut dibuktikan dari hasil cek genom melalui elektroforesis dimana semua genom muncul dengan memiliki ketebalan pita DNA yang berbeda. Elektroforesis menunjukkan pita DNA pada sampel embrio lebih tipis dibandingkan dengan pita DNA pada sampel larva. Adanya perbedaan pada ketebalan pita DNA tersebut terjadi karena perbedaan jumlah konsentrasi DNA hasil ekstraksi, dimana jumlah konsentrasi DNA pada sampel larva lebih tinggi dibanding DNA sampel embrio. Noer dan Gustiananda. (2007) melaporkan bahwa semakin besar konsentrasi templat akan semakin terang dan tebal pita DNA yang dihasilkan, namun konsentrasi templat yang terlalu tinggi juga akan mengakibatkan terbentuknya pita yang smear, sebaliknya konsentrasi templat terlalu rendah akan menyebabkan terbentuknya pita yang terlalu tipis untuk dapat dideteksi dengan cara elektroforesis gel agarosa. Restu dkk., (2012) menambahkan bahwa produk ekstraksi DNA yang berkualitas baik ditunjukkan dengan pita DNA yang terlihat tebal dan bersih serta pita DNA yang menyala. Kualitas genom embrio dan larva didukung oleh kuantitasnya. Hasil pengukuran konsentrasi DNA menunjukkan bahwa semua sampel
mempunyai kemurnian yaitu 1,8 – 2,0. Hal ini membuktikan bahwa kualitas semua genom sampel baik. Menurut Gallagher. (2004), konsentrasi DNA hasil ekstraksi yang baik berkisar antara 1,8-2. Rasio 1,8-1,9 dan 1,9-2,0 menunjukkan persiapan yang sangat murni dari masing-masing DNA dan RNA. Kemurnian DNA didapatkan dengan Absorbance 280/260. Menurut Gallagher. (2004), penyerapan sampel diukur pada beberapa panjang gelombang yang berbeda untuk menilai kemurnian dan konsentrasi asam nukleat. Pengukuran kuantitatif untuk Absorban 260 relatif murni pada persiapan asam nukleat dalam jumlah mikrogram. Pembacaan absorbansi tidak bisa membedakan antara DNA dan RNA. Namun, rasio Absorban 260 nm dan 280 nm dapat digunakan sebagai indikator kemurnian asam nukleat. Kontaminan pada 280 nm (misalnya protein) akan menurunkan rasio ini. Absorbansi pada 230 nm mencerminkan kontaminasi sampel oleh fenol atau urea, sedangkan absorbansi pada 325 nm menunjukkan kontaminasi oleh partikulat dan cuvettes kotor. Hasil Deteksi Transgen (PhGH) Pada Ikan Lele Transgenik F3 Deteksi transgen dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui apakah transgen (PhGH) tersebut masih dapat terdektesi dan diwariskan dari induk transgenik F2 ke generasi F3. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen dapat terdeteksi pada beberapa embrio dan larva ikan lele dumbo transgenik F3. Hasil penelitian yng sama dilaporkan oleh Marnis dkk., (2013), bahwa transgen dapat terdeteksi pada embrio dan larva ikan lele dumbo transgenik F1, kemudian dilanjutkan dengan deteksi terhadap generasi F2, dimana transgen terdeteksi pada larva
dan sirip ekor ikan lele dumbo transgenik F2 dengan persentase transmisi 8,11-50%. Hal ini mengindikasikan bahwa transgen masih stabil diturunkan hingga pada generasi ikan lele dumbo transgenik F3. Kinoshita dkk., (2003) melaporkan bahwa transgen pada ikan medaka transgenik diwariskan dengan stabil pada generasi F1 hingga F4 sesuai dengan kaidah Mendel. Hasil penelitian yang sama juga dilaporkan oleh Martinez dkk., (1999), dimana transgen ditransmisikan pada generasi F1 hingga F4 dengan stabil sesuai kaidah Mendel. Namun hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak semua embrio dan larva ikan lele dumbo transgenik F3 membawa transgen. Hal ini terjadi karena embrio dan larva dihasilkan dari induk ikan lele dumbo transgenik F2 yang bersifat heterozigot. Dalam penelitian sebelumnya telah dilakukan pembentukan generasi ikan lele dumbo transgenik yang positif membawa transgen secara homozigot melalui uji progeny F2 (Marnis dkk., 2014) yaitu dengan mengawinkan silang antara induk ikan lele transgenik F2 dengan induk ikan lele nontransgenik, dimana hasil penelitian menunjukkan bahwa induk F2 masih dalam populasi heterozigot dengan persentase transmisi sebesar 8,11%50%. Hal ini mengindikasikan bahwa transgen masih dapat ditransmisikan hingga generasi ikan lele transgenik F3 sesuai dengan kaidah Mendel. Analisis ekspresi Transgen (PhGH) Pada Embrio dan Larva Ikan Lele Transgenik F3 Kualitas dan kuantitas genom RNA Embrio dan Larva Ikan Lele Dumbo Transgenik F3 Hasil penelitian menunjukkan ekstraksi RNA dari sampel embrio dan
larva (pooling) berhasil dilakukan dengan menggunakan kit ekstraksi RNA (Tri Reagent Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH, USA). Hal tersebut dilihat dari hasil cek genom melalui elektroforesis dimana semua genom muncul dan terdapat dua baris pita RNA dengan ukuran fragmen yang berbeda yaitu 18S rRNA dan 28S rRNA. Hal ini mengindikasikan bahwa total RNA hasil ekstraksi terintegrasi dengan baik dan mRNA tidak terdegradasi, karena band 28S rRNA dan 18S rRNA muncul dan menunjukkan kualitas yang bagus pada semua sampel. Menurut Sambrook dan Russel. (2001) bahwa kualitas 28S rRNA dan 18S rRNA pada prokariota mencerminkan kualitas mRNA. Kualitas genom RNA tersebut didukung oleh kuantitasnya yang diukur dengan Qubit fluorometri (invitrogen). Hasil pengukuran konsentrasi RNA menunjukkan bahwa semua sampel mempunyai kemurnian 1,8 – 2,0. Hal ini membuktikan bahwa kualitas semua genom RNA sampel bagus. Hasil ekspresi Transgen (PhGH) Pada Ikan Lele Transgenik F3 Analisis ekspresi transgen dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui apakah transgen (PCcBAPhGH) pada ikan lele transgenik F3 terdeteksi dan terekspresi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen dapat terekspresi pada beberapa embrio dan larva. Hal tersebut diketahui melalui amplifikasi primer β-actin yang dibandingkan dengan hasil amplifikasi primer ACT107 dan PhGH2. Hasil penelitian yang sama juga dilaporkan oleh Marnis dkk., (2013 dan 2014), dimana transgen PhGH terekspresi pada embrio dan larva ikan lele dumbo transgenik F1 dan F2. Amplifikasi PCR menunjukkan bahwa penggunaan primer β-actin
berfungsi dengan baik, dimana total RNA muncul dengan ukuran fragmen 300 bp. Ekspresi transgen pada generasi ikan transgenik dipengaruhi oleh promotor yang berfungsi sebagai kontrol internal sehingga gen yang ditransfer diharapkan dapat aktif di seluruh jaringan tubuhnya. Alimuddin dkk., (2008) melaporkan bahwa ekspresi gen asing atau transgen yang diintoduksi dikontrol oleh suatu urutan DNA yang disebut promoter yang memiliki kemampuan dalam mengendalikan ekspresi gen asing yang diintroduksi, sehingga akan sangat menentukan keberhasilan transgenesis. Terekspresinya transgen pada ikan lele dumbo transgenik dipengaruhi oleh promotor β-actin. Menurut Alimuddin dkk., (2008) promoter βactin memiliki sifat yang dapat aktif pada semua jaringan/ sel otot. Liu dkk., (1990) menambahkan bahwa gen βactin yang berasal dari ikan mas dikendalikan oleh beberapa unsur regulasi, dimana unsur promotor proksimal mengarahkan tingkat ekspresi yang cukup tinggi sehingga dapat digunakan dalam transfer gen pada ikan. Dewi dkk., (2013) menambahkan bahwa promoter β-actin ikan mas mampu mengendalikan ekspresi gen PhGH dan telah terjadi over ekspresi pada ikan lele dumbo transgenik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen (PhGH) terekspresi pada beberapa keturunan ikan lele transgenik F3. Hal yang sama didapatkan dalam Huang dkk., (2005), dimana transgen (GFP) dapat terekspresi pada generasi F3 ikan zebra transgenik (Danio rerio). Hal ini mengindikasikan bahwa transgen masih stabil ditransmisikan dan terekspresi pada generasi ikan lele transgenik F3. Namun hasil penelitian menunjukkan bahwa transgen hanya dapat terekspresi pada beberapa embrio
dan larva. Marnis dkk., (2013) menyatakan bahwa meskipun transgen dapat terintegrasi ke dalam semua jaringan tubuh ikan target, namun transgen tersebut kemungkinan tidak terekspresi di seluruh jaringan tubuh ikan. Sehingga ada juga kemungkinan bahwa transgen berhasil diturunkan namun tidak terekspresi. Peluang terekspresinya transgen juga dipengaruhi oleh proses introduksi transgen ke dalam jaringan tubuh ikan target. Wei dan Zhu. (2010) melaporkan bahwan proses integrasi transgen terjadi secara acak dan lokasi penyisipan transgen juga tidak dapat diketahui dengan pasti, sehingga jumlah salinan di lokasi penyisipan juga tidak dapat dikontrol yang menyebabkan efisiensi dari ekspresi transgen lebih rendah. Terekspresinya transgen akan menyebabkan pertumbuhan ikan lele dumbo transgenik lebih cepat dibangdingkan dengan ikan lele nontransgenik. Dewi dkk., (2013) melaporkan bahwa ikan lele dumbo transgenik telah mengalami overekspresi, sehingga terjadi peningkatan kecepatan pertumbuhan hingga hampir dua kali lipat dari ikan lele nontransgenik. Hasil penelitian yang sama juga dilaporkan oleh Marnis dkk., (2013) bahwa transgen masih tetap stabil ditransmisikan dan terekspresi hingga pada generasi F2 dengan pola pertumbuhan yang lebih cepat dibanding ikan lele non-transgenik. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan 1. Transgen (PhGH) terdeteksi pada ikan lele dumbo (Clarias gariepinus) transgenik F3 dalam populasi heterozigot. 2. Transgen (PhGH) terekspresi pada beberapa ikan lele dumbo transgenik F3.
Saran Pembentukan generasi ikan lele dumbo transgenik dalam populasi homozigot perlu dilakukan, maka akan memungkinkan menghasilkan generasi selanjutnya secara keseluruhan membawa transgen (PhGH) sehingga peluang ekspresi transgen juga akan lebih tinggi pada generasi selanjutnya. DAFTAR PUSTAKA Alimuddin., L.I. Purwanti., M.H.F. Aththar., C. Muluk., O. Carman dan K. Sumantadinata. 2008. Aktivitas Promoter B-actin Ikan Medaka Jepang (Oryzias latipes) pada Ikan Mas (Cyprinus carpio). Jurnal Natur Indonesia. 11(2): 70-77. Bayer, T.A dan J.A. Campos-Ortega. 1992. A Transgene Containing Lacz is Expressed In Primary Sensory Neurons In Zebrafish. Journal of Development. 115: 421-426. Chong, S.S.C dan J.R. Vielkind. 1989. Expression and Fate of CAT Reporter Gene Microinjected Into Fertilized Medaka (Oryzias latipes) Eggs In The Form of Plasmid DNA, Recombinant Phage Particles and Its DNA. Journal of Theor Appl Genet. 78: 369-380. Devlin, R.H., T.Y. Yesaki., C.A. Biagi., E.M. Donaldson., P. Swanson dan W-K. Chan. 1994. Extraordinary Salmon Growth. Jurnal of Nature. 371: 209–210. Dewi,
R.R.S.P.S., H. Marnis., R. Suprapto dan N. Syawalia. 2013. Produksi Ikan Lele Cepat Tumbuh Generasi F-0
Dengan Menggunakan Metode Transgenesis. Jurnal Riset Akuakultur. 8(2): 173-180. Dunham, R.A., G. Warr., A. Nichols., P.L. Duncan., B. Argue., D. Middleton dan Z. Liu. 2002. Enhanced Bacterial Disease Resistance of Transgenic Channel Catfish (Ictalarus punctatus) Possessing Cecropin Genes. Journal of Marine Biotechnology. 4: 338-344. Du, S.J., Z. Gong., G.L. Fletcher., M.A. Shears., M.J. King., D.R. Idler dan C.L. Hew. 1992. Growth Enhancement In Transgenic Atlantic SalmonBy The Use of An “All Fish” Chimeric Growth Hormone Gene Construct. Journal Nature Biotecthnology. 10: 176-181 Garlagher, S.R. 2004. Quantitation of DNA and RNA with Absorption and Fluorescence Spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology. A.3D.1-A.3D.12 Huang, C.J., T.S. Jou., Y.L. Ho., W.H. Lee., Y.T. Jeng., F.J. Hsieh dan H.J. Tsai. 2005. Conditional Expression of a Myocardium Specific Transgene in Zebrafish Transgenic Lines. Journal of Developmental Dynamics. 233: 1294-1303. Kinoshita, M., M. Yamauchi., M. Sasanuma., Y. Ishikawa., T. Osada., K. Inoue., Y. Wakamatsu dan K. Ozato. 2003. A Transgene and Its Expression Profile are Stably Transmitted to Offspring in Transgenic Medaka Generated by the Particle Gun
Method. Journal of Zoological Science. 20: 869-875 Kobayashi, S., Alimuddin., T. Morita., M. Miwa., J. Lu., M. Endo., T. Takeuchi dan G. Yoshizaki. 2007. Transgenic Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Overexpressing Growth Hormone Show Reduced Ammonia Excretion. Journal of Aquaculture. 270: 427-435. Liu, Z., B. Moav., A.J. Faraz., K.S. Guise., A.R. Kapuscinski dan P.B. Hackett. 1990. Functional Analysis of Elements Affecting Expression of the β-actin Gene of Carp. Molecular and Cellular Biology. 10(7): 3432-3440. Marnis, H., B. Iswanto., R. Suprapto., Imron dan R.R.S.P.S. Dewi. 2014. Transmisi, Ekspresi, dan Distribusi Gen Hormon Pertumbuhan Ikan Patin Siam Pada Ikan Lele Afrika (Clarias gariepinus) Transgenik F-2. Jurnal Riset Akuakultur. 9(2): 179-190 Marnis, H., B. Iswanto., R. Suprapto dan Imron. 2013. Expression of Growth Hormone (PhGH) Gene and Analysis of Insuline-Like Growth Factor I (IGF-I) Production In African Catfish (Clarias gariepinus) Transgenic F-1. Journal of Indonesian Aquaculture. 8(2): 113-119. Martinez, R., A. Arenal., M.P. Estrada., F. Herrera., V. Huerta., J. Vazquez., T. Sanchez dan J.D.L. Fuente. 2000. Mendelian Transmission, Transgene Dosage and Growth Phenotype in Transgenic Tilapia (Oreochromis
Hornorum) Showing Ectopic Expression of Homologous Growth Hormone. Journal of Aquaculture. 173: 271-283. Nam, Y.K., C.H. Noh dan D.S. Kim. 1998. Transmission And Expression of An Integrated Reporter Construct In Three Generations of Transgenic Mud Loach (Misgurnus mizolepis). J.Aquaculture. 172: 229-245. Noer, A.S dan M. Gustiananda. 2007. PCR Tanpa Isolasi DNA dari Sel Epitel Rongga Mulut. JMS. 2(1): 35-45 Restu, M., Mukrimin dan Gusmiaty. 2012. Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNATanaman Suren (Toona Sureni Merr.) untuk Analisis Keragaman Genetikberdasarkan Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Jurnal Natur Indonesia 14(2): 138-142. Sambrook, J dan Russel, D.W. 2001. MolecularCloning A Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory press. Cold Spring Harbor NY USA Wei, H dan Z.Z. Yan. 2010. Integration Mechanisms of Transgenes and Population Fitness of GH Transgenic Fish. Journal of Science China Life Sciences. 53(4): 401-408. Yazawa, R., I. Hirono dan T. Aoki. 2005. Characterization of Promoter Activities of Four Different Japanese Flounder Promoters in Transgenic Zebrafish. Journal of Marine Biotechnology. 7: 625-633.
