Fenilalanin ammónia-liáz új típusú inhibítorainak vizsgálata

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar

Fenilalanin ammónia-liáz új típusú inhibítorainak vizsgálata

Készítette: Vida Lilla Témavezetők: dr. Poppe László dr. Vértessy Beáta

Budapest, 2014

1

Tartalom Köszönetnyilvánítás ....................................................................................................4 1.

Bevezetés ..........................................................................................................5

2.

Irodalmi áttekintés .............................................................................................7

2.1. Általános enzimkinetikai fogalmak .....................................................................7 2.1.1. Michaelis-Menten kinetika ..............................................................................8 2.1.2. Briggs-Haldane kinetika ..................................................................................9 2.2. Kinetikai paraméterek és meghatározásuk ..........................................................9 2.3. Reverzibilis inhibíció ....................................................................................... 12 2.4. A reverzibilis inhibíciók típusai ........................................................................ 15 2.4.1. Kompetitív inhibíció .................................................................................... 15 2.4.2. Nem-kompetitív inhibíció ............................................................................ 16 2.4.3. Unkompetitív inhibíció ................................................................................ 18 2.4.4. Kevert típusú inhibíció ................................................................................. 19 2.5. Ammónia-liázokról általában ........................................................................... 20 2.5. A fenilalanin ammónia-liáz (PAL, EC 4.3.1.24) ............................................... 20 2.5.1. A fenilalanin ammónia-liáz szerkezete ........................................................ 21 2.5.2 A fenilalanin ammónia-liázok szubsztrátjai, inhibítorai................................... 24 3.

Mérés során használt anyagok és módszerek ................................................... 30

3.1. Fehérje termelése, tisztítása .............................................................................. 30 3.1.1. Fehérje konstrukt előállítása ......................................................................... 30 3.1.2. Kompetens sejtek készítése .......................................................................... 33 3.1.3. Sejtek transzformálása.................................................................................. 34 3.1.4. Fehérje feltárása ........................................................................................... 35 3.1.5. Fehérje tisztítása........................................................................................... 35 3.1.7. SDS-gélelektroforézis .................................................................................. 39 2

3.1.8. Koncentráció meghatározása ........................................................................ 40 3.2. Inhibíciós mérések............................................................................................ 41 3.2.1. A vizsgált inhibítorok ................................................................................... 41 3.2.2. Reverzibilitás vizsgálata ............................................................................... 43 3.2.3. Kinetikai konstansok meghatározása ............................................................ 45 4.

Eredmények és kiértékelés .............................................................................. 47

4.1. Fehérje termelése, tisztítása .............................................................................. 47 4.1.1. Fehérje tisztítása........................................................................................... 47 4.1.2. SDS-gélelektroforézis .................................................................................. 48 4.2. Inhibíciós mérések............................................................................................ 50 4.2.1. Reverzibilitás vizsgálata ............................................................................... 50 4.2.2. Kinetikai konstansok meghatározása ............................................................ 54 5.

Összefoglalás .................................................................................................. 59

6.

Irodalomjegyzék .............................................................................................. 60

3

Köszönetnyilvánítás Szeretnék köszönetet mondani témavezetőimnek, dr. Vértessy Beátának és dr. Poppe Lászlónak, akik lehetővé tették számomra a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Szerves Kémia és Technológia Tanszékén, valamint a Magyar Tudományos Akadémia Enzimológiai Intézetében való kutatást. Emellett szeretném megköszönni, hogy munkámat felügyelték és irányították. Hálával tartozom Professzor Friedrich Hammerschmidtnek, aki rendelkzésemre bocsátotta a munkám során vizsgált inhibítorokat. Köszönettel tartozom még konzulensemnek, Bata Zsófiának, aki végig figyelemmel kísérte munkámat, beosztotta feladataimat, illetve bármilyen felmerülő probléma esetén segítségemre volt. Szeretném megköszönni továbbá az Fermenita Kft. nek, hogy rendelkezésemre bocsátotta a mérseimhez szükséges fehérjét, illetve Weisser Diának a fehréjetsiztítás során nyújott segítségét. Természetesen szeretném megköszönni mindazoknak, akik a két intézményben a mindennapok folyamán felmerülő nehézségek során segítettek, támogattak.

4

1. Bevezetés Enzimekre az élet minden területén szükségünk van. Nemcsak a szervezetünkben végbemenő folyamatokhoz, hanem az iparban is kiemelt szerepet játszanak. Már az ókorban is használtak élesztőket például sörfőzéshez, ma pedig nélkülözhetetlenné váltak. A legismertebb ilyen gomba a Saccharomyces cerevisiae, mely képes cukrot vagy keményítőt anaerob körülmények között alkoholos erejdéssel átalakítani. Az 1. ábrán a világ 2010-es, összes enzimtermelését iparági felhasználás szerint felosztva láthatjuk, a teljes piac becsült értéke 5,8 milliárd USD-ra rúg.

1. ábra: A világ enzimfelhasználása iparágak szerint [1]. Az enzim elnevezést 1876-ban Wilhelm Friedrich Kühne használta először, amikor is felfedezte a tripszin nevezetű enzimet. Ennek ellenére pontosan nem tudta még, hogy minek is adott nevet. Ma már tudjuk, hogy az enzimek a globuláris fehérjék közé tartoznak, és a szervezet folyamataiban fontos szerepet játszanak, mint biokatalizátorok. A sejtekben végbemenő biokémiai reakciók számára biztosítják azokat a körülményeket, melyek mellett azok megfelelő sebességgel végbemehetnek. A katalitikus folyamatok során a peptidláncban egymástól távoli aminosavak kerülnek olyan térhelyzetbe, hogy együttesen fejthetik ki hatásukat. A fehérje kötő zsebében egy olyan sajátos szerkezeti részlet alakul ki, amelyhez a szubsztrátmolekula illeszkedik, ezáltal az enzimhez 5

kapcsolódik. Ez a kötőhely, a katalitikus hellyel együtt az enzim aktív centrumát képzi. A katalitikus hely az a rész, ahol a katalitikus reakció lejátszódhat. Itt azok a funkciós csoportok találhatók, amelyek a szubsztrát átalakításában közvetlenül részt vesznek. Az enzimek enantioszelektív katalizátorok, képesek különbséget tenni enantiotróp csoportok és felületek között, mintegy 96–98%-os sztereo-szelektivitással. Általában 100°C alatt és normál légköri nyomáson működnek, ám amennyiben feltekeredésük nem megfelelő elveszítik aktivitásukat, kiválhatnak oldott formájukból. Mivel az aktív centrumban egymástól távol eső aminosavak is elhelyezkednek, illetve csak megfelelően feltekeredett állapotban aktívak, ezért az enzimek tanulmányozása során nagyon fontos a szerkezetük pontos ismerete. Erre kísérletes és in silico módszer is létezik. A molekulamodellezés előnye, hogy megfelelő mennyiségű és minőségű kísérleti adat birtokában modellt építve extrapolálhatunk. A bioinformatika segítségével előre tudjuk jelezni az enzimek reaktivitását, illetve az egyes aminosavak módosításával javíthatjuk ezen enzimek tulajdonságait, például a stabilitásukat vagy szelektivitásukat. A sokféle enzim közül a liázok a szubsztrátmolekulát úgy hasítják ketté, hogy a termékben kettős kötés alakul ki. A legtöbb esetben a visszafelé menő reakciót is képesek katalizálni, azaz amikor kettős kötésre való addíció játszódik le. Ilyenkor CO 2, NH3, H2O vagy egyéb molekula távozik a szubsztrátról vagy addícionálódik a szubsztrátra. Ezek az enzimek meglepően sokféle kofaktort, prosztetikus csoportot használnak, mint például fém ionok, B12-koenzim, vagy a 4,5-dihidro-4-metilidén-1H-imidazol-5-on, más néven MIO prosztetikus csoport [2]. Kísérleteink során Petroselinum crispum fenilalanin ammónia-liáz (PcPAL) enzimével dolgoztunk, melyet Escherichia coli-val termeltettünk. Nemzetközi együttműködés keretében Ausztriai kutatócsoporttól négy különböző potenciális inhibítort kaptunk. Ezeknek az inhibítoroknak az enzimkinetikai konstansait meghatároztuk, majd megvizsgáltuk az inhibíciók típusait. További kísérleteink során a legnagyobb affinitású inhibítort szeretnénk felhasználni kristályosítási vizsgálatokhoz, mivel úgy véljük, ez majd megkönnyíti az enzim aktív konformációjában való kristályosítását. Méréseink során egy 2006-ban megjelent cikkből indultunk ki, melyben a Rhodobacter sphaeroides-ből nyert tirozin ammónia-liázzal (RsTAL) végzetek kristályosítással kapcsolatos méréseket. A TAL szintén az ammónia liázok családjának tagja, mely dezaminálja az aromás aminosavakat (L-His, L-Tyr, L-Phe), katalizálja az L-Tyr-ról az ammónia nemoxidatív eliminációját transz-p-kumársavat eredményezve [3].

6

2. Irodalmi áttekintés Ahogy azt már a Bevezetés c. fejezetben is említettem, a liázok olyan enzimek, melyek C-C, C-O, C-N, és más kötéseket hasítanak szét eliminációval, kettős kötéseket, gyűrűket kialakítva a molekulán [4]. A következő fejezetekben először enzimkinetikai áttekintést fogok végezni, majd utána a liázokon belül az ammónia-liázokról, elsősorban a fenilalanin ammónia-liázról fogok beszélni.

2.1. Általános enzimkinetikai fogalmak Az enzimek a fehérjék egy különálló csoportját alkotják. Feladatuk a sejtekben lejátszódó biokémiai folyamatok katalizálása. Nélkülük a termodinamikailag lehetséges, vagyis szabadenergia-csökkenéssel járó reakciók lassan mennének végbe, mivel az élő szervezet reakciókörülményei enyhék (30°C, 1 bar, semleges körüli pH). Az enzimek segítségével a kémiai reakció aktiválási energiája csökken, így a reakció-sebesség megnő. A reakció során létrejön egy úgynevezett aktivált komplex, mely az enzim-szubsztrát komplexnek felel meg. Az enzimek a kötőhelyükön képesek megkötni szubsztrátjaikat, majd az aktív helyen alakítják át azokat. Ez a két hely lehet azonos, de különböző is; egymáshoz közeli, de távoli is. Természetesen nemcsak szubsztrátkötő helyek, hanem aktivátor-, inhibítor-, és koszubsztrátkötő helyek is léteznek. Leegyszerűsítve a folyamat lényege, hogy az enzim megköti a szubsztrátot, majd annak átalakítása után a termék leválik róla, ily módon az enzim újabb szubsztrátot lesz képes átalakítani. A kinetikai vizsgálatok segítségével matematikai összefüggésekkel érthetjük meg az enzimes reakciók jellemzőit. Az enzim mennyiségét Unit-ban, azaz enzimegységben adjuk meg, mely a szubsztrát átalakításának vagy a termék keletkezésének sebességét jelenti. Az enzimegység általános definíciója: Egy egység az az enzimmennyiség, mely 1 μmol szubsztrátot alakít át vagy 1 μmol terméket képez 1 perc alatt adott reakciókörülmények között. SI rendszerben az enzimegység egysége: 1 Katal, mely annyi enzimet jelent, amennyi 1 mol szubsztrátot 1 s alatt alakít át. Mivel 1 Katal hatalmas mennyiség, általában ehelyett mást, például az nKat értéket használjuk, mely 10 -9 Katalnak felel meg [5]. Emellett használatos még a mg/ml, g/dm3, illetve a mol/dm3 mértékegység is. A célszerűség kedvéért kísérleteink során mi is ezen mérőszámok közül használtuk az enzim mennyiségének kifejezésére a mg/ml mértékegységet. 7

2.1.1. Michaelis-Menten kinetika Michaelis és Menten az alábbi reakcióból indultak ki:

(2.1) ,ahol E: enzim, S: szubsztrát, P: termék, ES: enzim-szubsztrát komplex Mivel a második lépést irreverzibilisnek vették – k2=0 –, illetve az első lépés gyorsan egyensúlyra vezet, emiatt ezt a kinetikai leírást rapid ekvilibrium kinetikának nevezzük. A kinetikai levezetésekből megkapjuk a maximális reakciósebességet, ha minden enzim komplexben kötött alakban van jelen: V max=k2E0, ahol E0 a bemért enzim mennyiségét jelenti. A Michaelis-Menten kinetika egyenletei a következők [5]:

(2.2) , ahol V: kezdeti reakció sebesség, Vmax: maximális reakció sebesség, S: szubsztrát koncentráció, Ks: Michaelis-Menten állandó A kinetikai levezetéshez azonban néhány feltételezést, illetve elhanyagolást kellett tenni, melyek a következők voltak: 

az enzim katalitikus mennyiségben van jelen, koncentrációja kisebb a szubsztráténál



az [ES] komplex kinetikailag stabil, [EP] komplex nem halmozódik fel



az enzim aktív centrumához egy szubsztrátmolekula tud csak kötődni



koncentrációt használunk aktivitás helyett [5].

8

2.1.2. Briggs-Haldane kinetika Briggs és Haldane a steady state megközelítésből indul ki, szintén a (2.1) reakciósémát véve alapul. Megállapították, hogy egy rövid felfutási szakasz után hosszú ideig az [ES] komlex mennyisége alig változik. Ezt nevezzük steady state-nek, kvázi állandósult állapotnak. Ennek az állapotnak van egy ún. pre-steady state állapota is, ahol a kinetikai egyenletek nem érvényesülnek, azonban ez az állapot igen rövid. A Briggs-Haldane kinetikai egyenlete a következő [5]:

(2.3) ,ahol V: kezdeti reakció sebesség, Vmax: maximális reakció sebesség, S: szubsztrát koncentráció, Km: Michaelis-Menten állandó

2. ábra: Briggs-Haldane kinetikai egyenlet pre-steady state és steaydy state állapota [5].

2.2. Kinetikai paraméterek és meghatározásuk A 2.1 egyenletben található egyedi reakciósebességi állandókat egybegyűjtve bevezethetjük a Michaelis-konstanst: Km=(k-1+k2 )/k1. Ha a (2.2) és (2.3) egyenletekre vezessük be, hogy

9

(2.4) , ahol k1; k-1; k2: reakciósebességi állandók Látható, hogy Km értéke csak akkor közel megegyező Ks értékével, ha k1 jóval nagyobb, mint k2. Ha Michaelis-Menten kinetika esetén a Vmax=k2E0, akkor Km elhanyagolható S mellett, így V körülbelül egyenlő V max-szal. Ez azt jelenti, hogy a reakció nulladrendűvé válik a szubsztrát koncentrációjára nézve, azaz minden enzim telített szubsztráttal. Amennyiben S hanyagolható el Km mellett, akkor V körülbelül egyenlő 1/Ks*S, vagyis az alacsony szubsztrátkoncentrációnál az enzim kezdeti sebessége arányos a szubsztrát koncentrációjával. Km értékét a V=Vmax/2 értékhez tartozó abszcissza-koordinátaként nyerhetjük, így a felmaximumhoz tartozó szubsztrátkoncentrációt adják meg. Azaz amikor Km=S, akkor V=Vmax/2 [5].

3. ábra: Km és Vmax meghatározása [6]. Ha a kezdeti reakciósebességet mérjük más-más bemért S koncentrációk mellett, akkor Vmax és Km értékeket grafikus módszerekkel meghatározhatjuk. A V-S diagram esetében problémát jelenthet, hogy nehezen állapítható meg, hogy mikor érjük el a nulladrendű tartományt. Alternatív grafikus módszerek a Lineweaver-Burk-féle ábrázolás, 10

a Hanes-Langmuir- és az Eadie-Hofstee-féle módszer. Utóbbi kettő általában jobb eredményre vezet, mint a Lineweaver-Burk-féle megoldás, mivel azok esetében valamelyik változó mindkét tengelyen szerepel [5].

4. ábra: Km és Vmax grafikus meghatározása [6]. Mivel Vmax arányos a bemért enzim mennyiségével, ezért az enzimaktivitás mérőszáma. Azonban ez az érték függ az enzim mennyiségétől, így annak nem egy jellemző

tulajdonsága.

Az

elsőrendű

sebességi

állandó,

azaz

k2

viszont

enzimtulajdonságnak számít, turnover number-ként is nevezik. Magyarul általában váltásszámként használják. Ez az érték megadja az 1 perc alatt egy enzimmolekula által átalakított szubsztrátmolekulák számát. Általánosan minden enzimre definiálható, hogy Vmax=kcatE0, ahol kcat a katalitikus állanód, azaz a váltásszám. Bonyolultabb kinetikai esetekben kcat nem mindig egyezik meg k2-vel. Km jó közelítéssel megadja a szubsztrát koncentrációját a sejtekben, tulajdonképpen az enzim affinitását mutatja meg a szubsztráthoz. Minél kisebb K m, annál nagyobb az enzim szubsztrátra vonatkoztatott affinitása. Ez az érték állandó egy adott enzimre nézve, így jó összehasonlítási alapként szolgálhat. Amennyiben ismerjük a K m értéket, Vmax-ot is helyesen határozhatjuk meg [5].

11

2.3. Reverzibilis inhibíció Az enzimek inhibíciója kétféle lehet: beszélhetünk irreverzibilis és reverzibilis inhibícióról. Mivel kísérleteink során a vizsgált inhibítorok reverzibilisnek bizonyultak, így a második típust, a reverzibilis inhibíciót fogom bemutatni. Reverzibilis inhibíció során az inhibítor az enzimmel kialakítja az ún. EI komplexet. Az inhibítor emellett képes az enzim-szubsztrát komplexhez is kötődni, létrehozva az EAI komplexet, mely lehet aktív vagy inaktív. Mint minden reakció során a kötődés a legelső lépés [7].

(2.5) , ahol E: enzim, A: szubsztrát, EA: enzim-szubsztrát komplex, P: termék, I: inhibítor, EI: enzim-inhibítor komplex, EAI: enzim-szubsztrát-inhibítor komplex A reakciómechanizmusban két sebességi állandó, k2 az inhibeálatlan reakcióhoz, k6 az EAI komplexhez, és a szubsztrát és inhibítor disszociációs konstansa szerepel [7]:

(2.6)

Ezek kapcsolata:

12

(2.7) Ebből az egyenletből látható, hogy amennyiben három konstanst ismerünk, akkor a negyediket is kiszámíthatjuk. Ha differenciálegyenlet a szabad enzimre és az enzim-szubsztrát komplexre nézve nulla, akkor a steady-state állapot adatai a következők [7]:

(2.8) A ν reakciósebesség egyenlete pedig:

(2.9) Az enzim teljes mennyisége az összege az összes lehetséges enzim komlexeknek, az ahol az enzim-inhibítor komplexeket el kell osztani az inhibíciós konstansokkal [7].

(2.10) Ebből az egyenletből kifejezve [E] mennyisége [7]:

(2.11) Mivel a (2.4) egyenletek első tagjában az [EI] komplex helyettesíthető volt Kic=k-3/k3 [7]:

13

(2.12) Emellett [E] is helyettesíthető a (2.11) egyenlet alapján:

(2.13) Ez megadja [EA] komplexet, ha behelyettesítjük még, hogy Km=(k-1+k2)/k1:

(2.14) Ezt behelyettesítve a sebességi egyenletbe (2.9), alkalmazva, hogy V1=k2[E]0, V2=k6[E]0, illetve behelyettesítve [EAI] helyére Kiu-t, megkapjuk:

(2.15) Ez a sebességi egyenlet az általános inhibíciós mintára igaz (2.5), mely tartalmaz egy eltérő inhibíciós mechanizmust, a részben nemkompetitív inhibíciót is. Amikor az enzim még mindig aktív az inhibítor jelenlétében, akkor beszélünk részleges inhibícióról. Amennyiben a bekötött inhibítor teljesen inaktiválja az enzimet, akkor teljes inhibícióról van szó, ahol az EAI komplex inaktív. Ezt hívjuk dead-end komlexnek. A különböző inhibíciós mechanizmusok megengedik, hogy mind az enzimhez, mind az EA komlexhez kötődjön az inhibítor [7].

14

2.4. A reverzibilis inhibíciók típusai 2.4.1. Kompetitív inhibíció A kompetitív típusú inhibítorok az enzimhez kötődve megakadályozzák a szubsztrát enzimhez való bekötődését. Amennyiben a szubsztrát az inhibítor előtt köt be az enzimhez, akkor pedig az inhibítor nem képes hozzákapcsolódni az enzimhez. Emiatt a kötőhelyért zajló versengés miatt kapta a nevét ez a fajta inhibíció. A kompetitív inhibítorok lehetnek az enzim természetes szubsztrátjához kémiailag hasonlóak, azonban az enzim őket nem képes átalakítani. Ezért ilyen esetben szubsztrátanalógoknak, az enzim alternatív szubsztrátjainak is nevezzük őket. Emellett azonban lehetnek teljesen eltérőek is szerkezetileg a természetes szubsztráttól. Klasszikus kompetitív inhibícióról beszélünk, ha szerkezeti hasonlóság van a szubsztrát és az inhibítormolekula között, illetve mindkettő a szubsztrát-kötőhelyhez kapcsolódnak. Amikor az inhibítor kötődik be először, és lefedi a szubsztrát kötőhelyét – megakadályozva ezzel a szubsztrát kötődését – sztérikus gátlásról beszélünk. Olyan eset is lehetséges, amikor mind az inhibítor, mind a szubsztrát két kötőhellyel rendelkezik, azonban csak az egyikért alakul ki versengés. A negyedik esetben, ha az inhibítor- és/vagy szubsztrátmolekula átlapoló kötőhelyekre kötődik be, akkor bár nem köt be a másik molekula kötőhelyére, mégis lefedi azt. Ez a sztérikus gátlás egy változatának tekinthető. Végtermékgátlásról is beszélhetünk, ami nem más, mint az ún. kompetitív feedback inhibíció. Ez lehetőséget nyújt az enzimek számára egyfajta szabályozásra, mellyel a sejtek meg tudják akadályozni, hogy a reakcióik végtermékei adott esetben túltermelődjenek. Ilyenkor a keletkező termék inhibítorként kapcsolódik be a reakciósor egy enziméhez, ezzel gátolva annak működését, még több termék keletkezését [5].

5. ábra: Kompetitív inhibíció Michaelis-Menten ábrázolása [5].

15

A 4. ábrán látható, hogy a kompetitív inhibíció esetében a V max nem változik, az inhibítor csak a látszólagos Kmi értékek nőnek. Vagyis az inhibítor úgy hat, mintha csökkentené az enzim affinitását a szubsztráthoz. Az 5. ábrán látható Lineweaver-Burk ábrázoláson látható, hogy a görbék iránytangense az inhibítor koncentrációjától függnek. Az alábbi összefüggésekben látható Ki paraméter azt az inhibítor-koncentrációt jelzi, mely kétszer olyan meredek LineweaverBurk egyenest ad, a nem inhibeálthoz képest [5].

6. ábra: Kompetitív inhibíció Lineweaver-Burk ábrázolása [5]. 2.4.2. Nem-kompetitív inhibíció Ebben a típusban az inhibítornak nincs hatása a szubsztrát kötődésére, illetve ez fordítva is igaz. Mind a szubsztrát, mind az inhibítor véletlenszerűen, reverzibilisen, és egymástól teljesen függetlenül, az enzim különböző kötőhelyeire kötnek. Ezáltal létrejöhet kétféle komplex, az enzim-szubsztrát vagy az enzim-inhibítor komplex [5].

16

7. ábra: Nem-kompetitív inhibíció Michaelis-Menten ábrázolása [5]. A 6. ábrán látható, hogy a nemkompetitív inhibítorok a látszólagos V max értéket változtatják meg, míg a Km értékre nincsenek hatással. Azaz az inhibítor az enzim egy másik aktív helyéhez kötődik, nem ahhoz, melyhez természetes szubsztrátja kötődik, ennek ellenére befolyásolja az enzim szubsztráthoz való affinitását. A klasszikus értelemben vett nemkompetitív inhibíció azonban csak rapid ekvilibrium körülményei között létezhet. A Lineweaver-Burk ábrázolásán a nem-kompetitív inhibíció esetében is látható, hogy a görbék meredeksége függ az inhibítor koncentrációjától. A függvény ábrázolása is azonos a – 4. ábrán látható – kompetitív inhibíció függvényével, azonban fontos különbség, hogy míg a kompetitív inhibíció esetén az inhibeált egyenes az inhibíció nélkülit az y tengelyen metszi az x=0 pontban, addig a nemkompetitív inhibeált egyenes az inhibíció nélkülit az x tengelyen, az y=0 pontban metszi [5].

8. ábra: Nem-kompetitív inhibíció Lineweaver-Burk ábrázolása [5].

17

2.4.3. Unkompetitív inhibíció Akkor beszélhetünk unkompetitív inhibícióról, ha az inhibítormolekula nem képes az enzimhez kötődni, csak abban az esetben, ha az enzim-szubsztrát komplex már létrejött. Ily módon kialakul egy inaktív enzim-szubsztrát-inhibítor komplex, melyből nem keletkezik termék. Ez egyfajta indukált illeszkedési modellt jelent, vagyis az inhibítor kötőhelye addig nem alakul ki, míg a szubsztrát hozzá nem köt az enzimhez. Ekkor konformáció-változás következtében az inhibítor képes bekötni, azonban ez a kötődés szintén egy konformáció-változással jár az aktív centrumban. Ennek során pedig a szubsztrát kötve marad. A Michaelis-Menten ábrázolásból látszik, hogy az unkompetitív inhibítorok mind a Vmax, mind a Km értékét csökkenti [5].

9. ábra: Unkompetitív inhibíció Michaelis-Menten ábrázolása [5].

10. ábra: Unkompetitív inhibíció Lineweaver-Burk árbázolása [5].

18

2.4.4. Kevert típusú inhibíció A kevert típusú inhibíció esetében az inhibítor bekötődése megváltoztatja az enzim affinitását a szubsztráthoz. Tulajdonképpen az a nem-kompetitív inhibíció egyik alfaja. A Michaelis-Menten árbázolásból látható, hogy a Vmax, illetve a Km is változik az inhibítor koncentrációjának megfelelően [5].

11. ábra: Kevert típusú inhibíció Michaelis-Menten ábrázolása [5].

12. ábra: Kevert típusú inhibíció Lineweaver-Burk ábrázolása [5].

19

2.5. Ammónia-liázokról általában Az

ammónia-liázok

az

α,β

telítetlen

molekulák

keletkezését

katalizálják

szubsztrátjaikból ammónia eliminációjának segítségével. Az aminosav C-N-liázok olyan enzimek, melyek a szén-nitrogén kötések nem oxidatív hasítását katalizálják. Legismertebb képviselőik az L-α-aminosavakból α,β telítetlen karbonsavakat előállító ammónia-liázok. A reakciójuk a 2. ábrán látható (EC 4.3.1.x). Az eliminációs reakciókban meg kell történnie a pro-Sβ proton absztrakciójának, aminek mechanizmusa a bázisos, normális

körülmények

közt

ionizált

aminocsoport

jelenléte

mellett

sokáig

megválaszolatlan kérdés volt [2].

13. ábra: Általános reakciója az ammónia-liázoknak.

2.5. A fenilalanin ammónia-liáz (PAL, EC 4.3.1.24) Az L-fenilalanin gombákban, növényi, bakteriális és emberi szervezetben eltérően hasznosul. A növényekben ennek a vegyületnek a metabolizmusának első lépését, vagyis amikor az ammónia nem oxidatív módon eliminálódik, a fenilalanin-ammónia liáz katalizálja. Ez a 13. ábrán látható. A képződő transz-[E]- fahéjsav számos fenilpropanoid vegyület szintézisének a kiindulási vegyülete, például lignin, flavonoidok, egyes kumarinszármazékok [8].

20

14. ábra: L-fenilalanin nem oxidatív dezaminálása. A PAL a növényi stresszválaszban is fontos szerepet játszik, bioszintézisét számos tényező befolyásolja, mint például a patogén hatások, szöveti sérülések, UV-sugárzás, alacsony hőmérséklet stb. Fontos szerepe miatt herbicidek gyakori célpontja [9]. Baktériumokban PAL igen ritkán fordul elő. Ez magyarázható azzal, hogy a baktériumokban – szemben a növényekkel – a fenilpropanoidok nem nélkülözhetetlenek. Emberi szervezetben az L-fenilalanin eszcenciális aminosav, azonban lebontásáért nem a PAL enzim, hanem a fenilalanin-hidroxiláz (PAH, EC 1.14.16.1) enzim a felelős, mely katalitikus mennyiségű molekuláris oxigén, vasion és tetrahidrobiprotein kofaktorok jelenlétében L-tirozinná alakítja az L-fenilalanint [10]. A fenilketonúria (PKU) nevű betegség hátterében a fenilalanin-hidroxiláz enzim alacsony mennyisége áll. Ez az egyik leggyakoribb aminosavanyagcsere zavar, mely elsősorban a központi idegrendszert károsítja. Az ilyen betegséggel születő csecsemőknél az abnormális agyfejlődés miatt többek között ún. törpefejűséget, szellemi fogyatékosságott, epilepsziaszerű görcsöket diagnosztizálnak. A gyógymódok között szerepel a fenilalanin ammónia-liáz terápia, amivel a fenilalanin transz-fahéjsavvá alakítható. Kísérleteink során – ahogy azt már említettem – a petrezselyemből származó fenilalanin ammónia-liázzal dolgoztunk. Ezt az enzimet sikeresen alkalmazták a megfelelő telítetlen prekurzorokból L-aril-alaninek ammónia addícióval végbemenő szintézisénél. Illetve az L-enantiomerek racém elegyből való szelektív bontásánál képesek az arilalanin D-enantiomerének nagy tisztaságban való előállítására [4].

2.5.1. A fenilalanin ammónia-liáz szerkezete A fenilalanin ammónia-liáz hasonló reakciót katalizál, mint a hisztidin ammónialiáz (HAL, EC 4.3.1.3), tirozin ammónia-liáz (TAL, EC 4.3.1.23), illetve a fenilalanin 2,3aminomutáz és tirozin 2,3-aminomutáz enzimek (PAM és TAM, EC 5.4.3.x). Ezek az enzimek szerkezetükben is hasonlóak. A különböző szervezetekből származó hisztidin és 21

fenilalanin

ammónia-liázok,

valamint

tirozin

és

fenilalanin

2,3-aminomutázok

homotetramer formában aktívak, ez a 14. ábrán látható. Emellett a szekvenciák összehasonlításakor több homológ régiót is felfedeztek, mely valószínűsítette, hogy ezen enzimek aktív centrumai, illetve működési mechanizmusai is hasonlóak lehetnek [11].

15. ábra: PcPAL kristályszerkezete (1W27), láncok eltérő színekkel kiemelve [12]. Az első háromdimenziós szerkezetét a fenilalanin ammónia-liáznak Rhodosporidium toruloides nevű baktériumból izolált enzimről készítették. Az aktív centrumának kialakításában hét α hélix vesz részt, melyek közül hat pozitív, egy pedig negatív töltéssel rendelkezik. A MIO kofaktor, azaz a 4,5-dihidro-4-metilidén-1H-imidazol-5-on három pozitív hélixen helyezkedik el, növelve azok elektrofilitását. A hélixek dipólusai teljesen kompatibilisek az aktív centrumban fenilalaninnal összekapcsolt PAL-lal. Az első kovalens kötés a szubsztrát aminocsoportja és a MIO metilidén csoportja között jön létre. 12 nagyon konzervált régió az N-terminális közeli hélixeken – melyek erősítik a funkciót – a szubsztrát felismerésben, a MIO aktiválásában, a termék szeparálásában, a proton szolgáltatásában, vagy a szubsztrát fenilcsoportjáról származó elektron polarizációjában játszik szerepet. A C-terminális melletti, egyetlen negatív pólusú hélix, mely növeli a bázisosságot, a magasan konzervált His rész egy általános bázisként működik. Ez vonja el a pro-S-hidrogént a szubsztrátról [13]. A legfeltűnőbb egyezés az ammónia eliminációban a már említett, esszenciális 4,5dihidro-4-metilidén-1H-imidazol-5-on aminosavainál

található.

Az

(MIO)

Ala-Ser-Gly

prosztetikus aminosavakból

csoport

prekurzor

poszt-transzlációs,

autokatalitikus úton a 15. ábrán látható módon képződik 2 víz molekula kilépésével. Az 22

elektrofil, prosztetikus csoport létezésére kísérleti bizonyíték először a Pseudomonas putida HAL (PpHAL) kristályszerkezetének meghatározásával adódott.

16. ábra: MIO csoport keletkezése A MIO csoportot a felfedezése óta kísérletileg azonosították több PAL, PAM, TAM szerkezetben is: Rhodosporidium toruloides PAL (RtPAL, 1Y2M gomba) [14] Petroselinum crispum PAL (PcPAL, 1W27, petrezselyem) [12] Anabaena variablis PAL és Nostoc punctiforme PAL (AvPAL, 3CZO és NpPAL 2NYF, cianobaktériumok) [15], Streptomyces globisporus TAM (SgTAM, 2QVE, baktérium) [16], Taxus canadensis PAM (TcPAM, 3NZ4, tiszafa több törzsében is) [17] Pantoea agglomerans PAM (PaPAM, 3UNV, baktérium) [18] Az MIO prosztetikus csoporton kívül, a Tyr110 (PcPAL szerinti számozás), és ekvivalensei a PAL és a rokon enzimek aktív centrumainak legkonzerváltabb részei. Az a kísérleti tény, hogy a Tyr110Phe mutáció a PAL szinte teljes inaktivációjához vezet [19], azt bizonyítja, hogy ennek az aminosavnak is kritikus szerepe van a katalízisben. A PcPAL mutánsokkal végzett kísérletek igazolták, hogy a Tyr110, Asn260 és a Gln348 aminosavaknak van a legfontosabb szerepe a katalízis során [19] A PcPAL kristályszerkezetében a Tyr110 fenolos oxigén atomja 21,6 Å távolságra van a MIO metilidéncsoportjától, így feltehetően nem ez az enzim aktív konformációja. A kristályszerkezetben megtalálható MIO-hoz kötött DTT – ditio-treol, mely egy általánosan alkalmazott redukálószer a molekuláris biológiában – okozza a kicsavarodott állapot létrejöttét. Az enzimnek kétféle konformációja létezik, a „loop-in” nevű, mely a kisebb 23

távolságú, kompaktabb hurok konformáció, illetve a „loop-out”, a nagyobb távolságú, nyitott hurok konformáció. Az enzim csak a „loop-in” konformációs állásban van katalitikusan aktív állapotban, a „loop-out” feltekeredés eredményeképpen egy irreverzibilis katalitikus aktivitásvesztés jön létre [20]. A molekulában a Tyr110-t tartalmazó hurkot tirozin-huroknak nevezzük. Ha a Cterminális multihélix doménje hiányzik, ez jóval merevebb, illetve aktív centrumba hajló aktív szerkezet eredményez. Emiatt az enzim aktivitásához szükséges ennek a huroknak a destabilizációja [20]. A legnagyobb különbség a prokarióta és az eukarióta szerkezetek között az 16. ábrán is látható C-terminális régióban található multihélix tartományban van. Növényi és gomba eredetű enzimek esetében jelen van egy C terminális, kb. 170 aminosav hosszú multihélix domén, ami a bakteriális enzimek esetében nem figyelhető meg. PcPAL-on végzett molekuladinamikai vizsgálatok alapján tudjuk, hogy a terminális multihélix régió nélkül sokkal merevebb a tirozin-hurok, mint annak jelenlétében. Így valószínűsíthető, hogy a multihélix tartomány a tirozin-hurok dinamikájának befolyásával hat az enzim működésére [20].

17. ábra: Bal oldalon az eukatióta, jobb oldalon a prokarióta PAL [12].

2.5.2 A fenilalanin ammónia-liázok szubsztrátjai, inhibítorai A fenilalanin ammónia-liáz egy nem túl szubsztrátspecifikus enzim. Ezt a tulajdonságát kihasználhatjuk enantiomertiszta aminosavszármazékok előállítására akirális

24

vegyületekből. Ha az ammóniakoncentráció 5 M feletti a reakcióelegyben, akkor a PAL képes az ammónia aril-akrilátra való enantioszelektív addícióját katalizálni [21]. Természetesen, ahogy a nevéből is adódik, a PAL elsődleges, ún. természetes szubsztrátja az L-fenilalanin, azonban emellett számos egyéb szubsztrátot is azonosítottak az évek során. Ezekben a kísérletekben nemcsak azt vizsgálták, hogy az adott vegyület szubsztrátja lehet-e a fenilalanin ammónia-liáznak, hanem a reakciómechanizmust is próbálták megérteni az eltérő reaktivitások alapján. Ilyen vizsgált szubsztrátok például a ciklooktatetraenil-(D,L)-alanin (COT), vagy az L-fenilalaninnál is magasabb Vmax értékekkel rendelkező piridil-(L)-alaninek, a 2-piridil-, 3-piridil-, és a 4-piridil-(L)alaninek A kísérletek során kereskedelmi forgalomban kapható Petroselinum crispum PAL-t alkalmaztak [22]. Az irodalomban közölt mérési eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.

Km/Km(L-Phe)

Vmax/Vmax(L-Phe)

L-Phe

1

1

2-Pyridyl-L-Ala

22,0

0,8

3-Pyridyl-L-Ala

41,6

2,4

4-Pyridyl-L-Ala

12,1

1,8

COT-D,L-Ala

22,6

0,0058

1. táblázat: Piridil-(L)-alaninek kinetikai álladnói L-fenilalaninra vonatkoztatva [22]. Az eredményekből szembetűnő, hogy a COT-(D,L)-alanin Km meglehetősen magas, és a Vmax egészen alacsony. Ezt okozhatja, hogy a fenilcsoport kötő részébe a COT gyűrűje nem tud optimálisan bekötni. A három különböző helyen kötődő piridil-(L)-alanin izomerjeinek értékei viszonylag különbözőek [22]. Számos fluor és klór tartalmú fenilalanin származékot is elfogadott az enzim szubsztrátjának, melyek irodalomban közölt mérési adatait a 2. táblázat tartalmazza. Az eredményekből látható, hogy azok a fenilalanin származékok, melyek benzolgyűrűje meta helyzetben tartalmazott

halogén

atomot,

gyorsabban

reagáltak

az

természetes

szubsztrátnál, alacsonyabb Km értékeket produkáltak. A második, illetve a negyedik szénatomon fluort vagy klórt tartalmazó szubsztrátok körülbelül azonos értékeket produkáltak, mint a szubsztituens nélküli L-fenilalanin, azaz kinetikai viselkedésük hasonló lehet. A nitrogéntartalmú vegyületek közül kettőt vizsgáltak, az 5-pirimidinillel végzett mérések során relatíve magas Km értékeket, de fenilalaninhoz hasonló Vmax 25

értékeket kaptak, viszont a 2-pirimidinillel való reakció során átalakulást is, nem csupán inhibíciót észleltek. A mérések során kereskedelmi forgalomban kapható Petroselinum crispum PAL-t használtak [23]. Km [μM]

Km/Km(L-Phe)

Vmax/Vmax(L-Phe)

L-Phe

33

1

1

2-fluor-L-Phe

65

1,97

1,14

3- fluor-L-Phe

79

2,4

2,09

4- fluor-L-Phe

10

0,3

0,56

2,6-difluor-L-Phe

85

2,6

0,85

3,5-difluor-L-Phe

15,9

4,82

2,72

76

2,3

0,16

2-klór-L-Phe

50

0,15

1,03

3-klór-L-Phe

94

2,85

2,01

4-klór-L-Phe

45

1,4

0,82

420

12,73

0,80

2,3,4,5,6pentafluor-L-Phe

β-(5-pirimidinil)D,L-Ala β-(2-pirimidinil)D,L-Ala

Ki = 7mM

0,00

2. táblázat: Halogén- és nitrogéntartalmú vegyületek kinetikai állandói [23]. A 2010-es évek elején szintén végeztek vizsgálatokat a fenilalanin ammónia-liáz szubsztrátjait illetően. Korábbi kutatásokból azt már tudták, hogy az olyan mutáns enzimek, melyekben a MIO prosztetikus csoport nem tud kialakulni, csak a nitrocsoportot tartalmazó szubsztrátokkal képesek reagálni. Úgy vélték, hogy a MIO csoport a szubsztrát β-protonját savasítja meg, és felvetették azt az elméletet, miszerint a MIO csoport a szubsztrát aromás gyűrűjét támadja meg, majd az ennek eredményeként keletkező pozitív töltés savanyítja meg a β-protont. Röntgenfelvételekkel bizonyították, miszerint a MIO csoport a szubsztrát amino-csoportját támadja meg [24]. A 2011-ben végzett kísérletek során az 5-fenil-furán-2-il-alaninok közül négyet vizsgáltak és találtak megfelelő PAL szubsztrátnak. A mérési eredményeket a 3. táblázat tartalmazza. A vizsgálatok során kereskedelmi forgalomban kapható Rhodotorula glutinis PAL-t alklamaztak [24].

26

L-Phe 5-fenil-furán-2-ilalanin 4-bróm-5-fenilfurán-2-il-alanin 4-klór-5-fenilfurán-2-il-alanin 2-klór-5-fenilfurán-2-il-alanin

Km (µM)

Km/Km(L-Phe)

Vmax/Vmax(L-Phe)

32,01

1

1

2,33

0,07

0,17

21,4

0,67

0,46

13,4

0,42

0,35

9,7

0,3

21

3. táblázat: 5-fenil-furán-2-il-alanin savak kinetikai állandói [24]. 2012-ben az 5-fenil-furán-2-il-alaninok méréseihez hasonló vizsgálatokat végeztek nitro-fenilalaninokkal, viszont ezekkel a mérésekkel sem tudták egyértelműen eldönteni, hogy milyen mechanizmus szerint mennek végbe a reakciók, ahogy a 2011-es kísérletek sem tették ezt lehetővé, mely során vad típusú és mutáns enzimeket használtak. A mérési eredmények a 4. táblázatban láthatók. A 2-nitro-fenilalanin és a 4-nitro-fenilalanin Km értékei jóval magasabbak a természetes szubsztráténál, ezek a vegyületek jóval reaktívabbak, mint a 3-nitro-fenilalanin [25]. Km (µM)

Vmax/Vmax(L-Phe)

L-Phe

33,3

Km/Km(L-Phe) 1

2-nitro-Phe

268,1

8,05

0,57

3-nitro-Phe

64,6

1,94

0,21

4-nitro-Phe

295,5

8,87

0,86

1

4. táblázat: Nitro-fenilalaninok kinetikai állandói [25]. Ebben a kísérletsorozatban azt is megállapították, hogy annak az enzimnek, melyben nem jön létre MIO, a nitro-fenilalaninok kevésbé jó szubsztrátként funkcionálnak a természetesnél [25]. Természetesen nemcsak az enzim által átalakítható szubsztrátokat, hanem az azt gátló inhibítorokat is vizsgálják. Egy 2002-ben, az általunk elvégzett kísérletekhez hasonló mérések során kereskedelmi forgalomban kapható Rhodotorula glutinis PAL-t, illetve annak inhibítoratit vizsgálták meg. A kezdeti kinetikai vizsgálatokat 2 ml-es küvettákban 27

végezték, 10 μl PAL-lal, 25°C-on, 0,1M-os TRIS pufferrel (pH=8,8), 0,05–1 mM Lfenilalanin koncentráció mellett. 290 nm-en mérték a fahéjsav keletkezésének sebességét a kezdeti reakciósebesség meghatározásához. A KM és Ki értékeket a Lineweaver-Burk standard linearizációs módszerrel határozták meg. Az alkalmazott L-Phe koncentrációt növelték az inhibítorok jelenlétében [26]. A fenol, orto-krezol, illetve a meta-krezol kevert inhibícióval gátolja a PAL működését. Ezeknek az inhibítoroknak glicinnel való együttes alkalmazásakor a para-krezol/glicin esetében nem volt észlelhető inhibíció, orto-krezol/glicin és fenol/glicin alkalmazásakor kevert, míg a meta-krezol/glicin párosításnál kompetitív inhibíciót figyeltek meg. Az erős szinergisztikus inhibíciók arra engednek következtetni, hogy az inhibítorok az aktív centrumába kötnek az enzimnek, mivel azok a szubsztrát struktúrájához hasonló szerkezettel bírnak [26]. A vizsgálatok során megállapították, hogy a ciklohexanol, alanin és glicin-etil-észter nem inhibítorai a PAL-nak. Továbbá az anizol és a fenol általi inhibíció igen hasonló egymáshoz: feltehetően a fenol OH-csoportján lévő proton nem fontos az enzimhez való kötődés szempontjából. Megfigyelték még, hogy a 3-fluorfenol erősebb inhibítor a fenolnál, illetve a pirrol és a 2-karboxil-furánsav sem inhibeáló hatású. Érdekes megfigyelés még, hogy míg az orto- és meta-krezol jó inhibítorai a PAL-nak, addig a para-krezol sem önmagában, sem glicinnel együtt sem hat gátlólag az enzimre. A parakrezol glicinnel kevert reakciója során csupán a glicin inhibeáló hatása érvényesül. A mérési adatokat az 5. táblázat tartalmazza. Az eredményekből látható, hogy az aromás gyűrűnek kiemelten fontos szerepe van az aktív helyhez való kötésnél. A ciklohexanol, mely gyűrűs molekula, nem inhibeálja az enzimet. A heteroaromás gyűrűt tartalmazó pirrolnál és 2-karboxil-fumársavnál az inhibíció hiányára a π elektrofil interakció lehet a magyarázat az aktív centrumon. Az is észrevehető, hogy a geometriai elhelyezkedés igen fontos, főképp a metil-csoport pozíciója a hidroxil-csoporthoz képest. Ha ezek para helyzetben vannak, a molekula nem illeszkedik a PAL aktív centrumába [26].

[I] mM

Vi/V0

o-Krezol

3,5

0,522

m-Krezol

3,5

0,765

p-Krezol

3,5

1

Fenol

3,5

0,462

Glicin

3

0,679

28

Alanin

2

0,866

Benzoesav

3,5

0,660

Benzol

3,51

0,834

2-Furánsav

3,5

1

Cikolhexanol

2,5

1

L-Alanin

3,9

1

Imidazol

3,3

0,59

Glicin-etil-észter

3,5

1

Anizol

3,47

0,513

3-Fluorfenol

3,42

0,106

Tiofenol

3

0,831

Pirrol

3

1

Toluol

1,7

1

D,L-Glutaminsav

3

1

Benzoesav/glicin

3

0,55

Fenol/glicin

0,11

0,58

o-Krezol/glicin

0,1

0,66

m-Krezol/glicin

0,5

0,43

p-Krezol/glicin

2

0,46

5. táblázat: Inhibítorok kinetikai állandói [26]

29

3. Mérés során használt anyagok és módszerek 3.1. Fehérje termelése, tisztítása 3.1.1. Fehérje konstrukt előállítása Kutatásainkhoz a szükséges PcPAL-t szekvenciája alapján rendeltük meg és gyártották le. A kapott gén szekvenciája a következő volt: GCAGCGGCCATATCGACGACGACGACAAGCATATGCTCGAGATGGAAAACGGAAACGGAGCCACTACTAACGGACATGT AAACGGAAACGGAATGGACTTCTGCATGAAGACTGAAGACCCCTTGTACTGGGGAATTGCCGCCGAAGCCATGACTGGA TCCCATTTGGACGAAGTAAAGAAGATGGTAGCCGAATACAGAAAGCCCGTAGTAAAGTTGGGAGGAGAAACTTTGACTA TTTCCCAGGTAGCCGCCATTTCCGCCAGAGACGGATCCGGAGTAACTGTAGAATTGTCCGAAGCCGCCAGAGCCGGAGT AAAGGCCTCCTCCGACTGGGTAATGGACTCCATGAACAAGGGAACTGACTCCTACGGAGTAACTACTGGATTCGGAGCC ACTTCCCATAGAAGAACTAAGCAGGGAGGAGCCTTGCAGAAGGAATTGATTAGATTCTTGAACGCCGGAATTTTCGGAA ACGGATCCGACAACACTTTGCCCCATTCCGCCACTAGAGCCGCCATGTTGGTAAGAATTAACACTTTGTTGCAGGGATA CTCCGGAATTAGATTCGAAATTTTGGAAGCCATTACTAAGTTCTTGAACCAGAACATTACTCCCTGCTTGCCCTTGAGA GGAACTATTACTGCCTCCGGAGACTTGGTACCCTTGTCCTACATTGCCGGATTGTTGACTGGAAGACCCAACTCCAAGG CCGTAGGACCCACTGGAGTAATTTTGTCCCCCGAAGAAGCCTTCAAGTTGGCCGGAGTAGAAGGAGGATTCTTCGAATT GCAGCCCAAGGAAGGATTGGCCTTGGTAAACGGAACTGCCGTAGGATCCGGAATGGCCTCCATGGTATTGTTCGAAGCC AACATTTTGGCCGTATTGGCCGAAGTAATGTCCGCCATTTTCGCCGAAGTAATGCAGGGAAAGCCCGAATTCACTGACC ATTTGACTCATAAGTTGAAGCATCATCCCGGACAGATTGAAGCCGCCGCCATTATGGAACATATTTTGGACGGATCCGC CTACGTAAAGGCCGCCCAGAAGTTGCATGAAATGGACCCCTTGCAGAAGCCCAAGCAGGACAGATACGCCTTGAGAACT TCCCCCCAGTGGTTGGGACCCCAGATTGAAGTAATTAGATCCTCCACTAAGATGATTGAAAGAGAAATTAACTCCGTAA ACGACAACCCCTTGATTGACGTATCCAGAAACAAGGCCATTCATGGAGGAAACTTCCAGGGAACTCCCATTGGAGTATC CATGGACAACACTAGATTGGCCATTGCCGCCATTGGAAAGTTGATGTTCGCCCAGTTCTCCGAATTGGTAAACGACTTC TACAACAACGGATTGCCCTCCAACTTGTCCGGAGGAAGAAACCCCTCCTTGGACTACGGATTCAAGGGAGCCGAAATTG CCATGGCCTCCTACTGCTCCGAATTGCAGTTCTTGGCCAACCCCGTAACTAACCATGTACAGTCCGCCGAACAGCATAA CCAGGACGTAAACTCCTTGGGATTGATTTCCTCCAGAAAGACTTCCGAAGCCGTAGAAATTTTGAAGTTGATGTCCACT ACTTTCTTGGTAGGATTGTGCCAGGCCATTGACTTGAGACATTTGGAAGAAAACTTGAAGTCCACTGTAAAGAACACTG TATCCTCCGTAGCCAAGAGAGTATTGACTATGGGAGTAAACGGAGAATTGCATCCCTCCAGATTCTGCGAAAAGGACTT GTTGAGAGTAGTAGACAGAGAATACATTTTCGCCTACATTGACGACCCCTGCTCCGCCACTTACCCCTTGATGCAGAAG TTGAGACAGACTTTGGTAGAACATGCCTTGAAGAACGGAGACAACGAAAGAAACTTGTCCACTTCCATTTTCCAGAAGA TTGCCACTTTCGAAGACGAATTGAAGGCCTTGTTGCCCAAGGAAGTAGAATCCGCCAGAGCCGCCTTGGAATCCGGAAA CCCCGCCATTCCCAACAGAATTGAAGAATGCAGATCCTACCCCTTGTACAAGTTCGTAAGAAAGGAATTGGGAACTGAA TACTTGACTGGAGAAAAGGTAACTTCCCCCGGAGAAGAATTCGAAAAGGTATTCATTGCCATGTCCAAGGGAGAAATTA TTGACCCCTTGTTGGAATCCTTGGAATCCTGGAACGGAGCCCCCTTGCCCATTTCCTGAGCTGAGCAATAACTAGCATA ACCCCTTGGGGCCTCTAAACGG

Ennek a génnek az aminosav-szekvenciáját az Expasy translate programmal kaphatjuk meg, mely a következő [27]:

30

SGHIDDDDKHMLEMENGNGATTNGHVNGNGMDFCMKTEDPLYWGIAAEAMTGSHLDEVKK MVAEYRKPVVKLGGETLTISQVAAISARDGSGVTVELSEAARAGVKASSDWVMDSMNKGT DSYGVTTGFGATSHRRTKQGGALQKELIRFLNAGIFGNGSDNTLPHSATRAAMLVRINTL LQGYSGIRFEILEAITKFLNQNITPCLPLRGTITASGDLVPLSYIAGLLTGRPNSKAVGP TGVILSPEEAFKLAGVEGGFFELQPKEGLALVNGTAVGSGMASMVLFEANILAVLAEVMS AIFAEVMQGKPEFTDHLTHKLKHHPGQIEAAAIMEHILDGSAYVKAAQKLHEMDPLQKPK QDRYALRTSPQWLGPQIEVIRSSTKMIEREINSVNDNPLIDVSRNKAIHGGNFQGTPIGV SMDNTRLAIAAIGKLMFAQFSELVNDFYNNGLPSNLSGGRNPSLDYGFKGAEIAMASYCS ELQFLANPVTNHVQSAEQHNQDVNSLGLISSRKTSEAVEILKLMSTTFLVGLCQAIDLRH LEENLKSTVKNTVSSVAKRVLTMGVNGELHPSRFCEKDLLRVVDREYIFAYIDDPCSATY PLMQKLRQTLVEHALKNGDNERNLSTSIFQKIATFEDELKALLPKEVESARAALESGNPA IPNRIEECRSYPLYKFVRKELGTEYLTGEKVTSPGEEFEKVFIAMSKGEIIDPLLESLES WNGAPLPIS-AEQ-LA-PLGASKR

Amennyiben ezt a szekvenciát ClutsalW programmal összehasonlítjuk, látható, hogy az általunk használt PcPAL-ban két felületi cisztein kimutáltunk, mivel azok keresztkötéseket képeznek, ami az enzim kicsapódását illetve inaktiválódását okozhatják. [28]. Használt

MLEMENGNGATTNGHVNGNGMDFCMKTEDPLYWGIAAEAMTGSHLDEVKKMVAEYRKPVV 60

Irodalmi

---MENGNGATTNGHVNGNGMDFCMKTEDPLYWGIAAEAMTGSHLDEVKKMVAEYRKPVV 57 *********************************************************

Használt

KLGGETLTISQVAAISARDGSGVTVELSEAARAGVKASSDWVMDSMNKGTDSYGVTTGFG 120

Irodalmi

KLGGETLTISQVAAISARDGSGVTVELSEAARAGVKASSDWVMDSMNKGTDSYGVTTGFG 117 ************************************************************

Használt

ATSHRRTKQGGALQKELIRFLNAGIFGNGSDNTLPHSATRAAMLVRINTLLQGYSGIRFE 180

Irodalmi

ATSHRRTKQGGALQKELIRFLNAGIFGNGSDNTLPHSATRAAMLVRINTLLQGYSGIRFE 177 ************************************************************

Használt

ILEAITKFLNQNITPCLPLRGTITASGDLVPLSYIAGLLTGRPNSKAVGPTGVILSPEEA 240

Irodalmi

ILEAITKFLNQNITPCLPLRGTITASGDLVPLSYIAGLLTGRPNSKAVGPTGVILSPEEA 237 ************************************************************

Használt

FKLAGVEGGFFELQPKEGLALVNGTAVGSGMASMVLFEANILAVLAEVMSAIFAEVMQGK 300

Irodalmi

FKLAGVEGGFFELQPKEGLALVNGTAVGSGMASMVLFEANILAVLAEVMSAIFAEVMQGK 297 ************************************************************

Használt

PEFTDHLTHKLKHHPGQIEAAAIMEHILDGSAYVKAAQKLHEMDPLQKPKQDRYALRTSP 360

Irodalmi

PEFTDHLTHKLKHHPGQIEAAAIMEHILDGSAYVKAAQKLHEMDPLQKPKQDRYALRTSP 357 ************************************************************

Használt

QWLGPQIEVIRSSTKMIEREINSVNDNPLIDVSRNKAIHGGNFQGTPIGVSMDNTRLAIA 420

Irodalmi

QWLGPQIEVIRSSTKMIEREINSVNDNPLIDVSRNKAIHGGNFQGTPIGVSMDNTRLAIA 417 ************************************************************

Használt

AIGKLMFAQFSELVNDFYNNGLPSNLSGGRNPSLDYGFKGAEIAMASYCSELQFLANPVT 480

Irodalmi

AIGKLMFAQFSELVNDFYNNGLPSNLSGGRNPSLDYGFKGAEIAMASYCSELQFLANPVT 477 ************************************************************

31

Használt

NHVQSAEQHNQDVNSLGLISSRKTSEAVEILKLMSTTFLVGLCQAIDLRHLEENLKSTVK 540

Irodalmi

NHVQSAEQHNQDVNSLGLISSRKTSEAVEILKLMSTTFLVGLCQAIDLRHLEENLKSTVK 537 ************************************************************

Használt

NTVSSVAKRVLTMGVNGELHPSRFCEKDLLRVVDREYIFAYIDDPCSATYPLMQKLRQTL 600

Irodalmi

NTVSSVAKRVLTMGVNGELHPSRFCEKDLLRVVDREYIFAYIDDPCSATYPLMQKLRQTL 597 ************************************************************

Használt

VEHALKNGDNERNLSTSIFQKIATFEDELKALLPKEVESARAALESGNPAIPNRIEECRS 660

Irodalmi

VEHALKNGDNERNLSTSIFQKIATFEDELKALLPKEVESARAALESGNPAIPNRIEECRS 657 ************************************************************

Használt

YPLYKFVRKELGTEYLTGEKVTSPGEEFEKVFIAMSKGEIIDPLLESLESWNGAPLPIS 719

Irodalmi

YPLYKFVRKELGTEYLTGEKVTSPGEEFEKVFIAMSKGEIIDPLLECLESWNGAPLPIC 716 **********************************************.***********.

A munkánk során használt PcPAL enzimet a pET vektorcsaládba tartozó pET19b vektorral expresszálták. Ennek a vektorcsaládnak a tagjai nagy mennyiségű fehérje termelésére alkalmasak. A plazmid térképe a 6. ábrán látható. A PcPAL génjét szintetikus oligonukleotidokból és PCR termékekből állították össze. A fragmentet beklónozták a vektorba a XhoI és Bpu1102I restrikciós endonukleázok segítségével. A plazmid DNS-t a transzformált baktériumtól megtisztították, majd a koncentrációt UV spektroszkópiával határozták meg. A szekvenciát szekvenálással ellenőrizték, ami a megadott restrikciós hasítóhelyeken belül 100%-ban megegyezett a kívánttal. A kapott 5 μg mintát ezután fagyasztva szárították [29]. A konstrukt N- terminális végén 6 darab histidin található, amely lehetőséget ad az enzim könnyű tisztítására.

32

18. ábra: pET19b plazmid térkép [29] 3.1.2. Kompetens sejtek készítése A kompetens sejtek elkészítéséhez a QIAGEN protokollját alkalmaztam. Ennek az eljárásnak a lényege az, hogy a sejtek fala átjárhatóvá váljon, ennek köszönhetően pedig transzformálás során a DNS-t be tudjunk juttatni a mikroorganizmusba. A munka során használt oldatok a következők voltak: 1) TFB I. oldat Összetétele: 100 mM RbCl, 50 mM MnCl, 30 mM Kálium-acetát, 10 mM CaCl2, 15%-os glicerin. Az oldat pH-ját óvatosan, 10%-os ecetsavval állítottuk be 5,8ra 2) TFB II. oldat Összetétele: 10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 75mM CaCl2, 15%-os glicerin. Az oldat pH-ját óvatosan, KOH-dal állítottuk 6,8-ra

33

A munka során használt tápoldat a következő volt: 1) Luria-Bertani, azaz LB tápoldat Összetétele: 5,0 g élesztőkivonat, 10,0 g tripton, 10,0 g NaCl. A tápoldat pH-ját 7-re állítottuk, majd desztillált vízzel a térfogatot 1 literre egészítettük ki. Autóklávban sterileztük le a tápoldatokat. 2) LB táptalaj Összetétel:5,0 g élesztőkivonat, 10,0 g tripton, 10,0 g NaCl, 17 g agar. A táptalaj pH-ját 7-re állítottuk, majd ennek is 1 literre egészítettük ki a térfogatát desztillált vízzel. 5 ml steril LB tápoldathoz 5,65 μl karbenicillint adtunk. Ezután steril fülke alatt steril pipetta heggyel felszedtünk valamennyit a fagyasztott, -70°C-os Rosetta BL21 sejtekből. Ezután a steril hegyet, illetve a rajta lévő sejteket a 5 ml antibiotikumos LB tápoldatba helyeztük. Overnight növesztettük 37°C-on rázógépben, 200 rpm fordulatszámon rázatva. 50 ml steril LB tápoldathoz 56,5 μl karbenicillint adtunk. Az overnight növesztés során felnőtt kultúrából 1 ml-t hozzáadtunk az antibiotikumos táptalajhoz, majd addig növesztettük sejtkultúrát 37°C-on, amíg annak optikai denzitása 0,3 és 0,6 közé nem esett. Miután ezt az értéket elértük, az 50 ml sejtszuszpenziót steril falconcsőbe helyeztük, majd centrifugálás (20 perc, 4°C, 3600 rpm) segítségével választottuk el a sejteket. A felülúszót steril fülke alatt eltávolítottuk, ezután a sejteket felszuszpendáltuk 5 ml TFB I. oldatban. A szuszpendálás után 20 percen keresztül jégen tároltuk a mintát, majd ismét lecentrifugáltuk (20 perc, 4°C, 3600 rpm) és a felülúszót szintén steril fülke alatt eltávolítottuk. A sejteket 1 ml TFB II. oldatban szuszpendáltuk, és 20 percig jégen tároltuk. Az így elkészült kompetens sejteket 100 µl-es egységekre osztottuk, és amelyek nem kerültek egyből felhasználásra, azokat a felhasználásig -70°C-on tároltuk. 3.1.3. Sejtek transzformálása A kompetenssé tett Rosetta BL21 sejtekből 100 μl -hez 1 μl 10x híg β-merkaptoetanolt (BME) adtunk, majd 5 percen keresztül jégen tartottuk. Ezután körülbelül 100 ng plazmidot adtunk a sejtekhez majd 30 percre jégre tettük. Ezután 60 másodpercig 42°C-on termosztáltuk a mintát, így a hirtelen hősokk miatt a membránt felépítő foszfolipidek mozgékonysága nő, ezért permeábilissá válik. Ekkor a sejt felületén megtapadt plazmidok 34

hőmozgásuk, illetve az átjárhatóság növekedése végett nagyobb valószínűséggel jutnak be a sejtbe. A termosztálás után 2 percig jére tettük, Ezután 200 μl steril tápoldatot adtunk a sejteket és 1 órán át inkubáltuk őket 37°C-on. Ennek köszönhetően a sejtek regenerálódnak, majd szaporodni kezdenek. Az inkubálás alatt elkészítettük az 50 ml táptalajt, melybe 56,5 μl karbenicillin és 50 μl klóramfenikol antibiotikumaokat mértünk be. Ebből 10 ml-t petri csészébe öntöttünk, majd erre a táptalajra szélesztettük az inkubálás után a sejteket, és overnight 37°C-on termosztáltuk őket. 3.1.4. Fehérje feltárása Mivel nagy mennyiségű enzimre volt szükségünk kísérleteink során, ezért a Fermentia Kft. Fermentációs Kísérleti Üzemében termelt fehérjét használtuk a kísérleteink során. Az eljárás során E. coli BL21 DE3 expressziós törzset használtak. Az inokulum előállítását 37°C-on egy éjszakán keresztül 10 ml térfogatban 500 ml Erlenmeyer lombikban végezték. A 10 literes fermentort 100 ml inokulummal oltották be. A sejteket 1mMIsopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) indukciót követően 28°C-on 10–12 órán át növesztették, majd centrifugával választották el a sejttömeget. A feltárást szintén a Fermentia Kft. Fermentációs Kísérleti Üzemében történt. Először elkészítették a lízis puffert, mely 150 mM NaCl-ot, 50 mM pH=8,0 TRIS puffert, és 0,5 mM EDTA-t tartalmazott. 500 ml lízis pufferben felszuszpendáltak ~21 g PcPAL sejttömeget, hozzáadtak 10db proteáz inhibitor tablettát (Roche cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets, 11836145001), majd nagynyomású homogenizátorban két körben ~1000bar nyomáson feltárták: az első lépés: p=920-980 bar-on, T=3,5-32°C-on;a második lépés: p=920-960bar-on és T=3,0-32°C-on zajlott. Ezután 150 ml lízis pufferrel öblítették a készüléket. A homogenizált sejtszuszpenziót centrifugálták (4°C, 4200 rpm, 60 perc) Majd 24 h elteltével újból lecentrifugálták, hogy az állás során kicsapódó fehérjéktől is megszabaduljanak. 3.1.5. Fehérje tisztítása A PcPAL tisztítását Ni-NTA gyanta segítségével végeztük el. A munka során felhasznált oldatok, pufferek mennyiségét feleslegben véve a tisztítandó fehérje oldat mennyiségéhez igazítottuk. A szilárd anyagokat analitikai mérleg, a folyadékokat

35

mérőhenger segítségével mértük be. A tisztítás során 20 ml Ni-NTA gyantát használtunk, az alkalmazott oldatok mennyiségét ehhez számítottuk ki. Pufferek készítése

1) Low Salt puffer (LS), pH=7,5; 2000 ml; 50 mM HEPES, 30 mM KCl 2) High Salt puffer (HS), pH=7,5; 100 ml; 50 mM HEPES, 300 mM KCl 3) Dialízis puffer (PBS), pH= 7,5; 8000 ml; 50 ml PBS A pufferek készítése során a kívánt pH értéket szükség esetén tömény HCl vagy tömény NaOH hozzáadásával állítottuk be digitális pH mérő segítségével. Imidazol oldatok készítése A különböző koncentrációjú imidazol oldatokat minden esetben a fenti leírt puffer oldatokkal készítettük el.

1) Low Imidazol LS puffer oldat (LIm 25), pH=7,5; 500 ml; 25 mM Imidazol LS oldata 2) High Imidazol LS puffer oldat (HIm 500), pH=7,5; 500 ml; 500 mM Imidazol LS oldata 3) Ultrahigh Imidazol LS puffer oldat (UHIm 1000), pH=7,5; 50 ml; 1000 mM Imidazol LS oldata

A Ni-NTA gyanta előkezelése A GE HealthCare Ni-NTA gyantát 2x40 ml vízzel és 40 ml LS pufferrel mostuk (mosás: a gyantát 45 ml-es talp nélküli fuga csövekbe töltöttük és 15 percig rázattuk sík rázógépen, ~ 450 rpm, RT). A mosások között a gyantát lecentrifugáltuk (2250 rpm; 3 perc; 4°C). A fehérje oldat megkötése a gyantán

36

A feltárás során kapott felülúszó fehérje oldat összes fehérje tartalmát Bradford módszerrel meghatározzuk. A reagensben lévő Coomassie Brillant Blue G-250 festék a fehérjékhez savas közegben elektrosztatikus és van der Waals kölcsönhatással köt, ezáltal kék színt eredményez. Ez a festék elnyelési maximumát eltolja 465 nm-ről 595 nm-re. Először kalibrációt végeztünk el. Ezt Bovine Serum Albuminnal (BSA), a gyártó által megadott protokoll alapján készítettük el. Ekkor a vak 3 ml Bradford reagens volt, melyhez 100 μl desztillált vizet adtunk. A mérések során a 3 ml Bradford reagenshez 100 μl fehérjét mértünk. A kalibráció után a feltárt felülúszóból higítási sort készítettünk, majd az alapabszorbanciát levonva a kapott értékéből megkaptuk a felülúszó abszorbanciáját a különböző higításokban. Az abszorbancia ismeretében a kalibrációs egyenest felhasználva kiszámítottuk a koncentrációkat. A felülúszó fehérje tartalmából és a gyanta gyártója által közölt kapacitás adatokból (40 mg His-tagelt fehérje/ml gyanta) megbecsültük, hogy hány részletben szükséges a felülúszó megtisztítása. A felül mennyiségű fehérje oldatot a gyantához adtuk, majd 30 percen át rázattuk (sík rázógép, ~450 rpm, RT). Ezután a gyantát centrifugáltuk (2250 rpm; 3 perc, 4°C). Majd elkezdtük a mosási eljárást. Mosási eljárás – a célfehérje kinyerése a gyantáról A megadott sorrendben, mosó oldatokkal mostuk a gyantát a tiszta célfehérje kinyerése érdekében. A mosó oldatok térfogata minden esetben 40 ml volt. Minden mosás után a gyantát centrifugáltuk (2250 rpm; 3 perc, 4°C). Minden mosás utáni frakciót külön fuga csövekbe gyűjtöttünk és hűtve tároltunk. Kapott frakció 1. Lépés: Low Salt puffer

LS1

2. Lépés: High Salt puffer

HS

3. Lépés: Low Salt puffer

LS2

4. Lépés: Imidazol oldat LS pufferben (25 mM Imidazol)

LIm1


LIm2


LIm3


HIm1


HIm2


HIm3

37


HIm4

A fehérjeszennyezés elúcióját a LS (1,2), HS, LIm (1,2,3) frakciók esetén Bradfordreagenssel

követtük.

A

kialakuló

szín

mélységéből

(szürkétől

a

sötétkékig)

következtettünk a fehérjekoncentrációra. A célfehérje elúcióját a HIm (1,2,3,4) frakciók szintén Bradford módszerrel követtük. Így elkülöníthető volt az ún. csúcsfrakció, amely a legkoncentráltabb a célfehérjére nézve. Amennyiben az adott HIm frakció már nem tartalmazott fehérjét, vagy csak rendkívül kis mennyiségben, akkor azt nem volt érdemes dializálni. Dialízis A HIm frakciókat egyesítettük és dialízis membráncsövek (Sigma D9652, továbbiakban membrán) segítségével dializáltuk. A gyártó által megadott kapacitásból kiszámítottuk a szükséges membrán hosszát majd elvégeztük a membrán előkezelését. Először lezártuk a membrán egyik végét csomózással és csipesszel, majd az egyesített HIm frakciókat beletöltöttük a membránba, végül csomózással és csipesszel lezártuk a másik végét is. Az így kapott lezárt dialízis zsákokat a bennük lévő dializálandó fehérje oldat térfogatához képest 20-szoros térfogatú dialízis pufferben (50 mM Na2HPO3; pH=7,5) 4°C-on dializáltuk. A dialízist mágneses keverővel enyhén kevertetve, hűtő szekrényben oldottuk meg. 2 óra elteltével a dialízis puffert frissre cseréltük, majd az oldatot egy éjszakán át tovább dializáltuk 4 oC-on. A dialízis végeztével meghatároztuk a fehérjetartalmat Bradford módszerrel. Dializátum töményítése A dialízis után kapott híg fehérje oldatot koncentrálni, töményteni kell. Erre a célra cellulóz membránnal ellátott speciális Milipore Amicon töményítő rendszeréthasználtunk. A teljes dialzált oldatot a fugacsövekbe töltöttük (~ 10 ml oldat/ db fugacső), majd a mintát centrifugáltuk (3000 rpm, 4 oC, 15 min). A kívánt töménység elérése után ellenőriztük fehérje tartalmat Bradford módszerrel. Gyantatisztítás

38

A 15 ml gyantát 30 ml UHIm mosó oldattal (1 M imidazol LS pufferben) oldattal, majd 5x 30 ml oszloptérfogatnyi desztillált vízzel mostuk. A mosások között centrifugálást végeztünk (2250 rpm; 3 perc, 4°C), majd a gyantára 20 ml 20%-os etanolt (20 v/v% etanol desztillált vízben) töltöttünk, és 4 oC-on tároltuk. 3.1.7. SDS-gélelektroforézis Miután Bradford-reagenssel koncentráció-meghatározást végeztünk, az eredmények pontosítása miatt SDS-gélelektroforézist végeztünk el. Az SDS-PAGE (nátrium-dodecilszulfátos-poliakril-amid-gélelektroforézis) a fehérjék alegységszerkezetének vizsgálatára szolgál. A fehérjét hőkezeljük SDS-sel, mint erős anionos detergenssel, illetve DTT-vel, mely diszulfid hidakat képes bontani. Ekkor az alegységszerkezet felbomlik, a fehérje denaturálódik, apoláris, hidrofób részük kitekeredik. Az SDS pH 7 és 11 között negatív töltéssel elfedi a fehérje eredeti töltését, így az képes lesz a molekulatömege szerint vándorolni a gélben. Emiatt ez a módszer a méret szerinti elválasztásra alkalmas. Első lépésként elvégeztük az SDS gélöntést, melynek lépései a következők voltak: 1) A gélöntéshez szükséges üveglapokat 96%-os alkohollal letöröltük. 2) A kazettát befogtuk a tartóba. 3) Összeöntöttük a gélhez szükséges anyagokat. Mivel két gélre volt szükségünk, a mennyiségeket két géllap elkészítéséhez igazítottuk. -

12%-os elválasztó gélhez, 8,8 ml ddH2O-t, 200 μl 10%-os SDS puffert, 5 ml elválasztó puffert és 6 ml 40%-os akrilamid oldatot adtunk.

-

4%-os tömörítő gélhez 12,85 ml ddH2O-t, 200 μl 10%-os SDS puffert, 5 ml tömörítő puffert és 1, 95 ml 40%-os akrilamid oldatot adtunk.

4) Az elválasztó gélhez közvetlenül az öntés előtt 100 μl 10%-os APS-t és 10 μl TEMED oldatot adtunk, majd a két üveglap közé öntöttük kb. 3/5 részig. 5) Desztillált vizet rétegeztünk a tetejére. 6) 30–35 percig hagytuk a polimerizációt, majd szűrőpapírcsíkkal leitattuk róla a vizet, míg teljesen száraz nem lett. 7) Ezután szintén a közvetlen öntés előtt a tömörítő gélhez is hozzámértünk 100 μl 10%-os APS-t és 20 μl TEMED oldatot. 8) Öntés után a tömörítő gélbe behelyeztük a fésűt, majd 30 – 35 percig hagytuk a polimerizációt. 39

9) Miután elkészült a gél, behelyeztem az SDS kádba. Míg a polimerizáció zajlott, 4 μl mintakoktélhoz (62.5 mM TRIS pH 6.8, 25% glicerin, 2% SDS, 0.01% brómfenolkék, 350 mM DTT) 16 μl mintát adtunk, és 4 percig 98°C-on termosztáltuk azt. A létrából (Page Ruler) 3 μl-t vittünk fel. A termosztálás után a zsebekbe töltöttük a 20 μl mintákat és 200 V-on 35 percig végeztük az elektroforézist. Az elektroforézis után festést végeztünk, melynek menete a következő volt: 1) A gélt bemostuk desztillált vízzel egy műanyag tálba, majd tető nélkül mikrohullámú sütőben melegítettük. 2) Ezután rázógépen 5 percig rázattuk. 3) Az előző két lépést háromszor ismételtük, míg a frontvonal el nem halványodott a gélen. 4) Ezután a desztillált vizet leöntöttük a gélről és kék festéket öntöttünk rá, míg el nem lepte a gélt. 5) 2 órán keresztül rázattuk a gélt újból a rázógépen. 6) A 2 óra letelte után desztillált vízzel mostuk a gélt, majd szintén desztillált vízzel rázattuk. 7) 5 percenként cseréltük a gélen lévő desztillált vizet egészen addig, amíg megfelelően ki nem mosódott a nem fehérjéhez kötődő festék. 8) Ezután a gélt üveglapra helyeztük, majd fényképeztük. 3.1.8. Koncentráció meghatározása A fehérjék 200–280nm-en spektrálisan elnyelnek. A peptidkötés már 200 nm-en, egy aromás aminosavat tartalmazó oldallánc azonban 280 nm-en ad jelet. Fehérjék mellett nukleinsavak elnyelését is lehet mérni, ezek 260 nm-en nyelnek el. Adott oldott anyag extinciós koefficiense (ε, ml*mg-1*cm-1) a 10 g/l töménységű és 1 cm vastagságú oldat abszorbanciáját jelenti, mely az aminosav-szekvencia alapján Protparam programmal számítható ki [30]. A mérést Nanodrop ND-2000 spektrofotométeren (Thermo Scientific) végeztük el, mely a fehérjeoldat 280 nm-en észlelt háttérrel korrigált elnyelésből a Lambert-Beer törvény segítségével számítja ki a koncentrációt.

40

A=ε*l*c ,ahol A: abszorbancia; ε: extinciós koefficiens, l: optikai úthossz, c: koncentráció A mérés során a műszer megadja az A280/A260 értéket is, mely megmutatja, hogy az adott fehérje minta mennyire szennyezett nukleinsavakkal. A fehérje tisztítás végén, illetve az inhibíciós méréseket megelőzően a Nanodrop készülék segítségével is meghatároztuk a fehérje koncentrációját.

3.2. Inhibíciós mérések 3.2.1. A vizsgált inhibítorok Ahogy azt már korábban említettem, nemzetközi együttműködés keretében négy, különböző inhibítorral dolgoztunk kutatásunk során. A kapott anyagok minden esetben a két enantiomer racém elegyét tartalmazták. A 6. táblázat tartalmazza a főbb adatokat róluk. Az előzetes információk alapján tudtuk, hogy az RQ 63W2 nevű inhibítor analógja a homociszteinnek, mely PAL inhibítorként ismert.

41

Anyag neve

Sorszáma

Kapott mennyiség

M (g/mol)

RQ 106/W7

1

23 mg

213,173

Képlete

C9H12O3N1P1

RQ 63W2

4

27 mg

171,151 C3H10O3S1N1P1

RQ 339

5

30 mg

201,162 C8H12O3N1P1

RQ 339 NP

6

30 mg

178.063 C7H10O3N1P1

6. táblázat: Inhibítorok jellemzői Minden inhibítort a 8,8 pH-jú 100 mM-os TRIS pufferben oldottunk fel. A legtöbbjük feloldódott valamilyen fokú rázás hatására, azonban az RQ 339-es csak ultrahang segítségével oldódott fel teljesen a pufferben. A továbbiakban az inhibítorokat sorszámuk alapján fogom megkülönböztetni. A mérések során alkalmazott oldatok, illetve azok elkészítési módja a következők voltak: 

TRIS puffer A mérések során 100 mM, 30°C-on 8,8-as pH-jú TRIS puffert alkalmaztunk. Ezt úgy állítottuk elő, hogy 6,057 g szilárd, bázikus TRIS-t 450 ml desztillált vízben oldottunk, majd sósavval 20°C-on 9,08-as pH-ig titráltuk. Ezután a kapott oldatot 500 ml-re egészítettük ki.



L-fenilalanin oldata

42

Vizsgálatainkkor

40

mM-os

L-fenilalanin,

azaz

L-Phe

törzsoldattal

dolgoztunk. 20 ml-es mennyiség előállításához 132,152 mg szilárd Lfenilalanint oldottunk 20 ml TRIS pufferben. A méréseket UV-VIS spektrofotométerrel (Spectronic Genesys 2, Milton Roy 123– 10937) végeztük Kinetika üzemmódban PMMA küvettákban. A termosztálást Ecoline Staredition, Lauda Re104 termosztáttal oldottuk meg. Detektálás során a fahéjsav képződését mértük 290 nm-en. A mérések előtt ellenőriztük, hogy van-e a különböző komponenseknek elnyelésük 290 nm-en illetve, hogy képződik-e belőlük ezen a hullámhosszon elnyelő termék. 3.2.2. Reverzibilitás vizsgálata Általában,

ha

enzimek

inhibícióját

vizsgáljuk,

feltételezhetjük

a

folyamat

reverzibilitását. Az anyagok, mint például a szubsztrát szerkezeti analógja, egy külön helyre köt, mint például az aktív centrumba reverzibilis módon, majd hígulás esetén disszociál onnan vagy az eredeti szubsztrát nagy mennyiségű hozzáadása miatt elmozdul kötőhelyéről. Emellett természetesen számos szubsztrát irreverzibilis módon köt az enzimekhez. Irreverzibilis kötés elsősorban specifikus kötőhelyen jöhet létre, de előfordul az is, hogy a kötődés nem specifikus. Mielőtt részletesebb kinetikai vizsgálatokat végzünk az inhibítorokon, minden esetben először meg kell állapítanunk, hogy az adott anyag reverzibilis vagy irreverzibilis inhibítora-e az adott enzimnek. Erre többféle módszer létezik. Reverzibilis inhibítorok esetén például, először meg kell mérnünk az enzim aktivitását inhibítor nélkül. Eztuán hozzá kell adnunk az inhibítort a mintához, majd ha ezt a reverzibilisen kötött ligandumot eltávolítjuk az enzimről – mondjuk dialízissel, gélszűréssel –, akkor az enzim eredeti aktivitását kell visszakapnunk a mérések során. Ezzel szemben az irreverzibilisen kötődő inhibítoroknál az enzim inaktívvá válik. Az ilyen mérések során azonban figyelembe kell venni azt is, hogy az aktivitás csökkenését okozhatja az elválasztás módja. Emiatt pedig nem mindig világos, hogy az aktivitás-csökkenést az inhibítor okozta-e [7]. Ennél egyszerűbb módszer talán, az enzim az inhibítorral való inkubálása. Amennyiben reverzibilis az inhibítorunk, akkor az egyensúly nagyon gyorsan kialakul az enzimmel, és ez nem változik az időben, ellentétben az irreverzibilis inhibítorral, amelynek a kötődése

43

folytonos aktivitáscsökkenéssel jár, amennyiben sztöchiometrikus mennyiségben adjuk az enzimhez. Méréseink során az enzim koncentrációja 0,12 mg/ml volt a PMMA küvetta 1 ml-es mennyiségében. A mérés hőmérséklete 30°C volt. Az első mérés előtt 5 percig inkubáltuk a mintákat ugyanezen a hőmérsékleten, melyek az enzimet, inhibítort, és megfelelő mennyiségű TRIS-t tartalmaztak, majd egy órán keresztül 10 percenként mértük az enzim aktivitását. A vizsgálatok során az L-Phe koncentrációja 5 mM volt, és a mérések minden esetben a természetes szubsztrát hozzáadásával kezdődtek. Az inhibítorok koncentrációi: Inhibítor neve

Inhibítor sorszáma

Inhibítor koncentrációja

RQ 106/W7

1.

3 μmol/ml

RQ 63W2

4.

6 μmol/ml

RQ 339

5.

15 μmol/ml

RQ 339 NP

6.

15 μmol/ml

44

3.2.3. Kinetikai konstansok meghatározása A különböző reverzibilis inhibíciós típusok könnyen meghatározhatók kísérleti úton, ahol először a kezdeti reakciósebességet kell meg állapítani különböző szubsztrátkoncentrációk mellett. Ezekből a mérésekből a Km és V értékek megkaphatók a MichaelisMenten egyenletből. Ezután az enzimet azonos szubsztrát-koncentráció mellett kell tesztelni, az inhibítor koncentrációját változtatva. A szubsztrát és az inhibítor mennyiséget a Michaelis és az inhibíciós konstansok értéke körül

célszerű változtatni. Normál

inhibíciós tesztek esetén hiperbolikus görbét kapunk, ha a sebességet a szubsztrát koncentrációjának függvényében ábrázoljuk. Inhibítor jelenlétében a görbék laposabbak lesznek, és még magas szubsztrát-koncentráció esetén sem érik el az inhibeálatlan görbét [7]. Méréseink során az inhibítorokat L-Phe oldatával TRIS pufferben inkubáltuk 30°C-on, majd az enzim hozzáadásával indítottuk a kísérletet. Kontrolloknak minden esetben PcPALt, L-fenilalanint és megfelelő mennyiségű TRIS puffert tartalmazó mintákat használtunk. UV-VIS spektrofotométerrel végeztük a mérést, vaknak pedig L-Phe és az adott inhibítor oldatait használtuk. A mérések során az L-Phe és az inhibítorok koncentrációi a következők voltak:

c(L-Phe) 0,5 1 2 5 0,05 0,05 0,05 0,05 0,1 0,1 0,1 0,1 c(inhibítor) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,5 0,5 0,5 0,5 7. táblázat: 1. Inhibítoral végzett mérések mintáinak összetétele

c(L-Phe) 0,5 1 2 5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 0,5 c(inhibítor) 1 1 1 1 2 2 2 2 8. táblázat: 4. Inhibítoral végzett mérések mintáinak összetétele 45

c(L-Phe) 0,5 1 2 5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 0,5 c(inhibítor) 1 1 1 1 0,1 0,1 0,1 0,1 9. táblázat 5. Inhibítoral végzett mérések mintáinak összetétele

c(L-Phe) 0,5 1 2 5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 0,5 c(inhibítor) 1 1 1 1 2 2 2 2 10. táblázat: 6. Inhibítoral végzett mérések mintáinak összetétele

46

4. Eredmények és kiértékelés 4.1. Fehérje termelése, tisztítása 4.1.1. Fehérje tisztítása A tisztítási eljárás során először a kapott felülúszó összes fehérje-koncentrációját határoztuk meg Bradford-reagenssel, mivel szükségünk volt erre az értékre, hogy kiszámítsuk, hány részletben tudjuk megtisztítani GE HealthCare Ni-NTA gyantán a fehérjénket. Első lépésben Bovine Serum Albuminnal (BSA), a gyártó által megadott protokoll alapján elkészítettük a kalibrációs egyenest. Ekkor a vak 3 ml Bradford reagens volt, melyhez 100 μl desztillált vizet adtunk. A mérések során a 3 ml Bradford reagenshez 100 μl BSA fehérjét mértünk. Az egyes fehérje-koncentrációk lemérése után a kapott átlag értékét mindig korrigáltuk a vak átlagának kivonásával. A mérési eredmények:

vak 0,125 mg/ml BSA 0,25 mg/ml BSA 0,5 mg/ml BSA 1 mg/ml BSA

Korrigált átlag

1. mérés

2. mérés

3. mérés

Átlag

0,530

0,529

0,528

0,529

0,57

0,572

0,573

0,572

0,043

0,623

0,622

0,620

0,622

0,093

0,831

0,746

0,754

0,777

0,248

0,674

0,673

0,669

0,672

0,143

11. táblázat: Kalibrációs mérés eredményei

47

Kalibrációs egyenes

y = 0,2255x + 0,0259 R² = 0,9884

0,3 0,25

A

0,2 0,15

0,1 0,05 0 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

C

19. ábra: Kalibrációs egyenes Ezután a feltárt felülúszóból higítási sort készítettünk, a mérések átlagából levonva a kalibrációban használt vak átlagát megkaptuk a valós abszorbancia értékeket, majd a kalibrációs egyenes egyenletéből kiszámítottuk az összes fehérje-koncentrációt a felülúszóban. Higítási sor 10x 20x 50x 75x 100x

Átlag 1,018 0,993 0,785 0,654 0,634

Abszorbancia 0,489 0,464 0,256 0,125 0,105

Koncentráció [mg/ml] 2,054 1,941 1,022 0,439 0,352

12. táblázat: Összes fehérje-koncentráció meghatározása Számításaink szerint a PcPAL koncentráció a felülúszóban ezek alapján 15 mg/ml. Nekünk 190 ml felülúszót kellett megtisztítani, ami 2850 mg enzimet jelent. A 25 ml-es gyantán 0,5 g fehérjét tudtunk tisztítani, vagyis a 2,85 g PcPAL-hoz 142,5 ml gyanta kell. Ezek alapján a rendelkezésre álló gyantán a tisztítási eljárást hatszor kellett elvégeznünk, hogy az enzim összes mennyiségét megkapjuk. 4.1.2. SDS-gélelektroforézis A tisztítási eljárás után SDS-gélelektroforézist végeztünk az első, illetve az utolsó körben vett mosófolyadékok mintáiból. Az első körben vett mintákat „B”, az utolsóban

48

pedig „E” jellel különböztettük meg egymástól. A gélképből látható, hogy a fenilalanin ammónia-liázt sikerült elválasztanunk a pelletben található egyéb fehérjéktől.

20. ábra: SDS-gélelektroforézis (1)

21. ábra: SDS-gélelektroforézis (2) 49

4.2. Inhibíciós mérések 4.2.1. Reverzibilitás vizsgálata Az 1. inhibítor esetében a mérések során az L-Phe koncentráció az 1 ml-es PMMA küvettákban 2 mM, az enzim koncentráció 0,12 mg/ml, az inhibítor koncentráció pedig 3μmol/ml volt.

1. inhibítor

Fahéjsav koncentráció [mM]

0,25 0. perc

0,2

10. perc 0,15 20. perc 0,1

25. perc 36. perc

0,05

Enzim inhibítor nélkül

0 0

100

200

300

idő [s]

22. ábra: 1. inhibítor mérési eredményei a nem inhibeált enzim eredményével együtt

50

1. inhibítor 0,03


0,025 0,02 0. perc 10. perc

0,015

20. perc 0,01

25. perc 36. perc

0,005

0 0

50

100

150

200

250

300

idő [s]

23. ábra: 1. inhibítor mérési eredményei

4. Inhibítor 0,25

Fahéjsav koncentráció [mMl]

0. perc 0,2

13. perc

0,15

28. perc 40. perc

0,1

50. perc 0,05 55. perc 0 0

100

200

300


idő [s]


51

4. Inhibítor


0,25

0,2 0. perc

0,15

13. perc 28. perc

0,1

40. perc 50. perc

0,05

55. perc

0 0

50

100

150

200

250

300

idő [s]


5. Inhibítor

0. perc

0,25


6. perc 0,2 11. perc 0,15 16. perc 0,1

20. perc

0,05

30. perc 37. perc

0 0

100

200

300

idő [s]

26. ábra: 5. inhibítor mérés eredményei az inhibeálatlan enzim értékeivel

52

5. Inhibítor 0,06 0. perc Fahéjsav koncentráció [mM]

0,05 6. perc 0,04

11. perc

0,03

16. perc

0,02

20. perc 30. perc

0,01

37. perc

0 0

50

100

150

200

250

300

idő [s]


6. Inhibítor 0,25


0. perc 0,2

13. perc

0,15

24. perc 39. perc

0,1

52. perc 0,05 63. perc 0 0

100

200

300

68. perc

idő [s]


53

6. Inhibítor 0,25


0. perc 0,2

13. perc

0,15

24. perc 39. perc

0,1

52. perc 0,05 63. perc

0 0

100

200

68. perc

300

idő [s]

29. ábra: 6. inhibítor mérési eredményei A vizsgálatok megkezdése előtt már tudtuk, hogy amennyiben reverzibilis az inhibítorunk, akkor az egyensúly nagyon gyorsan ki fog alakulni a mérés során az enzimmel, és ez nem változik az időben; ellentétben az irreverzibilis inhibítorral, amelynek a kötődése folyamatos aktivitáscsökkenéssel jár, amennyiben sztöchiometrikus mennyiségben adjuk az enzimhez. Látható, hogy méréseink során az aktivitás nem változott időben, vagyis minden megvizsgált inhibítorunk reverzibilisen képes az enzimhez kötődni. Az is megfigyelhető, hogy az idő előrehaladtával az inhibítorok enzimre gyakorolt hatása állandó, mivel a görbék közötti eltérés elhanyagolhatóan kicsi. A 6. inhibítor félreeső 0. percben mért görbéje feltehetően azért különbözik ennyire a többitől, mert az L-fenilalanin nem volt megfelelő hőmérsékletre termosztálva. 4.2.2. Kinetikai konstansok meghatározása A mérési adatokból elkészítettük az

inhibítorok

Michaelis-Menten,

illetve

Lineweaver-Burk ábrázolását, melyekből megállapíthattuk, hogy milyen típusúak az adott inhibítorok.

54

1. Inhibítor Michaelis-Menten ábrázolása 0,0012 0,001

0,05 mM

0,0008 V

0,1 mM 0,0006 0,2 mM 0,0004 0,5 mM 0,0002 Enzim inhibítor nélkül

0 0,0

2,0

4,0

6,0

S

30. ábra: 1. Inhibítor mérési eredményeinek Michaelis-Menten ábrázolása

1. Inhibítor Lineweaver-Burk ábrázolása 500000 400000 300000 0,05 mM

1/V

200000

0,1 mM 100000

0,2 mM

0 -1

0,5 mM 0

1

2

3

-100000


-200000 -300000

1/S

31. ábra: 1. Inhibítor mérési eredményeinek Lineweaver-Burk ábrázolása

55

4. Inhibítor Michaelis-Menten ábrázolása 0,0009 0,0008 0,25 mM

0,0007 0,0006

0,5 mM

V

0,0005 0,0004

1 mM

0,0003 2 mM

0,0002

0,0001


0 0,0

2,0

4,0

6,0

S


5. Inhibítor Michaelis-Menten ábrázolása 0,0008

0,0007 0,25 mM

0,0006

V

0,0005

0,5 mM

0,0004 1 mM 0,0003

0,1 mM

0,0002

0,0001


0 0,0

2,0

4,0

6,0

S


56

5. Inhibítor Lineweaver-Burk ábrázolása 120000 100000

1/V

80000 60000

0,25 mM

40000

0,5 mM

20000

1 mM 0,1 mM

0 -1

-20000

0

1

2


3

-40000 -60000

1/S

34. ábra: 5. Inhibítor mérési eredményeinek Lineweaver-Burk ábrázolása

6. Inhibítor Michaelis-Menten ábrázolása 0,0009 0,0008 0,25 mM

0,0007 0,0006

0,5 mM

V

0,0005 0,0004

1 mM

0,0003

2 mM

0,0002 0,0001


0 0,0

2,0

4,0

6,0

S


57

6. Inhibítor Lineweaver-Burk ábrázolása 120000 100000

0,25 mM

80000 0,5 mM

60000 1/V

40000

1 mM

20000 2 mM

0 -1

-20000

0

1

2

3

-40000 -60000

Enzim inhibítor nélkül Lineáris (Enzim inhibítor nélkül)

1/S

36. ábra: 6. Inhibítor mérési eredményeinek Lineweaver-Burk ábrázolása Az 1. inhibítor Lineweaver-Burk ábrázolásából arra a következtetésre jutottunk, hogy ez az inhibítor kompetitív típusú, mivel a meghosszabbított egyenesek egy pontban metszik egymást a Lineweaver-Burk ábrázoláson. A 4. inhibítor az adott koncentrációk mellett nem volt inhibeáló hatással az enzimre, mely az inhibítor mérési adatainak Michaelis-Menten ábrázolásából látható. Az 5. és 6. inhibítor szintén egy kompetitív inhibítor, ami a Lineweaver-Burk ábrázolásokon jó látható.

58

5. Összefoglalás Az enzimek a mindennapi élet nélkülözhetetlen mozgatórugói. Olyan biokatalizátorok, melyek a kémiai reakciók sebességét az aktiválási energia csökkentésével érik el. A legtöbb enzim fehérje, így működésük több körülménytől is függ, mint például a hőmérséklet, ionerősség, és pH. Minden enzim a rá jellemző optimális körülmények között képes működni. A fenilalanin ammónia-liáz az ammónia-liázok csoportján belül egy olyan enzim, mely a növényekben az L-fenilalanin metabolizmusának első lépését katalizálja. Baktériumokban PAL igen ritkán fordul elő, emberi szervezetben pedig az L-fenilalanin eszcenciális aminosav, azonban lebontásáért nem a PAL enzim, hanem a fenilalaninhidroxiláz (PAH, EC 1.14.16.1) enzim a felelős. Kutatásaink során egy nemzetközi együttműködésnek köszönhetően négy különböző inhibítort vizsgáltunk meg. Az inhibítorok olyan molekulák, melyek az enzimhez reverzibilis vagy irreverzibilis módon kötődve megakadályozzák a szubsztrátok átalakítását.

Vizsgálataink során először megpróbáltuk megállapítani, hogy az adott

inhibítorok reverzibilisen vagy irreverzibilisen kapcsolódnak a fenilalanin ammónialiázhoz. Mivel mind a négy inhibítor reverzibilisnek bizonyult, további méréseink során arra kerestük a választ, vajon kompetitív, nem-kompetitív, unkompetitív, vagy kevert típusú inhibítorok lehetnek-e. Kísérleteinkből azt a választ kaptuk, hogy a négy inhibítorból három kompetitív típusú, míg a negyedik esetében nem állt rendelkezésünkre megfelelő adat a kiértékeléshez. Ennek hátterében az állt, hogy a mérési koncentrációkban az adott inhibítor nem inhibeálta az enzimet. További kutatásaink során szeretnénk pontosítani a kapott értékeinket további mérések segítségével. Emellett a megfelelő inhibítor kiválasztásával kristályosítási kísérleteket végeznénk, melyek segítségével szerkezeti információkat nyerhetnénk az eukarióta eredetű PAL C terminálisán található kb. 170 aminosav hosszúságú multihélix domén tirozin-hurok merevségére gyakorolt hatásáról, ezáltal az enzim egész műkődésére vonatkozó befolyásáról. Ezt a kristályosítási kísérletet a továbbiakban egy olyan eukarióta mutánssal szeretnénk elvégezni, melyen ez a multihélix domén nem található meg.

59

6. Irodalomjegyzék 1

DiCosimo, R., McAuliffe, J., Poulose, A.J., Bohlmann, G.: Industrial use of immobilized enzymes, Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 6437–6474

2

Poppe, L.; Rétey, J.: Properties and Synthetic Applicatons of Ammonia-Lyases, Curr. Org. Chem., 2003, 7, 1297–1315

3

Louie, G. V.; Bowman, M. E.; Moffitt, M. C.; Baiga, T. J.; Moore, B. S.; Noel, J. P.: Structural Determinants and Modulation of Substrate Specifity in PhenylalanineTyrosine Ammonia Lyase, Chem. Biol., 2006, 13, 1327–1338

4

Poppe, L.; Paizs, Cs.; Kovács, K.; Irimie, F-D.; Vértessy, B.: Preparation of Unnatural Amino Acids with Ammonia-Lyases and 2,3-Aminomutases, Methods in Mol. Biol., 2012, 794, 3–19

5

Sevella Béla: Biomérnökiműveletek és folyamatok, 2. javított kiadás, 2011

6

https://lists.ch.bme.hu/pipermail/vegyeszkar2008/attachments/20110204/a2cc830b/attachment-0023.pdf

7

Hans Bisswanger: Enzyme Kinetics Principles and Methods, Second, Revised and Updated Edition, 2008

8

Kovács, K.; Holczinger, A.; Vértessy, B.; Poppe, L.: Expression of phenylalanine ammonia-lyases in Escherichia coli strains, Studia UBB. Chemia, 2010, 4, 275–282

9

Röther, D.; Poppe, L.; Morlock, G.; Viergutz, S.; Rétey, J.: An active site homology model of phenylalanine ammonia-lyase from Petroselinum crispum, Eur. J. Biochem., 2002, 269, 3065–3075

10

Blau, N., van Spronsen, F.J., Harvey, L.L.: Phenylketonuira, The Lancet, 2010, 376, 623–635

11

Watts, K.T., Mijts, B.N., Lee, P.C., Manning, A. J., Schmidt-Deanert, C.: Discovery of a Substrate Selectivity Switch in Tyrosine Ammonia-Lyase, a Member of the Aromatic Amino Acid Lyase Family, Chem. Biol., 2006, 13, 1317–132

12

Ritter, H., Schulz, G. E.: Structural Basis for the Entrance into the Phenylpropanoid Metabolism Catalyzed by Phenylalanine Ammonia-Lyase, The Plant Cell, 2004, 16, 3426–3436

13

Calabrese, J. C.; Jordan, D. B.; Boodhoo, A.; Sariaslani, S.; Vannelli, T.: Crystal Structure of Phenylalanine Ammonia Lyase: Multiple Helix Diploes Implicated in Catalysis, Biochem., 2004, 43, 11403–11416

14

Wang, L.,Gamez, A.,Sarkissian, C.N., Straub, M., Patch, M.G., Han, G.W., Striepeke, S., Fitzpatrick, P., Scriver, C.R., Stevens, R.C.: Structure-based chemical modification 60

strategy for enzyme replacement treatment of phenylketonuria, Mol.Genet.Metab, 2005, 86, 134–140 15

Moffitt, M. C., Louie, G. V., Bowman, M. E., Pence, J., Noel, J.P., Moore, B.S.: Discovery of Two Cyanobacterial Phenylalanine Ammonia Lyases: Kinetic and Structural Characterization, Biochemistry, 2007, 46, 1004–1012

16

Christenson,

S.

D.,

Liu,

W.,

Toney,

Methylideneimidazole-5-one-Containing

M.

Tyrosine

D.,

Shen,

B.:

Amionmutase

A Novel 4in

Enediyne

Antitumor Antibiotic C-1027 Biosyntesis, J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 6062–6063 17

Feng, L., Wanninayake, U., Strom, S., Geiger, J., Walker, K.D.: Mechanistiy, Mutational, and Structural Evaluation of a Taxus Phenylalanine Aminomutase, Biochemistry, 2011, 50, 2919–2930

18

Strom, S., Wanninayake, U.,Ratnayake, N.D.,Walker, K.D.,Geiger, J.H.: Insights into the Mechanistic Pathway of the Pantoea agglomerans Phenylalanine Aminomutase, Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 2012, 51, 2898–2902

19

Röther, D., Poppe, L., Morlock, G., Viergutz, S., Rétey, J.: An active site homology model of phenylalanine ammonia-lyase from P. crispum, Eur. J. Biochem,. 2002, 269, 3065–3075

20

Pilbák, S. , Tomin, A., Rétey, J., Poppe,L.: The essential tyrosine-containing loop conformation and the role of the C-terminal multi-helix region in eukaryotic phenylalanine ammonia-lyases, FEBS Journal, 2006, 273, 1004–1019

21

Poppe, L.; Rétey, J.: Újabb eredmények a szintetikus biokatalízis terén: a fenil-alanin ammónia-liáz reakció vizsgálata és alkalmazása, Biokémia, 2003, 3, 49–64

22

Golge, A.; Langer B.; Poppe, L.; Rétey, J.: The Behavior of Substrate Analogues and Secondary Deuterium Isotope Effects in the Phenylalanine Ammonia-Lxase Reaction, Biochem. and Biophys., 1998, 359, 1–7

23

Golge, A.; Zon, J.; Kövári, Á.; Poppe, L.; Rétey, J: Phenylalanine Ammonia-Lyase: The Use of Its Broad Substrate Specificity for Mechanistic Investigations and Biocatalysis-Syntesis of L-Arylalanines, Chem. Eur. J.; 2000, 6, 3386–3390

24

Paizs, Cs.; Tosa, M. I.; Bencze, L. Cs.; Brem, J.; Irimie, F. D.; Rétey, J.: 2-amino-3(phenylfuran-2-yl) propionic acids and 5-phenylfuran-2-yl acrylic acids are novel substrates of phenylalanine ammonia-lyase, Heterocycles, 2011, 82, 1217–1228

61

25

Tosa, M. I.; Brem, J.; Mantu; A.; Irimie, F. D.; Paizs, Cs.; Rétey, J.: The Interaction of Nitro-phenylalanines with Wild Type and Mutant (MIO less) Phenylalanine Ammonia-Lyase, ChemCatChem, 2012, 5, 779–783

26

Alunni, S.; Cipiciani, A.; Fioroni, G.; Ottavi, L.: Mechanism of inhibition of phenilalanine ammonia-lyase by phenol inhibitors and phenol/glycine synergistic inhibitors, Arch.of Biochem. and Biophys., 2003, 412, 170–175

27

http://web.expasy.org/cgi-bin/translate/dna_aa

28

http://www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolresult.ebi?jobId=clustalw2-I20141009094244-0727-71345499-oy

29

www.lifetechnologies.com

30

http://web.expasy.org/protparam/

62

Fenilalanin ammónia-liáz új típusú inhibítorainak vizsgálata

Recommend Documents