B aromfitudomány FELTÉTELEZETT ÖSSZEFÜGGÉS A PROGESZTERONTERMELÉS ÉS A KALCIUM FELSZÍVÓDÁSA KÖZÖTT TOJÓTYÚKBAN Mézes Miklós és Lencsés György* Szent István Egyetem, Takarmányozástani Tanszék *Szent István Egyetem Állatélettani és Állategészségügyi Tanszék 2103 Gödöllő, Páter K. u. 1. Összefoglaló: A tojótyúkok kalcium-anyagforgalma a tojástermelési időszak alatt a folyamatos tojáshéjképzés miatt nagyon intenzív folyamat. Ennek szervezeten belüli szabályozása jól ismert, de kevés információ áll rendelkezésre a kalcium bélcsatornából történő felszívódását szabályozó hormonális hatásokról. A vizsgálatok célja annak megállapítása volt, hogy a tojáshéjképzés egyes szakaszaiban lévő tojótyúkok eltérő szexuálszteroid hormon termelése milyen hatást gyakorol a kalcium felszívódására a vékonybél egyes szakaszaiból, illetve ezek a hatások inaktív petefészekkel rendelkező tojótyúkokban hormonális kezeléssel kiválthatók-e? A vizsgálatok eredményei alapján megállapítható volt, hogy a tojáshéj képzése során a legnagyobb mértékű változásokat a progeszteron hormon mutatta, és annak változásaival párhuzamosan változott a kalciumfelszívódás mértéke is, különösen a duodenumból. Inaktív petefészekkel rendelkező tojótyúkok hosszan tartó szexuálszteroid-kezelésének hatására szintén megváltozott a kalciumfelszívódás mértéke, ugyancsak elsősorban a duodenumból, és ebben az esetben is elsődlegesen a progeszteron hatása volt kifejezett. Az eredmények alapján tehát levonható az a következtetés, hogy a kalcium felszívódásának mértékét tojótyúkokban – más tényezők mellett – a progeszteron hormon termelésének szintje jelentősen befolyásolja.
Kulcsszavak: tojótyúk, kalciumfelszívódás, szexuálszteroidok, progeszteron
POSSIBLE CORRELATION BETWEEN THE PROGESTERON SECRETION AND CALCIUM ABSORPTION IN THE LAYING HEN Abstract: The calcium metabolism of the laying hen is a very intensive process because of the continuous egg shell formation during the egg production cycle. Internal regulation of that process is well known but there is only limited information about the hormonal effects which regulate the intestinal absorption of calcium. Purpose of the investigation was to establish the effect of different sexual steroid hormone secretion of the laying hen in different stages of egg shell formation on the calcium absorption from the different parts of small intestine and whether those effects can be provoked with hormonal treatments in laying hen with inactive ovary? Results show that progesterone is characterized by the most marked changes during the egg shell formation and parallel with that the rate of calcium absorption also changes, particularly from the duodenum. The changes of the rate of calcium absorption, as the effect of long-term sexual steroid treatment in laying hens with inactive ovary, also mainly from the duodenum, were observed too. In that case the most marked effect of progesterone was also found. Based on these results it can be stated that the rate of calcium absorption – beside other factors – mostly affected by the level of progesterone secretion in the laying hen.
Keywords: laying hen, calcium absorption, sexual steroids, progesterone 34
A Baromfi VIII. évf. 2005/1.
1. Bevezetés A madarak szaporodásbiológiájában különleges szerepet tölt be a progeszteron. Semmi kétség nincs afelől, hogy részt vesz a szaporodás szabályozásában, de kezdve a szintézishelytől a hatáshelyig, több probléma is felvetődik. Először is a madarakban hiányzik az emlősökre jellemző sárgatest, mely ott egyértelműen a szintézis helye, ugyanakkor a vérplazmában tapasztalható jelentős változásokat többen kimutatták a szaporodás ciklusváltozásaitól függően (Muray et al., 1980; Mézes és Lencsés,1985). A bioszintézis helyéül általában a nagy nyeles tüszők granulosa sejtjeit jelölik meg. Ugyancsak közismert, hogy a posztovulációs calixban, az ovuláció után, a későbbi degenerációs folyamatokat megelőzik a granulosa sejtek proliferatív változásai, melynek további progeszteronszintézis lehet a következménye (Gilbert és Wood-Gush, 1971) Továbbá az sem kétséges, hogy a progeszteron részt vesz a petevezető morfológiai és funkcionális alakításában (Lencsés, 1976). A tojótyúkok sajátos kalcium-anyagforgalmának is könyvtárnyi az irodalma. Példaként említhetjük a follikuláris csontnak is nevezett medulláris csont kialakulását (Simkiss, 1967). Az elnevezés azt jelzi, hogy a szexuálhormonok fő szexuális hatásukon kívül egyéb, például a kalcium-anyagforgalomra kifejtett szereppel is rendelkeznek, hiszen a folyamatos tojáshéjképzéshez szükséges mésztartalékok biztosítása a bélcsatornából történő fokozott mértékű felszívódás és a csontokban való raktározás nélkül elképzelhetetlen. Bizonyított tény az is, hogy a tojásképzés napi ritmusa hatással van a csontból történő, ugyancsak fluktuáló kalcium-mobilizációra (Taylor et
al., 1971; Lencsés, 2001). A csontokból történő kalciummobilizáció mellett mások a tojótyúkban intenzív bélfali és uterinális kalciumkötő fehérje (CaBP vagy kalbindin) szintézisét mutatták ki, amely véleményük szerint csak részben áll a D-vitamin derivátumok kontrollja alatt (Striem és Bar, 1991). Vizsgálataink célja a fentiek alapján azon feltételezésünk bizonyítása volt, mely szerint a tojáshéjképzés során bekövetkező hormonális változások befolyásolják a felszívódás mértékét is, melyben szerepet játszhat a változó progeszteron-szekréció is.
2. Anyag és módszer A kísérleti állatok kiválasztása és csoportosítása
Egy szokásos ketreces tartástechnológiával rendelkező tojástermelő istállóból, abban az időszakban, amikor a tyúkok átlagos tojástermelése már 50% alatt volt (közvetlenül a selejtezés előtt) számos tyúknál per cloacam ellenőriztük a nemi szervek állapotát, ill. a tojásképzés pillanatnyi helyzetét. Ennek megfelelően csoportosítottuk az állatokat a következőképpen: Inaktív: a petefészek és a petevezető már sorvadt. Aktív: a petefészek fürtös szerkezetű, a petevezető erőteljesen proliferált, de benne tojás nem tapintható. Lágy: az isthmusban (szoros) lágy héjú tojás tapintható, illetve a megfigyelés után 2 órával már a héjmirigyben volt tapintható a lágy héjú tojás. Meszesedő: az előbbi csoportba válogatott tyúkok közül többet meghagytunk, majd 8 órával később újra ellenőriztük a tojás állapotát. Ekkor a héj vékony, könnyen törő, repedő volt, azaz a meszesedés még nem fejeződött be.
Kemény: az előbbi csoportba válogatott tyúkok közül néhányat újra meghagytunk. 10 órával későbbi, ismételt ellenőrzéskor kemény héjú, ovipositiora alkalmas tojást találtunk a héjmirigyben. Hormonvizsgálatok
Az állatokat cervicalis dislocatiot követően elvéreztettük, illetve utólag újfent ellenőriztük a nemi szervek állapotát és a tojásképzés szakaszát. A progeszteron meghatározása dietiléteres extrakció után történt. A meghatározáshoz humán diagnosztikai célra kifejlesztett I125 -progeszteron radio-immunoassy (RIA) készletet alkalmaztunk (MTA Izotóp Intézete, Budapest). A jelölt antigén I125 – progeszteron–11–α–szukcinil–TME volt. A mérés során az intraassay koefficiens 6,72%, az interassay koefficiens 9,46% volt. A tesztoszteron meghatározása szintén dietiléteres extractió után történt. A meghatározásokhoz ebben az esetben is humán diagnosztikai célra kifejlesztett I125 – tesztoszteron–RIA készletet (MTA Izotóp Intézete, Budapest) alkalmaztunk. A jelölt antigén ebben az esetben I125 -tesztoszteron-3-karboxi-metiloxim volt. A mérés során az intraassay koefficiens 8,14%, az interassay koefficiens 11,4% volt. A 17–β–ösztradiol hormon meghatározásra humán diagnosztikai célra kidolgozott ”direkt assay”-t alkalmaztunk, ahol közvetlenül a vérplazmából – és nem annak extraktumából – történt a mérés. A kapott értékek emiatt némiképp magasabbak voltak az irodalmi átlagnál, a baromfi vérplazma-fehérjék magasabb nem specifikus I125 kötési reakciója miatt. A mérésekhez H3–17–β–ösztradiol készletet (Serono, Uppsala) alkalmaztunk. A jelölt antigén 2,4,6,7,16,17-H3 -ösztradiol volt. Az intraassay koefficiens 9,14%
35
B aromfitudomány A Baromfi VIII. évf. 2005/1.
volt, míg ebben az esetben interassay koefficiens mérés nem történt. Kalciumfelszívódási vizsgálatok
A korábban meghatározott elvek szerint újabb egyedeket válogattunk ki, ekkor a válogatás fő szempontja az volt, hogy itt is legyen inaktív, aktív, lágy, meszes, kemény jelzésű csoport, úgyszintén 10–10 egyeddel. A módszer elvében azt az eredeti, Verzár (1935) által kidolgozott módszert követi (cit. Ludány, 1955), amelyet Radwan (1980) baromfi ásványianyag-forgalmának vizsgálatára módosított. Ennek lényege, hogy egy meghatározott bélszakaszból történő ásványianyag felszívódását vizsgálja élő állatban, in situ feltételek között. Az altatás kloralóz– uretán 1:7 arányú keverékének intravénás adagolásával történt. A narkózis beállta után a hasfal tollait eltávolítottuk, majd a linea alba mentén kb. 3–5 cm hosszan átmetszettük a teljes bélfalat. A vékonybeleket ideiglenesen kiemeltük, majd az anatómiai bélyegek alapján elkülönítettük rajta a duodenumot, jejunumot és az ileumot (Fehér, 1980). A teljes bélszakaszt 39°C-os fiziológiai oldattal átöblítettük, majd az átöblítést elvégeztük az elkülönített bélszakaszokkal külön-külön is, mind orális, mind aborális irányban úgy, hogy közben bejuttattuk a vizsgálandó Ca(H2PO4) 2 oldatot, amely 8mg/ml kalciumot tartalmazott. Ebből az oldatból 2 ml-t adtunk a duodenumba, 5 ml-t a jejunumba és 4 ml-t az ileumba (azaz kb. 1ml/10cm bélszakasz). A bélszakaszokat eredeti helyzetükbe raktuk vissza (in situ), majd a hasfalat ideiglenesen lezártuk. Ezt követően ellenőriztük az állatok testhőmérsékletét, és a műtőasztal melegítésével igyekeztük elkerülni a hypothermiát. Pontosan 60 perc „fel-
36
szívódási idő” elteltével a hasfalat újra felnyitottuk, a bélszakaszokat kiemeltük, majd a lekötéseket külön–külön átvágtuk. A még bélben lévő oldatot többször átmostuk desztillált vízzel, majd szűrés után 100 ml-re hígítottuk. Ebből az oldatból meghatároztuk a visszamaradt kalcium mennyiségét. Kalciumtartalom meghatározása
A módszer elve az, hogy lúgos közegben (pH=12-13) titráljuk a minta Ca-tartalmát, Patton–Reeder reagens mellett borvörösből égszínkékbe való átcsapásig. Ugyanígy jártunk el a 10 mg% Ca–tartalmú standard oldattal (Sajó, 1973) Hormonkezelések
A tojástermelési időszak végén a fent meghatározott elvek szerint olyan egyedeket választottunk ki, amelyekben mind a petefészek, mind a petevezető sorvadt volt, azaz a tojótyúkokat szexuálisan inaktívnak tekinthettük. Az állatokból 4 csoportot alakítottunk ki olyan módon, hogy mindegyik csoportba 20–20 egyed kerüljön. Az állatokat a továbbiakban ketrecekben tartottuk (10 tyúk/m2), természetes megvilágítás mellett. Takarmányuk kereskedelmi forgalomban lévő tojótáp volt, amely ad libitum állt az állatok rendelkezésére, csakúgy, mint az ivóvíz. A kezelést egy hónapon át folytattuk úgy, hogy a hormonkészítményeket minden második nap felváltva a kétoldali comb- ill. mellizomba fecskendeztük intramuscularisan, az egyenletesebb felszívódás érdekében. Hormonkészítményként ösztradiolpropionátot (Akrofollin inj., Richter G. Rt., Budapest), progeszteront (Glanducorpin inj., Richter G. Rt.., Budapest), illetve tesztoszteronfenilpropionátot (Retandrol inj., Richter
G. Rt., Budapest) alkalmaztunk. A készítményeket a megfelelő dózis érdekében steril napraforgó olajban (Gyógyszerészeti Központ, Budapest) hígítottuk. A kezelések során az egyes csoportok alkalmanként az alábbi kezelésekben részesültek: 1. csoport: 1,5 mg/kg ttm. ösztradiol, 2. csoport: 1 mg/kg ttm. ösztradiol + 0,5 mg/kg progeszteron, 3. csoport: 1 mg/kg ttm. ösztradiol + 0,5 mg/kg tesztoszteron, 4. csoport: 1ml/tyúk steril napraforgó olaj (kontroll). Az eredmények statisztikai értékelése
Az egyes csoportokban és egyes paraméterek tekintetében mért értékeket Student féle „t” teszttel, valamint variancia analízissel (ANOVA) hasonlítottuk össze MS Excel 7.0 programcsomag segítségével.
3. Eredmények Szexuálszteroid hormonszintek változása a vérplazmában a tojáshéjképzés alatt
A vérplazmában mért hormonszintváltozásokat az 1. ábrán mutatjuk be. Látható, hogy a 17-β ösztradiol tartalom a „sorvadt” csoportban volt a legalacsonyabb, amely mérsékelt emelkedés után a „lágy” csoportban éri el maximumát, majd innen újra deklinál a „kemény” csoport értékéig. Az egyes csoportok között mért eltérések statisztikailag is követhetők voltak: sorvadt/aktív (P<0,001), aktív/ lágy (P<0,05), míg a lágy/meszes illetve a meszes/kemény csoportok közötti eltérés statisztikailag nem volt szignifikáns (P>0,05). A vérplazma progeszterontartalma a szexuálisan
A Baromfi VII. évf. 2004/4.
1. ábra
Hormonszintek a héjmeszesedés alatt
1. táblázat Kísérleti csoportok
A kalcium-felszívódás mértéke az egyes bélszakaszokból a héjkalcifikáció alatt Doudenum
Jejunum
Ileum
Kalcium-felszívódás mértéke (%)
Sorvadt
35
29
80
Aktív
89
41
91
Lágy
89
68
84
Meszes
94
82
93
Kemény
89
41
91
2. táblázat
A variancia eredete
A héjkalcifikáció állapota és az egyes bélszakaszokban mért kalcium-felszívódás közötti kapcsolat variancia értéke Szabadságfok
F érték
A bélszakaszok között (B)
2
114,3**
A héjképzés állapota között (H)
4
84,5**
Interakció B*H
8
19,98**
Hiba
45
Szignifikancia szint: **=P≤0,01
inaktív (sorvadt) csoporthoz képest a tojásképzés első szakaszában, az „aktív” és a „lágy” csoportok esetében még alacsonyabb, majd a „meszes” csoportban rendkívül magas értéket mutat, amelyet a „kemény” csoportban újra alacsonyabb érték követett. Az egyes csoportok között mért eltérések statisztikailag a következők voltak: sorvadt/aktív (P<0,05), aktív/lágy (P>0,05), lágy/meszes (P<0,01), illetve meszes/kemény (P<0,01). A vérplazma tesztoszteron-tartalma az élettani határértékeken belül alig változott az egyes csoportok között. Kalcium-felszívódási vizsgálatok a vékonybél egyes szakaszaiból
A tojáshéj-meszesedés különböző szakaszaiban lévő állatokban elvég-
37
B aromfitudomány A Baromfi VIII. évf. 2005/1.
2. ábra
A kalcium-felszívódás mértéke az egyes bélszakaszokból a héjkalcifikáció alatt (%)
3. táblázat
Kezelések
Szexuálszteroid kezelések hatása a kalcium felszívódására a vizsgált bélszakaszokból Duodenum
Jejunum
Ileum
Kalcium-felszívódás mértéke (%) Kontroll
40
71
61
Ösztrogén
70**
90**
82**
Ösztrogén+Progeszteron
75**
97**
89**
Ösztrogén+Tesztoszteron
72**
90**
86**
Szignifikancia - a kontroll csoporthoz viszonítva: **=P≤0,01
zett kalcium-felszívódási vizsgálatok eredményeit az 1. táblázatban mutatjuk be. A kalcium-felszívódás legmagasabb értékét a „meszes” csoportban, míg a legalacsonyabb értéket a „sorvadt” csoportban tapasztaltuk. Az „aktív”, a „lágy” és a „kemény” csoportba sorolt állatoknál mért felszívódási értékek a fenti két szélső érték közé estek. A varianciaanalízis eredményeiből (2. táblázat) kiderült, hogy mind az egyes bélszakaszok eltérő kalcium-
38
abszorpciós kapacitása, mind a tojásképzés pillanatnyi állapota szignifikáns mértékben hat a kalcium-felszívódás mértékére, de jelentős e két élettani tényező interakciójának hatása is. A bélszakaszokat külön–külön is vizsgálva megállapítható, hogy a felszívódás mértéke mindhárom bélszakaszban a „meszes” csoportban volt a legmagasabb, míg a legalacsonyabb értékeket a „sorvadt” csoport egyedeiben mértük (2. ábra).
A
kalcium
változása
felszívódásának hormonkezelések
hatására
A kalcium felszívódásának mértékét az egyes bélszakaszokból az inaktív petefészekkel rendelkező tojótyúkok egy hónapig tartó hormonkezelésének hatására a 3. táblázatban és a 3. ábrán mutatjuk be. Szembetűnő, hogy a vizsgált vékonybél-szakaszok összértékét tekintve a kalcium-felszívódás mértéke a legalacsonyabb a kezelet-
A Baromfi VIII. évf. 2005/1.
3. ábra
Szexuálszteroid kezelések hatása a kalcium felszívódására a vizsgált bélszakaszokból
len csoportban, emelkedett ugyanakkor a szexuálszteroid hormonkezelésben részesült csoportokban. Az egyes bélszakaszok felszívó kapacitása sem egyforma, a legalacsonyabb értékeket a duodenumban, míg a legmagasabbakat a jejunumban mértük. A bélszakaszok között mért felszívódásbeli eltérések szignifikánsak (P<0,01) voltak. Különösen nagy volt az eltérés az
„ösztrogén + progeszteron” kombinált kezelésben részesült csoportban.
4. Az eredmények értékelése
nos időtengelyre vetítjük, az emelkedett progeszteronszinttel együtt növekedik a kalciumfelszívódás mértéke is, amelynek fő támadási pontja az a jejunum, ahol más szerzők a fokozott CaBP-szintézist is kimutatták (Striem és Bar, 1991). A szexuálhormon kezelések során megfigyelhető, hogy a legnagyobb mértékű felszívódást az ösztrogén/ progeszteron kombinált kezelés idézte elő, szintén elsősorban a jejunumban. A fentiek alapján úgy gondoljuk, hogy kísérleteink – bár egyelőre csak közvetett módon – bizonyítják, hogy a szexuálhormonoknak, azon belül is a progeszteronnak kitüntetett hatása van tojótyúkokban a fokozott kalciumfelszívódás mértékére.
A vizsgálat eredményei alapján jól látható, hogy amennyiben a héjkalcifikáció alatti történéseket azo-
Irodalomjegyzék Fehér Gy. (1980) A háziállatok funkcionális anatómiája. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest Gilbert, A.B. and Wood-Gush, D.G.M. (1971) Ovulatory and ovipository cycles. In: Bell, D.J. and Freeman, B.M.(eds.): Physiology and biochemistry of the domestic fowl. Academic Press, New York Lencsés Gy. (1976) Morphological changes during shell formation. Anat. Hist. Embriol. 5:173. Lencsés Gy. (2001) A tojótyúk kalcium és foszfor anyagforgalmának vizsgálata különböző módszerekkel. PhD értekezés. Szent István Egyetem, Gödöllő Ludány Gy. (1955) A gyomor- bélhuzam működésének vizsgálati módszerei. In: Kovách A. (szerk.): A kísérletes orvostudomány vizsgáló módszerei. III. kötet Akadémiai Kiadó, Budapest, Mézes M. and Lencsés Gy. (1985) Changes in vitamin E and lipid-peroxide status in the laying hen during egg-shell formation. Acta Vet. Hung. 33:33-39. Muray T., Pethes Gy., Péczely P. (1980) Changes of plasma progesterone and testosterone level in chicken (Gallus domesticus): from the first day of life to the beginning of oviposition. Acta Vet. Hung. 28: 97-112. Radwan, A. El-Soad (1980) Study of calcium absorption and metabolism in poultry. Kandidátusi értekezés. MTA, Budapest Striem, S. and Bar, A. (1991) Modulation of quail intestinal and egg shell calbindin (Mr 28,000) gene expression by vitamin D3, 1,25dihydroxyvitamin D3 and egg laying. Mol. Cell Endocrinol. 75:169-177. Taylor T.G., Simkiss K., Stringer B. (1971) The skeleton: its sturucture and metabolism. In: Bell, D.J. and Freeman, B.M. (eds): Physiology and Biochemistry of the domestic fowl. Academic Press, New York Sajó I. (1973) Komplexometria. Műszaki Kiadó, Budapest Simkiss, K. (1967) Calcium in reproductive biology. Chapman and Hall, London
39
