Doktori értekezés
A miokardium intracelluláris kalcium homeosztázisa: iszkémiás és kardiomiopátiás változások
Dr. Szenczi Orsolya
Témavezető: Dr. Ligeti László Klinikai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézet, Budapest, 2005 Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Pavlik Gábor, tagok: Dr. Kékesi Violetta, Dr. Hamar János Hivatalos bírálók: Dr. Kékesi Violetta, Dr. Hamar János
TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK ................................................................................................2 RÖVIDÍTÉSEK ............................................................................................................5 1 IRODALMI ÁTTEKINTÉS .....................................................................................8 1.1 A kalcium tranzienst létrehozó mechanizmusok.................................................8 1.1.1 A kalcium felszabadulás mechanizmusa és szabályozása.........................8 1.1.1.1 A „Ca2+-spark”-ok kialakulása....................................................8 1.1.1.2 A kalcium felszabadulás szabályozása ........................................9 1.1.2 A kalcium szerepe a szívizom kontrakciós-relaxációs folyamatában...... 10 1.1.3 A kalcium szekvesztrálódás mechanizmusa és szabályozása.................. 10 1.1.3.1 A szarkoplazmatikus retikulum Ca2+-pumpája .......................... 10 1.1.3.2 A Na+/Ca2+ csereranszporter ..................................................... 11 1.1.3.3 A Ca2+-ATP-áz pumpa ............................................................. 11 1.1.3.4 A mitokondriális Ca2+-uniporter ............................................... 12 1.1.3.5 Az Ca2+i pufferolása ................................................................. 12 1.2 A kalcium szerepe a szívizom kontraktilitásának homeometriás szabályozásában ........................................................................................................................ 13 1.2.1 A szimpatikus idegrendszer szerepe ...................................................... 13 1.2.1.1 A β1-adrenerg receptorok.......................................................... 13 1.2.1.2 Az α1-adrenerg receptorok ........................................................ 14 1.2.2 A nitrogén-monoxid szerepe.................................................................. 15 1.3 A kalcium túlterhelés kialakulása és következménye ....................................... 16 1.3.1 A degeneratív enzimek aktiválódása...................................................... 16 1.3.2 A mitokondriumok károsodása .............................................................. 17 1.3.3 Az ingerképzés és vezetés zavara .......................................................... 17 1.4 A kalcium hiány és következményei ................................................................ 18 1.5 A kalcium homeosztázis zavara speciális kórképekben .................................... 18 1.5.1 A szívizom iszkémiás/reperfúziós károsodása ....................................... 18 1.5.1.1 Az iszkémia.............................................................................. 19 1.5.1.2 A reperfúzió ............................................................................. 20 1.5.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia ................... 22 1.5.2.1 A funkciózavar kialakulásának feltételezet mechanizmusai....... 22 1.6 Az iszkémiás/reperfúziós és kardiomiopátiás állapotok ellen védő mechanizmusok – a HS előkezelés, valamint a poli(ADP-ribóz) polimeráz gátlása ............................................................................................................. 24 1.6.1 Az iszkémiás/reperfúziós károsodással szembeni védelem – a hősokk kezelés .................................................................................................. 24 1.6.1.1 A hősokk előkezelés védőhatása ............................................... 24 1.6.1.2 A HS kezelést követő védőhatás kialakulásának feltételezett mechanizmusa .......................................................................... 25 1.6.1.3 Terápiás lehetőségek................................................................. 31 1.6.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia – a poli(ADPribóz) polimeráz (PARP) szerepe .......................................................... 32 1.6.2.1 A PARP szerkezete................................................................... 32
2
1.6.2.2 A PARP funkciója .................................................................... 33 1.6.2.3 A PARP túlaktiválódása ........................................................... 34 1.6.2.4 A PARP gátlása........................................................................ 34 2 CÉLKITŰZÉSEK .................................................................................................. 36 3 MÓDSZEREK ....................................................................................................... 37 3.1 Felhasznált állatok ........................................................................................... 37 3.2 Langendorff-készítmény.................................................................................. 37 3.3 Fluoreszcens mérés.......................................................................................... 39 3.4 Statisztika........................................................................................................ 42 3.5 A hősokk előkezelést követő iszkémiás/reperfúziós károsodás vizsgálata ........ 42 3.5.1 A hősokk előkezelés.............................................................................. 42 3.5.2 A perfúziós protokoll............................................................................. 42 3.5.3 A HSP70 meghatározása ....................................................................... 43 3.6 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia vizsgálata ............. 43 3.6.1 Kardiomiopátia előidézése..................................................................... 43 3.6.2 Perfúziós protokoll ................................................................................ 44 4 EREDMÉNYEK .................................................................................................... 45 4.1 A hősokk előkezelést követő iszkémiás/reperfúziós károsodás vizsgálata ........ 45 4.1.1 A miokardium HSP70 tartalma.............................................................. 45 4.1.2 A szív mechanikai teljesítménye............................................................ 45 4.1.3 A vég-diasztolés Ca2+i-szint................................................................... 47 4.1.4 Az Ca2+i-tranziens ................................................................................. 47 4.1.5 Az Ca2+ iránti érzékenység .................................................................... 48 4.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia vizsgálata ............. 54 4.2.1 A szív mechanikai teljesítménye............................................................ 54 4.2.2 A vég-diasztolés Ca2+i-szint................................................................... 55 4.2.3 Az Ca2+i-tranziens ................................................................................. 55 4.2.4 A Ca2+ iránti érzékenység...................................................................... 55 5 MEGBESZÉLÉS.................................................................................................... 62 5.1 A hősokk előkezelést követő iszkémiás/reperfúziós károsodás vizsgálata ........ 62 5.1.1 A szív hemodinamikai tevékenysége ..................................................... 63 5.1.2 A vég-diasztolés Ca2+i-szint................................................................... 63 5.1.3 Az Ca2+i-tranziens ................................................................................. 64 5.1.4 A Ca2+ iránti érzékenység...................................................................... 65 5.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia vizsgálata ............. 66 5.2.1 A szív hemodinamikai tevékenysége ..................................................... 67 5.2.2 A vég-diasztolés Ca2+i-szint................................................................... 67 5.2.3 Az Ca2+i-tranziens ................................................................................. 68 5.2.4 A Ca2+ iránti érzékenység...................................................................... 69 5.2.5 A kardiomiopátia progressziója ............................................................. 69 6 KÖVETKEZTETÉSEK.......................................................................................... 70
3
7 KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS ................................................................................. 72 8 IRODALOMJEGYZÉK ......................................................................................... 73 9 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ................................................................. 90 10 ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................... 92 11 SUMMARY ........................................................................................................... 94
4
RÖVIDÍTÉSEK ±dCa2+/dtmax
a
Ca2+-felszabadulás és
szekvesztrálódás
maximális
sebessége ±dP/dtmax
a bal kamrán belüli izovolumetriás nyomásnövekedés és csökkenés maximális sebessége
·O2-
szuperoxid anion
·OH-
hidroxil anion
ADPR
adenozin-difoszfát-ribóz
ATP
adenozin-trifoszfát
Ca2+i
intracelluláris szabad kalcium
Ca2+SR
intraszarkoplazmatikus kalcium
cAMP
ciklikus adenozin-monofoszfát
CB2
2-es típusú kannabinoid receptor
CF
koronária áramlás
CO
szén-monoxid
COX-2
ciklooxigenáz-2
DAG
diacil-glicerol
DNS
dezoxi-ribonukleinsav
DOX
doxorubicin
eNOS
endoteliális nitrogén-monoxid szintáz
FKBP12.6
immunofilin FK506-kötő fehérje
GRP
glukóz-regulált fehérje
GTP
guanozin-trifoszfát
H2 O2
hidrogén-peroxid
HO-1
hem-oxigenáz-1
HS
hősokk
HSF
hősokk faktor
5
HSP
hősokk fehérje
I/R
iszkémia/reperfúzió
ICa
az L-csatornákon beáramló Ca2+-áram
INDO
indometacin
iNOS
indukálható nitrogén-monoxid szintáz
IP3
inozitol-1,4,5-triszfoszfát
KATP-csatorna
ATP-függő kálium csatorna
Kd
disszociációs konstans
MAPK
mitogén aktivált protein kináz
mRNS
messenger ribonukleinsav
NA
nikotinsavamid
NAD(H)
nikotinsavamid-adenin-dinukleotid (redukált)
NADP(H)
nikotinsavamid-adenin-dinukleotid foszfát (redukált)
NCX
Na+/Ca2+ cseretranszporter
NF-ĸB
nukleusz faktor-ĸB
NO
nitrogén-monoxid
nNOS
neuronális nitrogén-monoxid szintáz
ONOO-
peroxinitrit
PARP
poli(ADP-ribóz) polimeráz
PIP2
foszfatidilinozitol-4,5-difoszfát
PJ34
[N-(6-oxo-5,6-dihydrophenanthridin-2-yl)-N,Ndimethylacetamide.HCl], PARP gátló vegyület
PKC
protein kináz C
PLC
foszfolipáz C
Plv
balkamrai nyomás
Rmin és Rmax
nulla és telített Ca2+-koncentráció melletti fluoreszcens jelek hányadosa
ROS
reaktív oxigén gyökök
6
RyR2
szívizom specifikus rianodinreceptor
SD
standard deviáció
SERCA2a
SR Ca2+-ATP-áz pumpája
SR
szarkoplazmatikus retikulum
Vmax
SERCA2a maximális transzport sebessége
7
1
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
1.1 A kalcium tranzienst létrehozó mechanizmusok 1.1.1 A kalcium felszabadulás mechanizmusa és szabályozása 1.1.1.1 A „Ca2+-spark”-ok kialakulása A szívizomsejtben kialakuló intracelluláris kalcium szignál döntő szerepet játszik a szívizom kontrakciójának létrejöttében. A szívizom kontrakciójához szükséges intracelluláris szabad kalcium (Ca2+i) döntő többsége a szarkoplazmatikus retikulumból (SR) szabadul fel (37). Ezt a folyamatot a membránban lévő, feszültség függő, L típusú kalcium (Ca2+) csatornákon keresztül beáramló Ca2+ (ICa) idézi elő (18,94). Ezek a csatornák a szarkolemma betüremkedéseiben, a sejt tengelyére merőleges transzverzális tubulusokban helyezkednek el, a Z-vonal és egyúttal a SR közelében (15). A csatornák nyílásával a SR közelében megemelkedik a lokális Ca2+-koncentráció, amely a SR rianodinérzékeny
Ca2+-csatornáit,
a
rianodinreceptorokat
aktiválja.
A
rianodinreceptoroknak három izoformja ismert: a vázizomban található RyR1 (160,180), a szívizomban levő RyR2 (114,121) és az agyban, vázizomban és simaizomban működő RyR3 (22,54). Az egyes rianodinreceptor molekulák egymástól térben elszeparáltak, aktiválódásuk és a rajtuk keresztül kiáramló Ca2+ mennyisége a közvetlen környezetükben levő intracelluláris miliő függvénye (174). Az individuális RyR2 receptorokon keresztül felszabaduló úgynevezett „Ca2+-spark”-ok, azaz Ca2+szikrák, a SR spontán kialakuló elemi jelensége (23). Ugyanakkor a sejt depolarizációja és ennek következtében az L típusú Ca2+-csatornák nyílása szintén kiváltja a Ca2+szikrákat. Annak ellenére, hogy a Ca2+-szikrák eredete és pontos mechanizmusa még nem teljesen tisztázott, feltételezhető, hogy a SR-ból kis csoportokban felszabaduló Ca2+ térbeli és időbeli szummációja alakítja ki a szisztolé során mért Ca2+i-tranzienst. Ezt a Ca2+-indukálta Ca2+-felszabadulást tekintik a szívizomban kialakuló excitációskontrakciós kapcsolás lokális mechanizmusának (12,153,174).
8
1.1.1.2 A kalcium felszabadulás szabályozása A SR-ból történő Ca2+-felszabadulás legfontosabb triggere a már említett ICa áram, a Ca2+-felszabadulás
helyi
szabályozásában
azonban
feltételezhetően
egyéb
mechanizmusok is szerepet játszhatnak (174). A szarkolemma feszültségfüggő és magas intracelluláris
Na+-koncentráció
mellett
reverz
módban
üzemelő,
Na+/Ca2+
cseretranszporterén (NCX) (90), valamint a szarkolemma T-típusú Ca2+-csatornáján kis mennyiségű Ca2+ áramlik a sejtbe (147). A T-típusú Ca2+-csatornákon a sejtbe irányuló Ca2+-áram az L-típusú Ca2+-csatornáknál alacsonyabb hatékonysággal vált ki Ca2+szikrákat. A Na+/Ca2+ cseretranszporter reverz módú működése nem vált ki Ca2+szikrákat, ennek ellenére valószínű, hogy ez a mechanizmus állítja be a lokális Ca2+koncentráció emelésével a szív RyR2 receptorainak ICa árammal szembeni érzékenységét. A RyR2 receptorokon keresztül létrejövő Ca2+-felszabadulást extra- és intralumenális tényezők, így a receptorokhoz kötődő kinázok: protein kináz A és Ca2+kalmodulin-függő protein kináz (165) valamint regulátor fehérjék: kalszekvesztrin (53), sorcin (107) és az FK506-kötő FKBP12.6 fehérje (102) szabályozzák. A SR-ban levő Ca2+-koncentráció (Ca2+SR) csökkenésével egyidejűleg a RyR2 konduktanciája is csökken,
míg
a
Ca2+SR-koncentráció
emelkedésével
párhuzamosan
RyR2
konduktanciája is fokozódik. Valószínűnek látszik, hogy az Ca2+SR-változásainak érzékelésében a RyR2 receptorhoz kötődő kalszekvesztrin játssza a központi szerepet. Alacsony Ca2+SR-koncentráció esetén a kalszekvesztrin/triadin/junkcin komplex a RyR2 receptorhoz kötődik és gátolja a RyR2 konduktanciáját. A Ca2+SR-szint emelkedésekor a kalszekvesztrin Ca2+-t köt, amelynek során a kalszekvesztrin/triadin/junkcin komplex közötti interakció csökken és a csatorna konduktanciája egyre fokozódik. A RyR2 csatorna maximális konduktanciáját a kalszekvesztrin disszociációja után éri el (53). A kalszekvesztrin mellett a sorcin nevű Ca2+-kötő fehérjének is feltételezett szerepet tulajdonítanak
a
RyR2
receptoron
keresztül
létrejövő
Ca2+-felszabadulás
befolyásolásában. A sorcin a RyR2 receptorhoz kötődve gátolja a csatorna megnyílását. Ez a gátló hatás a sorcin protein kináz A által létrejövő foszforilációja során szűnik meg (107). Az FKBP12.6 nevű regulátorfehérje a RyR2 receptorhoz kötődve stabilizálja a receptor zárt állapotának konformációját, ezzel megakadályozza a diasztolé alatti Ca2+szivárgást. A RyR2 aktivitása újraindul, illetve fokozódik, amikor a regulátorfehérjét protein kináz A foszforilálja, és az FKBP12.6 leválik a RyR2 receptorról. Valószínű,
9
hogy az FKBP12.6 a RyR2 Ca2+ iránti érzékenységét is befolyásolja. Alacsony FKBP12.6 koncentráció mellett ugyanis a RyR2 sokkal érzékenyebb az Ca2+i iránt, mint magas koncentrációnál (76,102).
1.1.2 A kalcium szerepe a szívizom kontrakciós-relaxációs folyamatában Az excitációs-kontrakciós kapcsolás folyamata során a sejtben megemelkedett Ca2+i a troponin C-hez kötődve indítja be és tartja fenn a kontraktilis fehérjék összehúzódását, a kontrakció kialakulását. A szarkomerekbe rendeződött vastag (miozin) és vékony (aktin) filamentumok egymáson való elcsúszásának előfeltétele, hogy kölcsönhatásba lépjenek egymással, úgynevezett kereszthidak alakuljanak ki közöttük. Ezt a kapcsolatot a mioplazma megemelkedett Ca2+i-koncentrációja tartja fenn azáltal, hogy az aktinhoz kapcsolódó troponin-tropomiozin komplex Ca2+i-t kötve olyan konformációváltozáson megy keresztül, hogy az aktin miozinkötő helyei a miozin számára hozzáférhetővé válnak. A depolarizácó befejeztével valamint a repolarizáció kezdetével azonban az Ca2+i-koncentráció lecsökken. Megszűnik a sejtbe irányuló ICa és a következményes Ca2+-felszabadulás a SR-ból, és túlsúlyba kerülnek az Ca2+i-ot a mioplazmából eltávolító folyamatok. Ezeknek a folyamatoknak az eredője a diasztolé során detektálható Ca2+i-tranziens. A csökkenő Ca2+i-szint következtében a Ca2+ disszociál a troponin C-ről, a kontraktilis fehérjék közötti kereszthidak felbomlanak, a filamentumok szétkapcsolódnak, létrejön a relaxáció (119).
1.1.3 A kalcium szekvesztrálódás mechanizmusa és szabályozása 1.1.3.1 A szarkoplazmatikus retikulum Ca2+-pumpája Az Ca2+i döntő többsége (emberben 75%, nyúlban 70%, patkányban 92%) a SR-be jut vissza, a SR Ca2+-pumpáján a SERCA-n, pontosabban SERCA2a-n keresztül, amely elnevezés a miokardiumban található izoformra utal (11). Az energiaigényes aktív transzport során egy adenozin-trifoszfát (ATP) molekula hidrolízise mellett két Ca2+ kerül mintegy 1000-szeres koncentráció grádiens ellenében a SR-ba, hiszen az SR-ben jelenlevő Ca2+SR-koncentráció néhány mM/l, ezzel szemben a mioplazmatikus szisztolés Ca2+i-koncentráció néhány µM/l (42). A folyamat azonban mégsem elektrogén, azaz a
10
látszólag nettó egyirányú ionmozgás nem vezet a SR membránjának két oldala közötti feszültségkülönbség kialakulásához. Ennek hátterében valószínűleg az áll, hogy a SR membránjában nagy permeábilitású K+ és Cl- csatornák helyezkednek el, amelyek lehetővé teszik más ionok kompenzáló mozgását. Ugyanezen ok miatt nem generál membránpotenciál változást a SR-ból kilépő nagy mennyiségű Ca2+ sem. A SR-ba visszapumpált Ca2+ kalszekvesztrinhez (43) és kalretikulinhoz (154) kötődve raktározódik a soronkövetkező depolarizációig. A SERCA2a Ca2+ iránti affinitását egy 27kDa molekula tömegű fehérje, a foszfolamban szabályozza. A SR membránjában elhelyezkedő fehérjét ciklikus adenozin-monofoszfát (c-AMP)-függő protein kináz A képes foszforilálni. A foszfolamban defoszforilált állapotban csökkenti a SERCA2a Ca2+ iránti affinitását. A foszforilálódás hatására a gátlás megszűnik (77,96,143). A SERCA2a aktivitását maga a Ca2+ is fokozza, mivel Ca2+-kalmodulin-függő protein kinázt aktivál, amely a pumpát foszforilálja. A foszforiláció eredményeként létrejött konformáció változás miatt a SERCA2a maximális transzport sebessége (Vmax) nő (115,163,176). Másrészt a Ca2+ direkt módon képes a SERCA2a konformációját megváltoztatni, aminek következtében a pumpa aktivitása nő (119).
1.1.3.2 A Na+/Ca2+ csereranszporter A szarkolemmában található NCX-en kifelé irányuló Ca2+-áram (emberben 25%, nyúlban 28%, patkányban 7%-ban) szintén hozzájárul a szívizom relaxációjához szükséges alacsony Ca2+i-szint visszaállításához. A Na+-gradienshez kapcsolt aktív transzport folyamat során három Na+ belépése mellett egy Ca2+ áramlik kifelé. A Ca2+itúlterheléssel járó patológiás folyamatok során a megemelkedett subszarkolemmális Ca2+-eltávolítás rajtuk keresztül valósul meg (119).
1.1.3.3 A Ca2+-ATP-áz pumpa A szarkolemmában, mint más sejtekben is, van Ca2+-ATP-áz pumpa. A SERCA2a-val összehasonlítva azonban olyan kis mennyiségben vesz részt a normál szívciklus alatti Ca2+i-eliminációban, hogy működése valószínűleg elhanyagolható. Ugyanakkor expressziójának és funkciójának tekintetében humán miokardiumból nyert adatok nem állnak rendelkezésre. Magas Ca2+i-szinttel járó kórképekben ill. fokozott katekolamin
11
stimuláció következtében a csatorna kalmodulin ill. cAMP közvetített foszforiláción megy keresztül, amelynek során aktivitása fokozódik (119).
1.1.3.4 A mitokondriális Ca2+-uniporter A
mioplazmából
történő
Ca2+-eltávolításhoz
elviekben
2+
hozzájárulhat
a
2+
mitokondriumokban működő Ca -uniporter. Ezen a csatornán keresztül a Ca facilitált diffúzióval jut a mitokondriumba, mivel a mitokondriális elektrokémiai protongrádiens negatív mitokondriális membránpotenciált tart fenn. Fiziológiás körülmények között azonban a Ca2+-eltávolítás ezen útja szintén jelentéktelen (119). A mitokondriális Ca2+transzport elsődleges feladata, hogy koordinálja a miokardiális ATP igény és ellátottság közötti egyensúly kialakulását (105).
1.1.3.5 Az Ca2+i pufferolása Az Ca2+i-tranziens kialakításában az imént említett Ca2+-pumpák működése mellett az Ca2+i-pufferek is részt vesznek. A SR-ból felszabaduló Ca2+i 99%-a pufferekhez kötődik. Az Ca2+i-pufferek elhelyezkedésüket tekintve lehetnek mobilisak, sejten belül bármerre szabadon diffundálók, mint pl. a kalmodulin vagy az ATP, illetve helyhez kötöttek, mint pl. a troponin C, a SERCA2a, a miozin, a szarkoplazma és a szarkolemma fopszfolipidjei. Ca2+-kötő képességük alapján gyors (kalmodulin, kalszekvesztrin) és lassú (troponin) valamint nagy és alacsony affinitású puffereket különböztetünk meg (108,134,149). Az Ca2+i-pufferek közül a szarkolemma Ca2+i-kötő helyei nagy kapacitással, de alacsony affinitással, míg a szarkoplazmás retikulum Ca2+i-kötő helyei, a troponin C és a kalmodulin kis kapacitással, de nagy affinitással kötik a kontrakciók során felszabaduló Ca2+i-t (6). A felszabaduló kalcium 1%-a citoplazmában, mint szabad Ca2+i van jelen. A szívizomsejtben található pufferek által létrehozott pufferkapacitás a kontrakció-relaxáció során nem állandó. Ha az Ca2+i-szint emelkedik, a citoplazma pufferkapacitása csökken, így a pufferekről a Ca2+ disszociál, az Ca2+i-szint tovább emelkedik. Ugyanakkor, ha az Ca2+i-szint csökken, a pufferkapacitás emelkedik, pufferekhez kötődő Ca2+ tovább csökkenti az Ca2+i-szintet. Mindebből az a következtetés vonható le, hogy a citoplazma pufferkapacitása is befolyásolja az Ca2+itranziens amplitúdóját, fel- és leszálló szárának meredekségét (36).
12
1.2 A kalcium szerepe a szívizom kontraktilitásának homeometriás szabályozásában A szívizomsejt kontrakciójának és relaxációjának alapfeltétele mioplazma Ca2+ikoncentrációjának ciklikus emelkedése és csökkenése, azaz az Ca2+i-tranziens kialakulása. Ugyanakkor az Ca2+i-koncentráció változása a miokardium kontrakciójának és relaxációjának a mértékét is meghatározza. Az összehúzódások erejét változatlan diasztolés rosthosszúság mellett főként az adrenerg stimuláció és a nitrogén-monoxid (NO) szabályozzák (homeometriás szabályozás). A két szignál transzdukciós folyamat sejten belüli regulátora az Ca2+i. Az inotrop és luzitrop hatások, (azaz a kontrakció és relaxáció mértéke) az Ca2+i-szint növekedésével ill. csökkenésével függenek össze. Az izomrostok diasztolés hosszúságának változása (a Frank-Starling és az erő-frekvencia mechanizmusok révén) szintén képes befolyásolni a szív mechanikai teljesítményét (heterometriás szabályozás) (76).
1.2.1 A szimpatikus idegrendszer szerepe 1.2.1.1 A β1-adrenerg receptorok A pozitív inotrop hatás kialakulása A szimpatikus idegrendszer elsősorban β1-adrenerg receptorokon keresztül fokozza a kontrakciót és a relaxációt. A pozitív inotrop hatás során katekolaminok kötődnek a β1adrenerg receptorokhoz, amelyek konformáció változáson mennek keresztül. Az aktivált receptor Gs-fehérjét köt, amely fehérje adenilát ciklázt aktivál. Az adenilát cikláz aktiválás során ATP-ből cAMP keletkezik. A megnövekedett cAMP szint proteinkinázokat aktivál, amelyek a szarkolemma Ca2+-csatornáit foszforilálják (16). Ennek következtében a szarkolemma L-típusú Ca2+-csatornáin keresztül fokozódik a Ca2+beáramlás az extracelluláris térből, az Ca2+i-tranziens amplitúdója megnő. A megemelkedett triggerkalcium hatására fokozódik a Ca2+-indukálta Ca2+-felszabadulás a SR-ből és megemelkedik az Ca2+i-koncentráció. Minthogy egy átlagos szisztolé alatti Ca2+i-koncentráció során a kontraktilis helyeknek csak a fele aktív, a szív rendelkezik egy bizonyos rezerv kapacitással. A megemelkedett Ca2+i-koncentráció következtében több troponin C képes Ca2+-t kötni, így nő az aktin-miozin kereszthidak száma, azaz a
13
feszülés mértéke. A β1-adrenerg receptor aktiváció cAMP képződés nélkül is fokozhatja a szarkolemma L-típusú Ca2+-csatornáit. Feltételezik, hogy ebben a folyamatban a szarkolemma Ca2+-csatornái közvetlenül aktiválódnak G-proteineken keresztül (73). A β1-adrenerg stimulus hatására létrejött aktív protein-kináz A a miozin könnyűláncát is foszforilálja, ezzel nő a miozin affinitása az aktin iránt, tehát a közöttük kialakuló keresztkötések száma tovább növekszik. Valószínűnek látszik, hogy a megemelkedett Ca2+i-koncentráció önmagában is előidézi a miozin könnyűlánc foszforilációját. Mindezek mellett a megemelkedett Ca2+i-koncentráció feltehetőleg a miozin ATP-áz aktivitást is fokozza, amely folyamat szintén hozzájárul a fokozott erőgeneráláshoz (119).
A luzitrop hatás kialakulása A β1-adrenerg receptorokon keresztül szabályozott luzitrop hatás alapja szintén a megemelkedett cAMP szint és következményes protein kináz A aktiválódás. Ennek eredményeképpen két egymással párhuzamos folyamat zajlik. Egyrészt, foszforilálódik a SR-ban található foszfolamban és megnő a SERCA2a aktivitás (lásd előbb). Ennek az a következménye, hogy fokozódik a Ca2+ visszavétele a SR-ba. Ugyanakkor a pozitív inotrop hatás során jelentős mértékben megemelkedett Ca2+i-koncentráció önmagában is fokozza a foszfolamban foszforilációját, ami szintén hozzájárul a β1-adrenerg receptor közvetített pozitív luzitrop hatáshoz. A másik β1-adrenerg receptor mediált luzitrop hatás a troponin I foszforilációja, amelynek következtében csökken a troponin C Ca2+ iránti affinitása. A Ca2+ disszociál a troponin C-ről, ez pedig a kontraktilis fehérjék, azaz az aktin és miozin molekulák között meglevő kereszthidak felbomlását segíti elő (119).
1.2.1.2 Az α1-adrenerg receptorok A szívizomban a szimpatikus idegrendszer az α1-adrenerg receptorokon keresztül megvalósuló Ca2+i-koncentrációt szabályozó hatása fiziológiás körülmények között csekély. Az α1-adrenerg receptor stimulálása során a receptor Gq-fehérjét köt, amely fehérje a szarkolemmában levő foszfolipáz C-t aktiválja. A foszfolipáz C a membrán foszfolipidjét alkotó foszfatidil-inozitolt két komponensre hasítja: inozitol-1,4,5triszfoszfátra (IP3) és diacil-glicerolra (DAG). Az IP3 a SR membránjában levő IP3
14
receptorokhoz kötődve Ca2+-kiáramlást indukál a mioplazmába. Az ily módon létrejött Ca2+i-koncentráció emelkedés miatt fokozódik a szívizom kontraktilitása. Szintén pozitív inotrop hatású az angiotenzin II vagy endotelin receptorok aktiválódása. A Ca2+ikoncentráció emelkedése, hasonlóan az α1-adrenerg receptor aktiváláshoz, foszfolipáz C aktiválás következtében nő meg (119).
1.2.2 A nitrogén-monoxid szerepe Valószínű, hogy a szívizom inotropiájának beállításában a NO is szerepet játszik, mint mediátor molekula. Feltételezik, hogy nem csak az ereket borító és az endokardiális endotéliumban, hanem az izomsejten belül is képződik NO. A szívben található NOszintáz izoformák térben egymástól elhatároltak. A kaveolákban elhelyezkedő endoteliális NO-szintáz (eNOS) aktivitás során keletkezett NO negatív luzitrop hatású, mivel csökkenti a β1-adrenerg aktivitásfokozódás miatt kialakuló pozitív inotrop és kronotrop hatást. Egyrészt, mint indirekt hírvivő kolinerg molekula, csökkenti az adrenerg aktivációt követő tachycardiát, másrészt az Ca2+i-koncentráció szabályozásával a kontrakció mértékét is képes befolyásolni. Az inotrop hatás hátterében valószínűleg a miofilamentumok cGMP által mediált csökkent Ca2+ iránti érzékenysége, valamint a szarkolemma L-típusú Ca2+-csatornáinak foszforilációja miatt kialakuló Ca2+-influx csökkenés áll. (19,119). Az eNOS aktivitással ellentétes hatást vált ki a neuronális NOszintáz (nNOS) által képződött NO. A szívizomsejtben levő másik NO-szintáz izoforma, a nNOS a SR-ban található. A nNOS aktivitás során keletkezett NO pozitív inotrop hatásának hátterében a RyR2 receptorok stimulálása, és a SR-ból történő fokozott Ca2+ felszabadulás áll (7).
15
1.3 A kalcium túlterhelés kialakulása és következménye A szívizomban létrejövő Ca2+i-koncentrációváltozás, valamint a pozitív inotrop és luzitrop hatás kialakulása között szoros kapcsolat áll fenn. Ha a szisztolé alatti Ca2+ikoncentrációemelkedés fokozza a szívizom kontraktilitását, akkor a diasztolé alatti jelentős Ca2+i-koncentráció csökkenés szükséges a tökéletesebb relaxációhoz. Ha a szisztolé vagy a diasztolé alatt fiziológiásan jelenlevő, Ca2+-felszabadító és szekvesztráló
mechanizmusok
zavart
szenvednek,
akkor
a
miociták
Ca2+i-
koncentrációja tartósan magas marad, a sejtek túltöltődnek Ca2+-mal. Az ily módon sérült excitációs/kontrakciós folyamat miatt a szív pumpafunkciója a normális keringés fenntartásához elégtelenné válik. A szívizomsejt Ca2+-mal való túltelődése a szív mechanikai teljesítményének csökkenéséhez vezet, illetve hozzájárul a kontraktúra kialakulásához.
1.3.1 A degeneratív enzimek aktiválódása A túlzott mértékű Ca2+i-koncentráció Ca2+-függő degeneratív enzimek (proteázok, foszfolipázok, endonukleázok) aktiválódásához vezet. Az aktivált foszfolipázok a sejtmembrán foszfolipidjeit feldarabolják, a keletkezett végtermékek a lipid kettősrétegben micellákat alkotnak. Ezek a micellák a fontos szerepet játszhatnak az ingerületterjedés lassulásának következtében kialakuló iszkémiás ventrikuláris aritmiák kialakulásában (119). A foszfolipázok mellett valószínűleg protein kinázok is aktiválódnak, amelyek a kontraktilis fehérjéket foszforilálják. Ennek eredményeként a kontraktilis fehérjéknek csökken a Ca2+ iránti érzékenysége, azaz csökken a szívizom kontraktilitása. A Ca2+-függő protein kinázok a citoszkeletont felépítő fehérjéket is foszforilálják, ezzel a citoszkeleton struktúrális felépítése szakad meg, amely az alapvető sejtműködés végbemeneteléhez biztosít kompartmeneket (167). A kóros mértékben
megemelkedett
Ca2+i-koncentrációnak
szerepet
programozott sejthalál, azaz az apoptózis kialakulásában is (49).
16
tulajdonítanak
a
1.3.2 A mitokondriumok károsodása A megemelkedett Ca2+i-koncentráció helyreállításában fontos szerepet kapnak a mitokondriális Ca2+-szekvesztráló transzporter folyamatok. Egy darabig ezek védekező mechanizmusok a kórosan magas Ca2+i-koncentrációval szemben, azonban tartósan fennálló Ca2+i-túltelítődés további kóros következményekkel jár. Kezdetben a mitokondriumok, mint Ca2+-pufferek, felveszik a citoplazmából a Ca2+-ot, egy kritikus koncentráció
fölött
azonban
maguk
is
túltelítődnek
Ca2+-mal.
A
magas
2+
intramitokondriális Ca -koncentráció módosítja a mitokondrium belső membránjában elhelyezkedő ADP/ATP transzlokáz konformációját. A szerkezeti változás miatt a specifikus transzporter olyan membránpórussá módosul, amelyen minden 1500Da alatti molekula képes szabadon áramolni. A mitokondrium belső membránjának permeábilitás fokozódása miatt beáramló K+, Mg2+ és Ca2+ a mitokondrium struktúrális és funkcionális károsodását okozzák. A mitokondrium megduzzad és külső membránja rupturál, amelynek következtében citokrom c felszabadulás és kaszpáz aktiváláson keresztül megindulhat a programozott sejthalál folyamata. Ugyanakkor a mitokondrium membránpotenciáljának megszűnésével a légzési lánc is összeomlik és a miocita energiatermelése megtorpan (155).
1.3.3 Az ingerképzés és vezetés zavara Az Ca2+i-koncentráció emelkedése kamrai aritmia kialakulásának lehetőségét fokozza. Az Ca2+i-koncentráció emelkedését követően ugyanis fokozott foszfolipáz aktivitás figyelhető meg és az aktivált foszfolipázok a membránt alkotó foszfolipideket degradálják. A keletkező lizofoszfogliceridek akkumulálódnak a sejtmembránba és abnormális akciós potenciál terjedést indukálnak. Bizonyos sejtekben nő, másokban csökken az akciós potenciál terjedési sebessége. A szívizomsejtek között levő elektromos inhomogenitás kamrai aritmiák kialakulására hajlamosít. A magas Ca2+ikoncentráció gátolja az intercelluláris réskapcsolatokon (gap junction) keresztül létrejövő ingerületterjedést is, amely szintén aritmiára hajlamosító tényező (119). A Ca2+i-koncentrációnak emelkedése abnormális Ca2+-oszcillációk kialakulásához vezet, amely késleltetett utódepolarizáció kialakulását és következményes kamrai automáciát
17
eredményez, és hozzájárul a reperfúzióban megfigyelhető Ca2+i-túlterhelés által kiváltott kontraktúra kialakulásához (129).
1.4 A kalcium hiány és következményei Az Ca2+i-hiány bár csupán mesterségesen, laboratóriumi körülmények között hozható létre, jelentősége mégsem elhanyagolható, mivel az excitációs/kontrakciós folyamatok pontosabb megismerését teszi lehetővé. A kalciumkötő pufferrel (BAPTA) létrehozott abszolút Ca2+i-hiányt kísérleteink során a nulla Ca2+i-koncentráció melletti fluoreszcens jel meghatározásához használtuk, amelynek ismerete nélkülözhetetlen a Módszerek című fejezetben bemutatásra kerülő Ca2+i-szint meghatározásához.
1.5 A kalcium homeosztázis zavara speciális kórképekben Az értekezésemben vizsgált két speciális kórképben, a szívizom iszkémiás/reperfúziós károsodása és az oxidatív stressz által kiváltott kardiomiopátia fennállása során a Ca2+ihomeosztázist fenntartó folyamatok sérülése figyelhető meg. Ahhoz, hogy ezek a kórképek eredményesen kezelhetővé váljanak, pontosan meg kell ismerni, milyen mechanizmusok hozzák létre az Ca2+i-koncentráció tartós emelkedését, és ennek következtében elégtelenné váló kamrai kontrakciót és relaxációt.
1.5.1 A szívizom iszkémiás/reperfúziós károsodása A kardiovaszkuláris és cerebrovaszkulás kórképek döntő többségének alapja az elégtelen vérellátásból adódó iszkémiás károsodás. Ezeknek az iszkémiás sérüléseknek a nagy része még visszafordítható az idejekorán elvégzett sebészi beavatkozással vagy gyógyszeres terápia segítségével, amelyek célja az iszkémiás szövet infarktusának vagy nekrózisának megelőzése. Az iszkémiát követő reperfúzió során a szervek további súlyos károsodásnak vannak kitéve a sejteket elárasztó nagy mennyiségű oxigén miatt. Ennek megfelelően az iszkémia megszűntetése mellett a reperfúziós károsodás kivédésére is hangsúlyt kell fektetni. A hatékony terápiás beavatkozás érdekében fontos
18
tisztázni az iszkémia/reperfúzió alatti biokémiai, celluláris és mikrovaszkuláris történéseket (103).
1.5.1.1 Az iszkémia Kontraktúra kialakulása Az iszkémia állapotát az energiatermelés leállása és Ca2+i-túlterhelés jellemzi. Amikor a szívizmot ellátó koronária artériákban a keringés elégtelenné válik, a csökkent vérellátás miatt a szívizom oxigén igénye és ellátottsága közötti egyensúly felbomlik. A kialakult oxigénhiány miatt megszakad a mitokondriumokban a légzési lánc többlépcsős folyamata, megtorpan az ATP termelés. Annak érdekében, hogy a szívizomsejt energiaigényes folyamatai ne szenvedjenek zavart, megindul a szívizomsejtek gyors adaptációja a kialakult iszkémiás állapothoz. Megkezdődik a magas energiájú foszfátraktárak kiürítése, ezzel párhuzamosan nő az inorganikus foszfát mennyisége. Ennek a metabolitnak a felszabadulása a legfontosabb tényező a kontrakciók mérsékléséhez. Valószínű, hogy a kereszthidak kialakulását az inorganikus foszfát metabolitok gátolják. A csökkent energiatermelés miatt a zsírsav metabolizmust felváltja az anaerob glikolízis. Ennek eredményeként nagy mennyiségű laktát szaporodik fel, mely az amúgy már lecsökkent kontraktilitást tovább gyengíti. A glikolízis során ugyanis egy molekula glukóz két molekula laktáttá alakítása két H+ felszabadulását eredményezi, ami miatt intracelluláris pH csökkenés jön létre. Az így keletkezett H+-ok leszorítják a Ca2+-okat a kontraktilis fehérjékről. Mivel a Ca2+-troponin kapcsolat az aktin-miozin
kereszthíd
létrejöttének
alapja,
ennek
hiányában
a
kontrakció
mechanizmusa zavart szenved. Hosszantartó, súlyos iszkémia során a kontrakció végbemeneteléhez már nem áll rendelkezésre elegendő ATP, de ATP hiányában a relaxáció is zavart szenved. Az aktin és miozin szálak elcsúszott állapotban egymáshoz kapcsoltan maradnak, amelynek eredményeként a szívizomban kontraktúra alakul ki (119).
19
Az Ca2+i-túlterhelés kialakulása A kontraktúra kialakulásával párhuzamosan és fokozatosan emelkedik az Ca2+ikoncentráció. Ennek hátterében egyrészt az ATP hiány miatt kialakult energiaigényes folyamatok zavara áll, mivel sérülnek a sejt fiziológiás Ca2+i-koncentrációját fenntartó felszabadító és szekvesztráló mechanizmusok. Az ATP hiánya mellett az iszkémia alatt fellépő súlyos acidózis gátolja a SERCA2a működését és a Ca2+-indukálta Ca2+felszabadulást a RyR2 receptorokon (2,59). Továbbá a pH emelkedés mérséklésére megindult kompenzációs lépések az Ca2+i-koncentráció emelésével járnak. A Ca2+-ot a megemelkedett H+-koncentráció leszorítja az intracelluláris pufferekről, továbbá a H+ok
Na+/H+
cseretranszporteren
keresztüli
eltávolítása
miatt
intracellulárisan
megemelkedett Na+-ok NCX-en történő kilépésével Ca2+-ok lépnek a sejtbe (51,87). A sejt Ca2+i-mal való túltelődését fokozza, hogy a hosszantartó rövidülés és feszülés a sejt vázát alkotó citoszkeleton struktúrájának roncsolása mellett a sejtmembránt és a SR membránját is károsítja. A bennük keletkezett réseken keresztül a Ca2+ szabadon áramolhat (129). A folyamatot súlyosbítja, hogy a magas Ca2+i-koncentráció következtében aktiválódott
degeneratív enzimek
tovább
fokozzák a
miocita
membránjának degradációját (26,166).
1.5.1.2 A reperfúzió Az Ca2+i-túlterhelés által kiváltott kontraktúra A reperfúzió állapotát Ca2+i-túlterhelés és reaktív oxigén szabadgyökök képződése jellemzi. Abban az esetben, ha az iszkémia alatt a mitokondriumok nem szenvedtek irreverzibilis károsodást, a reperfúzió során létrejövő reoxigenizáció az energiatermelés gyors helyreállásához vezet. Elegendő mennyiségű ATP jelenlétében a rigor állapotában megrekedt szívizom újra kontrahálni kezd. Ugyanakkor a magas Ca2+i-koncentráció helyreállítása nem tart lépést a kontraktilis apparátus reaktiválódásával. Ennek következtében kontrollálatlan Ca2+-függő kontrakciók jönnek létre és kialakul az úgynevezett Ca2+i-túlterhelés okozta kontraktúra. A folyamat hátterében az áll, hogy nagy amplitúdójú és frekvenciájú oszcillációs Ca2+-szikrák jelennek meg a citoplazmában. Kialakulásukban egyrészt SR-ból felszabaduló nagy mennyiségű Ca2+,
20
valamint az iszkémiát követő alacsony Na+-koncentráció miatt reverz módban üzemelő NCX-en keresztül a sejtbe áramló Ca2+-ok vesznek részt.
Hosszan tartó iszkémiát követően a mitokondriumok nem képesek a sejt energiatermelését gyorsan helyreállítani, így a reperfúzió kezdetén a miocitákban tartósan alacsony marad az ATP szint. Az alacsony ATP szint az iszkémiához hasonló, Ca2+i-koncentrációtól függetlenül létrejövő úgynevezett rigor-típusú kontraktúra kialakulásához vezet (129)
Az akut oxidatív stressz Az iszkémiát követő reperfúzió alatt a sejtet hirtelen olyan nagy mennyiségű oxigén árasztja el, ami a mitokondriális légzési lánc kapacitását meghaladja. Ennek következtében csak részben redukált, reaktív oxigén szabadgyökök képződnek: szuperoxid anion (·O2-), hidroxil anion (·OH) és hidrogén-peroxid (H2O2). A reperfúzió alatti szabadgyök képződés további forrásai az aktivált neutrofil granulociták NADPH oxidáz rendszere, az iszkémia alatt megemelkedett katekolaminok auto-oxidációja, valamint az ATP depléció miatt kialakuló xantin dehidrogenáz/xantin oxidáz enzim átalakulás (13). A fokozott szabadgyökképzés mellett az iszkémián átesett szívizom antioxidáns koncentrációja lecsökken, mivel az anaerob glikolízisre áttért miocita felhasználja a glutation regenerálásához szükséges redukált nikotinsavamid-adenindinukleotid-foszfátot (NADPH). A redukált glutation visszaoxidálódása nem következik be, ezért nem képes a szabadgyök megkötésére. Az oxigén szabadgyök molekulák rendkívül reaktívak, lipideket peroxidálnak, megváltoztatják a fehérjék szerkezetét és működését, befolyásolják a génexpressziót, károsítják a dezoxi-ribonukleinsav (DNS) struktúráját, apoptozist indukálnak. A lipid peroxidáció során károsodott membrán permeábilitása megnő korábban átjárhatatlan ionok számára. Ezzel tovább súlyosbodik az iszkémia alatt felborult intracelluláris ionhomeosztázis (103).
Feltételezik, hogy az Ca2+i-túlterhelés és a szabadgyök képződés egymással szoros kapcsolatban van. Az Ca2+i-túlterhelés fokozza a szabadgyök képződést és fordítva. A megemelkedett Ca2+i-koncentráció Ca2+-függő proteázt aktivál, amely fokozza egyrészt
21
a xantin dehidrogenáz/xantin oxidáz enzim átalakulást, másrészt, károsítja a mitokondriális légzési lánc folyamatát, így elősegíti a szabadgyök képződést. A reaktív oxigén szabadgyökök ugyanakkor befolyásolják a miokardium Ca2+-transzport folyamatait, mivel károsítják a SR és a sejt membránját és gátolják az anaerob glikolízist (103).
1.5.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia Az oxidatív stressz által kiváltott kardiomiopátia egy olyan specifikus kórkép, amely leggyakrabban krónikus adriamycin (doxorubicin, DOX) kezelés után alakul ki. A DOX széles
spektrumú
megbetegedés
antineoplasztikus
(leukémiák,
limfómák
antibiotikum, és
egyéb
melyet
számos
karcinómák)
malignus
terápiája
során
alkalmaznak. A terápiás felhasználást azonban korlátozza a vegyület dózisfüggő kardiotoxikus hatása. Krónikus DOX kezelést követően ugyanis irreverzibilis kardiomiopátia alakul ki, melyet csökkent kamrai funkció, csökkent ejekciós frakció, kamradilatáció, megemelkedett szívfrekvencia és csökkent vérnyomás jellemez. Szövettani metszetekben a miocitákban vakuolumok figyelhetőek meg, amelyek degradált miofibrillumokkal teli kitágult szarkotubulusok (145,146).
1.5.2.1 A funkciózavar kialakulásának feltételezet mechanizmusai A DOX indukálta miokardiális funkciózavar hátterében számos mechanizmus állhat. Csökken a nukleinsav és a protein szintézis, vazoaktív aminok szabadulnak fel, módosul az adrenerg aktiváció, a mitokondriumokban funkciózavar lép fel, módosul a szarkolemmális Ca2+-transzport, csökken a Na+-K+-ATP-áz, a Ca2+-ATP-áz, az adenilát cikláz aktivitás, megindul szabad oxiradikálok fokozott képződése, felgyorsul a lipid peroxidáció (145). Valószínűnek látszik, hogy a kardiotoxikus hatás kialakulásáért főként az oxidatív és nitrozatív stressz okozta sejtkárosodás felelős (113,146,173). A szervezetbe került DOX ugyanis redukciós cikluson megy keresztül, amelynek során szabadgyökök képzőnek (145). A képződött szabadgyökök károsítják a sejt szerkezetét és megzavarják a sejt fiziológiás működését. A sejtfunkció irreverzibilis zavara egyben az adott szerv funkciójának zavarát is okozza. A szabadgyökök miokardium károsító képességének egyik bizonyítéka, hogy a szabadgyökök különféle farmakonokkal, (vas
22
kelátorok, antioxidáns vitaminok, NO-szintáz inhibitor) történő semlegesítése védelmet nyújt a DOX által kiváltott kardiotoxicitással szemben. Terápiás felhasználásukat azonban korlátozza a nem kívánt kóros mellékhatásuk (41,109,110, 124,145). A DOX által indukált kóros miokardiális kontrakció és sejthalál kialakulásához vezető pontos mechanizmus nem ismert. A miociták hipertrófiájának kialakulásában a peroxinitrit által kiváltott, fokozott mátrix metalloproteináz aktivitásnak tulajdonítanak feltételezett szerepet. A fokozott enzimaktivitás eredményeként felgyorsul az extracelluláris mátrix elemeinek lebomlása, és zavart szenved a miocitákban lezajló remodeling folyamata. Végül a sejt váza szétesik és a miocita excentrikusan hipetrófizál (4,151). Az oxidatív stressz során képződő szabadgyökök a mitokondriumok fiziológiás működését is megzavarják. A szabadgyökök hatására a mitokondriumokból fokozódik a citokrom c elválasztás. A citokrom c aktiválja a kaszpáz-3 enzimet, amely a sejtben apoptozist indukál (24,50,69). A mitokondriumok valószínűleg közvetlenül is károsodnak a DOX által indukált szabadgyökképződés hatására fellépő lipid peroxidáció folyamatában. Maga a DOX szelektíven gátolja azoknak a mitokondriális enzimeknek a transzkripcióját, amelyek a miocita fiziológiás energiatermelésében központi szerepet játszanak. Nevezetesen az ADP/ATP transzlokáz szívizom specifikus izoformját, a mitokondriális elektrontranszport vas-szulfur ún. Reiske fehérjét, valamint a 6foszfofrukto-1-kináz izomspecifikus izoformját (63). Ez magyarázhatja a DOX szelektív kardiotoxicitását.
23
1.6 Az iszkémiás/reperfúziós és kardiomiopátiás állapotok ellen védő mechanizmusok – a HS előkezelés, valamint a poli(ADP-ribóz) polimeráz gátlása 1.6.1 Az iszkémiás/reperfúziós károsodással szembeni védelem – a hősokk kezelés 1.6.1.1 A hősokk előkezelés védőhatása Az utóbbi két évtizedben számos olyan tanulmány készült, amelyben kimutatták, hogy hősokk (HS) előkezelés hatására megnő a szívizom iszkémiás/reperfúziós károsodással szembeni tűrőképessége (29,71,84,148,179).
A szívizom kontrakciós ereje visszatér. A HS előkezelés kardioprotektív hatását Currie és kutatócsoportja mutatta ki elsőként patkány szíven. Kísérleteikben a HS előkezelés után 24 órával véghez vitt iszkémiát követő reperfúziós protokoll során a mechanikai restitúció javulását figyelték meg (29). Ezt a jótékony hatást később nyúl és kutya miokardiumban is tapasztalták (135,179). A HS előkezelés kardioprotektív hatása azonban a kor előrehaladtával egyre kevésbé érvényesül (47,93).
Antiaritmiás hatás. A HS előkezelés mérsékli az iszkémiás/reperfúziós károsodás következtében kialakuló kamrai aritmiák kialakulását és időtartamát patkányokon végzett in vitro és in vivo kísérletekben (67,152).
Az infarktus kiterjedése. A HS előkezelés mérsékli a koronária artériák okklúzióját követő reperfúzió során kialakuló infarktus kiterjedését egészséges és genetikailag létrehozott hipertrófizált szívizomban egyaránt (35,66).
A miociták és a koronária endothel életképessége. HS előkezelés hatására alacsonyabb a sejt sérülését jelző markerek, azaz a kreatin kináz (29) és a laktát dehidrogenáz extracelluláris koncentrációja (162). A HS előkezelés megakadályozza, hogy a mitokondriumok szerkezete és működése sérüljön az iszkémiás/reperfúziós inzultus
24
során, valamint, hogy a nagyenergiájú foszfát raktárak ne ürüljenek ki teljesen (139,178). HS előkezelést követően mérséklődik a metabolikus acidózis. HS előkezeléssel kivédhető az iszkémia/reperfúzió okozta endotélsérülés miatt kialakuló koronária artéria diszfunkció.
1.6.1.2 A
HS
kezelést
követő
védőhatás
kialakulásának
feltételezett
mechanizmusa A miocitákban a HS előkezelés hatására kifejlődő kardioprotektív hatás összetett intracelluláris kaszkádfolyamat végeredménye. A HS előkezelésre adott válasz három komponensre bontható: 1. a HS kezelés hatására képződő, a kardioprotektív választ beindító trigger molekulák és receptoraik (1. ábra, sötétszürkével jelölve), 2. a trigger molekulák kiváltotta szignál transzdukciós folyamatok (1. ábra, világosszürkével jelölve), 3. a kardioprotektív választ kiváltó mediátorok (1. ábra, fehérrel jelölve).
Trigger molekulák és receptoraik A HS előkezelést követően a plazma katekolamin koncentrációja megemelkedik és fokozódik a miokardiális noradrenalin turnover is (78,79). Az α1-adrenerg receptorok blokkolásával a HS előkezelés kardioprotektív hatása nem alakul ki (66). A HS előkezelés következtében a NO termelés fokozódik, amelyet blokkolva szintén elmarad az HS előkezelés jótékony hatása (98). A HS előkezelés stimulálja a reaktív oxigén szabadgyökök és a citokinek termelését is. Ezeknek a molekuláknak a neutralizálása szintén a HS előkezelés kardioprotektív hatását csökkenti (40,74,138). Feltételezik, hogy a hem-oxigenáz-1 és a kalcitonin gén-kapcsolt peptid szintén szerepel a HS előkezelés védőhatásának kiváltásában (95). További triggermolekulaként tartják számon az opioidokat. Az δ1-opiod receptor gátlásával ugyanis elmarad a HS előkezelés kardioprotektív hatása (128).
25
HŐSOKK KEZELÉS citokinek
ROS opioidok
SZARKOLEMMA
endokannabinoidok
katekolaminok
NO
δ1-opioid receptor
α1-adrenoreceptor
PIP2
CB2 receptor
PLC hem
IP3
NOS
HO-1
ROS
DAG
NO
CO
MITOKONDRIUM
PKC
CITOSZOL
KATP csatorna
MAPK NO Fokozott antoixidáns aktivitás
SEJTMAG
Fehérje szintézis:
transzkripciós faktorok NF-κB
HSP, COX-2, iNOS
HSF
I/R SZEMBENI TŰRŐKÉPESSÉG
gén transzkripció
1. ábra. A HS előkezelés kardioprotektív hatásának feltételezett mechanizmusa.CO: szén monoxid, COC-2: ciklooxigenéz-2, DAG: diacil-glicerol, HO-1: hemoxigenéz-1, HSF: hősokk faktor, HSP: hősokk fehérje, KATP csatorna: ATP-függő kálium csatorna, MAPK: mitogén aktivált protein kináz, NO nitrogén-monoxid, iNOS: indukálható nitrogénmonoxid szintáz, NF-κB: nukleusz faktor—κB, PIP2: foszfatidil-inozotol-difoszfát,PLC: foszfolipáz C, PKC: protein kináz C, ROS: reaktív oxigén gyökök (Joyeux-Faure M et al. Cardovasc Res,2003,469-77).
A jelátviteli mechanizmusok A HS előkezelést követő védőhatás kialakulásának feltételezett mechanizmusában az alábbi szignáltranszdukciós folyamatok szerepelnek.
Foszfolipáz C (PLC) és protein kináz C (PKC). HS előkezelés hatására a szarkolemmában levő foszfatidilinozitol-4,5-difoszfátot (PIP2) a PLC bontja DAG-ra és IP3-ra. A keletkezett DAG a protein kináz C-t aktiváláson keresztül kardioprotektív gének transzkripcióját idézi elő. A PKC aktivációját a HS előkezelés hatására képződött NO is képes előidézni (17).
26
Protein tirozin kinázok. Bár a protein tirozin kinázok gyógyszeres gátlásával nem marad el a HS kezelést követően kialakuló kardioprotektív hatás, a protein tirozin kinázok szerepe mégsem zárható ki, mivel fibroblasztokban HS előkezelés hatására létrejövő, fokozott c-Src tirozin kináz aktivitást figyeltek meg (65).
Mitogén aktivált protein-kinázok (MAPK). HS előkezelés hatására a p38 MAPK aktiválódását figyelték meg. Ugyanakkor, a HS előkezelést megelőzően adott p38 MAPK gátlószerrel a szívizom iszkémiával szembeni fokozott ellenállóképessége nem alakult ki. Bár a PKC által közvetített MAPK aktivitás kialakulásának pontos mechanizmusa egyenlőre nem ismert, feltételezik, hogy a MAPK a sejtmagban olyan gének átírását indukálja, amelyek kapcsolatban lehetnek a kardioprotektív hatás kialakulásával (132).
A kardioprotektív választ kiváltó mediátorok A hősokk fehérjék Bár a folyamatos kutatások ellenére még ma sem tisztázott milyen folyamatok felelősek a hősokk fehérje (HSP) által közvetített szívizomvédelemért, valószínű, hogy a HSP család több tagja is kiemelt szerepet játszik a miociták iszkémiás inzultussal szembeni védelmében. Közvetlen kapcsolatot mutattak ki a hősokk előkezelést követően kialakuló HSP upreguláció és a szívizom iszkémia utáni mechanikai teljesítményének helyreállása között.
A hősokk fehérjék szintézise A HSP-nek a stresszhatás által kiváltott károsodást mérsékelik, illetve, hogy jelenlétükkel a soron következő stressz okozta káros hatásokat kivédik. Bár a HSP-k nevüket onnan kapták, hogy első megismert képviselőjük HS előkezelést követően termelődött a sejtben, kiderült, hogy a HS előkezelésen kívül számos egyéb, a sejtet érő noxa is HSP termelődéshez vezet. A sejtet ért hipoxia, iszkémia, gyulladás, akut magas vérnyomás valamint nehézfémek, endotoxinok, reaktív szabadgyökök, farmakonok, anesztetikumok, alkohol stb. szintén HSP termelődést indukálnak. Az extracelluláris vagy intracelluláris stressz a sejtben inaktivált állapotban jelen levő hősokk-faktort
27
(HSF) aktiválja. Az aktivált hősokk-faktort a sejtmagba vándorol és a DNS HSPgénjéhez kötődve messenger ribonukleinsav (mRNS) szintézist indukál. A HSP képződés lépései, a transzkripció és a transzláció folyamata meghatározott időt vesz igénybe. Ennek eredményeként késleltetett, illetve időben megnyújtott kardioprotektív hatás alakul ki. A HS előkezelés közvetítette jótékony hatás a kezelés utáni 24. órában éri el maximumát és mintegy 48-72 óráig tart (56). A folyamatos kutatások ellenére azonban még ma sem tisztázott milyen folyamatok felelősek a közvetlenül a HS előkezelés és/vagy a HSP által közvetített szívizomvédelemért (84,148).
A hősokk fehérje családok A miokardiumban szintetizálódó HSP-ket molekulatömegük szerint csoportosítjuk. Ezen belül megkülönböztetünk konstitutív és indukálható formákat. Az indukálható formák a sejtet érő intracelluláris stresszt követően exszpresszálódnak és citoprotektív tulajdonságuk révén a sejt túlélését segítik elő. Ezzel szemben a HSP-k konstitutív formája stresszhatástól függetlenül is jelen vannak a sejtben. Ezeknek a molekuláris csaperonoknak (dajkafehérjéknek) a feladatuk, hogy a protein szintézis során biztosítsák a fehérjék háromdimenziós konformációját, amely hiányában denaturálóládnak, aggregálódnának(104).
HSP70 Elsőként a HSP70 (a jelölés a molekulatömegre utal) fehérje családot hozták közvetlen összefüggésbe kardioprotektív hatásokkal. Humán HSP70 overexpresszált egerekben figyeltek meg iszkémiás/reperfúziós károsodást követően kialakuló jobb mechanikai restitúciót (75). A HSP 70 egyik fő feladata, hogy megakadályozza az iszkémia során sérült és ez által instabil formába került fehérjék denaturációját (56). A fehérjének ezt a funkcióját a 2-es számú sematikus ábra szemlélteti. A Hsp70 végzi a már denaturálódott és aggregálódott fehérjék degradálásához szükséges lizoszómális transzportot is. Ezen kívül a HSP70 szerepe a súlyos iszkémiás károsodás következtében létrejövő apoptózis kialakulásának gátlásában is felmerült (84). Humán HSP70 génnel rendelkező és HSP70 fehérjét expresszáló transzgenetikus egérmodellben közvetlen kapcsolatot mutattak ki a HSP70 termelődés és a miokardiális ATP és nagyenergiájú foszfátraktárak iszkémia
28
alatti konzerválódása, valamint a súlyos iszkémiás acidózis mérséklése között (131). Mindezek ellenére az iszkémiás/reperfúziós inzultusban nyújtott védő hatás pontos mechanizmusa egyelőre nem ismert (48).
Transzláció
HSP 70
ATP
kész fehérje
ADP ATP
Hidrofób aggregáció
ADP ATP ADP ATP ADP
HŐSOKK 0 P7 HS Denaturált fehérje
2. ábra. A HSP70 szerepe a fehérjék szerkezetének kialakításában és fenntartásában (Gray CC et al. IJBCB 1999;31:559-73).
HSP90 A citoplazmában legnagyobb mennyiségben előforduló stresszfehérje a HSP90, amelynek endoplazmatikus retikulumbeli homológja a GRP94 (glukóz-regulált fehérje) (30). A Hsp90 molekuláris csaperon funkciója mellett részt vesz egyéb HSP-k transzkripciójának fokozásában, az aktinhoz és a tubulinhoz kötődve részt vesz az aktinmiozin interakció szabályozásában és hozzájárul a citoszkeleton dinamikájának befolyásolásában, ha a sejtet stresszhatás éri (48). A HSP90 legutóbb megismerésre került funkciója az endoteliális nitrogén-monoxid szintáz aktivitásának stimulálása. A HSP90 tehát a NO termelés közvetett fokozásával a véredények endotél-függő relaxációját képes előidézni (48). A GRP94 az endoplazmás retikulum alacsony
29
affinitású, de nagy kapacitású Ca2+-kötő fehérjéje, expressziója HS és egyéb stressz hatására fokozódik (171).
HSP60 A legkorábban megismert HSP-ek egyike a HSP60 (30). Ez a fehérje a mitokondrium fő molekuláris csaperonja. Feladata, hogy elősegítse a sejtmagban kódolt mitokondriális fehérjék citoplazmából történő intramitokondriális transzportját (48).
HSP27 A kisméretű HSP családjába tartozó HSP27 legfontosabb feladata, hogy stabilizálja a miofilamentumokat (az aktint) és a citoszkeleton vázát alkotó fehérjéket (pl.dezmin). Ezen kívül a Hsp27 megemeli a redukált glutation szintjét a sejten belül, ezzel biztosítja a citoplazma redukált állapotát és az oxidatív stresszel szembeni védelmet (30). A HSP27 valószínűleg képes gátolni az iszkémiás inzultus legsúlyosabb következményét, a programozott sejthalál kifejlődését is. A HSP 27 termelés stressz-aktivált stimulálása protein kináz C és p38-MAP kináz közvetített HSF képződésen keresztül alakul ki (48).
Egyéb mediátorok KATP csatorna. Feltételezhető, hogy a mitokondriális ATP-szenzitív K+ csatornák PKC, MAPK, NO kiváltotta fokozott aktivitása szerepet játszik a HS előkezelés hatására kialakuló kardioprotektív hatás létrejöttében. A csatorna megnyílásával a mitokondrium membránja depolarizálódik, így az iszkémia alatt kialakult magas Ca2+i-koncentráció ellenére is alacsony marad a mitokondriumokba irányuló elektrokémiai Ca2+-grádiens. Ennek következtében nem alakul ki a mitokondriumokat súlyosan károsító intramitokondriális Ca2+i-túlterhelés (57,130).
Endogén kannabinoidok. Az endogén kannabinoid rendszer aktiválódása a CB2 receptorokon keresztül hozzájárul az iszkémiás inzultus során létrejövő miokardiális infarktus kiterjedésének mérsékléséhez. A CB2-receptorokat blokkolva ugyanis elmarad a HS előkezelés iszkémia/reperfúzióval szembeni védő hatása. A HS előkezelés
30
közvetítette védő hatás kialakulásában szoros kapcsolatot mutattak ki a NO és az endogén kannabinoid rendszer között. Feltételezik, hogy a NO által indukált kardioprotektív hatás a CB2-receptorok aktivációján keresztül jön létre. Úgy tűnik tehát, hogy a NO lehet trigger és lehet mediátor molekula is a HS előkezelés által kiváltott védőhatás kialakulásában. Az endokannabinoidok CB2-receptorokon keresztül kiváltott, iszkémiás inzultussal szembeni védőhatásának kialakulása feltételezhetően PKC és MAPK aktivitáson keresztül valósul meg. (64).
Ciklooxigenáz-2 (COX-2). A HS előkezelés hatására fokozódik a miokardiális COX-2 fehérje expressziója. A fokozott COX-2 aktivitás megléte az iszkémia/reperfúzió alatt nyújtott kardioprotektív hatás egyik feltétele. A COX-2 gátlásával elmarad a HS előkezelés iszkémiás/reperfúziós károsodással szemben nyújtott jótékony hatása (3).
Antioxidáns enzimek. A megemelkedett antioxidáns koncentráció a reperfúzió alatt keletkező reaktív szabadgyökök eliminálásával járul hozzá a jobb mechanikai restitúció létrejöttéhez. Az endogén miokardiális kataláz fokozott expressziója figyelhető meg HS előkezelést követően. A kataláz enzim gyógyszeres gátlásával nem érvényesül a HS előkezelés jobb hemodinamikai restitúciót létrehozó, az infarktus kiterjedését mérséklő, valamint antiaritmiás hatása iszkémiás/reperfúziós károsodáson átesett szívizomban (29). A HS előkezelés jótékony hatásának kialakulásában mediátorként szerepet játszó másik antioxidáns enzim a szuperoxid diszmutáz. Az enzimet kódoló mRNS-nek és magának a fehérjének a koncentrációja a HS előkezelést követően jelentős mértékben megemelkedik. Kísérletes adatok azt mutatják, hogy a szuperoxid diszmutáz gyógyszeres gátlásával a hipoxia-reoxigenizáció ellen védelmet nyújtó HS előkezelés teljes mértékben hatástalan (177).
1.6.1.3 Terápiás lehetőségek A HS előkezelés bizonyítottan jótékony hatásának ellenére a klinikumban való alkalmazása még várat magára. Bár a melegítés a leghatékonyabb induktora a HSP termelődésnek, a HS előkezelés nem specifikus terápia és számos káros mellékhatása van: a sejt vázát alkotó citoszkeleton szerkezete feltöredezik, a mitokondriumok
31
megduzzadnak, a Golgi apparátus szétesik és sejt energiatermelése az anaerob glikolízisre áll át. A gyakorlatban két lehetséges mód áll rendelkezésünkre a HSP termelődés stimulálására. Az egyik lehetőség a gyógyszeres terápiával kiváltott fokozott HSP termelés. Jelenleg egy hidroxilamin származék, a bimoclomol áll klinikai kipróbálás alatt. Ez a vegyület többszörösére képes fokozni a kardioprotektív HSP-k expresszióját, különös tekintettel a HSP70-re (169). A másik ígéretes megoldás a genetikai manipuláció segítségével megsokszorozott HSP termelés. Az eljárás során HSP70 génnel rendelkező vírus vagy plazmid liposzómát injektálnak intravénásan vagy direkt a szívizomba (84). A HSP termelés indukciója mellett lehetőség van a kardioprotektív hatás kialakulásában résztvevő intracelluláris folyamatok gyógyszeres indukciójára. Klinikai vizsgálatok zajlanak az opioidokkal és a KATP csatorna működését stimuláló vegyületekkel, amelyek a HS előkezeléshez hasonló kardioprotektív hatást képesek előidézni. (72,127).
1.6.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia – a poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP) szerepe 1.6.2.1 A PARP szerkezete Az utóbbi időben került felismerésre, hogy a doxorubicin által indukált oxidatív és nitrozatív
stressz
szoros
összefüggésben
van
a
poli(ADP-ribóz)
polimeráz
túlaktiválódásával (123). A sejtmagban fiziológiásan jelenlevő, öt alcsoportból álló enzimcsalád legtöbbet tanulmányozott tagja a poli(ADP-ribóz) polimeráz 1 (PARP). Szerkezetét tekintve a 113 kD molekulasúlyú PARP enzim három specifikus régióból áll. Az N terminális régió DNS megkötésére képes, cinkujjas motívumot tartalmaz. A középső, automodifikációra képes központi domain köti magához a szintetizálódott ADP-ribóz polimert és kapcsolja a sérült DNS szálhoz. A C-terminális régió végzi a NAD hasítását és az ADP-ribóz polimer képzését (28).
32
1.6.2.2 A PARP funkciója A PARP szerepe az eukarióta sejtben sokrétű. A PARP kijavítja a DNS szálon keletkezett hibákat, ezzel biztosítja a genom integritását (31,32,33,141). Emellett a PARP szabályozza különféle gyulladásos mediátorok transzkripcióját (55,88,118,157), részt vesz a sejt súlyosan károsodott alkotóelemeinek eliminációjában (10,140,141,144) és feltételezett szerepet tulajdonítanak a replikáció és differenciáció szabályozásában is 5,70,89,161). A PARP enzimcsalád többi tagjai a PARP-1-hez hasonló szerkezettel és feltehetőleg hasonló funkcióval bíró PARP-2 és PARP-3 enzimek, valamint a mitózis során ADP-ribozilációt végző VPARP és a telomer hosszát ADP-ribolizációval szabályozó tankiráz enzimek (28).
sejtmag PARP (aktív)
PARP (inaktív)
NAD
ADPR
ONOONO• H2O2
ADPR NA ADPR ADPR
glukóz
ADPR
NAD
NAD
NADH
piruvát
ATP
NAD
NADH mitokondrium
3. ábra. A poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP) enzim túlaktiválódásának következtében lezajló intracelluláris folyamatok. ADPR: adenozin-difoszfát-ribóz, ATP: adenozintrifoszfát, H2O2: hidrodén-peroxid, NAD: nikotinsavamid-adenin-dinukleotid, NADH: redukált nikotinsavamid-adenin-dinukleotid, NO·: nitroxil, ONOO-: peroxinitrit (Pacher P et al., J Am Coll Cardiol,2002,1006-15).
33
1.6.2.3 A PARP túlaktiválódása A DOX indukálta oxidatív és nitrozatív stressz során nagy mennyiségben keletkeznek reaktív szabadgyökök, amelyek károsítják a DNS szálat (124,123,173,). A DNS szál sérülését követően a PARP aktiválódik és megkezdi a DNS szál javítását. Ennek során a NAD-ot kettéhasítja nikotinsavamidra és ADP-ribózra, majd a keletkezett ADP-ribózból polimert készít, amelyet a sérült rész hisztonjához kapcsol. A doxorubicin indukálta oxidatív és nitrozatív stressz során azonban a PARP túlaktiválódik, a sejt NAD raktárai kiürülnek. Ahhoz, hogy nikotinsavamidból újabb NAD keletkezzen ATP jelenléte szükséges. Ugyanakkor a NAD a mitokondriális légzési lánc elektron transzportere is, ezért a PARP túlaktiválódás következtében az ATP szintézis zavart szenved (3.ábra). Az energiatermelés zavarát súlyosbítja, hogy a csökkent mennyiségű NAD lassítja a glikolízis folyamatát is. Az így kialakult energiadepléció a fiziológiás sejtfunkciók zavarát eredményezi (123,158,170). Az oxidatív és nitrozatív stressz és a következményes energiadepléció mértéke határozza meg, hogy a sejt túlél vagy elpusztul. Ha a PARP túlaktiválódás nem meríti ki teljesen az energiaraktárakat, akkor a sejt túlél. Ellenben, ha az energiadepléció mértéke túllép egy bizonyos küszöbszintet, akkor a sejtben megindul a nekrózis, amely a sejtmembrán integritásának megszakadásával és a lizoszómális enzimek intracelluláris térbe kerülésével jellemezhető degeneratív folyamatokat vonja maga után. Ugyanakkor, a súlyos ATP hiány az egyik legjelentősebb programozott sejthalált indukáló faktor is (28).
1.6.2.4 A PARP gátlása Egyre több in vivo kísérleti modellből származó megfigyelés bizonyítja, hogy a PARP gyógyszeres gátlásával kivédhetőek azok az akut és krónikus intracelluláris patológiás folyamatok, amelyek a kóros mértékű szabadgyök képződés miatt jöttek létre. A PARP gátlás célja, hogy a sejt alapvető katabolikus és anabolikus folyamataihoz nélkülözhetetlen energiaforrás ne apadjon el (28). A PARP enzim gátlására alkalmas vegyületek két csoportra oszthatóak. Az úgynevezett klasszikus inhibitorok, mint a nikotinsavamid, illetve a szerkezetileg analóg benzamid és származékai jól tolerálható, ugyanakkor kevésbé hatásos és nagy dózisban toxikus hatással is rendelkező vegyületek. A másik csoport az újabban kifejlesztett, nagyobb hatékonyságú, isoquinolin vázat tartalmazó vegyületek. Számos képviselőjük közül az egyik
34
legkedvezőbb tulajdonságokkal a fenantridinon vázat tartalmazó PJ34 [N-(6-oxo-5,6dihydrophenanthridin-2-yl)-N,
N-dimethylacetamide.HCl]
rendelkezik.
A
PJ34
szelektíven gátolja a PARP1 enzimet. A vegyület vízoldékony HCL só, ezért terápiás alkalmazása per os lehetséges (28,62). Kísérleteinkben ez a PARP gátló vegyület került alkalmazásra.
35
2
CÉLKITŰZÉSEK
Értekezésem
fő
célkitűzése
a
szívizom
Ca2+i-homeosztázisát
patofiziológiás
állapotokban fenntartó és szabályozó mechanizmusok megismerése volt. Doktori értekezésemben a miokardium kalcium homeosztázisát vizsgáltam két speciális kórképben, a HS előkezelésen átesett miokardiumban iszkémia/reperfúzió során, valamint az oxidatív és nitrozatív stressz által létrehozott kardiomiopátiában. Az általam vizsgált két speciális kórkép közös vonása, a kóros mértékben megemelkedett Ca2+ikoncenráció és az ennek következtében kialakuló kamrai teljesítményromlás. Jelenleg nem áll rendelkezésünkre olyan izolált kardiomiocitából vagy perfundált szívből származó irodalmi adat, amely HS előkezelésben részesült iszkémiás/reperfúziós szívben, illetve DOX által indukált kardiomiopátiában vizsgálná és tisztázná a hemodinamikai paraméterekkel szinkron változó Ca2+i-homeosztázis zavarokat. A rendelkezésre álló irodalomban a szívizom homogenizátumból készült preparátumokban és
izolált
sejtorganellumokban
extrapolálhatóak
működő
szívre.
mért Ez
a
eredmények
csupán
fenntartásokkal
problémakör
elsősorban
az
élettani
alapkutatáshoz sorolható, ugyanakkor a kísérleti eredmények a miokardiális iszkémia és a DOX által indukált kardiomiopátia patomechanizmusának tisztázása révén racionálisabb terápiás lehetőségek kidolgozását segíthetik elő.
A vizsgálataink kérdései működő szívben, „in vitro” körülmények között:
1.
Hogyan befolyásolja a HS előkezelés az iszkémiás/reperfúziós károsodásnak kitett miokardium Ca2+i-homeosztázisát?
2.
Miként módosul az Ca2+i-felszabadulás és szekvesztráció folyamata HS előkezelés hatására a szív mechanikai teljesítményének tükrében?
3.
Hogyan változik a miokardium Ca2+i-homeosztázisa a DOX-nel indukált kardiomiopátiás szívben alapállapotban és oxidatív (hidrogén-peroxid) stressz alatt?
4.
Milyen szerepet játszik a PARP túlaktiválódás a DOX által indukált szívelégtelenség során fellépő kórós Ca2+i-homeosztázis kialakulásában?
36
3
MÓDSZEREK
3.1 Felhasznált állatok A kísérleteinkben felhasználásra kerülő hím Sprague-Dawley patkányokat 12 óránként sötét/világos váltakozó megvilágítású ketrecben tartottuk, amelyben szabad elérést biztosítottunk vízhez és élelemhez. A kísérleti protokoll megtervezését és kivitelezését a Semmelweis Egyetem Kutatásetikai és Tudományos Bizottságának engedélyével a National Institute of Health (NIH Publication No. 85-23, revised 1996) állatkísérleti etikai irányelveinek megfelelően hajtottuk végre.
3.2 Langendorff-készítmény Kísérleteinkben a szívműködésre jellemző élettani paramétereket Langendorff szerint perfundált patkányszíveken vizsgáltuk (83). A készítmény lényege, hogy oxigénben gazdag perfúziós folyadék kerül a koronária artériákba azáltal, hogy az aorta billentyűk felett levő folyadékoszlop nyomása zárja a szemilunáris billentyűket. A perfúziós folyadék útja a következő: aorta, aa. coronariae, kapillárisok, vv. coronariae, sinus venosus, jobb pitvar, jobb kamra, a. pulmonalis, szív külső felszíne. Az így fenntartott koronária keringés biztosítja a perfundált szív kontrakciójához szükséges oxigént és tápanyagokat.
A kísérleteink során használt Langendorff perfúziós készülék (Experimetria Ltd., Budapest) sematikus rajza a 4. ábrán látható. A HS ill. DOX előkezelést követően a kísérleti állatokban 40 mg/ttkg i.p. adott pentobarbitállal anesztéziát idéztünk elő. A mellkasból eltávolított szívet jeges, Ca2+-mentes Krebs-Henseleit oldatba mártottuk, majd az aortacsonknál fogva a Langendorff apparátus kanüljére applikáltuk. Az aortában mérhető retrográd perfúziós nyomást 70 Hgmm-re állítottuk a perfúziós folyadékoszlop segítségével. A módosított Krebs-Henseleit oldatból álló perfúziós folyadék az alábbiakat tartalmazta: 118 mM NaCl, 4,3 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 0,5 mM NaEDTA, 2,0 mM CaCl2, 11 mM glukóz, 5
37
mM piruvát (Sigma – Budapest). Az oldatot karbogénnel (95% O2-nel és 5% CO2-dal) ekvilibráltattuk, a pH-ját 7,4-re állítottuk, a hőmérsékletét 37 ºC-on tartottuk. A kísérleti protokoll során a szíveket 37 ºC-os Krebs-Henseleit oldatot tartalmazó szervfürdőben tartottuk. Erre a célra a szív felszínéről lecsöpögő perfúziós folyadékot gyűjtöttük össze.
KrebsHenseleit oldat
Karbogén Túlfolyócső Áramlásmérő transzducer
Elektron sokszorozó
Higanygőz lámpa Kanül Szív
Száloptika
Szervfürdő Balkamrai nyomásmérő Termosztát és pumpa
A Langendorff készülékésés optikai rendszer sematikus 4. ábra. 4.ábra. A Langendorff készülék optikaimérmérőrendszer sematikus rajza (http://quantametrics.com).
38
A koronária áramlást a perfúziós folyadék
nyomásmérő transzducer
útjába helyezett ultrahangos áramlásmérő
pulmonális véna
bal pitvar
mitrális billentyű
segítségével mértük (T-106, Transonic System ka szálopti
nyomást
nyomásmérő ballon bal kamra
Inc., Ithaca NY, USA). A bal kamrán belüli
5. ábra
a mitrális
billentyű
szájadékán
keresztül a kamrába vezetett műanyag ballon végéhez
csatlakoztatott
nyomásmérő
segítségével regisztráltuk (5. ábra) (Electromedics Inc., Englewood, CO, USA). A ballonkatéterhez csatlakozó fecskendőn keresztül a ballon térfogatának változtatásával a balkamrai vég-diasztolés nyomást 5 és 10 Hgmm közé állítottuk. A bal kamrában mért nyomáshullám analízisével határoztuk meg a szisztolés nyomást, a diasztolés nyomást, a kettő különbségéből számolható pulzusnyomást és a kamrai kontrakciók frekvenciáját. A bal kamrán belüli nyomásnövekedés és csökkenés maximális sebességét (±dP/dtmax), amely paraméter a szívizom kontraktilitásáról ad felvilágosítást, a kamrai nyomás pozitív és negatív deriváltjaiból származtattuk.
3.3 Fluoreszcens mérés Miután a szívek a Langendorff perfúziós készülék kanüljére kerültek, 30 percen keresztül perfundáltuk a módosított Krebs-Henseleit oldattal. Az ekvilibrációs periódus alatt 250 µg INDO-1 AM fluoreszcens festéket 0,25 ml dimetil-szulfoxid és 0,08 g pluronic F-127 elegyében oldottunk, majd 40 ml Krebs-Henseleit oldattal hígítottuk, amely az alábbi vegyületeket tartalmazta: 118 mM NaCl, 5,5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 25 mM HEPES, 11 mM glukóz, 5 mM Na-piruvát és 1,5 mM CaCl2. Az így kapott 6,25 µM INDO-1 AM-et tartalmazó oldatot az ekvilibrációs periódus elteltével az aorta kanülön keresztül, perisztaltikus pumpa segítségével (Cole-Palmer Co., Chicago, IL, USA) a szívbe perfundáltuk. A miocita festékkel való telítődését a szív felszínéről összegyűjtött oldat recirkuláltatásával biztosítottuk. 20 perces festékkel való feltöltés után a fluoreszcens jelek elérték maximumukat. Ezt követte az extracelluláris térben levő festék kimosása módosított a Krebs-Henseleit oldattal, normál Langendorff perfúzió során 15 percen keresztül.
39
A szívizomsejtben levő Ca2+i-szintet fluoro-reflektanciás módszerrel, INDO 1 AM fluoreszcens festék segítségével mértük (20,52). A higanygőz lámpa (Oriel, Stratford, CT, USA) 340 nm-es szűrt excitációs fényét száloptika segítségével a bal kamra falára vezettük, majd az emittált fényt fotomultiplierbe (Electron Tubes Ltd., Ruislip, Middlesex, England) vezetve detektáltuk. Az Ca2+i-hoz kötött festék fluoreszcens jelét a 400 nm-es, a szabad festékét az 506 nm-es hullámhossz tartományban mértük. A szövet nem specifikus optikai denzitásbeli változásairól a 340 nm-en detektált reflektancia adott információt. Az excitációs fényt 1 percnél tovább tartósan nem fókuszáltuk a szívre, ezzel minimalizáltuk az UV fény expozícióját követő szöveti károsodást és az intracelluláris festék fluoreszcenciájának gyors csökkenését. A fluoreszcencia és reflektancia jeleket a hemodinamikai paraméterekkel együtt többcsatornás AD konverteren keresztül számítógép segítségével regisztráltuk (Hemosys, Experimetria, Budapest).
A citoplazma Ca2+i-koncentrációját a 400 és 506 nm-es jelek aránya határozza meg. A különböző hullámhosszokon detektált jeleket korrigáltuk a megvilágítás nélküli szövetről elvezetett jellel, valamint a szövet festékkel való feltöltése előtt mért autofluoreszcens jellel. Laboratóriumunkban végzett korábbi kísérletsorozatban kimutattuk, hogy az INDO-1 AM nem szekvesztrálódik a mitokondriumokba, tehát az elvezetett jelek döntő többsége a citoplazmából származik (61). Ugyanakkor iszkémia alatt, a mitokondriális NAD(P)H eltolódás miatt a miokardium autofluoreszcenciájának fokozódásával mind a 400, mind az 506 nm-es jel megváltozik. Az iszkémia első 20 percében mindkét jel autofluoreszcenciája meredeken emelkedik, majd egy emelkedett értéken
állandósul. A perfúzió
újraindításával
mindkét
hullámhosszon
mért
autofluoreszcens jel gyorsan, 2-3 perc alatt visszatér az iszkémia előtti értékre. Ebből kifolyólag az iszkémia alatt elvezetett fluoreszcens jeleket az autofluoreszcencia változásainak
megfelelően
korrigálni
kell.
A
korrekciós
számok
korábbi
kísérletsorozatban kerültek meghatározásra.
A kötött és a szabad festék emissziójából az alábbi képlet segítségével határoztuk meg az Ca2+i-szinteket:
40
[Ca 2+ ]i = K d ⋅
R − Rmin ⋅β Rmax − R
(52)
A képletben szereplő R a 400 és 506 nm-es fluoreszcens jelek hányadosa. Az INDO 1 AM disszociációs konstansát (Kd) az irodalomból ismert 844 nM értékkel számoltuk (8). Rmin és Rmax azaz, a nulla és telített Ca2+i-koncentráció melletti fluoreszcens jelek hányadosát külön kísérletsorozatban határoztuk meg. INDO-1 AM-mel feltöltött kontroll szíveknek 20 µM BAPTA-AM (Sigma) oldatot perfundáltunk az Rmin meghatározásához, illetve 1 µM 4-bromo-kalcium-ionofor (A23187, Sigma) oldatot adagoltunk az Rmax kiszámításához. A szabad festék telített és nulla Ca2+i-koncentráció alatt detektált fluoreszcens jeleinek a hányadosa adja meg a képletben szereplő β értékét. A nyers Ca2+i-tranzienseket 30 Hz–es zajszűréssel simítottuk (133).
2+
Ca Plv
nM 400
Hgmm 120
i
300
90
200
60
100
30
0
0 0
150
300 Idő (ms)
450
600
6. ábra. Kontroll szívekben szinkron regisztrált balkamrai nyomás és Ca2+i-tranziens.
A 6. ábrán kontroll szívekben mért típusos Ca2+i-tranziensek és velük párhuzamosan regisztrált kamrai nyomáshullámok láthatóak. Az Ca2+i-tranziens analízise során meghatároztuk a szisztolés és diasztolés Ca2+i-szinteket és az Ca2+i-tranziens amplitúdóját. Az történő Ca2+i felszabadulásának és szekvesztrálódásának mértékét az
41
Ca2+i-tranziensből származtatott ±Ca2+i/dtmax kiszámításával határoztuk meg. A szívek Ca2+ iránti érzékenységét a szisztolés kamrai nyomás és szisztolés Ca2+i-koncentráció maximumának hányadosával jellemeztük.
3.4 Statisztika Az individuális kísérletekben kapott eredményeinket átlagoltuk és kiszámítottuk a hozzájuk tartozó standard deviációt (SD). A kontroll, a DOX kezelt és a DOX kezelés mellett PARP gátlót is kapott csoportok között meglevő statisztikailag szignifikáns különbségeket egytényezős variancianalízist követő Fisher post hoc teszt segítségével mutattuk ki. Az iszkémiás/reperfúziós károsodás mértékét, a HS előkezelés ill. a H2O2 infúzió hatását Student’s t-teszttel analizáltuk. A különbségeket p<0,05 esetén tekintettük szignifikánsnak.
3.5 A hősokk előkezelést követő iszkémiás/reperfúziós károsodás vizsgálata 3.5.1 A hősokk előkezelés 250-300 g tömegű, hím Sprague-Dawley patkányokban (n=6) anesztéziát idéztünk elő s.c. Hypnorm adásával (0,01 mg fentanyl/100 g és 0,5 mg fluanison/100g testsúlyra számolva)
(26).
Ezt
követően
az
állatokat
melegítőpadra
helyeztük,
maghőmérsékletüket 42±0,5 ºC-ra melegítettük, és 15 percig ezen a hőmérsékleten tartottuk. A kontroll csoportként használt állatokat (n=5) hasonló kezelési protokollnak vetettük alá, de maghőmérsékletüket nem emeltük a fiziológiás 37 ºC fölé. A HS előkezelést követően az állatokat külön ketrecbe helyezve biztosítottuk az anesztéziából történő tökéletes felépülést és az ivóvízhez történő szabad hozzáférést.
3.5.2 A perfúziós protokoll A HS előkezelésen átesett és a kontroll állatok szívét 24 óra elteltével Langendorff szerint perfundáltuk. A kísérleti protokoll 30 perc globális iszkémiát követő
42
reperfúzióból állt. Az iszkémia alatt a szívek módosított Krebs-Henseleit oldattal történő perfundálását teljesen leállítottuk, majd 30 perc elteltével újra indítottuk. A kísérleti protokoll során párhuzamosan regisztráltuk a hemodinamikai paramétereket és az Ca2+itranzienseket.
3.5.3 A HSP70 meghatározása A kísérleti protokoll végén a teljes kamraizomzatot lemetszettük és –80 ºC –os folyékony nitrogénbe helyezve lefagyasztottuk. A mintákból Western blot analízissel határoztuk meg a szívek HSP70 tartalmát. A meghatározás egyes fázisait korábbi publikációkban leírtak szerint hajtottuk végre (25).
3.6 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia vizsgálata 3.6.1 Kardiomiopátia előidézése 250-350 g-os hím Sprague-Dawley patkányokat négy kísérleti csoportra osztottunk. Az egyik csoportot heti egyszer 2,5 mg/ttkg szubkután adott DOX-nel kezeltük hat héten keresztül (DOX csoport, n=5) (150). A kontroll csoportot csak szubkután adott fiziológiás sóoldattal kezeltük, szintén hat héten keresztül (Kontroll csoport, n=6). A harmadik kísérleti csoportban az állatok a fent említett DOX kezelés mellett 20 mg/ttkg PJ34-et is kaptak ivóvízben oldva ( DOX-PJ csoport, n=5), illetve a negyedik kísérleti csoport a kontroll csoporthoz hasonló kezelés mellett szintén kapott 20 mg/ttkg PJ34-et (Kontroll-PJ csoport, n=6). Az állatok az ivóvízben oldott PJ34-et 6 héten keresztül, a kísérleti protokoll megkezdéséig folyamatosan itták. Ez a kezelési séma, amelyet a meglevő irodalmi adatok alapján állítottunk fel, alkalmas arra, hogy maximális PARP gátlás alakuljon ki a szívizomban (125,126).
43
3.6.2 Perfúziós protokoll A hat-hetes DOX kezelést követően az állatok szívét Langendorff szerint perfundáltuk. Párhuzamosan regisztráltuk a hemodinamikai paramétereket és az Ca2+i-tranzienseket. A kísérleti protokoll kezdetén a szíveket INDO-1 AM fluoreszcens festékkel töltöttük fel. Az intracelluláris téren kívül rekedt felesleges festéket 15 percen keresztül tartó kimosással távolítottuk el. A festékkel való feltöltés után készítettük az első regisztrátumot, amely a hat-hetes DOX kezelést jellemző alapállapotot írta le. Ezt követően a szívekben 600 µM H2O2 infúzióval oxidatív stresszt idéztünk elő. A hidrogén-peroxidot az aortacsonk feletti kanül oldalában elhelyezkedő, gyógyszerek adagolására kialakított oldalnyíláson keresztül infundáltuk, így a H2O2 a perfúziós folyadékkal együtt mosódott a koronária artériákba. Az oxidatív stressz alatti hemodinamikai paramétereket és a fluoreszcens jeleket megközelítőleg kettő percen keresztül tudtuk detektálni. Ezt követően fluoreszcens jel fokozatosan gyengült, és az alacsony jel/zaj arány miatt kiértékelésre alkalmatlanná vált. Ennek egyik lehetséges magyarázata, hogy a rendkívül reakcióképes H2O2 direkt vagy indirekt úton fokozta az INDO-1 AM kimosódását a szívizomsejtből. A kísérleti protokoll végén a szíveket a kanülről levettük, papírtörlővel szárazra töröltük és meghatároztuk a szívtömeget.
44
4
EREDMÉNYEK
4.1 A hősokk előkezelést követő iszkémiás/reperfúziós károsodás vizsgálata 4.1.1 A miokardium HSP70 tartalma A HS előkezelés eredményességét a szívek HSP70 tartalmának meghatározásával vizsgáltuk. A HS kezelés eredményességét bizonyítja, hogy a HSP70 tartalom, amelyet 179±51 integrált optikai denzitometriás relatív egységnek találtunk a kontroll szívekben, a HS előkezelésnek alávetett szívekben mintegy hétszeresére emelkedett.
4.1.2 A szív mechanikai teljesítménye A 30 perces iszkémiát követő 20 perces reperfúziós protokoll során mért hemodinamikai paraméterek az I. táblázatban és a 7. ábrán láthatóak. A HS előkezelés nem eredményezett szignifikáns változást a kontroll és a kezelt csoport festékkel való feltöltés előtt regisztrált hemodinamikai paraméterekben. Korábbi irodalmi adatokból ismeretes, hogy a fluoreszcens festékkel való feltöltés csökkenti a szív pumpafunkcióját. (38). Kísérleteinkben, bár nem szignifikánsan, de csökkent a kontroll szívek feltöltés utáni pulzusnyomása, ezzel szemben a HS előkezelésben részesült szívekben nem tapasztaltunk teljesítményromlást. A HS előkezelt szívek jobban tolerálták az iszkémiát, hiszen -mások publikált megfigyeléseivel összhangban (29,75,99,100,172,179) -a reperfúzió alatt mi is szignifikánsan magasabb pulzusnyomást mértünk. Az iszkémia előtti pulzusnyomásokat a reperfúzió 20. percében mért eredményekkel összehasonlítva, megállapítható, hogy a kiindulási alapállapothoz képest a kontroll szívekben 55% (75±20 vs 41±20 Hgmm), a HS előkezelt szívekben viszont csak 72%-ra (98±11 vs 71±12 Hgmm) csökkent a pulzusnyomás. A miokardium kontraktilitásról ad tájékoztatást a bal kamrán belüli izovolumetriás nyomásnövekedés és csökkenés maximális sebessége. A reperfúzió alatt regisztrált ±dP/dtmax értékeket tekintve elmondhatjuk, hogy HS előkezelés hatására szignifikánsan magasabb értékeket mértünk, mint a kontroll csoportban. A kiindulási alapállapothoz képest a HS előkezelt
45
szívekben a bal kamrán belüli izovolumetriás nyomásnövekedés és csökkenés maximális sebessége csupán 26%-kal (2057±208 vs 1513±305 Hgmm/s) és 16%-kal (1606±205 vs -1354±304 Hgmm/s) csökkent, szemben a kontroll szívekkel, amelyekben 49%-kal (1822±307 vs 938±500 Hgmm/s) és 38%-kal (-1302±130 vs -806±403 Hgmm/s) alacsonyabb értékeket regisztráltunk. A kontroll és a HS előkezelt szívekben az iszkémia előtt mért koronária áramlásokat tekintve nem volt szignifikáns különbség. A reperfúzió során azonban a HS előkezelt szívekben jelentősen nagyobb koronária áramlást detektáltunk.
I. táblázat. Iszkémia előtt és után mért hemodinamikai eredmények kontroll (K, n=5) és hősokk előkezelt (HS, n=6) szívekben.
Indo-1 AM Koronária áramlás (ml/perc)
Szisztolés nyomás (Hgmm)
Vég-diasztolés nyomás (Hgmm)
Pulzusnyomás (Hgmm)
+dP/dtmax (Hgmm /s)
-dP/dtmax (Hgmm /s)
Pulzusszám (ütés/perc)
Iszkémia
Rep 20 perc
HS
feltöltés előtt 11.2 ± 0.9
előtt 13.0 ± 1.5
9.5 ± 1.7+
K
10.6 ± 1.1
12.4 ± 1.8
6.9 ± 2.1+
HS
102 ± 7
106 ± 11
116 ± 5
K
104 ± 10
85 ± 18
105 ± 11
HS
8±1
8±2
45 ± 11+
K
8±1
10 ± 2
64 ± 22+
HS
94 ± 7
98 ± 11
71 ± 12+
K
96 ± 10
75 ± 20
41 ± 20+
HS
1693 ± 178
2057 ± 208
1513 ± 305+
K
1654 ± 113
1822 ± 307
938 ± 500+
HS
-1457 ± 71
-1606 ± 205
-1354 ± 304
K
-1302 ± 130
-1301 ± 331
-806 ±403+
HS
305 ± 59
294 ± 14
253 ± 31+
K
311 ± 12
323 ± 43
241 ± 53+
+
-szal jelölve az iszkémia előtt és a reperfúzió 20. percében mért statisztikailag szignifikáns különbségek (p<0.05).
46
Amikor az iszkémia során az ATP szint egy kritikus érték alá csökken, a szívizomban kontraktúra alakul ki. Kontraktúráról beszélünk, amikor a vég-diasztolés nyomás a nyugalmi állapothoz képest 5 Hgmm-rel megemelkedik. A 8A ábrán látható, hogy a HS előkezelésnek alávetett szívekben a kontraktúra 5 perccel később fejlődik ki, mint a kontroll szívekben. A HS előkezelésben részesült szívek reperfúzió alatti vég-diasztolés nyomása mindvégig alacsonyabb marad, mint a kontroll szíveké, bár ez az eltérés nem bizonyult szignifikánsnak. A reperfúzió folyamán minkét kísérleti csoportban bradikardia fejlődött ki.
4.1.3 A vég-diasztolés Ca2+i-szint Az Ca2+i-szint az iszkémia folyamán mindkét csoportban fokozatosan emelkedett. Az emelkedés a reperfúzió során a HS előkezelésen átesett szívekben megtorpan és az iszkémiás periódus végén mért értékhez képest alacsonyabb szinten stagnál, mint a kontroll szívekben, ahol a reperfúzió alatt az Ca2+i-szintje tovább emelkedik (8B ábra).
4.1.4 Az Ca2+i-tranziens Az Ca2+i-tranzienst jellemző dinamikus Ca2+i-paraméterek a 9. ábrán láthatóak. A SRból felszabaduló Ca2+ sebességét jellemző +dCa2+/dtmax és az oda szekvesztrálódó Ca2+ sebességét jellemző -dCa2+/dtmax értékekben nem volt különbség a HS előkezelt és a kontroll csoportban. A HS előkezelésnek alávetett szívekben magasabb szisztolés Ca2+iszintet mértünk.
Az Ca2+i-tranziensek az iszkémia kezdetén a szív mechanikai aktivitásának megszűnése ellenére, rövid ideig még jelen vannak. A 10. ábrán emellett az is látható, hogy a HS szívekben hosszabb ideg voltak jelen, mint a kontroll szívekben. A 4. percben még mindegyik szívben, az 5. percben még 4-ben volt detektálható Ca2+i-tranziens. Ezzel szemben kontroll csoportban a 4. percben 3, az 5. percben csak egy szívben volt megfigyelhető Ca2+i-tranziens.
47
4.1.5 Az Ca2+ iránti érzékenység A szívizom kontraktilis apparátusának Ca2+ iránti érzékenysége, amelyet a szisztolés Ca2+i-koncentráció és a hozzá tartozó szisztolés balkamrai nyomás maximumának hányadosával jellemeztünk, szignifikánsan magasabb maradt HS előkezelést követően. A miokardium Ca2+ iránti érzékenysége nem csak a reperfúzió alatt volt fokozottabb, hanem már az iszkémiát megelőzően is magasabb volt, mint a kontroll csoportban (11. ábra).
48
A +dP/dtmax (Hgmm/s)
2500 2000
*
1500
*
*
1000 500 0
B
-dP/dtmax (Hgmm/s)
0
-500
-1000
-1500
* *
-2000
Pulzusnyomás (Hgmm)
C
*
Kontroll (n=5)
120
Hősokk (n=6)
* 80
*
*
5
10
*
40
0 A
Idő (perc)
5
10
15
20
ISZKÉMIA
25
30
15
20
REPERFÚZIÓ
7A-C ábra. Kontroll (n=5) és hősokk előkezelt (n=6) patkányok izolált szíveiben mért hemodinamikai paraméterek alapállapotban (A) és 30 perces iszkémiát követő 20 perces reperfúzió alatt. A bal kamrán belüli izovolumetriás nyomásnövekedés (A) és csökkenés (B) maximális sebessége. (C) Pulzusnyomás. *jelöli a kontroll és HS csoportok közötti szignifikáns különbséget (p<0,05).
49
A Vég-diasztolés nyomás (Hgmm)
100
80
60
40
20
0
B Hősokk (n=6) Kontroll (n=5)
Vég-diasztolés Ca2+i (nM)
2000
* *
1500
*
*
*
1000
500
0 A
Idő (perc)
5
10
15
20
ISZKÉMIA
25
30
5
10
15
20
REPERFÚZIÓ
8A,B ábra. Kontroll (n=5) és hősokk előkezelt (n=6) patkányok izolált szíveiben mért vég-diasztolés (A) nyomás és (B) Ca2+i alapállapotban (A) és 30 perces iszkémiát követő 20 perces reperfúzió alatt. *jelöli a kontroll és HS csoportok közötti szignifikáns különbséget.
50
+dCa2+i/dtmax (nM/s)
A
34000
25500
17000
8500
0
-dCa2+i/dtmax (nM/s)
B
0
-5000
-10000
-15000
-20000
Kontroll (n=5) 3000
*
Hősokk (n=6)
*
Szisztolés Ca
2+
i
(nM)
C
2000
*
*
1000
0 A
Idő (perc)
5
10
15
20
ISZKÉMIA
25
30
5
10
15
20
REPERFÚZIÓ
9A-C ábra. Kontroll (n=5) és hősokk előkezelt (n=6) patkányok izolált szíveiben mért, az Ca2+i-tranzienst jellemző dinamikus paraméterek alapállapotban (A) és 30 perces iszkémiát követő 20 perces reperfúzió alatt. *jelöli a kontroll és HS csoportok közötti szignifikáns különbséget (p<0.05).
51
Amplitúdó Ca2+i (nM)
Kontroll
800
0 A
1
2
3
4
5
Amplitúdó Ca2+i (nM)
800
Hősokk
0 A
1
2
3
4
5
ISZKÉMIA
Idő (perc)
10. ábra. Kontroll (n=5) és hősokk előkezelt (n=6) patkányok izolált szíveiben mért Ca2+i-tranziensek jelenléte az iszkémia első 5 percében.
52
Kontroll (n=5) Hősokk (n=6)
* 0.3
(Hgmm/nM)
Maximális szisztolés nyomás / Maximális szisztolés Ca2+i
0.4
*
0.2
*
*
*
0.1
0 A
Idő (perc)
5
10
15
20
ISZKÉMIA
25
30
5
10
15
20
REPERFÚZIÓ
11. ábra. A kontraktilis apparátus Ca2+ iránti érzékenysége. Kontroll (n=5) és hősokk előkezelt (n=6) patkányok izolált szíveiben szisztolé alatt mért maximális balkamrai nyomás és maximális Ca2+i-koncentráció hányadosa alapállapotban (A) és 30 perces iszkémiát követő 20 perces reperfúzió alatt. *jelöli a kontroll és HS csoportok közötti szignifikáns különbséget (p<0.05).
53
4.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia vizsgálata 4.2.1 A szív mechanikai teljesítménye A hemodinamikai paramétereket tekintve az intakt szívizomban sem a hat-hetes DOX kezelés, sem a PJ34-gyel kiegészített DOX kezelés nem eredményezett szignifikáns változást a kiindulási alapállapotban (II. táblázat).
II. táblázat. Hemodinamikai paraméterek változása kontroll (n=6), DOX kezelt (n=5) és DOX kezelés mellett PARP gátlót is kapott (DOX+PJ) patkányok izolált szíveiben.
Kontroll (n = 6)
DOX (n = 5)
DOX+PJ (n = 5)
Szisztolés nyomás (Hgmm)
93 ± 13
84 ± 20
118 ± 10+
Vég-diasztolés nyomás (Hgmm)
8,4 ± 0,6
7,4 ± 0,2
7,9 ± 0,5
Pulzusnyomás (Hgmm)
85 ± 13
77 ± 20
110 ± 10+
291 ± 21
297 ± 18
285 ± 12
18 ± 3
13 ± 2*
16 ± 2
CF/HM (ml/min/g)
13,4 ± 2,2
12,8 ± 1,6
15,2 ± 1,3
+dP/dtmax (Hgmm /s)
2363 ± 255
2387 ± 301
2837 ± 442
-dP/dtmax (Hgmm /s)
-1483 ± 303
-1363 ± 344
-1900 ± 194
Szívfrekvencia (ütés/perc) Koronária áramlás (ml/perc)
CF: koronária áramlás, HM: szív tömeg. *-gal jelölve a Kontroll és a DOX kezelt szívekben mért statisztikailag szignifikáns különbség (p<0.05), +jelöli a DOX és DOX+PJ csoportok közötti szignifikáns különbséget alapállapotban (p<0.05). (A PJ34 kezelés önmagában nem okozott különbséget a hemodinamikai paraméterekben Kontroll vs Kontroll-PJ, ezért nem került feltüntetésre).
Kettő perces oxidatív stresszt követően (600 µM H2O2 infúzió adagolása után) a szívek mechanikai teljesítménye mindhárom csoportban lecsökkent. A balkamrai szisztolés nyomás, a pulzusnyomás és az izovolumetriás nyomásnövekedés és csökkenés maximális sebességének csökkenése a DOX-nel kezelt szívekben kifejezettebb volt. Azok az állatok, amelyek a DOX kezeléssel párhuzamosan PJ34-et is kaptak, a kontroll csoporthoz hasonlóan reagáltak az oxidatív stresszre. A PJ34 H2O2-dal szembeni védő hatása, a -dP/dtmax értékét kivéve, mindegyik mért hemodinamikai paraméterben megmutatkozott (12. ábra).
54
4.2.2 A vég-diasztolés Ca2+i-szint Az elvégzett kísérletsorozat legjelentősebb eredménye, hogy a DOX kezelés hatására a szívek vég-diasztolés Ca2+i-koncentrációja szignifikánsan nőtt (13. ábra). A kontroll egészséges szívekhez képest a DOX kezelést követően a vég-diasztolés Ca2+ikoncentráció megduplázódott (Kontroll csoportban: 109+22 nM, DOX–nal kezelt csoportban: 222+73 nM ). A vég-diasztolés Ca2+i-koncentráció emelkedése a PARP enzim gyógyszeres gátlásával kivédhető (DOX-PJ csoport). A H2O2-dal kiváltott oxidatív stressz mindhárom vizsgálati csoportban fokozta a vég-diasztolés Ca2+ikoncentrációt. A legmarkánsabb emelkedés a DOX-nal kezelt állatok szívében volt. A PJ34 kezeléssel szignifikánsan csökkenthető a DOX-nal kezelt állatok miokardiumában az oxidatív stressz által létrehozott vég-diasztolés Ca2+i-koncentráció növekedés. (Végdiasztolés Ca2+i-koncentráció a DOX csoportban: 548+298 nM, míg a DOX-PJ csoportban: 226+75 nM).
4.2.3 Az Ca2+i-tranziens A 14. ábrán látható, típusos Ca2+i-tranzienseken megfigyelhető, hogy DOX kezelés hatására a vég-diasztolés Ca2+i-koncentráció és a Ca2+i-amplitúdó megemelkedett. Ugyanakkor a Ca2+i-tranzienssel párhuzamosan regisztrált kamrai nyomáshullámok maximumai lecsökkentek. A Ca2+i-tranziens elemzése során kimutattuk, hogy a DOXnal kezelt szívekben megemelkedett a szisztolés Ca2+i-koncentráció és az Ca2+iamplitúdója, illetve a +dCa2+i/dtmax. H2O2-dal kiváltott oxidatív stressz egyik kísérleti csoportban sem okozott szignifikáns eltérést az alapállapothoz képest (15. ábra).
4.2.4 A Ca2+ iránti érzékenység A kontraktilis apparátus Ca2+ iránti érzékenységéről ad információt a szisztolés kamrai nyomás és szisztolés Ca2+i-koncentráció maximumának hányadosa. A 16. ábrán látható, hogy a DOX kezelés hatására a szívizom érzékenysége szignifikáns lecsökkent. A miokardium Ca2+ iránti érzékenységének csökkenése a PARP enzim gátlásával megelőzhető. A H2O2-dal kiváltott oxidatív stressz tovább rontotta a miokardium Ca2+-
55
érzékenységét mindhárom vizsgálati csoportban, ugyanakkor a PARP enzim gátlásával szignifikánsan javult a szívizom Ca2+ iránti érzékenysége.
56
Szisztolés nyomás (Hgmm)
#
105
C 4000
#
+
+dP/dtmax (Hgmm/s)
Alapállapot H2O2
A 140
#
$ 70
35
Kontroll
DOX
DOX-PJ
Kontroll
D
140
DOX
DOX-PJ
0
+ #
105
#
-dP/dtmax (Hgmm/s)
Pulzusnyomás (Hgmm)
$
2000
0
0
B
#
#
$
70
-1250
35 0
-2500
Kontroll
DOX
# #
DOX-PJ
12A-D. ábra. Hemodinamikai eredmények kontroll (n=6), DOX kezelt (n=5) és DOX kezelés mellett PARP gátlót is kapott (DOX+PJ, n=5) patkányok izolált szíveiben. (A) a balkamrai szisztolés nyomás, (B) a pulzusnyomás, (C) a bal kamrán belüli izovolumetriás nyomásnövekedés maximális sebessége, (D) a bal kamrán belüli izovolumetriás nyomáscsökkenés maximális sebessége. #jelöli a hidrogén-peroxid (H2O2) hatását; $jelöli a DOX és DOX+PJ csoportok közötti szignifikáns különbséget. (p<0,05); +jelöli a DOX és DOX+PJ csoportok közötti szignifikáns különbséget alapállapotban. (A PJ34 kezelés önmagában nem okozott különbséget az izolált szívek hemodinamikai paramétereiben, Kontroll vs Kontroll-PJ, ezért nem került ábrázolásra).
57
#
Vég-diasztolés Ca 2+i (nM)
900
$
Alapállapot H2O2 600
#
*
300
+
0
Kontroll
DOX
DOX-PJ
13. ábra. Alapállapotban és hidrogén-peroxid (H2O2) adását követően kialakuló végdiasztolés Ca2+i-koncentráció változások DOX által indukált kardiomiopátiában. #jelöli a hidrogén-peroxid (H2O2) hatását; +jelöli a DOX és DOX+PJ csoportok közötti szignifikáns különbséget alapállapotban; $jelöli a DOX és DOX+PJ csoportok közötti szignifikáns különbséget H2O2 adását követően (p<0,05); *jelöli a DOX és a Kontroll csoportok közötti szignifikáns különbséget alapállapotban (p<0,05). (A PJ34 kezelés önmagában nem okozott különbséget az izolált szívek vég-diasztolés Ca2+i-koncentráció változásában, Kontroll vs Kontroll-PJ, ezért nem került ábrázolásra).
58
A
nM
Hgmm 100
Ca2+i Plv
800
600
75
400
50
200
25
0
0
B 800
100
600
75
400
50
200
25
0
0 0
150
300
450
Idő (ms)
14. ábra. Típusos Ca2+i-tranziensek. (A) kontroll csoportból készült regisztrátumok, (B) a DOX-nal kezelt állatok szívén mért eredmények. A szaggatott vonalak a nyomáshullámokat, a folytonos vonalak az Ca2+i-tranzienseket jelölik.
59
C 40000
Alapállapot H2O2
*
Szisztolés Ca
800 + 400
20000
0
0 Kontroll 800
DOX
D
DOX-PJ
Kontroll
DOX
DOX-PJ
0
* -dCa2+i/dtmax (nM/s)
Ca2+i tranziens amplitúdója (nM)
B
*
2+
1200
+dCa i/dtmax (nM/s)
1600
2+ i
(nM)
A
600 400
-12500
200
-25000
0 Kontroll
DOX
DOX-PJ
15. ábra. Az Ca2+i-tranzienst jellemző dinamikus paraméterek DOX által indukált kardiomiopátia során. (A) szisztolés Ca2+i-koncentráció, (B) Ca2+i-tranziens 2+ 2+ amplitúdója, (C) +dCa i /dtmax, (D) -dCa i /dtmax. +jelöli a DOX és a DOX+PJ csoportok közötti szignifikáns különbséget alapállapotban; *jelöli a DOX és a Kontroll csoportok közötti szignifikáns különbséget alapállapotban (p<0,05). (A PJ34 kezelés önmagában nem okozott különbséget az Ca2+i-tranzienst jellemző dinamikus paraméterekben, Kontroll vs Kontroll-PJ, ezért nem került ábrázolásra).
60
Maximális szisztolés nyomás / Maximális szisztolés Ca2+i (Hgmm/nM)
Alapállapot
0.4
H2O2 +
0.3
0.2
* #
#
0.1
#
$
0 Kontroll
DOX
DOX-PJ
16. ábra. A miokardium Ca2+ iránti érzékenysége szisztolé alatt. *jelöli a DOX és a Kontroll csoportok közötti szignifikáns különbséget alapállapotban; +jelöli a DOX és DOX+PJ csoportok közötti szignifikáns különbséget alapállapotban; #jelöli a hidrogénperoxid (H2O2) hatását; $jelöli a DOX és DOX+PJ csoportok közötti szignifikáns különbséget H2O2 adását követően (p<0,05). (A PJ34 kezelés önmagában nem okozott különbséget a miokardium Ca2+ iránti érzékenységét tekintve, Kontroll vs Kontroll-PJ, ezért nem került ábrázolásra).
61
5
MEGBESZÉLÉS
5.1 A hősokk előkezelést követő iszkémiás/reperfúziós károsodás vizsgálata Az iszkémia/reperfúzió alatt bekövetkező szívizom károsodás létrejöttében a kóros mértékben megnövekedett Ca2+i-szint játssza a központi szerepet (39,46,60,116,129). Ez a körülmény többféle mechanizmussal vezet a normál szívműködés csökkenéséhez. Feltehető, hogy a Ca2+i-túlterhelés csökkenti a kontraktilis apparátus Ca2+ iránti érzékenységét azáltal, hogy protein kinázokat aktivál, amelyek a kontraktilis fehérjéket foszforilálják (56). Az a lehetőség is fennáll, hogy a megemelkedett Ca2+i-koncentráció megváltoztatja az intracelluláris pufferek Ca2+i-kötő képességét (SERCA2a, troponin C és a szarkolemmális kötőhelyek) (34,82,164). A reperfúzió alatti fokozott RyR2 aktivitás pedig hozzájárul az iszkémia alatt megemelkedett Ca2+i-szint fenntartásához (117). Ezek a tényezők valamennyien felelőssé tehetőek a szívizom hemodinamikai teljesítőképességének csökkenéséért.
Kevés és ellentmondásos adat áll rendelkezésre arról, hogy a HS előkezelésnek milyen hatása van az iszkémia/reperfúzió alatt bekövetkező Ca2+i-szint változásokra. Erre vonatkozólag csupán szívizom homogenizátumból készült preparátumokban és izolált sejtorganellumokban mért adatok állnak rendelkezésre. Ezekben a tanulmányokban egyaránt mértek emelkedett (117) illetve változatlan (75) SERCA2a aktivitást (Vmax), változatlan Ca2+ iránti affinitást (Kd), és egyes megfigyelések szerint a Ca2+-kötő helyek száma sem változott (117). Ezen kívül HS előkezelést követően csökkent intramitokondriális Ca2+-felvételt figyeltek meg. (29,179). Saját vizsgálataimban „in vitro” működő szívizomzatban vizsgáltam az Ca2+i-homeosztázis alakulását az iszkémiás/reperfúziós folyamatok során.
62
5.1.1 A szív hemodinamikai tevékenysége A kísérleteinkben megerősítést nyert az irodalmi adatokból ismert tény, hogy a HS előkezelés jótékony hatású a szívizom később bekövetkező iszkémiás/reperfúziós károsodásával szemben (29,75,99,100,172,179). Az iszkémiát követő reperfúzió alatt a HS előkezelt szívekben jobb hemodinamikai restitúciót figyeltünk meg, mint a kontroll csoportban. A HS előkezelésben részesült állatok szívein mért pulzusnyomás és ±dP/dtmax értékek magasabbak voltak, mint a kontroll csoportban. A vég-diasztolés nyomás egyik kísérleti csoportban sem tért vissza az iszkémia előtti kiindulási kontroll állapotban mért értékre, azonban a HS előkezelt szívekben a reperfúzió alatti végdiasztolés nyomáscsökkenés tendenciája kifejezettebb volt, korrelálva a szignifikánsan csökkenő vég-diasztolés Ca2+i-szintekkel. Ez a megfigyelésünk megegyezik a korábbi irodalmi adatokkal, amelyekben a HS előkezelt szívek vég diasztolés nyomásának teljes normalizálódása még a reperfúzió 30. percében sem alakul ki (172).
A perfúzió újraindítását követően a HS előkezelt szívekben az iszkémiát megelőző koronária áramlás 73%-ára, a kontroll szívekben csak annak 56%-ára tért vissza az áramlás. Megfigyelésünk, hogy a HS előkezelt szívekben a koronária áramlás helyreállása az iszkémiás inzultust követően jobb („borderline” szignifikancia p=0,05), egybevág a már meglevő irodalmi adatokkal. Ennek hátterében elképzelhető, hogy a HSP-k upregulációja áll, amely hozzájárul a koronáriák endotéliumában levő eNOS aktivitásának és az endothel NO termelésének fokozódásához (21,122). Az is lehetséges, hogy a HS előkezelt szívekben kifejlődő kontraktúra kisebb mértékű, mint a kontroll szívekben, így magasabb maradhat a miokardium perfúziója.
5.1.2 A vég-diasztolés Ca2+i-szint A
HS
előkezelt
kialakulásának
szívekben
hátterében
mérhető
számos
alacsonyabb
lehetséges
vég-diasztolés
mechanizmus
Ca2+i-szint
állhat.
Egyes
tanulmányokból jól ismert, hogy HS előkezelés következtében a mitokondriumok szerkezete és funkciója kevésbé sérül az iszkémiás/reperfúziós inzultus során. A miociták energiatermelése fenntartott, így az ATP és a nagy energiájú foszfátraktárak
63
nem
ürülnek
ki
teljesen
(101,130,131,179).
A
mitokondriumok
épségének
fenntartásához hozzájárulhat, hogy a HS előkezelés hatására a mitokondriumokban található KATP csatornák aktiválódnak. A csatorna megnyílásával a mitokondrium membránja depolarizálódik, így az iszkémia alatt kialakult magas Ca2+i-koncentráció ellenére is alacsony marad a mitokondriumokba irányuló Ca2+i-grádiens. Ennek következtében nem alakul ki a mitokondriumokat súlyosan károsító intramitokondriális Ca2+i-túlterhelés (57,81,130). A szívizom megtartott energiaellátása és a koronáriákban mérhető magasabb áramlás biztosítja az energiaigényes transzportfolyamatok lezajlását, a Ca2+i eltávolítását a citoszolból.
A HS előkezelés hatására az endoplazmatikus retikulumban a GRP94 Ca2+i-kötő stressz fehérje expressziója fokozódik. Ezek a fehérjék alacsony affinitással, de nagy kapacitással pufferolják az Ca2+i-ot (9,91,148,171). Valószínű, hogy a GRP fehérjék fokozott termelődése az egyik fő védekező mechanizmus az iszkémia alatt kialakuló miokardiális Ca2+i-túlterhelés ellen (111).
A HS előkezelés jótékony hatását magyarázhatja, hogy fokozza az antioxidatív enzimek, a kataláz és a szuperoxid diszmutáz aktivitását (29,56,71,80,92). Így a reperfúzió során keletkező reaktív oxigén szabadgyökök eliminálódnak, megelőzve a sejtmembrán foszfolipidjeinek degradálódását, a Ca2+ extracelluláris térből a sejtbe jutását. Az iszkémiát megelőző Ca2+i-koncentráció fenntartásával megelőzhető az Ca2+i-függő foszfolipázok
aktiválásának
következtében
kialakuló
poszt-iszkémiás
membránkárosodás folyamata is (26,166).
5.1.3 Az Ca2+i-tranziens Mivel az Ca2+i-tranzienst jellemző dinamikus paraméterekben (±dCa2+i/dtmax) az iszkémia/reperfúzió során sem a HS előkezelt, sem a kontroll szívekben nem tapasztaltunk különbséget, megállapíthatjuk, hogy a SR Ca2+-felszabadító (RyR2) és szekvesztráló (SERCA2a) csatornáinak aktivitása a HS előkezelt és a kontroll szívekben hasonló.
Ezt
a
megfigyelésünket
támasztja
64
alá
mások
korábbi,
a
SR-ot
homogenizátumban vizsgáló kísérletsorozata is (75). Azt a megfigyelésünket, hogy az iszkémia kezdetén a HS előkezelésnek alávetett szívekben az Ca2+i-tranziens hosszabb ideig detektálható, mint a kontroll szívekben, magyarázhatja, az a tény, hogy az iszkémia elején a HS előkezelésen átesett szívekben kevésbé súlyos az acidózis (2,59).
5.1.4 A Ca2+ iránti érzékenység A reperfúzió alatt mért balkamrai pulzusnyomás a HS előkezelt szívekben szignifikánsan nagyobb, mint a kontroll csoportban, ugyanakkor a nyomáshullámmal párhuzamosan regisztrált Ca2+i-tranziensek felszálló szárának analízise során nem találtunk különbséget a két vizsgált csoport között. A reperfúzió során detektált nagyobb balkamrai pulzusnyomás és a hozzá tartozó magasabb szisztolés Ca2+i-koncentráció azt a feltevésünket támasztja alá, hogy a HS előkezelés hatására a szívizom Ca2+ iránti érzékenysége megtartott. Ezt az állításunkat megerősíti, hogy a szisztolés balkamrai nyomás és a szisztolés intracelluláris Ca2+i-koncentráció maximumának hányadosa a HS előkezelésen átesett szívekben szignifikánsan nagyobb, mint a kontroll csoportban (11.ábra). További érdekes megfigyelésünk, hogy a HS előkezelést követően a szívizom Ca2+ iránti érzékenysége nem csak a reperfúzióban marad magasabb, hanem az iszkémiát megelőzően is kifejezettebb, mint a kontroll csoportban. Mivel a kontraktilis apparátus Ca2+ iránti érzékenysége határozza meg, hogy adott Ca2+i-koncentráció mellett mekkora erő (maximális szisztolés nyomás és pulzusnyomás) kifejtésére képes a szívizom, megállapítható, hogy a HS előkezelés hatására a kontraktilis apparátus Ca2+ iránti érzékenysége kifejezettebb.
A kontraktilis apparátus reperfúzió alatt fellépő csökkent Ca2+ iránti érzékenységének hátterében feltehetően a kontraktilitást szabályozó fehérjék degradációja áll. Az iszkémiás/reperfúziós inzultus során a megemelkedett Ca2+i-szint hatására a kalpain aktivitás fokozódik. A Ca2+i-függő cisztein proteázok családjába tartozó kalpain bontja a troponin I és troponin T szabályozó fehérjéket és a citoszkeletont alkotó strukturális fehérjéket (a-aktinin, spektrin, dezmin) is (45,82,106,167). HS előkezeléssel a miocita kontrakciót szabályozó és struktúrális fehérjéinek degradációja megelőzhető. Egyrészt a csökkent miokardiális Ca2+i-szint következtében a kalpain aktivitás is csökkent mértékű.
65
Másrészt a HS előkezelést követően a miokardium HSP27 koncentrációja megemelkedik. A HSP27 stabilizálja a struktúrfehérjék és a kontraktilitást szabályozó fehérjék szerkezetét (85,86).
5.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia vizsgálata A DOX által előidézett kardiomiopátia kialakulásának hátterében számos mechanizmus állhat (41,145). Mindezek közül azt tartják a legvalószínűbbnek, hogy az irreverzibilis változások kialakulásában az oxidatív és nitrozatív stressz okozta károsodás játssza a központi szerepet. A szervezetbe került DOX lebomlása során redukciós cikluson megy keresztül, amelynek során szabadgyökök képződnek. Ezek a rendkívül reakcióképes vegyületek számos citopatológiai folyamat előidézői. A képződött szabadgyökök alkalmasak számos citopatológiai folyamat előidézésére. A képződött szabadgyökök képesek mátrix metalloproteázokat aktiválni (4), a DNS szálat (124,123,126,150) és a mitokondriumokat károsítani, serkentik az apoptozist indukáló caspase-3 aktivitását és fokozzák citokrom c elválasztást (24,50). Ezen kívül a szabadgyökök képesek regulációs és gyulladásos fehérjék transzdukcióját és transzlációját fokozni 137). Annak ellenére, hogy a DOX patomechanizmusának számos részlete ismert, a szívizom kontraktilitásának csökkenésében és a sejthalál előidézésében szerepet játszó, DOX által indukált intracelluláris folyamatok pontos mechanizmusa nem tisztázott.
A kardiotoxicitás egyik legutóbb megismert lehetséges mechanizmusa a PARP enzim túlaktiválódással függ össze (123). Az eukariotákban fiziológiásan is jelen levő enzim számos intracelluláris folyamat szabályozója (170). A DNS szál sérülését követően akiválódott PARP gyorsan kiüríti a sejt energiaraktárait, miközben ADP-ribóz molekulákat kapcsol a NAD-ról a sérült DNS szálra. Az energiaigényes DNS szál javítás során az intracelluláris NAD és ATP gyorsan lecsökken, amelynek következtében mind a glikolízis, mind a mitokondriális légzési lánc folyamata megtorpan, maga után vonva az alapvető sejtfunkciók elégtelenné válását. A PARP túlaktiválódása a szöveti károsodás egyik fontos mechanizmusa, olyan fokozott oxidatív stresszel járó patofiziológiás állapotokban, mint a DOX által kiváltott kardiomiopátia (123,156).
66
5.2.1 A szív hemodinamikai tevékenysége Eredményeink azt mutatták, hogy a DOX által előidézett szívelégtelenség korai szakaszában a szívizom kontraktilitása számottevően nem változik. Ez a megfigyelés ellentétes a már meglévő irodalmi adatokkal, amelyek a DOX kezelést követő kamrai teljesítményromlásról számolnak be (124,137,142). Az általunk mért változatlan kamrai funkció egyik lehetséges magyarázata, hogy a Langendorff szerint perfundált szívek a kísérleti protokoll során, szemben az in vivo szívekkel, nem végeznek a külső nyomással szemben munkát, azaz nincs afterload. Éppen ezért az in vitro és az in vivo kísérletsorozatok eredményei nehezen hasonlíthatóak össze.
A DOX által kiváltott kardiomiopátia korai szakaszában a szívizom különösen érzékeny a hidrogén-peroxiddal létrehozott, akut oxidatív stresszre. Ennek egyik lehetséges magyarázata, hogy a DOX kezelés hatására mérséklődik a miokardium szabadgyökfogó és elimináló képessége, mivel az oxigén és nitrogén szabadgyökök állandó jelenléte miatt lecsökken a szuperoxid diszmutáz, glutation peroxidáz és a kataláz aktivitás (97,112). A miokardium szuprimált endogén antioxidáns rendszere nem képes kivédeni az akut oxidatív stressz károsító hatását. A DOX terápiában részesülő betegek fogékonyabbak a kardiovaszkuláris rendszert érintő megbetegedésekre. Ennek egyik feltételezhető oka a fentiekben ismertetett mechanizmus lehet.
5.2.2 A vég-diasztolés Ca2+i-szint Az oxidatív stressz által indukált kardiomiopátia viszonylag korai stádiumát jellemző patofiziológiai változások tanulmányozásához 6 hetes DOX kezelést tartalmazó kísérleti protokoll alkalmaztunk. A szívelégtelenség e korai fázisában még nem alakult ki szignifikáns kontraktilitásbeli hanyatlás az izolált, perfundált szívek miokardiumában. Ugyanakkor a megemelkedett vég-diasztolés Ca2+i-koncentráció jelzi, hogy a DOX kezelést követően viszonylag hamar felborul az Ca2+i-homeosztázis egyensúlya. A kardiomiopátiának ebben a viszonylag korai szakaszában a miokardiális Ca2+ikoncentráció
megemelkedése
ugyan
nem
vezet
közvetlenül
kamrai
teljesítményromláshoz, de hozzájárul a szívelégtelenség progresszióját jellemző
67
morfológiai és funkcionális változások kialakulásához (136,159). A kísérleteink eredményei alapján kijelenthető, hogy a PARP enzim túlaktiválódása kulcsszerepet játszik a DOX kezelést követően kialakuló miokardiális Ca2+i-homeosztázis zavarában. Ez a megállapításunk azon alapul, hogy a PARP enzim szelektív gátlásával mind kiindulási alapállapotban mind hidrogén-peroxid adását követően mérséklődött a DOX előkezelés hatására kialakuló magas miokardiális Ca2+i-szint. A PARP enzim két különböző
mechanizmussal
kapcsolódhat
be
a
sejtben
zajló
fiziológiás
és
patofiziológiás folyamatok szabályozásába (170). Egyrészt a DNS szál javítása során közvetett módon akadályozza a sejt működéséhez nélkülözhetetlen, ATP-igényes intracelluláris folyamatokat. A DNS szál sérülése miatt folyamatosan aktivált PARP felhasználja a sejt NAD raktárait, melynek következtében az intracelluláris ATP termelés lecsökken. Másrészt, a PARP enzim számos gén expresszióját és fehérje transzkripcióját szabályozza. Tekintettel a kapott eredményekre, valószínű, hogy a fent említett két mechanizmus kombinációja vezet a PARP által létrehozott miokardiális Ca2+i-homeosztázis zavarához.
5.2.3 Az Ca2+i-tranziens DOX kezelés hatására a vég-diasztolés Ca2+i-szint emelkedése mellett nőtt a szisztolés Ca2+i-koncentráció, az Ca2+i-tranziens amplitúdója és fokozódott a +dCa2+i/dtmax. Ismeretes, hogy DOX hatására csökken a SERCA2a által közvetített, ATP igényes Ca2+itranszport a SR-ba. Ugyanakkor a DOX kezelés során csökken a sejt energiakészlete és energiatermelése is (168). Így elképzelhető, hogy miocita alacsony energiaellátottsága miatt csökken az Ca2+i-szekvesztrálódása a SR-ba. A magas Ca2+i-szint fenntartásához hozzájárulhat a szabadgyökök által károsodott szarkolemma résein át az extracelluláris térből szabadon belépő nagy mennyiségű Ca2+ is. A PARP enzim gyógyszeres gátlásával megelőzhető a sejt energiaraktárainak kiürülése. A miocita energiaellátottságának helyreállításával biztosítható a Ca2+i-homeosztázist fenntartó pumpák működése. Lehetséges, hogy a DOX kezelést követően a PARP befolyásolja a Ca2+i-homeosztázist fenntartó csatornák fehérjéinek transzkripcióját. Az irodalomból ismert adatok szerint DOX hatására megváltozik a fiziológiás Ca2+-forgalmat biztosító fehérjék expressziója:
68
a SERCA2a és a RyR2 csatornák fehérjéi down-regulálódnak, míg az L-típusú Ca2+csatornák up-regulációja figyelhető meg (14,44,58).
5.2.4 A Ca2+ iránti érzékenység A szívizom kontraktilis apparátusának Ca2+ iránti érzékenysége, amelyet a szisztolés Ca2+i-koncentráció és a hozzá tartozó szisztolés nyomás hányadosával becsültünk meg, szignifikánsan lecsökkent a DOX kezelést követően. A szívizom Ca2+ iránti érzékenységének mintegy 50 %-os csökkenése, amely nem okozott ugyan nyilvánvaló mechanikai teljesítményromlást, megelőzhető volt PJ34 kezeléssel. Ma még nem teljesen tisztázott, milyen patológiás folyamat felelős a DOX által kiváltott Ca2+ iránti érzékenység csökkenéséért.
5.2.5 A kardiomiopátia progressziója Egyelőre nem ismert, hogy a tartósan alkalmazott PARP gátlás milyen hatással van a DOX által indukált kardiomiopátia kialakulására és progressziójára. Az eddig készült tanulmányokban a PARP inhibitor kezelést csupán néhány hétig, maximum egy hónapig alkalmazták és elsősorban a szív funkcionális változásait, azaz a miokardium kontraktilitását vizsgálták (124,123). Nem készült még olyan kísérletsorozat, amelyben hosszan tartó PARP gátlás alkalmazása során követik nyomon a DOX által indukált szívelégtelenséget jellemző morfológiai elváltozásokat és a progresszióra utaló patofiziológiai
jelek
kialakulását.
Ugyanakkor
bal
artéria
koronária
ramus
descendensének ligatúrájával ill. aorta aszcendens szűkítésével művi úton előidézett krónikus szívelégtelensében már leírták a PARP enzim gátlásának a remodelingre kifejtett kedvező hatását (125,175). Ezek alapján elképzelhető, hogy a PARP inhibitor alkalmazásával befolyásolni lehet a DOX által kiváltott kardiomiopátiát jellemző morfológiai és funkcionális változásokat.
69
6
KÖVETKEZTETÉSEK
Disszertációmban a HS előkezelésen átesett miokardium iszkémia/reperfúzió során mutatott jobb hemodinamikai restitúciójának, valamint a DOX által indukált kardiomiopátiának a hátterében álló Ca2+i-homeosztázis változásokat vizsgáltam. Az izolált szerv modell lehetővé tette az Ca2+i-szintek és a szív funkcióját jellemző aktuális hemodinamikai paraméterek szinkron detektálását és korreláltatását. Az in vivo körülményeket leginkább reprezentáló izolált szíveken végzett kísérletek lényeges, új eredményeit az alábbiakban foglalom össze:
1.
Kísérleteinkben
kimutattuk,
hogy
a
HS
előkezelés
mérsékli
az
iszkémiás/reperfúziós károsodás következtében kialakuló magas miokardiális vég-diasztolés Ca2+i-koncentrációt, a szívizom Ca2+i-mal való túltelődését. 2.
Eredményeink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a HS előkezelésben részesült szívizom kontraktilis apparátusának Ca2+ iránti érzékenysége
iszkémiát
követő
reperfúzió
alatt
megtartott.
Ezt
megállapításunkat arra a tényre alapozzuk, hogy ugyanolyan dinamikus
a
Ca2+i-
paraméterek mellett a HS előkezelt szívekben jobb hemodinamikai restitúciót figyelhettünk meg. 3.
A DOX kezelés hatására a miokardium vég-diasztolés Ca2+i-koncentrációja megemelkedik. A magas miokardiális vég-diasztolés Ca2+i-koncentráció PARP gátlással mérsékelhető. A DOX által indukált szívelégtelenségben csökken a miokardium Ca2+ iránti érzékenysége. A kontraktilis apparátus Ca2+ iránti érzékenységének csökkenése a PARP enzim gátlásával kivédhető. PARP gátlás kivédte a DOX-nal kezelt szívek hidrogén-peroxid által okozott további Ca2+i-túlterhelését és kontraktilitási zavarát.
70
4.
A kísérletsorozatban kapott eredmények azt mutatják, hogy a reaktív oxigén és nitrogén szabadgyökök, valamint az általuk létrehozott PARP túlaktiválódás kulcsszerepet játszik a DOX által indukált szívelégtelenség során fellépő kamrai teljesítményromlás létrejöttében. A PARP gátlás kardioprotektív hatásának egyik lehetséges mechanizmusa a szívizom Ca2+i-homeosztázisának helyreállítása. Az általunk tapasztalt folyamatok pontos mechanizmusának felderítésére azonban további kutatómunka szükséges.
71
7
KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS
Köszönöm témavezetőmnek, Dr. Ligeti Lászlónak, hogy munkám során mindig élvezhettem segítségét, tanácsait és figyelmemet a felmerülő kérdések során mindvégig a lényeges tudományos összefüggések felé irányította.
Ezúton szeretnék köszönetet mondani Dr. Kollai Márknak, a SE Klinikai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézet igazgatójának, hogy lehetővé tette számomra a kutatató munka elvégzését, folyamatosan támogatta, és mindvégig maximálisan segítette munkámat.
Munkám során értékes elméleti és gyakorlati segítségét kaptam Dr. Ger J van der Vussetól, Dr. Miklós Zsuzsannától, Dr. Ivanics Tamástól és Max FJ Holzhuijsentől. Jelentős asszisztensi és technikai segítségét köszönöm Nagy Zoltánnénak és Nagyné Fábián Juditnak.
Végül külön köszönöm férjem és szüleim bíztatását és áldozatkész segítségét, ami nélkül dolgozatom nem készülhetett volna el.
72
8
IRODALOMJEGYZÉK
1.
Adachi T, Weisbrod RM, Pimentel DR et al. Glutathiolation by peroxynitrite activates SERCA during arterial relaxation by nitric oxide. Nat Med 2004;10:1200-7.
2.
Allen DG, Orchard CH. The effects of changes of pH on intracellular calcium transients in mammalian cardiac muscle. J Physiol 1983;335:555-67.
3.
Arnaud C, Joyeux-Faure M, Godin-Ribuot D, Ribuot C. COX-2: an in vivo evidence of its participation in heat stress-induced myocardial preconditioning. Cardiovasc Res 2003;58:582–8.
4.
Bai P, Mabley JG, Liaudet L, Virag L, Szabo C, Pacher P. Matrix metalloproteinase activation is an early event in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Oncol Rep 2004;11:505-8.
5.
Bakondi E, Bai P, Bak I et al. Role of poly(ADP-ribose) polymerase in contact hypersensitivity. FASEB J 2002;16:A674.
6.
Balke CV, Egan TM, Wier WG. Process that remove calcium from the cytoplasm during excitation-contraction coupling in intact rat heart cells. J Physiol 1994;474:447-62.
7.
Barouch LA, Harrison RW, Skaf MW et al. Nitric oxide regulates the heart by spatial
confinement
of
nitric
oxide
synthase
isoforms.
Nature
2002;416(6878):337-9. 8.
Bassani JWM, Bassani RA, Bers DM. Calibration of indo-1 and resting intracellular [Ca]i in intact rabbit cardiac myocytes. Biophys J 1995;68:145360.
9.
Benjamin IJ, McMillan DR. Stress (heat shock) proteins. Molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. Circ Res 1998;83:117-32.
10.
Berger NA, Sims JL, Catino DM, Berger SJ. Poly(ADP-ribose) polymerase mediates the suicide response to massive DNA damage: studies in normal and DNA-repair defective cells. Princess Takamatsu Symp 1983;13:219–26.
11.
Bers DM, Bassani JW, Bassani RA. Na–Ca exchange and Ca fluxes during contraction and relaxation in mammalian ventricular muscle. Ann NY Acad Sci 1996;779:430–42.
73
12.
Bers DM. Cardiac excitation-contraction coupling and cardiac contractile force. Kluwer Academic Press, Boston MA 2003.
13.
Bolli R. Oxygen-derived free radicals and myocardial reperfusion injury: an overview. Cardiovasc Drugs Ther 1991;5 Suppl 2:249-68.
14.
Boucek RJ Jr, Miracle A, Anderson M, Engelman R, Atkinson J, Dodd DA. Persistent effects of doxorubicin on cardiac gene expression. J Mol Cell Cardiol 1999;31:1435-46.
15.
Brette F, Sallé L, Orchard. Differential modulation of L-type Ca2+ current by SR Ca2+ release at the T-tubules and surface membrane of rat ventricular myocytes. Circ Res 2004;95:e1-e7.
16.
Bunemann M, Gerhardstein BL, Gao T, Hosey MM. Functional regulation of L-type calcium channels via protein kinase A-mediated phosphorylation of the beta(2) subunit. J Biol Chem 1999;274:33851-4.
17.
Calderwood SK, Stevenson MA, Hahn GM. Effects of heat on cell calcium and inositol lipid metabolism. Radiat Res 1988;113:414–25.
18.
Cannell MB, Cheng H, Lederer WJ. The control of calcium release in heart muscle. Science 1995;268:1045–49.
19.
Casadei B, Sears CE. Nitric-oxide-mediated regulation of cardiac contractility and stretch responses. Prog Biophys Mol Biol 2003;82:67–80.
20.
Chance B. Continuous recording of intracellular reduced pyridine nucleotide changes in skeletal muscle in vivo. Tex Rep Biol Med 1964:Suppl 1:836-41.
21.
Chen JX, Meyrick B. Hypoxia increases Hsp90 binding to eNOS via PI3KAkt in porcine coronary artery endothelium. Lab Invest 2004;84:182-90.
22.
Chen SR, Li X, Ebisawa K, and Zhang L. Functional characterization of the recombinant type 3 Ca2+ release channel (ryanodine receptor) expressed in HEK293 cells. J Biol Chem 1997;272:24234-46.
23.
Cheng H, Lederer WJ, Cannell MB. Calcium sparks: elementary events underlying
excitation-contraction
1993;262:740–4.
74
coupling
in
heart
muscle.
Science
24.
Childs AC, Phaneuf SL, Dirks AJ, Phillips T, Leeuwenburgh C. Doxorubicin treatment in vivo causes cytochrome C release and cardiomyocyte apoptosis, as well as increased mitochondrial efficiency, superoxide dismutase activity, and Bcl-2:Bax ratio. Cancer Res 2002;62:4592-8.
25.
Cornelussen RN, Garnier AV, Vork NM et al. Heat stress protects aged hypertrophied and nonhypertrophied rat hearts against ischemic damage. Am J Physiol 1997;273:H1333-41.
26.
Cornelussen RN, Van der Vusse GJ, Roemen TH, Snoeckx LHEH. Heat pretreatment differentially affects cardiac fatty acid accumulation during ischemia and postischemic reperfusion. Am J Physiol 2001;280:H1736-43.
27.
Cornelussen RN, Ver Donck L, Verellen G et al. Calcium homeostasis in cardiomyocytes isolated from heat-shocked rats. Am J Phyisiol Heart Circ Physiol 1996;271:H1938-46.
28.
Cosi C. New inhibitors of poly (ADP-ribose) polymerase and their potential terapeutic targets. Expert Opin Ther Pat 2002;12:1047-71.
29.
Currie RW, Karmazyn M, Kloc M, Mailer K. Heat-shock response is associated with enhanced post-ischemic ventricular recovery. Circ Res 1988;63:543-49.
30.
Csermely P. Stresszfehérjék. Vince kiadó 2001.
31.
de Murcia G, Menissier de Murcia J. Poly(ADP-ribose) polymerase: a molecular nick-sensor. Trends Biochem Sci 1994;19:172–6.
32.
de Murcia G, Schreiber V, Molinete M et al. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase. Mol Cell Biochem 1994;138:15–24.
33.
de Murcia JM, Niedergang C, Trucco C et al. Requirement of poly(ADPribose) polymerase in recovery from DNA damage in mice and in cells. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:7303–7.
34.
Diaz ME, Trafford AW, Eisener DA. The role of intracellular Ca buffers in determining the shape of the systolic Ca transient in cardiac ventricular myocytes. Pflügers Arc-Eur J Physiol 2001;442:96-100.
35.
Donnelly TJ, Sievers RE, Vissern FL, Welch WJ, Wolfe CL. Heat shock protein induction in rat hearts. A role for improved myocardial salvage after ischemia and reperfusion? Circulation 1992;85:769–78.
75
36.
Eisner DA, Choi HS, Diaz ME, O'Neill SC, Trafford AW.Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res 2000;87:1087-94.
37.
Fabiato A. Calcium-induced release of calcium from the sarcoplasmic reticulum. J Gen Physiol 1985;85:189–320.
38.
Figueredo VM, Brandes R, Weiner MW, Maisse BM, Camacho A. Cardiac contractile dysfunction during mild coronary flow reductions is due to an altered calcium-pressure relationship in rat heart. J Clin Invest 1992;90:17941802.
39.
Fiolet JWT, Baartscheer A. Cellular calcium homeostasis during ischemia; a thermodynamic approach. Cardiovasc Res 2000;45:100-6.
40.
Flanagan SW, Moseley PL, Buettner GR. Increased flux of free radicals in cells subjected to hyperthermia: detection by electron paramagnetic resonance spin trapping. FEBS Lett 1998;431:285-6.
41.
Fogli S, Nieri P, Breschi MC. The role of nitric oxide in anthracycline toxicity and prospects for pharmacologic prevention of cardiac damage. FASEB J 2004;18:664-75.
42.
Frank KF, Bolck B, Erdmann E, Schwinger RH. Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase modulates cardiac contraction and relaxation. Cardiovasc Res 2003;57:20-7.
43.
Frank KF, Mesnard-Rouiller G, Chu G et al. Structure and expression of the mouse cardiac calsequestrin gene. Basic Res Cardiol 2001;96:636–44
44.
Gambliel HA, Burke BE, Cusack BJ et al. Doxorubicin and C-13 deoxydoxorubicin effects on ryanodine receptor gene expression. Biochem Biophys Res Commun 2002;291:433-8.
45.
Gao WD, Atar D, Backx PH, Marban E. Relationship between intracellular calcium and contractile force in stunned myocardium. direct evidence for decreased myofilament Ca-responsiveness and altered diastolic function in intact ventricular muscle. Circ Res 1995;76:1896-1904.
46.
Granger DN, Korthuis RJ. Physiologic mechanisms of postischemic tissue injury. Annu Rev Physiol 1995;57:311-32.
76
47.
Gray CC, Amrani M, Smolenski RT, Taylor GL, Yacoub MH. Age dependence of heat stress mediated cardioprotection. Ann Thorac Surg 2000;70:621–6.
48.
Gray CC, Amrani M, Yacoub MH. Heat stress and myocardial protection: experimental model or potential clinical tool? Int J Biochem & Cell Biol 1999;31:559-73.
49.
Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis. Science 1998;281:1309-12.
50.
Green PS, Leeuwenburgh C. Mitochondrial dysfunction is an early indicator of doxorubicin-induced apoptosis. Biochim Biophys Acta 2002;1588:94-101.
51.
Grinwald PM. Calcium uptake during post-ischemic reperfusion in the isolated rat heart: influence of extracellular sodium. J Mol Cell Cardiol 1982;14:35965.
52.
Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem 1985;260:344050.
53.
Gyorke I, Hester N, Jones LR, Gyorke S. The role of calsequestrin, triadin, and junctin in conferring cardiac ryanodine receptor responsiveness to luminal calcium. Biophys J 2004;86:2121-8.
54.
Hakamata Y, Nakai J, Takeshima H, and Imoto K. Primary structure and distribution of a novel ryanodine receptor/calcium release channel from rabbit brain. FEBS Lett 1992;312:229-35.
55.
Hauschildt S, Scheipers P, Bessler WG, Mulsch A. Induction of nitric oxide synthase in L929 cells by tumour-necrosis factor alpha is prevented by inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Biochem J 1992;288:255–600.
56.
Hess ML, Kukreja RC. Free radicals, calcium homeostasis, heat shock proteins and myocardial stunning. Ann Thorac Surg 1995;60:760-6.
57.
Hoag JB, Qiuan YZ, Nayeem MA, D’Angelo M, Kukreja RC. ATP-sensitive potassium channel mediates delayed ischemic protection by heat stress in rabbit heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol 1997;273:H2458-64.
77
58.
Huang XM, Zhu WH, Kang ML. Study on the effect of doxorubicin on expressions of genes encoding myocardial sarcoplasmic reticulum Ca2+ transport proteins and the effect of taurine on myocardial protection in rabbits. J Zhejiang Univ Sci 2003;4:114-20.
59.
Hulme JT, Orchard CH. Effect of acidosis on Ca2+ uptake and release by sarcoplasmic reticulum of intact rat ventricular myocytes. Am J Physiol 1998;275:H977-87.
60.
Inserte J, Garcia-Dorado D, Ruiz-Meana M et al. Effect of inhibition of Na(+)/Ca(2+) exchanger at the time of myocardial reperfusion on hypercontracture and cell death. Cardiovasc Res 2002;55:739-48.
61.
Ivanics T, Miklós ZS, Dézsi L et al. Concomitant accumulation of intracellular free calcium and arachidonic acid in the ischemic-reperfused rat heart. Mol Cell Biochem 2001;226:119-28.
62.
Jagtap P, Soriano FG, Virag L et al. Novel phenanthridinone inhibitors of poly (adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: potent cytoprotective and antishock agents. Crit Care Med 2002;30:1071-82.
63.
Jeyaseelan R, Poizat C, Wu HY, Kedes L. Molecular mechanisms of doxorubicin-induced cardiomyopathy. Selective suppression of Reiske ironsulfur protein, ADP/ATP translocase, and phosphofructokinase genes is associated with ATP depletion in rat cardiomyocytes. J Biol Chem 1997;272:5828-32.
64.
Joyeux M, Arnaud C, Godin-Ribout D, Demenge P, Lamontagne, Ribout C. Endocannabinoids are implicated in the infarct size-reducing effect conferred by heat stress preconditioning in isolated rat hearts. Cardiovasc Res 2002;55:619-25.
65.
Joyeux M, Baxter GF, Thomas DL, Ribuot C, Yellon DM. Protein kinase C is involved in resistance to myocardial infarction induced by heat stress. J Mol Cell Cardiol 1997;29:3311–9.
66.
Joyeux M, Lagneux C, Bricca G, Yellon DM, Demenge P, Ribuot C. Heat stress-induced resistance to myocardial infarction in the isolated heart from transgenic [(mREN-2)27] hypertensive rats. Cardiovasc Res 1998;40:124–30.
78
67.
Joyeux M, Ribuot C, Bourlier V et al. In vitro antiarrhythmic effect of prior whole body hyperthermia: implication of catalase. J Mol Cell Cardiol 1997;29:3285–92.
68.
Joyeux-Faure, Arnaud C, Godin-Ribout D, Ribout C. Heat stress preconditioning and delayed myocardial protection: what is new? Cardiovasc Res 2003;60:469-77.
69.
Kalyanaraman B, Joseph J, Kalivendi S, Wang S, Konorev E, Kotamraju S. Doxorubicin-induced apoptosis: implications in cardiotoxicity. Mol Cell Biochem 2002;234-235:119-24.
70.
Kanai Y, Tanuma S, Sugimura T. Immunofluorescent staining of poly(ADPribose) in situ in HeLa cell chromosomes in the M phase. Proc Natl Acad Sci U S A 1981;78:2801–4.
71.
Karmazyn M, Mailer K, Currie RW. Acquisition and decay of heat-shockenhanced postischemic ventricular recovery. Am J Physiol Heart Circ Physiol 1990;259:H424-31.
72.
Kato R, Foex P. Myocardial protection by anesthetic agents against ischemiareperfusion injury: an update for anesthesiologists. Can J Anaesth 2002;49:777–91.
73.
Keef KD, Hume JR, Zhong J. Regulation of cardiac and smooth muscle Ca(2+) channels (Ca(V)1.2a,b) by protein kinases. Am J Physiol Cell Physiol 2001;281:C1743-56.
74.
Kekow J, Wiedemann GJ, Katschinski DM et al. Whole body hyperthermia increases plasma levels of transforming growth factor. Int J Oncol 1995;7:1427–32.
75.
Kontos MC, Shipley JB, Kukreja RC. Heat stress improves functional recovery and induces synthesis of 27- and 70-kDa heat shock proteins without preserving sarcoplasmic reticulum function in the ischemic rat heart. J Mol Cell Cardiol 1996;28:1885-94.
76.
Korzick DH. Regulation of cardiac excitation-contraction coupling: a cellular update. Adv Physiol Educ 2003;27:192-200.
77.
Koss KL, Kranias EG. Phospholamban: a prominent regulator of myocardial contractility. Circ Res 1996;79:1059–63.
79
78.
Kregel KC, Johnson DG, Seals DR. Tissue-specific noradrenergic activity during acute heat stress in rats. J Appl Physiol 1993;74:1988–93.
79.
Kregel KC, Overton JM, Johnson DG, Tipton CM, Seals DR. Mechanism for pressor response to nonexertional heating in the conscious rat. J Appl Physiol 1991;71:192–6.
80.
Kukreja RC, Hess ML. The oxygen free radical system: from equations through membrane protein-interaction to cardiovascular injury and protection. Cardiovasc Res 1992;26:641-55.
81.
Kukreja RC. Role of KATP channel in heat shock and pharmacological preconditioning. Ann NY Acad Sci 1999;874: 211-21.
82.
Lamers JMJ. Preconditioning and limitation of stunning: one step closer to the protected protein(s)? Cardiovasc Res 1999;42:571-5.
83.
Langendorff O. Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen. Pflügers Arch 1895;61:291-332.
84.
Latchman DS. Heat shock proteins and cardiac protection. Cardiovasc Res 2001;51:637–46.
85.
Lavoie JN, Gingras-Breton G, Tanguay RM, Landry J. Induction of chinise hamster HSP27 gene expression in mouse cells confers resistance to heat shock. J Biol Chem 1993;268(5):3420-9.
86.
Lavoie JN, Lambert H, Hickey E, Weber LA, Landry J. Modulation of cellular thermotolerance and actin filament stability accompanies phosphorylationinduced changes in the oligomeric structure of hat shock protein 27. Moll Cell Biol 1995;15:505-16.
87.
Lazdunski M, Frelin C, Vigne P. The sodium/hydrogen exchange system in cardiac cells: its biochemical and pharmacological properties and its role in regulating internal concentrations of sodium and internal pH. J Mol Cell Cardiol. 1985;17:1029-42.
88.
Le Page C, Sanceau J, Drapier JC, Wietzerbin J. Inhibitors of ADPribosylation impair inducible nitric oxide synthase gene transcription through inhibition of NF kappa B activation. Biochem Biophys Res Commun 1998;243:451–7.
80
89.
Leduc Y, Lawrence JJ, de Murcia G, Poirier GG. Cell cycle regulation of poly(ADP-ribose) synthetase in FR3T3 cells. Biochim Biophys Acta 1988;968:275–82.
90.
Litwin SE, Li J, Bridge JHB. Na-Ca exchange and the trigger for sarcoplasmic reticulum Ca release: studies in adult rabbit ventricular myocytes. Biophys J 1998;75:359–71.
91.
Liu H, Bowes RC, Water BVD, Sillence C, Nagelkerke JF, Stevens JL. Endoplasmic reticulum chaperones GRP78 and calreticulin prevent oxidative stress, Ca2+disturbances and cell death in renal epithelial cell. J Biol Chem 1997;272:21751-9.
92.
Liu X, Engelman RM, Morare II. Heat shock: a new approach for myocardial preservation in cardiac surgery. Circulation 1992;86:358-63.
93.
Locke M, Tanguay RM. Diminished heat shock response in the aged myocardium. Cell Stress Chaperones 1996;1:251–60.
94.
Lopez-Lopez JR, Shacklock PS, Balke CW, Wier WG. Local calcium transients triggered by single L-type calcium channel currents in cardiac cells. Science 1995;268:1042–5.
95.
Lu R, Peng J, Xiao L, Deng HW, Li YJ. Heme oxygenase-1 pathway is involved in delayed protection induced by heat stress against cardiac ischemiareperfusion injury. Int J Cardiol 2002;82:133–40.
96.
Luo W, Grupp IL, Harrer J et al. Targeted ablation of the phospholamban gene is associated with markedly enhanced myocardial 1 contractility and loss of bagonist stimulation. Circ Res 1994;75:401–9.
97.
Luo X, Evrovsky Y, Cole D, Trines J, Benson LN, Lehotay DC. Doxorubicininduced acute changes in cytotoxic aldehydes, antioxidant status and cardiac function in the rat. Biochim Biophys Acta 1997;1360:45-52.
98.
Malyshev I, Manukhina EB, Mikoyan VD, Kubrina LN, Vanin AF. Nitric oxide is involved in heat-induced HSP70 accumulation. FEBS Lett 1995;370:159–62.
99.
Marber MS, Walker JM, Latchman DS, Yellon DM. Attenuation by heat stress of a submaximal calcium paradox in the rabbit heart. J Mol Cell Cardiol 1993;25:1119-26.
81
100.
Marber MS, Walker JM, Latchman DS, Yellon DM. Myocardial protection after whole body heat stress in the rabbit is dependent on metabolic substrate and is related to the amount of the inducible 70-kD heat stress protein. J Clin Invest 1994;93:1087-94.
101.
Marber MS, Mestril R, Chi SH, Sayen MR, Yellon DM, Dillmann WH. Overexpression of the rat inducible 70-kD heat stress protein in a transgenic mouse increases the resistance of the heart to ischemic injury. J Clin Invest 1995;95(4):1446-56.
102.
Marx SO, Reiken S, Hisamatsu Y et al. PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell 2000;101:365-76.
103.
Maxwell SR, Lip GY. Reperfusion injury: a review of the pathophysiology, clinical manifestations and therapeutic options. Int J Cardiol 1997;58:95-117.
104.
Mayer MP, Bukau B. Hsp70 chaperones: Cellular function and molecular mechanism. Cell Mol Life Sci 2005;62:670-84.
105.
McCormack JG, Halestrap AP, Denton RM. Role of calcium ions in regulation of mammalian intramitochondrial metabolism. Physiol Rev 1990;70:391-425.
106.
McDonough JL, Arrel DK, Van Eyk JE. Troponin I degradation and covalent complex formation accompanies myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Res 1999;84:9-20.
107.
Meyers MB, Fischer A, Sun YJ et al. Sorcin regulates excitation-contraction coupling in the heart. J Biol Chem 2003;278(31):28865-71.
108.
Michailova A, DelPrincipe F, Egger M, Niggli E. Spatiotemporal features of Ca2+ buffering and diffusion in atrial cardiac myocytes with inhibited sarcoplasmic reticulum. Biophys J 2002;83:3134-51.
109.
Minotti G, Menna P, Salvatorelli E, Cairo G, Gianni L. Anthracyclines: molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity. Pharmacol Rev 2004;56:185-229.
110.
Minotti G, Recalcati S, Menna P, Salvatorelli E, Corna G, Cairo G. Links Doxorubicin cardiotoxicity and the control of iron metabolism: quinonedependent and independent mechanisms. Methods Enzymol 2004;378:340-61.
82
111.
Miyata H, Lakatta EG, Stern MD, Silverman HS. Relation of mitochondrial and cytosolic free calcium to cardiac myocyte recovery after exposure to anoxia. Circ Res 1992;71:605-13.
112.
Mohamed HE, El-Swefy SE, Hagar HH. The protective effect of glutathione administration on adriamycin-induced acute cardiac toxicity in rats. Pharmacol Res 2000;42:115-21.
113.
Myers CE, McGuire WP, Liss RH, Ifrim I, Grotzinger K, Young RC. Adriamycin: the role of lipid peroxidation in cardiac toxicity and tumor response. Science 1977;197:165-7.
114.
Nakai J, Imagawa T, Hakamata Y, Shigekawa M, Takeshima H, and Numa S. Primary structure and functional expression from cDNA of the cardiac ryanodine receptor/calcium release channel. FEBS Lett 1990;271:169-77.
115.
Narayanan N, Xu A. Phosphorylation and regulation of the Ca pumping ATPase in cardiac sarcoplasmic reticulum by calcium/ calmodulin-dependent protein kinase. Basic Res Cardiol 1997;92:25–35.
116.
Nicotera P, Bellomo G, Orrenius S. The role of Ca2+ in cell killing. Chem Res Toxicol 1990;3:484-94.
117.
O’Brien PJ, Li GO, Locke M, Klabunde RE, Ianuzzo CD. Compensatory upregulation of cardiac SR Ca2+-pump by heat-shock counteracts SR activity Ca2+-channel activation by ischemia and reperfusion. Mol Cell Biochem 1997;173:135-43.
118.
Oliver FJ, Menissier de Murcia J, Nacci C et al. Resistance to endotoxic shock as a consequence of defective NF-kappaB activation in poly(ADP-ribose) polymerase-1 deficient mice. EMBO J 1999;18:4446–54.
119.
Opie LH. Heart physiology from cell to circulation. Lippincott Williams & Wilkins 2004.
120.
Orchard CH, Kenetish JC. Effects of changes of pH on the contractile function of cardiac muscle. Am J Physiol Cell Physiol 1990;258:C967-81.
121.
Otsu K, Willard HF, Hanna VK, Zorzato F, Green NM, and MacLennan DH. Molecular cloning of cDNA encoding the Ca2+ release channel (ryanodine receptor) of rabbit cardiac muscle sarcoplasmic reticulum. J Biol Chem 1990;265:13472-83.
83
122.
Ou J, Fontana JT, Ou Z et al. Heat shock protein 90 and tyrosine kinase regulate eNOS NO· generation but not NO· bioactivity. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004;286:H561-9.
123.
Pacher P, Liaudet L, Bai P et al. Activation of poly(ADP-ribose) polymerase contributes to development of doxorubicin-induced heart failure. J Pharmacol Exp Ther 2002;300:862-7.
124.
Pacher P, Liaudet L, Bai P et al. Potent metalloporphyrin peroxynitrite decomposition catalyst protects against the development of doxorubicininduced cardiac dysfunction. Circulation 2003;107:896-904.
125.
Pacher P, Liaudet L, Mabley J, Komjati K, Szabo C. Pharmacologic inhibition of poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase may represent a novel therapeutic approach in chronic heart failure. J Am Coll Cardiol 2002;40:1006-16.
126.
Pacher P, Liaudet L, Soriano FG, Mabley JG, Szabo E, Szabo C. The role of poly(ADP-ribose) polymerase activation in the development of myocardial and endothelial dysfunction in diabetes. Diabetes 2002;51:514-21.
127.
Patel DJ, Purcell HJ, Fox KM. Cardioprotection by opening of the K(ATP) channel in unstable angina. Is this a clinical manifestation of myocardial preconditioning? Results of a randomized study with nicorandil. CESAR 2 investigation. Clinical European studies in angina and revascularization. Eur Heart J 1999;20:51–7.
128.
Patel HH, Hsu A, Gross GJ. Attenuation of heat shock-induced cardioprotection by treatment with the opiate receptor antagonist naloxone. Am J Physiol, Heart Circ Physiol 2002;282:H2011–7.
129.
Piper HM, Meuter K, Schafer C. Cellular mechanisms of ischemia-reperfusion injury. Ann Thorac Surg 2003;75:S644-8.
130.
Polla BS, Kantengwa S, Francois D et al. Mitochondria are selective targets for the protective effects of heat shock against oxidative injury. Cell Biology 1996;93:6458-63.
131.
Radford NB, Fina M, Benjamin IJ et al. Cardioprotective effects of 70-kDa heat shock protein in transgenic mice. Medical Sciences 1996;93:2339-42.
84
132.
Raingeaud J, Gupta S, Rogers JS et al. Pro-inflammatory cytokines and environmental stress cause p38 mitogen-activated protein kinase activation by dual phosphorylation on tyrosine and threonine. J Biol Chem 1995;270:7420– 6.
133.
Rhodes SS, Ropella KM, Audi SH et al. Cross-bridge kinetics modelled from myoplasmic [Ca2+] and LV pressure at 17 C and after 37 C and 17 C ischemia. Am J Physiol 2003:284:H1217-29.
134.
Robertson, SP, Johnson JD, Potter JD. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increase in Ca2+. Biophys J 1981;34:559–69.
135.
Robinson BL, Morita T, Toft DO, Morris JJ. Accelerated recovery of postischemic stunned myocardium after induced expression of myocardial heat-shock protein (HSP70). J Thorac Cardiovasc Surg 1995;109:753–64.
136.
Rossi F, Filippelli W, Russo S, Filippelli A, Berrino L. Cardiotoxicity of doxorubicin: effects of drugs inhibiting the release of vasoactive substances. Pharmacol Toxicol 1994;75:99-107.
137.
Sacco G, Bigioni M, Evangelista S, Goso C, Manzini S, Maggi CA. Cardioprotective effects of zofenopril, a new angiotensin-converting enzyme inhibitor, on doxorubicin induced cardiotoxocity in the rat. Eur J Pharmacol 2001;414:71-8.
138.
Salo DC, Donovan CM, Davies KJ. HSP70 and other possible heat shock or oxidative stress proteins are induced in skeletal muscle, heart, and liver during exercise. Free Radic Biol Med 1991;11:239-46.
139.
Sammut IA, Jayakumar J, Latif N et al. Heat stress contributes to the enhancement of cardiac mitochondrial complex activity. Am J Pathol 2001;158:1821–31.
140.
Schraufstatter IU, Hyslop PA, Jackson J, Revak SD, Cochrane CC. Oxidant and protease injury of the lung. Bull Eur Physiopathol Respir 1987;23:297– 302.
85
141.
Schreiber V, Hunting D, Trucco C et al. A dominant-negative mutant of human poly(ADP-ribose) polymerase affects cell recovery, apoptosis and sister chromatid exchange following DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92:4753–7.
142.
Schwartz ER, Pollick C, Dow J, Patterson M, Birnbaum Y, Kloner RA. A small animal model of non-ischemic cardiomyopathy and its evaluation by transthoracic echocardiography. Cardiovasc Res 1998;39:216-23.
143.
Schwinger RH, Brixius K, Bavendiek U et al. Effect of cyclopiazonic acid on the force–frequency relationship in nonfailing myocardium. J Pharmacol Exp Ther 1997;283:286–92.
144.
Sims JL, Benjamin RC. Alteration of poly(adenosine diphosphoribose) metabolism by ethanol: mechanism of action. Arch Biochem Biophys 1987;253:357–66.
145.
Singal PK, Iliskovic N, Li T, Kumar D. Adriamycin cardiomyopathy: pathophysiology and prevention. FASEB J 1997;11:931-6.
146.
Singal PK, Iliskovic N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med 1998;339:900-5.
147.
Sipido KR, Carmeliet E, Van der Werf F. T-type Ca21 current as a trigger for Ca21 release from the sarcoplasmic reticulum in guinea-pig ventricular myocytes. J Physiol 1998;508:439–51.
148.
Snoeckx LHEH, Cornelussen RN, Van Nieuwenhoven FA, Reneman RS, Van der Vusse GJ. Heat shock proteins and cardiovascular patophysiology. Physiol Rew 2001;81:1461-97.
149.
Soeller C, and Cannell MB. Numerical simulation of local calcium movements during L-type calcium channel gating in the cardiac diad. Biophys. J 1997;73:97–111.
150.
Solem LE, Heller LJ, Wallace KB. Dose-dependent increase in sensitivity to calcium-induced mitochondrial dysfunction and cardiomyocyte cell injury by doxorubicin. J Mol Cell Cardiol 1996;28:1023-32.
86
151.
Spinale FG, Coker ML, Thomas CV, Walker JD, Mukherjee R, Hebbar L. Time-dependent changes in matrix metalloproteinase activity and expression during the progression of congestive heart failure: relation to ventricular and myocyte function. Circ Res 1998;82:482–95.
152.
Steare SE, Yellon DM. The protective effect of heat stress against reperfusion arrhythmias in the rat. J Mol Cell Cardiol 1993;25:1471–81.
153.
Stern MD. Theory of excitation-contraction coupling in cardiac muscle. Biophys J 1992;63:497–517.
154.
Suk JY, Kim YS and Park WJ. HRC (histidine-rich Ca2+ binding protein) resides in the lumen of sarcoplasmic reticulum as a multimer. Biochem Biophys Res Commun 1999;263:667–71.
155.
Suleiman MS, Halestrap AP, Griffiths EJ. Mitochondria: a target for myocardial protection. Pharmacol Ther 2001;89:29-46.
156.
Szabados E, Fischer GM, Toth K et al. Role of reactive oxygen species and poly-ADP-ribose
polymerase
in
the
development
of
AZT-induced
cardiomyopathy in rat. Free Radic Biol Med 1999;26:309-17. 157.
Szabo C, Virag L, Cuzzocrea S et al. Protection against peroxynitriteinduced fibroblast injury and arthritis development by inhibition of poly(ADP-ribose) synthase. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:3867–72.
158.
Szabo G, Liaudet L, Hagl S, Szabo C. Poly(ADP-ribose) polymerase activation in the reperfused myocardium. Cardiovasc Res 2004;61:471-80.
159.
Takahashi S, Denvir MA, Harder L et al. Effects of in vitro and in vivo exposure to doxorubicin (adriamycin) on caffeine-induced Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum and contractile protein function in 'chemically-skinned' rabbit ventricular trabeculae. Jpn J Pharmacol 1998;76:405-13.
160.
Takeshima H, Nishimura S, Matsumoto T et al. Primary structure and expression from complementary DNA of skeletal muscle ryanodine receptor. Nature 1989;339:439-45.
161.
Tanuma SI, Enomoto T, Yamada MA. Changes in the level of poly ADPribosylation during a cell cycle. Exp Cell Res1978;117:421–30.
87
162.
Tekin D, Xi L, Zhao T, Tejero-Taldo M, Atluri S, Kukreja RC. Mitogen activated kinases mediate heat shock-induced delayed protection in mouse heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2001;282:H523-32.
163.
Toyofuku T, Curotto Kurzydlowski K, Narayanan N, MacLennan DH. Identification of Ser38 as the site in cardiac sarcoplasmic reticulum Ca ATPase that is phosphorylated by Ca / calmodulin-dependent protein kinase. J Biol Chem 1994;269:26492–6.
164.
Trafford AW, Diaz ME, Eisener DA. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflügers Arc-Eur J Physiol 1999;437:501-3.
165.
Uehara A, Yasukochi M, Imanaga I, Nishi M, Takeshima H. Store-operated Ca2+ entry uncoupled with ryanodine receptor and junctional membrane complex in heart muscle cells. Cell Calcium 2002;31:89-96.
166.
Van der Vusse GJ, Cornelussen RN, Roemen THM, Snoeckx LHEH. Heat stress pretreatment mitigates postischemic arachidonic acid accumulation in rat heart. Mol Cell Biochem 1998;185: 205-11.
167.
Van Eyk JE, Powers F, Law W, Larue C, Hodges RS, Solaro RJ. Breakdown and release of myofilament proteins during ischemia and ischemia/reperfusion in rat hearts. Circ Res 1998;82:261-71.
168.
Vidal RF, Eksborg S, Sundberg M, Carlberg M, Elfsson B, Andersson BS. Doxorubicin- and daunorubicin-induced energy deprivation and nucleotide degradation in isolated cardiomyocytes. Toxicology 1996;114:1-10.
169.
Vigh L, Literati PN, Horvath I et al. Bimoclomol: a non-toxic, hydroxylamine derivate with stress protein-inducing activity and cytoprotective effects. Nat Med 1997;3:1150-4.
170.
Virag L, Szabo C. The therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Pharmacol Rev 2002;54:375-429.
171.
Vitadello M, Penzo D, Petronilli V et al. Overexpression of the stress-protein Grp94 reduces cardiomyocyte necrosis due to calcium overload and stimulated ischemia. FASEB J 2003;17:923-5.
88
172.
Walker DM, Pasini E, Kucukoglu S et al. Heat stress limits infarct size in the isolated perfused rabbit heart. Cardiovasc Res 1993;27:962-7.
173.
Weinstein DM, Mihm MJ, Bauer JA. Cardiac peroxynitrite formation and left ventricular dysfunction following doxorubicin treatment in mice. J Pharmacol Exp Ther 2000;294:396-401.
174.
Wier WG, Balke CW. Ca2+ release mechanisms, Ca2+ sparks, and local control of excitation-contracton coupling in normal heart muscle. Circ Res 1999;85:770-6.
175.
Xiao CY, Chen M, Zsengeller Z et al. Poly(ADP-ribose) polymerase promotes cardiac remodeling, contractile failure and translocation of apoptosis-inducing factor in a murine experimental model of aortic banding and heart failure. J Pharmacol Exp Ther. 2005; 312:891-8.
176.
Xu A, Hawkins C, Narayanan N. Phosphorylation and activation of the Ca pumping ATPase of cardiac sarcoplasmic reticulum by Ca / calmodulindependent protein kinase. J Biol Chem 1993;268:8394–7.
177.
Yamashita N, Hoshida S, Taniguchi N, Kazuya T, Hori M. Whole-body hyperthermia provides biphasic cardioprotection against ischemia/reperfusion injury in the rat. Circulation 1998;98:1414-21.
178.
Yellon DM, Iliodromitis E, Latchman DS et al. Whole body heat stress fails to limit infarct size in the perfused rabbit heart. Cardiovasc Res 1992;26:342-6.
179.
Yellon DM, Pasini E, Cargnoni A, Marber MS, Latchman DS, Ferrari R. The protective role of heat stress in the ischemic and reperfused rabbit myocardium. J Mol Cell Cardiol 1992;24:895-907.
180.
Zorzato F, Fujii J, Otsu K et al. Molecular cloning of cDNA encoding human and rabbit forms of the Ca2+ release channel (ryanodine receptor) of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. J Biol Chem 1990;265: 2244-56.
89
9
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
Az értekezés témájával összefüggő, nemzetközi folyóiratban megjelent közlemények:
Szenczi O, Kemecsei P, Miklós Zs, Ligeti L, Snoeckx LHEH, van Riel NAW, op den Buijs J, Van der Vusse GJ, Ivanics T.: In vivo heat shock preconditioning mitigates calcium overload during ischaemia/reperfusion in the isolated, perfused rat heart. Pflügers Archiv European Journal of Physiology 2005;449:518-25.
Szenczi O, Kemecsei P, Holthuijsen M, van Riel N, van der Vusse G, Pacher P, Szabó Cs, Kollai M, Ligeti L, Ivanics T.: Poly(ADP-ribose) polymerase regulates myocardial calcium handling in doxorubicin-induced heart failure Biochemical Pharmacology 2005;69:725-32.
Egyéb, nemzetközi folyóiratban megjelent közlemény:
op den Buijs J, Miklós Zs, van Riel NAW, Prestia CM, Szenczi O, Tóth A, Van der Vusse GJ, Ligeti L, Ivanics T.: ß-adrenergic activation reveals impaired cardiac calcium handling at early stage of diabetes. Life Sciences, 2004 Life Sciences 2005;76:1083-98.
Idézhető absztrakt, előadás, poszter:
Ligeti L, Szenczi O, Pasztor M, Van der Vusse GJ, Ivanics T.Heat shock preconditioning upregulates the endocannabinoid system and prevents calcium overload of the ischaemic-reperfused myocardium. Cardiovasc J S Afr. 2004 Jul;15.
Szenczi O, Kemecsei P, Miklós Zs, Ligeti L, Snoeckx LHEH, van Riel NAW, op den Buijs J, Van der Vusse GJ, Ivanics T.: Hősokk előkezelés mérsékli a szívizom iszkémia/reperfúzió alatt létrejövő kalcium túlterhelését. MÉT Vándorgyűlés, Debrecen, 2004 (előadás).
90
Szenczi O, Kemecsei P, Miklós Zs, Ligeti L, Snoeckx LHEH, van Riel NAW, op den Buijs J, Van der Vusse GJ, Ivanics T.: Hősokk előkezelés mérsékli a szívizom iszkémia/reperfúzió alatt létrejövő kalcium túlterhelését. PhD Tudományos napok, Budapest, 2004 (poszter).
Szenczi O, Kemecsei P, Holthuijsen M, van Riel N, van der Vusse G, Pacher P, Szabó Cs, Kollai M, Ligeti L, Ivanics T.: Poli(ADP-ribóz) polimeráz szerepe doxorubicin által indukált kardiomiopátia során fellépő kóros miokardiális kalcium homeosztázisban. MÉT Vándorgyűlés, Budapest, 2005 (előadás).
Szenczi O, Kemecsei P, Holthuijsen M, van Riel N, van der Vusse G, Pacher P, Szabó Cs, Kollai M, Ligeti L, Ivanics T.: Poli(ADP-ribóz) polimeráz szerepe doxorubicin által indukált kardiomiopátia során fellépő kóros miokardiális kalcium homeosztázisban. PhD Tudományos napok, Budapest, 2005 (előadás).
91
10 ÖSSZEFOGLALÁS
A szívizomsejtben kialakuló intracelluláris kalcium (Ca2+i) szignál döntő szerepet játszik a szívizom kontrakciójának létrejöttében. Az Ca2+ jelenléte a szívizomsejt kontrakciójának és relaxációjának alapfeltétele. Ugyanakkor az Ca2+i-koncentráció változása a miokardium kontrakciójának és relaxációjának a mértékét is meghatározza. Értekezésem fő célkitűzése a szív hemodinamikai sajátosságainak és a szívizom Ca2+ihomeosztázisának működő szívben „in vitro” körülmények közötti szimultán vizsgálata iszkémiás és kardiomiopátiás állapotokban. Disszertációmban a HS előkezelésen átesett miokardium iszkémia/reperfúzió (I/R) során kialakuló változásait, valamint a doxorubicin (DOX) által indukált kardiomiopátia állapotában kialakuló zavarokat vizsgáltam.
Az iszkémia/reperfúzió alatt bekövetkező szívizom károsodás létrejöttében a kóros mértékben megnövekedett intracelluláris szabad kalciumszint Ca2+i játssza a központi szerepet. Az utóbbi két évtizedben számos olyan tanulmány készült, melyben kimutatták, hogy hősokk előkezelés hatására megnő a szívizom iszkémiás/reperfúziós károsodással szembeni tűrőképessége. Kevés, ellentmondásos, csupán szívizom homogenizátumból nyert adat áll azonban rendelkezésünkre arra vonatkozólag, hogy a hősokk előkezelésnek milyen hatása van az I/R alatt bekövetkező Ca2+i-változásra.
A kardiomiopátia kialakulásának – és így a DOX által létrehozott szívelégtelenség – hátterében
számos
mechanizmus
állhat.
Mindezek
közül
azt
tartják
a
legvalószínűbbnek, hogy az irreverzibilis változások kialakulásában az oxidatív és nitrozatív stressz okozta károsodás játssza a központi szerepet. A szervezetbe kerülő DOX lebomlása során redukciós cikluson megy keresztül, melynek során szabadgyökök képződnek. Ezek a rendkívül reakcióképes vegyületek számos citopatológiai folyamat előidézői. Károsítják a sejt szerkezetét és megzavarják a sejt fiziológiás működését. A kardiotoxicitás egyik legutóbb megismert lehetséges mechanizmusa a poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP) enzim túlaktiválódással függ össze.
92
Kísérleteink első részében izolált, működő szívben kimutattuk, hogy a HS előkezelés mérsékli az I/R károsodás következtében kialakuló magas miokardiális vég-diasztolés Ca2+i-koncentrációt, ezáltal csökken a szívizom kalciummal való túltelődése. Eredményeink arra utalnak, hogy a reperfúziót követően jobb a hemodinamikai restitúció, és ennek hátterében nagy valószínűséggel a kontraktilis apparátus HS előkezelés hatására kialakuló, fokozott Ca2+ iránti érzékenysége áll.
Kísérleteink második részében kimutattuk, hogy a DOX előkezelést követően a miokardium
vég-diasztolés
Ca2+i-koncentrációja
megemelkedik
és
csökken
a
miokardium Ca2+ iránti érzékenysége, továbbá, hogy fokozódik a szívizom sérülékenysége az akut oxidatív stresszel szemben. A kísérletsorozatban kapott eredmények azt mutatják, hogy a reaktív oxigén és nitrogén szabadgyökök, valamint az általuk létrehozott PARP túlaktiválódás kulcsszerepet játszik a DOX által indukált szívelégtelenség során fellépő kamrai teljesítményromlás létrejöttében. A PARP gátlás kardioprotektív hatásának egyik lehetséges mechanizmusa a szívizom Ca2+ihomeosztázisának
helyreállítása.
Az
általunk
tapasztalt
folyamatok
mechanizmusának felderítésére azonban további kutatómunka szükséges.
93
pontos
11 SUMMARY
Cardiac contractility is dependent upon the precise regulation of intracellular Ca2+i cycling, i.e. the Ca2+i transient. In the present study disturbances of Ca2+i handling in ischemic/reperfused heart after heat shock (HS) treatment and in doxorubicin (DOX) induced cardiomyopathy have been studied.
Over the past two decades, numerous studies have shown that HS preconditioning enhances the tolerance of the heart against ischemia/reperfusion insult. One of the features of ischemia/reperfusion-induced cardiac injury is the persistent increase of intracellular free Ca2+ level. Experimental data on Ca2+i handling in the ischemic/reperfused heart after HS treatment are, however, scarce. The available information mainly pertains alterations in SR calcium uptake and is contradictory. No experimental data regarding HS preconditioning and Ca2+i handling during ischemia/reperfusion have been obtained in isolated cardiomyocytes or perfused heart preparations, hence one of the main aims of the present study was, therefore, to determine the effect of in vivo HS pretreatment on Ca2+i handling in the intact ischemic/reperfused rat heart in relation to contractile performance and to disclose the nature of the alterations in Ca2+ release and sequestration processes, if there is.
Development of cardiomyopathy is multifactorial. However, it appears that oxidative and nitrosative stress – such as induced by DOX – plays a clear role in this process. Doxorubicin undergoes redox cycling to generate free radicals that are responsible for mediating the various cytopathologies associated. One of the more recently identified pathways of doxorubicin cardiotoxicity is related to poly(ADP ribose) polymerase (PARP) activation. When activated by DNA single-strand breaks, PARP initiates an energy consuming cycle slowing the rate of glycolysis and mitochondrial respiration eventually leading to cellular dysfunction and death. Very little is known however how these processes affect Ca2+i handling of the cardiomyocyte, prompting the secondary aim of the present study.
94
In the first part of our study we have shown for the first time in intact hearts “in vitro” that heat shock pretreatment prevents a further increase in end-diastolic Ca2+i after an ischemia/reperfusion insult and, hence, mitigates post-ischemic calcium overload. Our results also suggest that improved postischemic myocardial performance in response to HS pretreatment is at least partly due to a relatively preserved sensitivity of the myocardial contractile machinery towards Ca2+. However, delineation of the precise mechanisms responsible for the observed phenomena needs further experimental work.
In the second part of this study we made the following observations (1) demonstration of an increase in end-diastolic calcium levels in doxorubicin-treated hearts; (2) development of a decline in calcium sensitivity of the contractile machinery in the diseased hearts; (3) the enhanced susceptibility of the doxorubicin-treated hearts towards a subsequent acute oxidative stress and (4) the protective effects of PARP inhibitor, strongly suggesting that activation of the nuclear enzyme PARP is involved in the functional alterations of the doxorubicin-treated heart. Overall, the results of the current study are consistent with the notion that reactive oxidant species and the PARP pathway play a pathogenetic role in the development of doxorubicin induced cardiac dysfunction. Normalization of cellular calcium handling appears to be an additional mode of the cardio protective effects of PARP inhibitors.
95
