Mérımódszerek a kalcium homeosztázis vizsgálatában
Bányász Tamás
A Kalcium homeosztázis vizsgálatának célja
Sejtmembrán
Kalcium szignalizáció
Koncentráció (mennyiség)
Kontraktilis rendszer
1
A kalcium koncentráció mérésének módszerei
• • • • •
Iontartalom meghatározások Izotópvizsgálatok Ca szelektív elektródák Festékek Indirekt módszerek
Iontartalom meghatározások • •
Inkább csak történeti jelentısége van A szövetek össz-iontartalmát határozta meg (múlt idı!!!!) – – – – – – – –
Szövetminta nyerése Nedvessúly mérés Súlyálandóságig szárítás 104 °C-on Szárazsúly mérése Roncsolás H2O2-vel vagy HNO3-al, ismételt beszárításokkal Feloldás ismert térfogatú deszt. Vízzel Koncentráció meghatározása (lángfotométer, v. Atomabszorbciós módszerrel) Visszaszámolás
Gyakorlatilag nem volt alkalmas a kalcium dinamikájának vizsgálatára
2
Izotóp vizsgálatok • Ca45 – Gyors felezési idı (163 nap) – Kis energiájú β- sugárzás, bonyolult detekciós eljárásokkal (általában szcintillációs technika) – Alacsony biztonsági fokozatú izotóplabort igényel – A kalcium ion mindenhova kötıdik (eszközök, edények fala) ami miatt mindent összekoszolt – Hatalmas háttér apparátust igényel a biológiai probléma kezelésén túl (az egyetemeknek külön központi izotóp laboratóriuma volt)
• Felvételi és leadási görbék vizsgálata
Izotóp felvételi görbe • • • • • •
„Hideg” szövetet inkubálunk „forró” közegben Az inkubációs idıt a vizsgálati cél határozza meg, de (technikai okok miatt) pár percnél nem lehet rövidebb és egy-másfél óránál nincs értelme hosszabbat tervezni Párhuzamos minták szolgálnak a felvétel idıfüggésének vizsgálatára (hatalmas mennyiségő szövet és izotóp felhasználása, 100-150 minta kisérletenként) A felvételi idı végén hasonlóan járunk el mint az össz-iontartalom meghatározásnál (nedves súly, száritás, száraz súly, roncsolás....stb) Eredmény: multiexponenciális felvételi görbe → kompartment analízis. Alkalmazás – Szöveten gyakorlatilag a membránon át történı transzportsebesség vagy a kalcium raktárak hosszú léptékő változását mérhette. – Viszonylag jól mérte a pumpa sebességet hosszú idı átlagában – Vezikula preparátumon transzportsebesség mérésére ma is alkalmazható .... lenne, de a festékek használata technikailag egyszerübb.
3
Izotóp leadási görbe • Feltöltés után a forró mintát inkubáljuk hideg oldatban • Egy szövetmintához több mosóoldat adja a kimosás idıfüggésének pontjait • A mosóoldatok kezelése technikailag lenyegesen egyszerübb mint a szöveté (nem kell száritani, roncsolni, közvetlenül mérhetı) • Eredmény: multiexponenciális leadásii görbe → kompartment analízis. • Alkalmazás: lásd felvételi görbék
Kalcium szenzitív elektródák •
A módszer – A mérés alapelve a pH mérés elvével egyezik meg – Míg nagy méretekben (pl klinikai laborban vérplazmában meghatározni millimolaris koncentrációjú kalciumot) a technika rendkívül robosztus, a sejten belüli alkalmazása rengeteg technikai problémával jár. (Mikroelektród technika plusz ionszelektív elektródák módszere) – Házi gyártmányú, nagy ellenállású mikroelektródákat, egyedi kalibrálással kell készíteni.
•
Elınyei: – Sejten belüli mérést tesz lehetıvé – Másodpercnél kisebb idıfelbontás (response time<100ms) – 100 nM/l-t megközelítı érzékenység
•
Hátrányai: – Rendkívül munkaigényes (napi két rekord már jó eredmény) – Nagy mérési bizonytalanság • A membránpotenciál változás miatt a mért érték korrekciója szükséges (TEVC, illetve double barrell electrodes) • Egyéb jelenlévı ionok zavaró hatása • A soros ellenállás változása a hegy elszennyezıdése miatt
4
FIG. 1. Fabrication and testing of concentric ion-selective microelectrodes (ISMs)
Fedirko, N. et al. J Neurophysiol 96: 919-924 2006; doi:10.1152/jn.00258.2006
Copyright ©2006 The American Physiological Society
FIG. 2. Use of concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes in a rat hippocampal slice
Fedirko, N. et al. J Neurophysiol 96: 919-924 2006; doi:10.1152/jn.00258.2006
Copyright ©2006 The American Physiological Society
5
Ca szelektiv elektróda paraméterei Amplitude, pH
Conventional Concentric
Time to peak, ms
Half-Time to Peak, ms
Half-Time Decay, ms
0.016 ± 0.003
1,111 ± 115
421 ± 87
2,428 ± 234
0.04 ± 0.01*
399 ± 36*
186 ± 16*
813 ± 102*
Amplitude, Ca, mM
Conventional Concentric
Time to peak, ms
Half-Time to Peak, ms
Half-Time Decay, ms
0.051 ± 0.013
890 ± 72
316 ± 47
1,974 ± 294
0.18 ± 0.03*
365 ± 23*
197 ± 10*
860 ± 67*
6
Festékek • Müködési elv • Alkalmazás
A fluorescencia jelenségérıl általában Jablonsky diagramm
Az excitációs hullámhossz nem befolyásolja az emisszió spektrális tulajdonságait, csak az intenzitását
Az oldószer (közeg) módosítja az emisszió spektrális tulajdonságait Badan in: 1. Toluene 2. Chloroform 3. Acetonitrile 4. Ethanol 5. Methanol 6. Water
Méréstechnika átfedı spektrumok esetén (nagy érték az intenzitás)
7
Festékek jellemzıi Spectrum
Photobleaching
Na mégegyszer!!!!!! Az oldószer (közeg) módosítja az emisszió spektrális tulajdonságait
Vannak olyan festékek amelyek spektrális tulajdonságai a közeg kalcium koncentrációjának függvényei
8
Két klasszikus kalcium érzékeny festék
Indo-1
Fura
Single vawelength versus ratiometric methods
• Mik változtatják meg a fluorescencia intenzitását mérés közben? – Photobleaching – Ha változik a sejt • Pozíciója • Alakja
9
Single vawelength versus ratiometric methods R=I1/I2
( Ri − Rmin)
C := Kd⋅ B⋅
I1
i
I2
( Ri − Rmax)
Hullámhosszkijelzık Felsı monokromátor bemenı rés Felsı monokromátor kijövı rés Monokromátor rés állítók Felsı monokromátor
Alsó monokromátor
Disc
Tükör elmosódva Alsó monokromátor kijövı rés
Alsó monokromátor bemenı rés
10
Chopper versus bifurcation cable
A festékek használata
11
Isolated cardiac myocyte
A festék sejtbejuttatásának módja • Mikroinjekció • AM forma
12
Principle of epifluorescent measurement
Microscope for epifluorescent measurement
13
Calcium Transients measured in mammalian cardiac cell
Confocal microscopy
14
Marvin Minsky
http://web.media.mit.edu/~minsky/papers/ConfocalMemoir.html
Fig.2
Z-line
RyR labeling
L~2m
T-tubule labeling
15
A.
B.
Longitudinal axis
Transverse axis
L T
D.
140
100 80
Frequency
Frequency
E. 150
60
Number
Frequency
120
40 20
100
50
2.4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
µm) Transverse spacing (µm) Transverse distances ( (µm) Transverse spacing
2.5
SHR-HF cell
2.2
Control cell
2.0
* SHR-HF cell
1.8
**
Control cell
1.6
**
SHR-HF tissue
1.4
Longitudinal spacing z-line spacing(µm) (µm)
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Control tissue
0
0
Transverse
Longitudinal CRU spacing (µm)
C.
16
Spark analysis
Elementary calcium release events on mammalian muscle
x-y image
line scan image
20 µm control
30 mM thymol 400 ms
512 p 73.1 um
2 F0
17
ECRE under control conditions spark
ember 3 F0
F0
200 ms trailing ember
leading ember
250 p
Total Internal Reflection Fluorescence Microscope (TIRFM) Probléma 1.:
18
Total Internal Reflection Fluorescence Microscope (TIRFM) Probléma 2.: tárgy
kép
A megoldás: teljes visszaverıdés
19
1. Specimen 2. Evanescent wave range 3. Cover slip 4. Immersion oil 5. Objective 6. Emission beam (signal) 7. Excitation beam
http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/tirf/olympusaptirf.html
A háttér zajának csökkentése TIRFM-el
20
Kontasztfokozás TIRFM -el
Izolált, dobogó szív, szövetek
21
A mérırendszer
Gyakorlatilag epifluorescens jelet mérünk
Indirekt módszer: INa/Ca mérése
C
caffeine R-indo
2
1
0
I-NCX (pA) 0 -40 -80 1s
22
Ca homeosztázis módositasa
• Diffúzibilis/non Diffúzibilis Ca pufferek (BAPTA) • Caged calcium/puffer
Modellezés
23
Tematika • •
A kalcium homeosztázis vizsgálatának célja A Calcium koncentráció mérésének módszerei – – – –
Iontartalom meghatározások Izotópvizsgálatok Ca szenzitiv elektródák Festékek • Története • A festékek mőködési módja – Single wavelength – Ratiometric
• A festékek használata – Single cell – Szövet-szerv
– Indirekt módszerek: INa/Ca
• •
Caged Calcium/Buffers Modellezes
24
